JPH10248564A - ケラチン分解能を有するプロテアーゼＥＫ３および細菌Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ＥＫ３株 - Google Patents
ケラチン分解能を有するプロテアーゼＥＫ３および細菌Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ＥＫ３株Info
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- JPH10248564A JPH10248564A JP9059491A JP5949197A JPH10248564A JP H10248564 A JPH10248564 A JP H10248564A JP 9059491 A JP9059491 A JP 9059491A JP 5949197 A JP5949197 A JP 5949197A JP H10248564 A JPH10248564 A JP H10248564A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
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- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ケラチン分解能を有するプロテアーゼの提
供。 【解決手段】 下記の理化学的性質を有するプロテアー
ゼ。(a) 作用及び基質特異性：カゼイン並びにヒト及び
動物の毛髪由来のケラチンを分解する。カゼイン分解活
性よりもケラチン分解活性の方が高い。(b) 至適ｐＨ：
ｐＨ１０．０のアルカリ条件で最大活性を示す。ｐＨ７
の中性付近で、約６０％の活性を有する。(c) ｐＨ安定
性：温度３０℃の条件下で１時間保持した場合、ｐＨ１
０ではほとんど失活せず、ｐＨ６〜９で約７０％の活性
を有する。
供。 【解決手段】 下記の理化学的性質を有するプロテアー
ゼ。(a) 作用及び基質特異性：カゼイン並びにヒト及び
動物の毛髪由来のケラチンを分解する。カゼイン分解活
性よりもケラチン分解活性の方が高い。(b) 至適ｐＨ：
ｐＨ１０．０のアルカリ条件で最大活性を示す。ｐＨ７
の中性付近で、約６０％の活性を有する。(c) ｐＨ安定
性：温度３０℃の条件下で１時間保持した場合、ｐＨ１
０ではほとんど失活せず、ｐＨ６〜９で約７０％の活性
を有する。
Description
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、低温およびアルカリ条件下でケラチン分解能
を有するプロテアーゼ及びその用途ならびにプロテアー
ゼを産生する微生物に関する。
を有するプロテアーゼ及びその用途ならびにプロテアー
ゼを産生する微生物に関する。
【０００２】背景技術 ケラチンなどの不溶性タンパク質を分解するプロテアー
ゼとしては、従来からケラチナーゼが知られている。こ
れらはいずれもカゼインなどの水溶性タンパク質を分解
する活性が高く、ケラチンに特異的に作用するプロテア
ーゼは本発明者らが知る限り報告されていない。
ゼとしては、従来からケラチナーゼが知られている。こ
れらはいずれもカゼインなどの水溶性タンパク質を分解
する活性が高く、ケラチンに特異的に作用するプロテア
ーゼは本発明者らが知る限り報告されていない。
【０００３】一方、低温細菌は、古くから知られてお
り、その存在は低温の環境下で広く確認されている。土
壌、魚介類、乳製品に加え、人為的にコントロールされ
た低温環境などからも見いだされている。食品微生物学
によって低温性細菌の研究が進んでいたが、これは系統
学にもとづくものであり、生態や機能などに関したもの
ではなかった。
り、その存在は低温の環境下で広く確認されている。土
壌、魚介類、乳製品に加え、人為的にコントロールされ
た低温環境などからも見いだされている。食品微生物学
によって低温性細菌の研究が進んでいたが、これは系統
学にもとづくものであり、生態や機能などに関したもの
ではなかった。
【０００４】低温細菌から得られる酵素は、低温に最適
温度を持つ低温酵素であることが期待される。この低温
