JPS6055118B2 - 新規な細菌アルカリプロテア−ゼ及びその製造方法 - Google Patents
新規な細菌アルカリプロテア−ゼ及びその製造方法Info
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- JPS6055118B2 JPS6055118B2 JP57017596A JP1759682A JPS6055118B2 JP S6055118 B2 JPS6055118 B2 JP S6055118B2 JP 57017596 A JP57017596 A JP 57017596A JP 1759682 A JP1759682 A JP 1759682A JP S6055118 B2 JPS6055118 B2 JP S6055118B2
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- alkaline
- alkaline protease
- bacillus
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規なアルカリプロテアーゼＡＰＩ一２１及
びその製造方法に関し、更に詳しくはアルカリ性の条件
下、比較的低温度（室温〜約４０℃）にても酵素活性を
有する細菌アルカリプロテアーゼＡＰＩ−２１並びに新
菌種バチルス属ＮＫＳ−２１を培養することによつて生
産される該アルカリプロテアーゼＡＰＩ−２１の製造方
法に関する。
びその製造方法に関し、更に詳しくはアルカリ性の条件
下、比較的低温度（室温〜約４０℃）にても酵素活性を
有する細菌アルカリプロテアーゼＡＰＩ−２１並びに新
菌種バチルス属ＮＫＳ−２１を培養することによつて生
産される該アルカリプロテアーゼＡＰＩ−２１の製造方
法に関する。
アルカリプロテアーゼは一般に熱に対して中性プロテア
ーゼよりも安定であるため、その用途も皮革加工用、食
品工業用、繊維工業用あるいは医薬としての応用等、広
範囲にわたつている。
ーゼよりも安定であるため、その用途も皮革加工用、食
品工業用、繊維工業用あるいは医薬としての応用等、広
範囲にわたつている。
また、近年では洗剤添加用酵素の需要が増大している。
このような洗剤添加用酵素として実用に供されているも
のは殆んどバチルス属細菌のアルカリプロテアーゼであ
り、高温度高活性型の酵素である。すなわち、これら公
知の酵素は通常ＰＨ９〜１０附近に至適作用条件を有し
、高温度特に６００付近に最高活性を有し、低温度特に
室温付近では酵素活性が極めて低いものが多い。そのた
め我国における如く室温で洗濯を行なう習慣のある国で
は、十分に上記酵素の特性は発揮されていない。又、最
近における熱に比較的弱い化学繊維の増加、あるいは省
エネルギーの観点からもより低い温度でも高い活性が保
持される酵素の開発が要求されている。本発明者は、か
かる状況に鑑みより低温度で最高活性値を有する細菌ア
ルカリプロテアーゼを得ることを目的に、各種土壌中よ
りアルカリプロテアーゼ生産菌を検索した結果、土壌よ
り分離したバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する新
菌種、バチルス属ぺＫＳ−２１（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ
．ｎＯｖ．ＮＫＳ−２１、以下単にＮＫＳ−２１号菌と
いう）が上記目的に合致した新規アルカリプロテアーゼ
を培地中に生産することを見出し、この知見に基づき本
発明を完成したものである。
このような洗剤添加用酵素として実用に供されているも
のは殆んどバチルス属細菌のアルカリプロテアーゼであ
り、高温度高活性型の酵素である。すなわち、これら公
知の酵素は通常ＰＨ９〜１０附近に至適作用条件を有し
、高温度特に６００付近に最高活性を有し、低温度特に
室温付近では酵素活性が極めて低いものが多い。そのた
め我国における如く室温で洗濯を行なう習慣のある国で
は、十分に上記酵素の特性は発揮されていない。又、最
近における熱に比較的弱い化学繊維の増加、あるいは省
エネルギーの観点からもより低い温度でも高い活性が保
持される酵素の開発が要求されている。本発明者は、か
かる状況に鑑みより低温度で最高活性値を有する細菌ア
ルカリプロテアーゼを得ることを目的に、各種土壌中よ
りアルカリプロテアーゼ生産菌を検索した結果、土壌よ
り分離したバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する新
菌種、バチルス属ぺＫＳ−２１（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ
．ｎＯｖ．ＮＫＳ−２１、以下単にＮＫＳ−２１号菌と
いう）が上記目的に合致した新規アルカリプロテアーゼ
を培地中に生産することを見出し、この知見に基づき本
発明を完成したものである。
すなわち、本発明におけるアルカリプロテアーゼＡＰＩ
−２１を生産する菌株はその菌学的性質より好気性有胞
子細菌でありバチルス属に属する新菌種であることが判
明した。
−２１を生産する菌株はその菌学的性質より好気性有胞
子細菌でありバチルス属に属する新菌種であることが判
明した。
以下、これについて詳しく述べる。尚、同定にあたつて
の菌学的諸性質の試薬および分離方法は「バージエーズ
マニュアル オブ デターミネイデイブ バクテリオ
ロジー」第８版（１９７詳）の記載に基づいて行なつた
。本発明における菌株ＮＫＳ−２１号菌は、前述の如く
好気性有胞子細菌でありバチルス属に属することが明ら
かである。
の菌学的諸性質の試薬および分離方法は「バージエーズ
マニュアル オブ デターミネイデイブ バクテリオ
ロジー」第８版（１９７詳）の記載に基づいて行なつた
。本発明における菌株ＮＫＳ−２１号菌は、前述の如く
好気性有胞子細菌でありバチルス属に属することが明ら
かである。
而して本菌株の極めて特異的性状として中性の培地でも
アルカリ性の培地でも生育するが、特にアルカリ性の培
地において非常に良く生育し、最適生育条件としてのＰ
Ｈ値が８〜１０である点があげられる。このような性質
に近似した公知の菌株としてバチルス バスツリー（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓｐａｓｔｅｕｒｉｉ）、およびバチルス
アルカロフイルス（ＢａｃｌｌｌｕｓａｌｃａＩＯｐ
ｈｉｌｕｓ）、が挙げられる。しかるに、本発明におけ
る菌株ＮＫＳ−２１号菌は、上記の菌種とその菌学的性
質において一部一致する点もあるが異なる特性をも有し
、それらと別異の菌株てあり文献未記載の新菌種である
。すなわち、バチルス バスツリーとバチルスアルカロ
フイルスはともにアルカリ性ＰＨ域で生育する菌であり
、特にバチルス アルカロフイルスはＰＨ７では生育で
きない特性を有する。
アルカリ性の培地でも生育するが、特にアルカリ性の培
地において非常に良く生育し、最適生育条件としてのＰ
Ｈ値が８〜１０である点があげられる。このような性質
に近似した公知の菌株としてバチルス バスツリー（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓｐａｓｔｅｕｒｉｉ）、およびバチルス
アルカロフイルス（ＢａｃｌｌｌｕｓａｌｃａＩＯｐ
ｈｉｌｕｓ）、が挙げられる。しかるに、本発明におけ
る菌株ＮＫＳ−２１号菌は、上記の菌種とその菌学的性
質において一部一致する点もあるが異なる特性をも有し
、それらと別異の菌株てあり文献未記載の新菌種である
。すなわち、バチルス バスツリーとバチルスアルカロ
フイルスはともにアルカリ性ＰＨ域で生育する菌であり
、特にバチルス アルカロフイルスはＰＨ７では生育で
きない特性を有する。
一方、ＮＫＳ−２１号菌はアルカリ性ＰＨでよく生育す
るが、中性ＰＨにおいてもよく生育し、この点において
バチルスアルカロフイルスと異なる。又、バチルスバス
ツリーはデンプンを加水分解しないがＮＫＳ−２１号菌
はデンプンを加水分解する。更に、バチルスバスツリー
は硝酸塩を還元するが、ＮＫＳ−２１号菌は還元しない
。又、その形態においてはバチルスバスツリーは、内生
胞子が球形かやや楕円形であるが、ＮＫＳ−２１号菌の
内生胞子は卵形である。又、バチルスバスツリーは尿素
を分解するが、ＮＫＳ−２１号菌はこれを分解しない〜 以上の菌学的性質の差異により、ＮＫＳ−２１号菌はバ
チルスバスツリーとは明らかに別異の種である。
るが、中性ＰＨにおいてもよく生育し、この点において
バチルスアルカロフイルスと異なる。又、バチルスバス