酵素はたとえば衣料用洗剤に添加されて、低温でも効率
良く作用する洗剤としての応用が期待されている。また
高温での処理が困難である食品工業において、食品の品
質改善への利用も期待されている。更に、低温細菌由来
の酵素を検討することは、低温細菌の生理学的機能並び
に低温およびアルカリ条件下での適用機構を解明する上
で意義深いと思われる。
温度を持つ低温酵素であることが期待される。この低温
酵素はたとえば衣料用洗剤に添加されて、低温でも効率
良く作用する洗剤としての応用が期待されている。また
高温での処理が困難である食品工業において、食品の品
質改善への利用も期待されている。更に、低温細菌由来
の酵素を検討することは、低温細菌の生理学的機能並び
に低温およびアルカリ条件下での適用機構を解明する上
で意義深いと思われる。
【０００５】
【発明の概要】今般、発明者らは、Xanthomonas maltop
hilia ＥＫ３株の培養上清からケラチン分解能を有する
プロテアーゼを単離、精製し、このプロテアーゼが低温
アルカリ条件下で酵素活性を有することを見いだした。
本発明は、かかる知見に基づくものである。
hilia ＥＫ３株の培養上清からケラチン分解能を有する
プロテアーゼを単離、精製し、このプロテアーゼが低温
アルカリ条件下で酵素活性を有することを見いだした。
本発明は、かかる知見に基づくものである。
【０００６】従って、本発明は、ケラチン分解能を有す
るプロテアーゼの提供をその目的とする。
るプロテアーゼの提供をその目的とする。
【０００７】また、本発明は、前記プロテアーゼを産生
する微生物の提供をその目的とする。
する微生物の提供をその目的とする。
【０００８】更に、本発明は、上記微生物を用いた上記
プロテアーゼの製造法の提供をその目的とする。
プロテアーゼの製造法の提供をその目的とする。
【０００９】本発明によるケラチン分解能を有するプロ
テアーゼは、下記の理化学的性質を有することを特徴と
する。
テアーゼは、下記の理化学的性質を有することを特徴と
する。
【００１０】(a) 作用及び基質特異性：カゼイン並びに
ヒト及び動物の毛髪由来のケラチンを特に分解する。カ
ゼイン分解活性よりもケラチン分解活性の方が高い。 (b) 至適ｐＨ：ｐＨ１０．０のアルカリ条件で最大活性
を示す。ｐＨ７の中性付近で、約６０％の活性を有す
る。 (c) ｐＨ安定性：温度３０℃の条件下で１時間保持した
場合、ｐＨ１０ではほとんど失活せず、ｐＨ６〜９で約
７０％の活性を有する。 (d) 至適温度：ｐＨ１０．５で５０℃である。 (e) 温度安定性：ｐＨ１０．５で１時間保持した場合、
１０℃では活性の低下は見られず、３０℃において約４
０％の失活が見られた。５０℃以上では時間とともに急
速に失活し、１時間保持した場合には６０％以上失活し
た。 (f) ゲルクロマトグラフィーによる分子量が約３０ｋＤ
ａである。
ヒト及び動物の毛髪由来のケラチンを特に分解する。カ
ゼイン分解活性よりもケラチン分解活性の方が高い。 (b) 至適ｐＨ：ｐＨ１０．０のアルカリ条件で最大活性
を示す。ｐＨ７の中性付近で、約６０％の活性を有す
る。 (c) ｐＨ安定性：温度３０℃の条件下で１時間保持した
場合、ｐＨ１０ではほとんど失活せず、ｐＨ６〜９で約
７０％の活性を有する。 (d) 至適温度：ｐＨ１０．５で５０℃である。 (e) 温度安定性：ｐＨ１０．５で１時間保持した場合、
１０℃では活性の低下は見られず、３０℃において約４
０％の失活が見られた。５０℃以上では時間とともに急
速に失活し、１時間保持した場合には６０％以上失活し
た。 (f) ゲルクロマトグラフィーによる分子量が約３０ｋＤ
ａである。
【００１１】本発明によるケラチン分解能を有するプロ
テアーゼの製造法は、このプロテアーゼを産生する微生
物を培養し、その培養物からこのプロテアーゼを採取す
ることを含んでなるものである。
テアーゼの製造法は、このプロテアーゼを産生する微生
物を培養し、その培養物からこのプロテアーゼを採取す
ることを含んでなるものである。
【００１２】さらに、本発明による微生物は上記のケラ
チン分解能を有するプロテアーゼを産生するXanthomona
s maltophilia ＥＫ３株である。
チン分解能を有するプロテアーゼを産生するXanthomona
s maltophilia ＥＫ３株である。
【００１３】
【発明の具体的説明】微生物 本発明によるケラチン分解能を有するプロテアーゼは、
微生物を用いて生産できる。その生産菌としてはXantho
monas 属に属し、かつ上記の性質を有するプロテアーゼ
を産生するものであればよい。
微生物を用いて生産できる。その生産菌としてはXantho
monas 属に属し、かつ上記の性質を有するプロテアーゼ
を産生するものであればよい。
【００１４】本発明によるプロテアーゼを産生する能力
を有する微生物の好ましい具体例としては、Xanthomona
s maltophilia ＥＫ３株が挙げられる。この菌株は、本
発明者が動物園の土壌（ゾウ舎）から単離した微生物で
あり、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成９年１
月３１日付けで受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５８０６のも
と寄託された。
を有する微生物の好ましい具体例としては、Xanthomona
s maltophilia ＥＫ３株が挙げられる。この菌株は、本
発明者が動物園の土壌（ゾウ舎）から単離した微生物で
あり、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成９年１
月３１日付けで受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５８０６のも
と寄託された。
【００１５】本発明によるXanthomonas maltophilia Ｅ
Ｋ３株の微生物学的性質は下記の通りである。 （１）形態的性質 運動性を持ち、球菌の形態を持つ。 （２）培地上での性状 寒天培地上および液体培地で生育し、白色を呈する。 （３）生育最適条件 生育温度は１０℃〜３０℃で生育し、２０℃で良好に生
育する。 （４）菌体外に放出されるプロテアーゼ ２０℃または３０℃で生育された菌体からいずれもプロ
テアーゼが放出される。 （５）好気性または嫌気性の区別 生化学的試験から通性嫌気性と判断される。 （６）グラム染色 グラム染色による測定から陰性と認められる。 （７）生化学的性状 Xanthomonas maltophilia ＥＫ３株の主な生化学的性状
は下記に示される通りである。
Ｋ３株の微生物学的性質は下記の通りである。 （１）形態的性質 運動性を持ち、球菌の形態を持つ。 （２）培地上での性状 寒天培地上および液体培地で生育し、白色を呈する。 （３）生育最適条件 生育温度は１０℃〜３０℃で生育し、２０℃で良好に生
育する。 （４）菌体外に放出されるプロテアーゼ ２０℃または３０℃で生育された菌体からいずれもプロ
テアーゼが放出される。 （５）好気性または嫌気性の区別 生化学的試験から通性嫌気性と判断される。 （６）グラム染色 グラム染色による測定から陰性と認められる。 （７）生化学的性状 Xanthomonas maltophilia ＥＫ３株の主な生化学的性状
は下記に示される通りである。
【００１６】 試験項目 結 果 オキンダーゼテスト − ＯＦ(Oxidation termentation)テスト − 硝酸塩 − トリプトファン − グルコース（オイルで覆われた） − アルギニンジヒドロラーゼ（オイルで覆われた） − ウレアーゼ（オイルで覆われた） − エスクリン ＋ ゼラチン ＋ ｐ−ニトロ−フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド ＋ グルコース ＋ アラビノース − マンノース ＋ マンニトール − Ｎ−アセチル−グルコサミン ＋ マルトース ＋ グルコン酸塩 − カプリン酸塩 − アジピン酸塩 − マレイン酸塩 ＋ クエン酸塩 ＋ フェニル酢酸塩 −
【００１７】以上の性質から、単離された微生物は、Xa
nthomonas maltophilia （９９．９％）と判断される。
結果は、アピ２０ＮＥ（日本ビオメリュー・バイテック
株式会社）のプロファイルインデックスによる。
nthomonas maltophilia （９９．９％）と判断される。
結果は、アピ２０ＮＥ（日本ビオメリュー・バイテック