ツリーはデンプンを加水分解しないがＮＫＳ−２１号菌
はデンプンを加水分解する。更に、バチルスバスツリー
は硝酸塩を還元するが、ＮＫＳ−２１号菌は還元しない
。又、その形態においてはバチルスバスツリーは、内生
胞子が球形かやや楕円形であるが、ＮＫＳ−２１号菌の
内生胞子は卵形である。又、バチルスバスツリーは尿素
を分解するが、ＮＫＳ−２１号菌はこれを分解しない〜 以上の菌学的性質の差異により、ＮＫＳ−２１号菌はバ
チルスバスツリーとは明らかに別異の種である。
バチルスアルカロフイルスの菌株についての詳”細な分
類学的記述に関しては、前記「バージエーズ マニュア
ル オブ デターミネイテイブ バクテリオロジー」に
は見当たらず、不備である。
類学的記述に関しては、前記「バージエーズ マニュア
ル オブ デターミネイテイブ バクテリオロジー」に
は見当たらず、不備である。
また、バチルスアルカロフイルスの標準株は存しない。
従つて同書記載のオリジナル株であるバチルスアルカロ
フイルスＮＣＩＢｌＯ４３６株および同ＮＣＩＢｌＯ４
莫株とについて比較した。ＮＣｌＢｌＯ４３６株および
ＮＣＩＢｌＯ４莫株の両菌株ともグラム染色性は陽性で
あるが僅かであり、脱色され易い性質を有する。同様に
ＮＫＳ−２１号菌もグラム染色性は陽性であつて脱色さ
れ易い。また、栄養細胞の形態に関してはＮＣＩＢｌＯ
４３巾は０．７〜２．０μｍの短桿菌と０．８×４．６
μ丸の長桿菌とが電子顕微鏡下で観察され、一方ＮＣｎ
３ｌＯ４羽株の栄養細胞の大きさは０．７×１．５μｍ
である。しかるにＮＫＳ−２１号菌の栄養細胞の大きさ
は０．６〜０．８×２．５〜３．５ｐ混（電子顕微鏡観
察）であり、胞子の形状は卵形でその大きさは０．８×
１．２μｍである。また、運動性に関しＮＣＩＢｌＯ４
３６株及び同１０４莫株はそれが観察されないのに対し
、ＮＫＳ−２１号菌は運動性がある。次に生理的性質に
ついて、バチルスアルカロフイルスはマンニトール培地
に生育しないが、ＮＫＳ−２１号菌は生育する。またＮ
ＣＩＢｌＯ４あ株は７％食塩中で生育しないが、ＮＣＩ
ＢｌＯ４３８株は生育する。ＮＫＳ−２１号菌は７％食
塩水で生育する。以上の結果からＮＫＳ−２１号菌は、
バチルスアルカロフイルスＮＣＩＢｌＯ４３６株と同１
０４羽株とは一部その性質が近似するが、総体的に両者
から区別することができ別異の菌である。更に、ＮＫＳ
−２１号菌とバチルス●ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）とは、バチルス●ズブチリス栄養細
胞の大きさは巾０．７〜０．８μｍ１長さ２一３μｍで
あり、デンプンを分解する点において類似する。
従つて同書記載のオリジナル株であるバチルスアルカロ
フイルスＮＣＩＢｌＯ４３６株および同ＮＣＩＢｌＯ４
莫株とについて比較した。ＮＣｌＢｌＯ４３６株および
ＮＣＩＢｌＯ４莫株の両菌株ともグラム染色性は陽性で
あるが僅かであり、脱色され易い性質を有する。同様に
ＮＫＳ−２１号菌もグラム染色性は陽性であつて脱色さ
れ易い。また、栄養細胞の形態に関してはＮＣＩＢｌＯ
４３巾は０．７〜２．０μｍの短桿菌と０．８×４．６
μ丸の長桿菌とが電子顕微鏡下で観察され、一方ＮＣｎ
３ｌＯ４羽株の栄養細胞の大きさは０．７×１．５μｍ
である。しかるにＮＫＳ−２１号菌の栄養細胞の大きさ
は０．６〜０．８×２．５〜３．５ｐ混（電子顕微鏡観
察）であり、胞子の形状は卵形でその大きさは０．８×
１．２μｍである。また、運動性に関しＮＣＩＢｌＯ４
３６株及び同１０４莫株はそれが観察されないのに対し
、ＮＫＳ−２１号菌は運動性がある。次に生理的性質に
ついて、バチルスアルカロフイルスはマンニトール培地
に生育しないが、ＮＫＳ−２１号菌は生育する。またＮ
ＣＩＢｌＯ４あ株は７％食塩中で生育しないが、ＮＣＩ
ＢｌＯ４３８株は生育する。ＮＫＳ−２１号菌は７％食
塩水で生育する。以上の結果からＮＫＳ−２１号菌は、
バチルスアルカロフイルスＮＣＩＢｌＯ４３６株と同１
０４羽株とは一部その性質が近似するが、総体的に両者
から区別することができ別異の菌である。更に、ＮＫＳ
−２１号菌とバチルス●ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）とは、バチルス●ズブチリス栄養細
胞の大きさは巾０．７〜０．８μｍ１長さ２一３μｍで
あり、デンプンを分解する点において類似する。
しかるにバチルス●ズブチリスはＰＨ５．５〜８．５で
生育が活発であるが、ＮＫＳ−２１号菌が生育するＰＨ
９〜１０では生育できない。さらにバチルス・ズブチリ
スの生育最高温度は４５〜５５℃にあるが、ＮＫＳ−２
１号菌は４３度Ｃを超えた温度では生育できない点で明
らかに異るなどから、ＮＫＳ−２１号菌は明らかにバチ
ルスズブチリスとは別の種である。以上述べたように、
ＮＫＳ−２１号菌はその菌学的性質から近似の性質を有
する公知の菌株バチルスバスツリー、バチルスアルカロ
フイリスおよびバチルス・ズブチリスとは区別され、上
記のバージエーズ◆マニュアルに記載されている既知の
種のいずれとも異なる故新菌種に属することが明白であ
る。
生育が活発であるが、ＮＫＳ−２１号菌が生育するＰＨ
９〜１０では生育できない。さらにバチルス・ズブチリ
スの生育最高温度は４５〜５５℃にあるが、ＮＫＳ−２
１号菌は４３度Ｃを超えた温度では生育できない点で明
らかに異るなどから、ＮＫＳ−２１号菌は明らかにバチ
ルスズブチリスとは別の種である。以上述べたように、
ＮＫＳ−２１号菌はその菌学的性質から近似の性質を有
する公知の菌株バチルスバスツリー、バチルスアルカロ
フイリスおよびバチルス・ズブチリスとは区別され、上
記のバージエーズ◆マニュアルに記載されている既知の
種のいずれとも異なる故新菌種に属することが明白であ
る。
よつて、本菌を新菌種バチルス属ＮＫＳ一２１号菌と同
定した。該新菌種バチルス属ＮＫＳ−２１号菌は、特許
手続上の微生物の寄託の国際的挙認に関するブダペスト
条約に基づき昭和５７年２月３日附工業技術院微生物工
業技術研究所へ国際寄託され、受託番号は、微工研条寄
第部号である。
定した。該新菌種バチルス属ＮＫＳ−２１号菌は、特許
手続上の微生物の寄託の国際的挙認に関するブダペスト
条約に基づき昭和５７年２月３日附工業技術院微生物工
業技術研究所へ国際寄託され、受託番号は、微工研条寄
第部号である。
以下に、ＮＫＳ−２１号菌の菌学的諸性質を記載する。
なお、以下に記載する菌学的諸性質の試験および分離方
法は前記「バージエーズ マニュアル オブ デタミネ
イテイブ バクテリオロジー」（１９７↓羊）に基づい
て行なつた。土壌中より菌の分離については次の方法に
よつた。
法は前記「バージエーズ マニュアル オブ デタミネ
イテイブ バクテリオロジー」（１９７↓羊）に基づい
て行なつた。土壌中より菌の分離については次の方法に
よつた。
即ち、土壌塊の少量をペプトン培地に添加し、ＰＨ７〜
１０ｓ温度１０〜４０培の領域で振盪培養器を用い、４
０〜１５（転）間培養し、その一部分をとり寒天平板培
養て菌株を分離した。なお寒天平板培養の寒天濃度は１
．５％である。〔ＮＫＳ−２１号菌の菌学的性質〕 （ａ）形態 （１）栄養細胞の大きさ ０．６〜０．８×２．５〜３．５μｍ （２）細胞の多形性 細胞が伸長し０．６〜１．０×４．５μｍになること
あり（３）グラム染色性 陽性ではあるが脱色され易い （４）運動性 あり （５）鞭毛 周毛が複数存在し、約８〜１０μｍの長さである（６
）胞子の形、大きさ 卵形、０．８×１．２μｍ 内生胞子は細胞のやや端寄りのところに存在 Ｌ）培地における生育状態 （１）ペプトン培地 ＰＨ ＰＨ９．５２ ＯＯＣでも３（代）でも良く生育する ＰＨ７．２ ２Ｏ℃では遅いが生育し、３０℃では良く生 育する
生育温度（ＰＨ９．５） 約１４〜４１℃の温度範囲で
生育し、温度が４３℃を超えたり、１７Ｃ未満では生育
しない（２）他の培地 肉工キズ・ペプトン寒天斜面培地 よく生育する肉工キズ
・ペプトン寒天平板培地
よく生育する７％食塩存在肉工キズ・ペプトン寒天平
板培地 よく生育する肉工キ
ズ・ペプトン液体培地 よく生育する力ティン●ミート
エキス●ペプトン寒天斜面培地
よく生育する力ティン●ミートエキス●ペプトン寒天
平板培地 よく生育する力ティ
ン・ミートエキス●ペプトン液体培地
よく生育するスターチ・ペプトン液体培
地 よく生育するグルコース・ペプトン液体培地よく生
育するトリプトン・イーストエキス寒天培地
よく生育するスターチ・イースト
液体培地 生育する肉汁ゼラチン穿刺培養（１）Ｐ
ＨｌＯ．Ｏ３（代）培養：生育、液化（１１）ＰＨｌＯ
．Ｏ２Ｏ℃培養：表面上で弱く生育 し、弱く液化（Ｉ
ｉｉ）ＰＨ７．２３（代）培養：生育、液化（ＩＶ）Ｐ
Ｈ７．２２ＯＣ培養：表面上で弱く生育し、 弱く液化
（３）好気性で、嫌気的条件では生育しないｃ）生理学
的性質１硝酸塩の還元：還元しない ２ＶＰテストニ陰性 ３インドールの生成：生成しない ４デンプンの加水分解：加水分解する ５クエン酸の利用：利用する ５色素の生成：生成しない ７ウレアーゼニ陰性 ８チトクロームオキシターゼニ陽性 ９カタラーゼニ陽性 ［相］ 酸素に対する態度：好気性 ５０−Ｆテストニ弱いけれど発酵する ＠ 硝酸塩からの嫌気性でガスの発生：陰性◎■テスト
ニ陰性９硫化水素の生成：生成しない ＠無機窒素源の利用：硝酸塩及びアンモニくム塩を利用
する＠糖類からの酸及びガスの生成： Ｏその他 （１）フェニルアラニン脱アミノ作用：脱アミ ノ作用
する（１１）力ティン加水分解：加水分解する（Ｉｉ）
チロシン分解：分解する 本発明は以上の知見に基づいてなされたもσで、前記バ
チルス属ぺＫＳ−２１号菌の生産する奢規アルカリプロ
テアーゼＡＰＩ−２１並びにバチル′属ＮＫＳ−２１号
菌をアルカリ性培地に接種して１菌を培養し、培養物よ
りアルカリプロテアーゼＡＰＩ−２１を採取することを
特徴とする、新規なアルカリプロテアーゼＮ］−２１の
製造方法である。
１０ｓ温度１０〜４０培の領域で振盪培養器を用い、４
０〜１５（転）間培養し、その一部分をとり寒天平板培
養て菌株を分離した。なお寒天平板培養の寒天濃度は１
．５％である。〔ＮＫＳ−２１号菌の菌学的性質〕 （ａ）形態 （１）栄養細胞の大きさ ０．６〜０．８×２．５〜３．５μｍ （２）細胞の多形性 細胞が伸長し０．６〜１．０×４．５μｍになること
あり（３）グラム染色性 陽性ではあるが脱色され易い （４）運動性 あり （５）鞭毛 周毛が複数存在し、約８〜１０μｍの長さである（６
）胞子の形、大きさ 卵形、０．８×１．２μｍ 内生胞子は細胞のやや端寄りのところに存在 Ｌ）培地における生育状態 （１）ペプトン培地 ＰＨ ＰＨ９．５２ ＯＯＣでも３（代）でも良く生育する ＰＨ７．２ ２Ｏ℃では遅いが生育し、３０℃では良く生 育する
生育温度（ＰＨ９．５） 約１４〜４１℃の温度範囲で
生育し、温度が４３℃を超えたり、１７Ｃ未満では生育
しない（２）他の培地 肉工キズ・ペプトン寒天斜面培地 よく生育する肉工キズ
・ペプトン寒天平板培地
よく生育する７％食塩存在肉工キズ・ペプトン寒天平
板培地 よく生育する肉工キ
ズ・ペプトン液体培地 よく生育する力ティン●ミート
エキス●ペプトン寒天斜面培地
よく生育する力ティン●ミートエキス●ペプトン寒天
平板培地 よく生育する力ティ
ン・ミートエキス●ペプトン液体培地
よく生育するスターチ・ペプトン液体培
地 よく生育するグルコース・ペプトン液体培地よく生
育するトリプトン・イーストエキス寒天培地
よく生育するスターチ・イースト
液体培地 生育する肉汁ゼラチン穿刺培養（１）Ｐ
ＨｌＯ．Ｏ３（代）培養：生育、液化（１１）ＰＨｌＯ
．Ｏ２Ｏ℃培養：表面上で弱く生育 し、弱く液化（Ｉ
ｉｉ）ＰＨ７．２３（代）培養：生育、液化（ＩＶ）Ｐ
Ｈ７．２２ＯＣ培養：表面上で弱く生育し、 弱く液化
（３）好気性で、嫌気的条件では生育しないｃ）生理学
的性質１硝酸塩の還元：還元しない ２ＶＰテストニ陰性 ３インドールの生成：生成しない ４デンプンの加水分解：加水分解する ５クエン酸の利用：利用する ５色素の生成：生成しない ７ウレアーゼニ陰性 ８チトクロームオキシターゼニ陽性 ９カタラーゼニ陽性 ［相］ 酸素に対する態度：好気性 ５０−Ｆテストニ弱いけれど発酵する ＠ 硝酸塩からの嫌気性でガスの発生：陰性◎■テスト
ニ陰性９硫化水素の生成：生成しない ＠無機窒素源の利用：硝酸塩及びアンモニくム塩を利用
する＠糖類からの酸及びガスの生成： Ｏその他 （１）フェニルアラニン脱アミノ作用：脱アミ ノ作用
する（１１）力ティン加水分解：加水分解する（Ｉｉ）
チロシン分解：分解する 本発明は以上の知見に基づいてなされたもσで、前記バ
チルス属ぺＫＳ−２１号菌の生産する奢規アルカリプロ
テアーゼＡＰＩ−２１並びにバチル′属ＮＫＳ−２１号
菌をアルカリ性培地に接種して１菌を培養し、培養物よ
りアルカリプロテアーゼＡＰＩ−２１を採取することを
特徴とする、新規なアルカリプロテアーゼＮ］−２１の
製造方法である。
尚、本発明に用いる微生物は前記バチルス属ＮＫＳ−２
１号菌に限らず、その自然または人為的変異株であつて
も本発明の後記の如き特性を有するアルカリプロテアー
ゼＡＰ■−２１の生産性を有する限り当然に包含される
ものである。次に本菌ＮＫＳ−２１号菌を培養して得ら
れる本Ｌ発明の新規なアルカリプロテアーゼＡＰｌ−２
１について説明する。
１号菌に限らず、その自然または人為的変異株であつて
も本発明の後記の如き特性を有するアルカリプロテアー
ゼＡＰ■−２１の生産性を有する限り当然に包含される
ものである。次に本菌ＮＫＳ−２１号菌を培養して得ら
れる本Ｌ発明の新規なアルカリプロテアーゼＡＰｌ−２
１について説明する。
培養条件として、培地として例えばＰＨ８〜１０に調整
したペプトン培地を用い上記ＮＫＳ−２１号菌を接種し
好気的に振盪培養又は通気攪拌培養等で行なわれる。
したペプトン培地を用い上記ＮＫＳ−２１号菌を接種し
好気的に振盪培養又は通気攪拌培養等で行なわれる。
例えば、１５℃〜４（代）で４０〜１（イ）時間振盪培
養する。培養終了後、培養物より菌体を分離し清澄な培
養上清液を得た。この上清液に例えばタノールの如き有
機溶剤を添加することによりアルカリプロテアーゼＡＰ
Ｉ−２１を沈殿させた。沈”殿したアルカリプロテアー
ゼＡＰＩ−２１を遠心分離し、真空凍結乾燥してアルカ
リプロテアーゼＡＰＩ一２１酵素標品を得る。このよう
にして得られたアルカリプロテアーゼ７Ｖ）Ｉ−２１の
活性は、次のように測定する。
養する。培養終了後、培養物より菌体を分離し清澄な培
養上清液を得た。この上清液に例えばタノールの如き有
機溶剤を添加することによりアルカリプロテアーゼＡＰ
Ｉ−２１を沈殿させた。沈”殿したアルカリプロテアー
ゼＡＰＩ−２１を遠心分離し、真空凍結乾燥してアルカ
リプロテアーゼＡＰＩ一２１酵素標品を得る。このよう
にして得られたアルカリプロテアーゼ７Ｖ）Ｉ−２１の
活性は、次のように測定する。
培養清澄液を０．１Ｍ炭酸ソーダー０．１Ｍホウ酸一塩
化カリウム緩衝液（ＰＨｌＯ．Ｏ）で適当に希釈した液
０．５ｍｔにＰＨｌＯ．Ｏの２％ミルクカゼイン溶液０
．５ｍ１を加えて、３０℃で１０〜３紛酵素反応をさせ
た。酵素反応の終了は０．２Ｍ酢酸−０．２Ｍ酢酸ソー
ダ緩衝液を含む０．１Ｍトリクロル酢酸２ｍ１を加えて
反応を停止させた。３０℃、１紛以上放置後戸紙を用い
て淵過した。
化カリウム緩衝液（ＰＨｌＯ．Ｏ）で適当に希釈した液
０．５ｍｔにＰＨｌＯ．Ｏの２％ミルクカゼイン溶液０
．５ｍ１を加えて、３０℃で１０〜３紛酵素反応をさせ
た。酵素反応の終了は０．２Ｍ酢酸−０．２Ｍ酢酸ソー
ダ緩衝液を含む０．１Ｍトリクロル酢酸２ｍ１を加えて
反応を停止させた。３０℃、１紛以上放置後戸紙を用い
て淵過した。
泊液１ｍ１に０．４Ｍ炭酸ソーダ５ｍ１、５倍希釈のフ
ェノール試薬１ｍ１を添加し、３０ｍＣ１２紛間放置し
て発色させたのち６６扛ｍにおける吸光度を測定する。
なお、酵素単位は国際酵素委員会の「エンザイムノーメ
ンクレイチヤー」に従がい、３００ＣでＰＨｌＯ．Ｏの
１％力ティンを基質とし１秒間チロシン１モル相当量の
６６０ｒ１ｍの発色を示すトリクロル酢酸可溶性物質を
遊離するアルカリプロテアーゼ量を１力タール（Ｋａｔ
ａりとする。次に本発明で得られるアルカリプロテアー
ゼ７Ｖ）Ｉ−２１（以下「本酵素」という）の理化学的
性質について述べる。（１）作用及び基質特異性 タンパク質、例えば力ティン、ヘモグロビン、アルブミ
ン、グロブリン、肉タンパク、魚肉タンパク、大豆タン
パクなどを分解する。
ェノール試薬１ｍ１を添加し、３０ｍＣ１２紛間放置し
て発色させたのち６６扛ｍにおける吸光度を測定する。
なお、酵素単位は国際酵素委員会の「エンザイムノーメ
ンクレイチヤー」に従がい、３００ＣでＰＨｌＯ．Ｏの
１％力ティンを基質とし１秒間チロシン１モル相当量の
６６０ｒ１ｍの発色を示すトリクロル酢酸可溶性物質を
遊離するアルカリプロテアーゼ量を１力タール（Ｋａｔ
ａりとする。次に本発明で得られるアルカリプロテアー
ゼ７Ｖ）Ｉ−２１（以下「本酵素」という）の理化学的
性質について述べる。（１）作用及び基質特異性 タンパク質、例えば力ティン、ヘモグロビン、アルブミ
ン、グロブリン、肉タンパク、魚肉タンパク、大豆タン
パクなどを分解する。
（２）最適ＰＨ第１図から明らかなようにＰＨｌＯ〜１