株式会社）のプロファイルインデックスによる。
【００１８】微生物の培養 本発明に使用される菌株の培養にあたっては、培地は液
体でも固体でも良いが、通常は、液体培地による振盪培
養、又は通気攪拌培養が用いられる。
体でも固体でも良いが、通常は、液体培地による振盪培
養、又は通気攪拌培養が用いられる。
【００１９】この微生物を培養する培地としては、生育
に適しプロテアーゼを生産しうるものであればどのよう
なものでも良い。すなわち、炭素源としては、例えば、
グルコース、トレハース、フルクトース、マルトース、
シュクロース、デンプン、マルトオリゴ糖等が用いられ
る。窒素源としては、例えば、ペプトン、酵母エキス、
麦芽エキス、肉エキス、大豆粉、綿実粉、コーンスティ
ープリカー、各種アミノ酸類、及びその塩類、硝酸塩等
が用いられる。その他、リン酸マグネシウム、カルシウ
ム、ナトリウム、カリウム、鉄、マンガン等の無機塩
類、さらに、必要に応じてその他の栄養物をほど良く含
有する合成培地、又は天然培地を使用することができ
る。
に適しプロテアーゼを生産しうるものであればどのよう
なものでも良い。すなわち、炭素源としては、例えば、
グルコース、トレハース、フルクトース、マルトース、
シュクロース、デンプン、マルトオリゴ糖等が用いられ
る。窒素源としては、例えば、ペプトン、酵母エキス、
麦芽エキス、肉エキス、大豆粉、綿実粉、コーンスティ
ープリカー、各種アミノ酸類、及びその塩類、硝酸塩等
が用いられる。その他、リン酸マグネシウム、カルシウ
ム、ナトリウム、カリウム、鉄、マンガン等の無機塩
類、さらに、必要に応じてその他の栄養物をほど良く含
有する合成培地、又は天然培地を使用することができ
る。
【００２０】培地のｐＨ、培養温度などの培養条件は、
プロテアーゼを生産する範囲内で適宜変更し得るが、液
体振盪培養、又は通気攪拌培養の場合は、ｐＨ１０、温
度は２０℃の培養が適当である。
プロテアーゼを生産する範囲内で適宜変更し得るが、液
体振盪培養、又は通気攪拌培養の場合は、ｐＨ１０、温
度は２０℃の培養が適当である。
【００２１】本発明において利用されるプロテアーゼは
培養液中をはじめ、菌体の細胞壁、菌体内にも存在す
る。またこのプロテアーゼは菌体内および菌体外に放出
された粗酵素、あるいは抽出精製酵素または直接菌体の
形態で使用することができる。あるいはこれらの酵素を
担体に固定化して使用することもできる。
培養液中をはじめ、菌体の細胞壁、菌体内にも存在す
る。またこのプロテアーゼは菌体内および菌体外に放出
された粗酵素、あるいは抽出精製酵素または直接菌体の
形態で使用することができる。あるいはこれらの酵素を
担体に固定化して使用することもできる。
【００２２】酵素の採取 上記培養液からの本発明によるプロテアーゼの採取およ
び精製には、既知の精製法が単独でもしくは併用して利
用できる。
び精製には、既知の精製法が単独でもしくは併用して利
用できる。
【００２３】本発明によるプロテアーゼは、主として菌
体外、すなわち培養中に分泌されるため、例えば、ろ
過、又は遠心分離により菌体を除去することによって、
容易に粗酵素液を得ることができる。好ましい精製法と
しては、硫安などによる塩析、有機溶媒（例えば、メタ
ノール、エタノール、アセトンなど）による沈殿法、生
デンプンによる吸着法、限外ろ過、ゲルクロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィー、その他、各種ク
ロマトグラフィーなどが挙げられる。好ましい精製法の
具体例は、後記する実施例において記載する。
体外、すなわち培養中に分泌されるため、例えば、ろ
過、又は遠心分離により菌体を除去することによって、
容易に粗酵素液を得ることができる。好ましい精製法と
しては、硫安などによる塩析、有機溶媒（例えば、メタ
ノール、エタノール、アセトンなど）による沈殿法、生
デンプンによる吸着法、限外ろ過、ゲルクロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィー、その他、各種ク
ロマトグラフィーなどが挙げられる。好ましい精製法の
具体例は、後記する実施例において記載する。
【００２４】酵素の性質 本発明によるプロテアーゼの性質は、次に示される通り