１に最適ＰＨを有する。
１に最適ＰＨを有する。
なお、相対活性は次のようにして求める。本酵素液５０
μｅに０．５ｍ１の各緩衝液（ＰＨ６〜９は０．１Ｍリ
ン酸−カリウムー０．０５Ｍホウ酸ナトリウムニＰＨ９
〜１１は０．１Ｍ炭酸ナトリウムー０．１Ｍホウ酸一塩
化カリウムニＰＨｌｌ〜１２は０．１Ｍリン酸二ナトリ
ウムー苛性ソーダ）を含む２％のミルクカゼイン溶液を
加えて試験溶液を調製し、前記方法により酵素力価を測
定し、ＰＨｌＯ．Ｏにおける酵素力価を１００％として
相対活性を求める。
μｅに０．５ｍ１の各緩衝液（ＰＨ６〜９は０．１Ｍリ
ン酸−カリウムー０．０５Ｍホウ酸ナトリウムニＰＨ９
〜１１は０．１Ｍ炭酸ナトリウムー０．１Ｍホウ酸一塩
化カリウムニＰＨｌｌ〜１２は０．１Ｍリン酸二ナトリ
ウムー苛性ソーダ）を含む２％のミルクカゼイン溶液を
加えて試験溶液を調製し、前記方法により酵素力価を測
定し、ＰＨｌＯ．Ｏにおける酵素力価を１００％として
相対活性を求める。
（３）安定ＰＨ範囲
第２図から明らかなように本酵素はＰＨ７〜１１．５に
安定ＰＨ範囲を有する。
安定ＰＨ範囲を有する。
この評価は次の方法に従つた。
各種緩衝液ｌ（ＰＨ３〜８は０．１Ｍクエン酸−０．２
Ｍリン酸二ナトリウムニＰＨ８〜１１．０は０．１Ｍ炭
酸ナトリウムー０．１Ｍホウ酸一塩化カリウム；ＰＨｌ
ｌ．Ｏ〜１２．０は０．１５Ｍリン酸二ナトリウムー苛
性ソーダ）に基質として２％ミルクカゼインを添加し試
験液を，調製した。蒸留水により透析した適当希釈の本
酵素を含む酵素液５０μｅに前記種々のＰＨの緩衝液０
．５ｍ１を加えて、３０℃で１紛間加熱した。加熱後、
ＰＨｌＯ．Ｏの０．１Ｍ炭酸塩緩衝液９．５ｍ１を加え
、これを各種ＰＨ処理した酵素とし、前記方法．により
酵素力価を測定し、ＰＨｌＯ．Ｏにおける酵素力価を１
００％として相対活性を求める。本酵素は第２図に示す
ようにＰＨｌＯ〜１１において最も安定で、このＰＨ領
域では完全に活性を保持したままであつた。
Ｍリン酸二ナトリウムニＰＨ８〜１１．０は０．１Ｍ炭
酸ナトリウムー０．１Ｍホウ酸一塩化カリウム；ＰＨｌ
ｌ．Ｏ〜１２．０は０．１５Ｍリン酸二ナトリウムー苛
性ソーダ）に基質として２％ミルクカゼインを添加し試
験液を，調製した。蒸留水により透析した適当希釈の本
酵素を含む酵素液５０μｅに前記種々のＰＨの緩衝液０
．５ｍ１を加えて、３０℃で１紛間加熱した。加熱後、
ＰＨｌＯ．Ｏの０．１Ｍ炭酸塩緩衝液９．５ｍ１を加え
、これを各種ＰＨ処理した酵素とし、前記方法．により
酵素力価を測定し、ＰＨｌＯ．Ｏにおける酵素力価を１
００％として相対活性を求める。本酵素は第２図に示す
ようにＰＨｌＯ〜１１において最も安定で、このＰＨ領
域では完全に活性を保持したままであつた。
また、ＰＨ７〜１１．５では８０．％以上の残存活性を
示す。（４）作用温度の範囲 第３図に示されるように本酵素は５〜６５℃の範囲で力
ティンに作用する。
示す。（４）作用温度の範囲 第３図に示されるように本酵素は５〜６５℃の範囲で力
ティンに作用する。
最適温度は４５〜５０℃である。尚作用温度範囲は前記
と同様ＰＨｌＯ．Ｏで測定を行つた。（５）失活の条件
（温度安定性） 第４図に示されるように、本酵素はＰＨｌＯｓｌＯ分間
基質なしで加熱処理による条件で４０Ｃまでは活性が完
全に保持されるが、５（代）では大部分の活性を失う。
と同様ＰＨｌＯ．Ｏで測定を行つた。（５）失活の条件
（温度安定性） 第４図に示されるように、本酵素はＰＨｌＯｓｌＯ分間
基質なしで加熱処理による条件で４０Ｃまでは活性が完
全に保持されるが、５（代）では大部分の活性を失う。
またＰＨ８、１α珍問の基質なしの加熱処理の条件では
４５℃まで活性は保持されるが５０理ｃで失活が始まり
、６０性Ｃでほぼ完全に失活する。いずれにおいても基
質を添加しないで１０分間放置した場合である。Ｆ）保
存の安定性 本酵素は凍結あるいは凍結乾燥に対して安定である。
４５℃まで活性は保持されるが５０理ｃで失活が始まり
、６０性Ｃでほぼ完全に失活する。いずれにおいても基
質を添加しないで１０分間放置した場合である。Ｆ）保
存の安定性 本酵素は凍結あるいは凍結乾燥に対して安定である。
凍結乾燥標品は室温（２１〜Ｎ゜Ｃ）で２週間放置して
も活性の損失は殆んどなく、同標品をデシケ−ターに入
れ該室温に保存すれば失活は殆んど認められない。１）
阻害および活性化 本酵素はジイソプロピルフルオロリン酸 （ＤＥＰ）やフエニルメタンスルフオニルフルオリド（
ＰＭＳＦ）などプロテアーゼの活性セリン残基阻害剤に
よつて著しく阻害される。
も活性の損失は殆んどなく、同標品をデシケ−ターに入
れ該室温に保存すれば失活は殆んど認められない。１）
阻害および活性化 本酵素はジイソプロピルフルオロリン酸 （ＤＥＰ）やフエニルメタンスルフオニルフルオリド（
ＰＭＳＦ）などプロテアーゼの活性セリン残基阻害剤に
よつて著しく阻害される。
しかし、本酵素は動物のセリンプロテアーゼであるキモ
トリプシンの阻害剤であるトシルーフエニルアラニンー
クロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）あるいはトリプシンの
阻害剤であるトシルーリシンークロロメチルケトン（Ｔ
ＬＣＫ）によつては全く阻害されない。しかし、本酵素
はベンジルオキシカルボニルーフエニルアラニンークロ
ロメチルケトン（ＺＰＣＫ）によつて阻害を受ける。ま
た、本酵素はパラクロローマーキユリベンゾエート（Ｐ
ＣＭＢ）の添加によつて活性は全く影響を受けないし、
またエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）の
添加によつても活性は何ら影響されない。
トリプシンの阻害剤であるトシルーフエニルアラニンー
クロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）あるいはトリプシンの
阻害剤であるトシルーリシンークロロメチルケトン（Ｔ
ＬＣＫ）によつては全く阻害されない。しかし、本酵素
はベンジルオキシカルボニルーフエニルアラニンークロ
ロメチルケトン（ＺＰＣＫ）によつて阻害を受ける。ま
た、本酵素はパラクロローマーキユリベンゾエート（Ｐ
ＣＭＢ）の添加によつて活性は全く影響を受けないし、
またエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）の
添加によつても活性は何ら影響されない。
更に、本酵素はペプスタチンを添加しても活性には何ら
影響しない。以上の阻害剤の実験結果より、本酵素は活
性中心にセリン残基をもつセリンプロテアーゼであるこ
とが明白である。８）力価の測定法 前記の如くである。
影響しない。以上の阻害剤の実験結果より、本酵素は活
性中心にセリン残基をもつセリンプロテアーゼであるこ
とが明白である。８）力価の測定法 前記の如くである。
９）分子量
ゲルｐ過法〔セフアデツクス（登録商標）Ｇ一７厳用、
ＰＨｌＯにて測定〕による本酵素の分子量は、約２２０
００である。
ＰＨｌＯにて測定〕による本酵素の分子量は、約２２０
００である。
１１等電点
エレクトロフォーカシング法による本酵素（上記の分子
量約２２０００のゲル枦過の活性分画）の等電点は７．
４である。
量約２２０００のゲル枦過の活性分画）の等電点は７．
４である。
紫外線吸収スペクトル
２７５乃至２８２μｍｌこ極大吸収が存する。
赤外線吸収スペクトルは第５図に示す通りである。（１
１）元素分析 本酵素の如き高分子物質で元素分析を行い、炭素、水素
、窒素及び酸素の比を算出しても、その特性を示すこと
は不可能であるため、元素分析の測定は行つていない。
１）元素分析 本酵素の如き高分子物質で元素分析を行い、炭素、水素
、窒素及び酸素の比を算出しても、その特性を示すこと
は不可能であるため、元素分析の測定は行つていない。
（１２）アミノ酸組成本酵素のアミノ酸組成を、システ
イン／シスチン及びトリプトファンを除いて、４“Ｍｅ
ｔｈＯｄｓｉｎＥｎｚｙｍＯｌＯｇｙ′５■０１．ＸＩ
１１９６７、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ．ｓＮｅｗＹ
Ｏｒｋ）に記載の方法に従つて酵素の酸加水分解によつ
て、システイン／シスチンは過蟻酸による分解分析及び
トリプトファンはアルカリ分解分析によつて、求めた結
果から算出して以下の表に示した。
イン／シスチン及びトリプトファンを除いて、４“Ｍｅ
ｔｈＯｄｓｉｎＥｎｚｙｍＯｌＯｇｙ′５■０１．ＸＩ
１１９６７、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ．ｓＮｅｗＹ
Ｏｒｋ）に記載の方法に従つて酵素の酸加水分解によつ
て、システイン／シスチンは過蟻酸による分解分析及び
トリプトファンはアルカリ分解分析によつて、求めた結
果から算出して以下の表に示した。
この表にはまだ文献記載の他のアルカリプロテアーゼの
組成も掲げた。これらの結果から明らかなように、本発
明の酵素と他の酵素との間には、例えばセリン、アルギ
ニン、リシン、バリン、アラニン、トリプトファン、プ
ロリンなどのアミノ酸組成において顕著な相違がある。
＊（１）Ｊ．ＢｌＯｌ．Ｃｈｅｍ．、ダ本５２９氏（１
９関）米（２）Ｊ．ＢｉＯｌ．Ｃｈｅｍ．、２３３ｓ２
１３４ｓ（１９錦）以上の結果から明らかなように、本
酵素は特に）低温において活性を保持し、高温（５０Ｃ
以上）では容易に失活しＰＨｌＯ〜１１に最適ＰＨを有
する。
組成も掲げた。これらの結果から明らかなように、本発
明の酵素と他の酵素との間には、例えばセリン、アルギ
ニン、リシン、バリン、アラニン、トリプトファン、プ
ロリンなどのアミノ酸組成において顕著な相違がある。
＊（１）Ｊ．ＢｌＯｌ．Ｃｈｅｍ．、ダ本５２９氏（１
９関）米（２）Ｊ．ＢｉＯｌ．Ｃｈｅｍ．、２３３ｓ２
１３４ｓ（１９錦）以上の結果から明らかなように、本
酵素は特に）低温において活性を保持し、高温（５０Ｃ
以上）では容易に失活しＰＨｌＯ〜１１に最適ＰＨを有
する。
このような理化学的性質を有する本発明の酵素を、公知
の類似のアルカリプロテアーゼと比較検討した。； 従
来、グラム陽性細菌の細胞外アルカリプロテアーゼにつ
いては、バチルスリツケニフオルミス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｌｌｃｈｅｎｉｆＯｒｍｉｓ）の生産するアルカリプ
ロテアーゼ、バチルスズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ）の生産するアルカリプロテアーゼ（ズ
ｊブチリシンノボ）等が周知である。これらの各酵素は
ともに分子量が約２７０００〜３００００ｓ等電点９〜
１１の理化学的性質を有し、活性中心にセリン残基をも
つセリンプロテアーゼである。
の類似のアルカリプロテアーゼと比較検討した。； 従
来、グラム陽性細菌の細胞外アルカリプロテアーゼにつ
いては、バチルスリツケニフオルミス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｌｌｃｈｅｎｉｆＯｒｍｉｓ）の生産するアルカリプ
ロテアーゼ、バチルスズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ）の生産するアルカリプロテアーゼ（ズ
ｊブチリシンノボ）等が周知である。これらの各酵素は
ともに分子量が約２７０００〜３００００ｓ等電点９〜
１１の理化学的性質を有し、活性中心にセリン残基をも
つセリンプロテアーゼである。
そのほかに報告されているバチルスの生産する細胞外ア
ルカリプロテアーゼも分子量が２５０００〜３００００
ｓ等電点が９〜１１の範囲を有するものが多い。そして
以上の大部分はＰＨｌへ５ＣｆＣ１１０分間の熱処理で
は失活しない性質のものである。バチルスの生産する低
い分子量を有するアルカリプロテアーゼとしては、バチ
ルスＮＯ．Ｄ−６のアルカリプロテアーゼＥ−１、Ｅ−
２が公知であるが、両者は共に分子量２００００の酵素
であり、共にＰＨ９．Ｏｓ５Ｏ′Ｃの熱処理をしても活
性は全く低下しない（特公昭５６−４２３６）。更に他
のバチルスの生産するアルカリプロテアーゼとして、バ
チルスアルカロフイルスＮＣＩＢｌＯ４３６菌アルカリ
プロテアーゼ、同１０４羽菌アルカリプロテアーゼが知
られているが、これらはいずれも第１表に示すように州
１０ｓ５ＣｆＣ１１紛間の熱処理において９０％内外の
活性を保持する。更に前述のバチルスリツケニフオルミ
ス菌のアルカリプロテアーゼやバチルスズブチリス菌の
アルカリプロテアーゼはＰＨｌＯ、５０Ｃ１１紛間の熱
処理で７０〜８０％の活性を有する（第１表）。このよ
うに、従来公知のバチルスズブチリスをはじめバチルス
属細菌の生産するアルカリプロテアーゼは比較的高い温
度領域で安定である。しかるに、本発明の酵素は先にそ
の理化学的性質について述べたようにＰＨｌへ１紛間加
熱処理で４０℃以下では安定であるが、５（代）で大部
分の酵素活性を失う特徴を有する。またＰＨ８、１紛間
加熱処理では５０Ｃ附近で失活が始まり、ω゜Ｃで活性
は殆んど失われる。このような特徴的な温度安定性、お
よび前述の分子量、等電点並びにアミノ酸組成等の諸性
質からみて、本酵素は従来知られたバチルス属細菌の生
産するアルカリプロテアーゼのいずれとも異なる別種の
もので文献未記載である。
ルカリプロテアーゼも分子量が２５０００〜３００００
ｓ等電点が９〜１１の範囲を有するものが多い。そして
以上の大部分はＰＨｌへ５ＣｆＣ１１０分間の熱処理で
は失活しない性質のものである。バチルスの生産する低
い分子量を有するアルカリプロテアーゼとしては、バチ
ルスＮＯ．Ｄ−６のアルカリプロテアーゼＥ−１、Ｅ−
２が公知であるが、両者は共に分子量２００００の酵素
であり、共にＰＨ９．Ｏｓ５Ｏ′Ｃの熱処理をしても活
性は全く低下しない（特公昭５６−４２３６）。更に他
のバチルスの生産するアルカリプロテアーゼとして、バ
チルスアルカロフイルスＮＣＩＢｌＯ４３６菌アルカリ
プロテアーゼ、同１０４羽菌アルカリプロテアーゼが知
られているが、これらはいずれも第１表に示すように州
１０ｓ５ＣｆＣ１１紛間の熱処理において９０％内外の
活性を保持する。更に前述のバチルスリツケニフオルミ
ス菌のアルカリプロテアーゼやバチルスズブチリス菌の
アルカリプロテアーゼはＰＨｌＯ、５０Ｃ１１紛間の熱
処理で７０〜８０％の活性を有する（第１表）。このよ
うに、従来公知のバチルスズブチリスをはじめバチルス
属細菌の生産するアルカリプロテアーゼは比較的高い温
度領域で安定である。しかるに、本発明の酵素は先にそ
の理化学的性質について述べたようにＰＨｌへ１紛間加
熱処理で４０℃以下では安定であるが、５（代）で大部
分の酵素活性を失う特徴を有する。またＰＨ８、１紛間
加熱処理では５０Ｃ附近で失活が始まり、ω゜Ｃで活性
は殆んど失われる。このような特徴的な温度安定性、お
よび前述の分子量、等電点並びにアミノ酸組成等の諸性
質からみて、本酵素は従来知られたバチルス属細菌の生
産するアルカリプロテアーゼのいずれとも異なる別種の
もので文献未記載である。
よつて、本酵素を新規酵素と認定し、アルカリプロテア
ーゼＮ１−２１と命名した。本発明の新規な酵素「ＡＰ
Ｉ−２１」は、以上述べたようにＰＨ７〜１１．５で安
定で、ＰＨｌＯ〜１１位で最適活性を示すところより洗
剤ビルダーと混用可能である。
ーゼＮ１−２１と命名した。本発明の新規な酵素「ＡＰ
Ｉ−２１」は、以上述べたようにＰＨ７〜１１．５で安
定で、ＰＨｌＯ〜１１位で最適活性を示すところより洗
剤ビルダーと混用可能である。
従つて洗剤用酵素として効果的である。特に本酵素「Ａ
ＰＩ−２月は従来の洗剤用酵素に比し、比較的低温（２
０〜３０℃）でも高い相対活性を維持する。従つて、我
国におけるように室温水で洗濯する習慣を有する国にお
いて、本酵素は一般家庭用洗剤の助剤として使用するア
ルカリプロテアーゼとして、最も好ましいタイプのもの
である。また近時においては、生活廃棄物あるいは生活
廃水中にタンパク質が増加する傾向にあるが、これら廃
棄物処理あるいは汚水処理の段階で、本酵素を利用する
ことによりタンパク質の迅速な分解を促がし窒素資源の
循環再利用が可能である。また、食品加工など食品工業
へのプロテアーゼの利用に際しては、本酵素を利用する
ことにより、加工利用後５０〜６０℃程度の比較的低い
温度処理によつて簡単に酵素活性を失活させることがで
きる。従つて、本酵素はまた加工食品の品質管理上、効
果的な酵素である。次に本発明の実施例について説明す
る。
ＰＩ−２月は従来の洗剤用酵素に比し、比較的低温（２
０〜３０℃）でも高い相対活性を維持する。従つて、我
国におけるように室温水で洗濯する習慣を有する国にお
いて、本酵素は一般家庭用洗剤の助剤として使用するア
ルカリプロテアーゼとして、最も好ましいタイプのもの
である。また近時においては、生活廃棄物あるいは生活
廃水中にタンパク質が増加する傾向にあるが、これら廃
棄物処理あるいは汚水処理の段階で、本酵素を利用する
ことによりタンパク質の迅速な分解を促がし窒素資源の
循環再利用が可能である。また、食品加工など食品工業
へのプロテアーゼの利用に際しては、本酵素を利用する
ことにより、加工利用後５０〜６０℃程度の比較的低い
温度処理によつて簡単に酵素活性を失活させることがで
きる。従つて、本酵素はまた加工食品の品質管理上、効
果的な酵素である。次に本発明の実施例について説明す
る。
実施例１
本発明の新菌株ＮＫＳ−２１号菌を用い、この菌株の斜
面培養物を殺菌水に懸濁させ、その０．５ｍ１を種菌と
した。
面培養物を殺菌水に懸濁させ、その０．５ｍ１を種菌と
した。
酵素生産培地に力ティン１％、ミートエキス１％、ポリ
ペプトン１％、および炭酸水素ナトリウム１％からなる
培地を水酸化ナトリウムにてＰＨ９．５あるいは７．２
に調整した。
ペプトン１％、および炭酸水素ナトリウム１％からなる
培地を水酸化ナトリウムにてＰＨ９．５あるいは７．２
に調整した。
５ロータリーシエイカーによる振盪培養
（４）においては、いずれもＰＨ９．５に調整した上記
培地を１ｅ容のエルレンマイヤーフラスコ中に１００ｎ
ｔ１２００ｍ１、３００ｍ１入れ殺起後、種菌０．５ｍ
１を添加し２０±１℃の温度で２００ｒ′Ｐｍの振盪条
件でＮＫＳ−２１号菌を４１、６５ｓ８９の各時間培養
しアルカリプロテアーゼＮ］−２１を生産させた。一方
、往復振盪培養（Ｂ）においては、上記培地をＰＨ９．
５あるいはＰＨ７．２に調整した培地１００ｍ１を５０
０ｍ１容の坂ロフラスコに入れ殺菌後、種菌０．５ｍ１
を接・種し３（代）で往復振盪培養をした。
（４）においては、いずれもＰＨ９．５に調整した上記
培地を１ｅ容のエルレンマイヤーフラスコ中に１００ｎ
ｔ１２００ｍ１、３００ｍ１入れ殺起後、種菌０．５ｍ
１を添加し２０±１℃の温度で２００ｒ′Ｐｍの振盪条
件でＮＫＳ−２１号菌を４１、６５ｓ８９の各時間培養
しアルカリプロテアーゼＮ］−２１を生産させた。一方
、往復振盪培養（Ｂ）においては、上記培地をＰＨ９．
５あるいはＰＨ７．２に調整した培地１００ｍ１を５０
０ｍ１容の坂ロフラスコに入れ殺菌後、種菌０．５ｍ１
を接・種し３（代）で往復振盪培養をした。
所定の時間培養した培養物を２８０００Ｇ１１紛間遠心
分離をし菌体を分離し清澄な培養液上清液を得た。
分離をし菌体を分離し清澄な培養液上清液を得た。
得られたそれぞれの培養上清液中のアルカリプロテアー
ゼ活性を前記プロテアーゼ活性測定法に従つて測定し、
次の結果を得た。Ａ：ロータリ振盪培養法（２０℃、培
地の初発ＰＨ９．５）以上の結果、本酵素生産のための
小規模培養においては、１ｅ容エルレンマイヤーフラス
コ中に３００ｍ１の上記培地を入れ、２０℃でロータリ
ーシエカーにより振盪培養（４）するとら時間で最高の
比活性ならびに最高のプロテアーゼ生産量が得られた。
ゼ活性を前記プロテアーゼ活性測定法に従つて測定し、
次の結果を得た。Ａ：ロータリ振盪培養法（２０℃、培
地の初発ＰＨ９．５）以上の結果、本酵素生産のための
小規模培養においては、１ｅ容エルレンマイヤーフラス
コ中に３００ｍ１の上記培地を入れ、２０℃でロータリ
ーシエカーにより振盪培養（４）するとら時間で最高の
比活性ならびに最高のプロテアーゼ生産量が得られた。
ＮＫＳ−２１号菌を３０℃で往復振盪培養（Ｂ）すると
き、培地の初発はＰＨが９．５のみならずＰＨ７．２で
もＮＫＳ−２１号菌の生育は良好であり、そしてまたア
ルカリプロテアーゼＡＰｌ−２１の生産も高い結果が得
られた。
き、培地の初発はＰＨが９．５のみならずＰＨ７．２で
もＮＫＳ−２１号菌の生育は良好であり、そしてまたア
ルカリプロテアーゼＡＰｌ−２１の生産も高い結果が得
られた。
培地の初発ＰＨが９．５のみならず、ＰＨ７．２でＮＫ
Ｓ−２１号菌を培養する場合、培養温度は２０′Ｃの往
復振盪培養でも、３０℃培養の場合と類似の結果が得ら
れた。上記のような操作により得たＮＫＳ−２１号菌の
培養後の遠心分離上清液７ｅを３℃に冷却し、これに予
め３℃に冷却しておいたエチルアルコールを加え生成し
た沈殿を冷却遠心分離機で１１００？で遠心分離し、た
だちに真空凍結乾燥させ酵素粉末１５．７ｙを得た。
Ｓ−２１号菌を培養する場合、培養温度は２０′Ｃの往
復振盪培養でも、３０℃培養の場合と類似の結果が得ら
れた。上記のような操作により得たＮＫＳ−２１号菌の
培養後の遠心分離上清液７ｅを３℃に冷却し、これに予
め３℃に冷却しておいたエチルアルコールを加え生成し
た沈殿を冷却遠心分離機で１１００？で遠心分離し、た
だちに真空凍結乾燥させ酵素粉末１５．７ｙを得た。
タンパク質１ｙ当りのアルカリプロテアーゼの比活性は
０．７１マイクロカタール（４）．７１ｐＫａｔａ１／
Ｋ９・タンパク質）であり、回収率はお％であつた。タ
ンパク質はローリー法により測定した。このようにして
調製した凍結乾燥酵素標品を０．２Ｍ食塩を含む０．０
１Ｍ炭酸ナトリウム−ホウ酸一塩化カリウム緩衝液（Ｐ
ＨｌＯ．Ｏ）に溶解し、同緩衝液で平衡化したセフアデ
ツクスＧ−７５のカラム（２Ｃ７ｊ！×７４０）により
ゲルｔ過を行ない、溶出液を３ｍ１ずつ分画した。
０．７１マイクロカタール（４）．７１ｐＫａｔａ１／
Ｋ９・タンパク質）であり、回収率はお％であつた。タ
ンパク質はローリー法により測定した。このようにして
調製した凍結乾燥酵素標品を０．２Ｍ食塩を含む０．０
１Ｍ炭酸ナトリウム−ホウ酸一塩化カリウム緩衝液（Ｐ
ＨｌＯ．Ｏ）に溶解し、同緩衝液で平衡化したセフアデ
ツクスＧ−７５のカラム（２Ｃ７ｊ！×７４０）により
ゲルｔ過を行ない、溶出液を３ｍ１ずつ分画した。
タンパク質はローリー法により、アルカリプロテアーゼ
活性は上述のようにＰＨｌＯで測定した。以上の操作に
より精製酵素を得た。比活性は約１皓上昇し、タンパク
質１ｙ当たりの比活性は７．０マイクロカタールであつ
た。回収率は７０％であつた。実施例２ アルカリプロテアーゼ生産菌ＮＫＳ−２１号菌を用い、
５００ｅ発酵タンクによりアルカリプロテア９−ゼ７Ｖ
）Ｉ−２１生産とそれに続く酵素剤の製造を行なつた。
活性は上述のようにＰＨｌＯで測定した。以上の操作に
より精製酵素を得た。比活性は約１皓上昇し、タンパク
質１ｙ当たりの比活性は７．０マイクロカタールであつ
た。回収率は７０％であつた。実施例２ アルカリプロテアーゼ生産菌ＮＫＳ−２１号菌を用い、
５００ｅ発酵タンクによりアルカリプロテア９−ゼ７Ｖ
）Ｉ−２１生産とそれに続く酵素剤の製造を行なつた。
酵素生産培地は力ティン１％、ミートエキス１％、ポリ
ペプトン１％、炭酸水素ナトリウム１％からなる培地を
、水酸化ナトリウムによりＰＨ９．５に調整した。上記
の培地をまず１ｅ容のエダルレンマイヤーフラスコに３
００ｍ１添加し殺菌後、実施例１で述べた如く種菌０．
５ｍ１を加え、２（代）で３日間培養した。この培養液
３００ｍ１を予め上記の培地１０ｅを含む殺菌した３０
ｅジヤーフアメンター中に添加し、２０℃で３日間通気
攪拌培養をした。）攪拌は４００ｒ′Ｐｍｌ通気は１２
ｅ／分であつた。３０ｅ容ジヤーフアメンターで３日培
養した培養液１０ｅを無菌的に予め殺菌した２２０′の
上記培地を含む５００ｅ容の発酵タンクに移し、２０℃
で４日間の通気攪拌培養をした。
ペプトン１％、炭酸水素ナトリウム１％からなる培地を
、水酸化ナトリウムによりＰＨ９．５に調整した。上記
の培地をまず１ｅ容のエダルレンマイヤーフラスコに３
００ｍ１添加し殺菌後、実施例１で述べた如く種菌０．
５ｍ１を加え、２（代）で３日間培養した。この培養液
３００ｍ１を予め上記の培地１０ｅを含む殺菌した３０
ｅジヤーフアメンター中に添加し、２０℃で３日間通気
攪拌培養をした。）攪拌は４００ｒ′Ｐｍｌ通気は１２
ｅ／分であつた。３０ｅ容ジヤーフアメンターで３日培
養した培養液１０ｅを無菌的に予め殺菌した２２０′の
上記培地を含む５００ｅ容の発酵タンクに移し、２０℃
で４日間の通気攪拌培養をした。
攪拌は４００ｒｐｍ１通気は２００ｅ／分であつた。培
養終了後、培養物を冷却連続遠心分離機により１１００
０Ｃで遠心分離し菌体を除去し清澄な培養上清液２００
１を得た。培養上清液を３℃に冷却し、これに予め３゜
Ｃに冷却した２倍量のエチルアルコールを加えアルカリ
プロテアーゼ，ＡＰＩ−２１を沈殿させた。沈殿したア
ルカリプロテアーゼＡＰＩ−２１は冷却連続遠心分離機
で約１１０００Ｇで遠心分離し、直ちに真空凍結乾燥を
し、次に示す凍結乾燥アルカリプロテアーゼＡＰＩ一２
１酵素標品を得た。回収酵素重量（ｙ）
１２３０比活性（マイクロカタール／ｙ）
０．５２回収率（％）
７０上記で得た酵素標品を実施例１に従つて精製したと
ころ、分子量２２０００ｓ等電点７．４のアルカリプロ
テアーゼが得られた。
養終了後、培養物を冷却連続遠心分離機により１１００
０Ｃで遠心分離し菌体を除去し清澄な培養上清液２００
１を得た。培養上清液を３℃に冷却し、これに予め３゜
Ｃに冷却した２倍量のエチルアルコールを加えアルカリ
プロテアーゼ，ＡＰＩ−２１を沈殿させた。沈殿したア
ルカリプロテアーゼＡＰＩ−２１は冷却連続遠心分離機
で約１１０００Ｇで遠心分離し、直ちに真空凍結乾燥を
し、次に示す凍結乾燥アルカリプロテアーゼＡＰＩ一２
１酵素標品を得た。回収酵素重量（ｙ）
１２３０比活性（マイクロカタール／ｙ）
０．５２回収率（％）
７０上記で得た酵素標品を実施例１に従つて精製したと
ころ、分子量２２０００ｓ等電点７．４のアルカリプロ
テアーゼが得られた。
このアルカリプロテアーゼの酵素標品は、ＰＨｌＯで５
（代）、１紛間の熱処理により不安定な、低温活性型の
本発明のアルカリプロテアーゼＮ］−２１であつた。図
面の簡単な説明第１図は本発明の酵素の最適ＰＨを示す
グラフであり、第２図は本発明の酵素のＰＨ安定性を示
すグラフであり、第３図は本発明の酵素の作用温度範囲
および最適温度を示すグラフであり、第４図イおよび第
４図口は、それぞれ本発明の酵素のＰＨｌＯおよびＰＨ
８における温度安定性を示すグラフである。
（代）、１紛間の熱処理により不安定な、低温活性型の
本発明のアルカリプロテアーゼＮ］−２１であつた。図
面の簡単な説明第１図は本発明の酵素の最適ＰＨを示す
グラフであり、第２図は本発明の酵素のＰＨ安定性を示
すグラフであり、第３図は本発明の酵素の作用温度範囲
および最適温度を示すグラフであり、第４図イおよび第
４図口は、それぞれ本発明の酵素のＰＨｌＯおよびＰＨ
８における温度安定性を示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記の（１）ないし（３）の理化学的性質を有する
アルカリプロテアーゼＡＰＩ−２１。 （１）作用 最適ｐＨ範囲が１０〜１１であるアルカリ性領域でカゼ
インを加水分解し、その最適作用温度が４５〜５０℃で
ある。 （２）安定性 ｐＨ１０、１０分間の加熱処理による酵素活性の低下は
、４０℃まで認められないが、５０℃ではその９０％以
上の活性が失われ、ｐＨ８、１０分間の加熱処理の場合
５０℃で失活が始まり、６０℃ではほぼ完全に失活する
。 アルカリ性（特にｐＨ７〜１１．５）で安定であり、凍
結ならびに凍結乾燥に対して安定である。（３）酵素分
子 ゲル濾過法にて測定した分子量が２２０００；等電点が
７．４；紫外線吸収スペクトルが２７５乃至２８２ｎｍ
に極大吸収を有し；第５図に示す赤外線吸収スペクトル
を有し；活性中心にセリン残基を有する蛋白質である。 ２ バチルス属に属しアルカリプロテアーゼＡＰＩ−２
１を生産する新菌種バチルス属ＮＫＳ−２１号菌をアル
カリ性培地に接種して培養し、培養物よりアルカリ側に
最適ｐＨを有するアルカリプロテアーゼＡＰＩ−２１を
採取することを特徴とする新規なアルカリプロテアーゼ
ＡＰＩ−２１の製造方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57017596A JPS6055118B2 (ja) | 1982-02-08 | 1982-02-08 | 新規な細菌アルカリプロテア−ゼ及びその製造方法 |
| GB08302815A GB2116561B (en) | 1982-02-08 | 1983-02-02 | Novel alkaline protease and preparation method thereof |
| AU10970/83A AU556045B2 (en) | 1982-02-08 | 1983-02-03 | Alkaline protease api-21 from bacillus |
| CA000420937A CA1193213A (en) | 1982-02-08 | 1983-02-04 | Alkaline protease and preparation method thereof |
| FR8302276A FR2521163B1 (fr) | 1982-02-08 | 1983-02-08 | Nouvelle protease alcaline et son procede de preparation |
| US06/465,064 US4480037A (en) | 1982-02-08 | 1983-02-08 | Alkaline protease and preparation method thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57017596A JPS6055118B2 (ja) | 1982-02-08 | 1982-02-08 | 新規な細菌アルカリプロテア−ゼ及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58134990A JPS58134990A (ja) | 1983-08-11 |
| JPS6055118B2 true JPS6055118B2 (ja) | 1985-12-03 |
Family
ID=11948266
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57017596A Expired JPS6055118B2 (ja) | 1982-02-08 | 1982-02-08 | 新規な細菌アルカリプロテア−ゼ及びその製造方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4480037A (ja) |
| JP (1) | JPS6055118B2 (ja) |
| AU (1) | AU556045B2 (ja) |
| CA (1) | CA1193213A (ja) |
| FR (1) | FR2521163B1 (ja) |
| GB (1) | GB2116561B (ja) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6084397A (ja) * | 1983-10-17 | 1985-05-13 | 花王株式会社 | 洗浄剤組成物 |
| US4797362A (en) * | 1985-06-06 | 1989-01-10 | Lion Corporation | Alkaline proteases and microorganisms producing same |
| US4771003A (en) * | 1985-10-22 | 1988-09-13 | Genex Corporation | Heat stable alkaline proteases produced by a bacillus |
| US4764470A (en) * | 1986-02-05 | 1988-08-16 | Genex Corporation | Alkaline protease produced by a bacillus |
| DK386586D0 (da) * | 1986-08-14 | 1986-08-14 | Novo Industri As | Protease, fremgangsmaade til fremstilling deraf og anvendelse deraf |
| GB8629536D0 (en) * | 1986-12-10 | 1987-01-21 | Unilever Plc | Enzymatic detergent composition |
| AU620026B2 (en) | 1987-02-27 | 1992-02-13 | Genencor International, Inc. | Molecular cloning and expression of genes encoding proteolytic enzymes |
| US4865983A (en) * | 1987-12-04 | 1989-09-12 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Cleaning compositions containing protease produced by vibrio and method of use |
| PT89702B (pt) | 1988-02-11 | 1994-04-29 | Gist Brocades Nv | Processo para a preparacao de novos enzimas proteoliticos e de detergentes que os contem |
| US6287841B1 (en) | 1988-02-11 | 2001-09-11 | Genencor International, Inc. | High alkaline serine protease |
| US5041377A (en) * | 1988-03-18 | 1991-08-20 | Genencor International Inc. | Subtilisin crystallization process |
| DE3834550A1 (de) * | 1988-10-11 | 1990-04-19 | Basf Ag | Proteolytisches enzym, seine herstellung und verwendung |
| US5236839A (en) * | 1989-04-08 | 1993-08-17 | Juhyun Yu | Microbial cell wall lytic enzyme from Bacillus FERM BP-2841 |
| EP0414297B1 (en) * | 1989-08-11 | 1996-10-16 | Gist-Brocades N.V. | Efficient production of mutant proteases |
| DK246290D0 (da) * | 1990-10-12 | 1990-10-12 | Novo Nordisk As | Nyt enzym |
| MY107664A (en) * | 1991-01-17 | 1996-05-30 | Kao Corp | Novel alkaline proteinase and process for producing the same |
| WO1992017579A1 (en) * | 1991-03-29 | 1992-10-15 | Genencor International, Inc. | Alkaline protease 3733, its production and use in cleaning contact lens |
| DK58391D0 (da) * | 1991-04-03 | 1991-04-03 | Novo Nordisk As | Hidtil ukendte proteaser |
| DK58491D0 (da) * | 1991-04-03 | 1991-04-03 | Novo Nordisk As | Hidtil ukendte proteaser |
| CA2066556A1 (en) * | 1991-04-26 | 1992-10-27 | Toyoji Sawayanagi | Alkaline protease, method for producing the same, use thereof and microorganism producing the same |
| DK28792D0 (da) * | 1992-03-04 | 1992-03-04 | Novo Nordisk As | Nyt enzym |
| DE69333463D1 (de) * | 1992-05-18 | 2004-05-06 | Genencor Int | Alkalische Proteasen produzierende Bakterien, und Verfahren zur Herstellung dieser alkalischen Proteasen |
| US5621089A (en) * | 1992-05-27 | 1997-04-15 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Nucleic acid constructs for the production of a Bacillus alkaline protease |
| DK70292D0 (da) * | 1992-05-27 | 1992-05-27 | Novo Nordisk As | Nyt enzym |
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| WO1994006915A1 (en) * | 1992-09-24 | 1994-03-31 | Genencor International, Inc. | Cleaning compositions containing novel alkaline proteases |
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| US3723250A (en) * | 1967-10-03 | 1973-03-27 | Novo Terapeutisk Labor As | Proteolytic enzymes, their production and use |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2026092C3 (de) * | 1969-05-31 | 1979-04-12 | Rikagaku Kenkyusho, Saitama (Japan) | Verfahren zur Herstellung einer alkalischen Protease |
| GB1263765A (en) * | 1969-11-18 | 1972-02-16 | Godo Shusei Kabushika Kaisha | A method for the production of protease by cultivating bacteria |
| GB1395895A (en) * | 1971-05-28 | 1975-05-29 | Novo Terapeutisk Labor As | Enzyme products |
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| JPS5039151B2 (ja) * | 1972-09-02 | 1975-12-15 | ||
| GB1519148A (en) * | 1974-11-19 | 1978-07-26 | Gist Brocades Nv | Compositions of matter |
-
1982
- 1982-02-08 JP JP57017596A patent/JPS6055118B2/ja not_active Expired
-
1983
- 1983-02-02 GB GB08302815A patent/GB2116561B/en not_active Expired
- 1983-02-03 AU AU10970/83A patent/AU556045B2/en not_active Expired
- 1983-02-04 CA CA000420937A patent/CA1193213A/en not_active Expired
- 1983-02-08 US US06/465,064 patent/US4480037A/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-02-08 FR FR8302276A patent/FR2521163B1/fr not_active Expired
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3723250A (en) * | 1967-10-03 | 1973-03-27 | Novo Terapeutisk Labor As | Proteolytic enzymes, their production and use |
Also Published As
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|---|---|
| US4480037A (en) | 1984-10-30 |
| GB2116561B (en) | 1985-06-12 |
| GB2116561A (en) | 1983-09-28 |
| AU556045B2 (en) | 1986-10-23 |
| JPS58134990A (ja) | 1983-08-11 |
| CA1193213A (en) | 1985-09-10 |
| GB8302815D0 (en) | 1983-03-09 |
| FR2521163B1 (fr) | 1985-09-06 |
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