である。 (a) 作用及び基質特異性：カゼイン並びにヒト及び動物
の毛髪由来のケラチンを特に分解する。カゼイン分解活
性よりもケラチン分解活性の方が高い。すなわち、本発
明によるプロテアーゼはケラチンは特異的に分解する。 (b) 至適ｐＨ：ｐＨ９．５〜１０．５のアルカリ条件で
活性が最大となる。ｐＨ７の中性付近でも、約６０％を
保持する。至適ｐＨは１０．０である。 (c) ｐＨ安定性：温度３０℃の条件下で１時間保持した
場合、ｐＨ１０ではほとんど失活せず、ｐＨ６〜９で約
７０％の活性を有する。 (d) 至適温度：ｐＨ１０．５の条件下、５０℃で最大活
性を示す。４０℃では最大活性の約４０％、２０℃およ
び３０℃でも約３０％の活性を保持する。 (e) 温度安定性：ｐＨ１０．５の条件下で１時間保持し
た場合、１０℃では活性の低下は見られず、３０℃にお
いて約４０％の失活が見られた。５０℃以上では時間と
ともに急速に失活し、１時間保持した場合には６０％以
上失活した。 (f) 分子量：ゲルクロマトグラフィーによって測定した
分子量は約３０ｋＤａである。
である。 (a) 作用及び基質特異性：カゼイン並びにヒト及び動物
の毛髪由来のケラチンを特に分解する。カゼイン分解活
性よりもケラチン分解活性の方が高い。すなわち、本発
明によるプロテアーゼはケラチンは特異的に分解する。 (b) 至適ｐＨ：ｐＨ９．５〜１０．５のアルカリ条件で
活性が最大となる。ｐＨ７の中性付近でも、約６０％を
保持する。至適ｐＨは１０．０である。 (c) ｐＨ安定性：温度３０℃の条件下で１時間保持した
場合、ｐＨ１０ではほとんど失活せず、ｐＨ６〜９で約
７０％の活性を有する。 (d) 至適温度：ｐＨ１０．５の条件下、５０℃で最大活
性を示す。４０℃では最大活性の約４０％、２０℃およ
び３０℃でも約３０％の活性を保持する。 (e) 温度安定性：ｐＨ１０．５の条件下で１時間保持し
た場合、１０℃では活性の低下は見られず、３０℃にお
いて約４０％の失活が見られた。５０℃以上では時間と
ともに急速に失活し、１時間保持した場合には６０％以
上失活した。 (f) 分子量：ゲルクロマトグラフィーによって測定した
分子量は約３０ｋＤａである。
【００２５】酵素の用途 本発明によるプロテアーゼは低温およびアルカリ条件下
で、ケラチン分解能を示す。従って、本発明によるプロ
テアーゼを用いることによって、不溶性タンパク質であ
るケラチンの分解反応を低温において行うことが可能と
なる。例えば、衣料用洗剤組成物に添加することで、ケ
ラチンのような不溶性タンパク質を分解可能な洗剤を提
供することができる。この洗剤組成物は、本発明による
プロテアーゼが添加された以外は、常法に従って構成す
ることができる。すなわち、洗剤用界面活性剤、漂白
剤、ビルダーなど、通常の洗剤組成物と組み合わせて構
成することができる。
で、ケラチン分解能を示す。従って、本発明によるプロ
テアーゼを用いることによって、不溶性タンパク質であ
るケラチンの分解反応を低温において行うことが可能と
なる。例えば、衣料用洗剤組成物に添加することで、ケ
ラチンのような不溶性タンパク質を分解可能な洗剤を提
供することができる。この洗剤組成物は、本発明による
プロテアーゼが添加された以外は、常法に従って構成す
ることができる。すなわち、洗剤用界面活性剤、漂白
剤、ビルダーなど、通常の洗剤組成物と組み合わせて構
成することができる。
【００２６】
【実施例】以下に、具体的な実施例を示し、本発明をよ
り詳細に説明するが、本発明がこれらの実施例に限定さ
れないことは言うまでもない。
り詳細に説明するが、本発明がこれらの実施例に限定さ
れないことは言うまでもない。
【００２７】なお、特に断らない限り、以下においてタ
ンパク質量の測定は、色素結合法であるバイオラッドプ
ロテインアッセイ（バイオラッド社）を用いて行った。
また、クロマトグラフィーのタンパク質の検出は、２８
０ｎｍの紫外部の吸収を測定することにより行った。
ンパク質量の測定は、色素結合法であるバイオラッドプ
ロテインアッセイ（バイオラッド社）を用いて行った。
また、クロマトグラフィーのタンパク質の検出は、２８
０ｎｍの紫外部の吸収を測定することにより行った。
【００２８】また、プロテアーゼの活性の測定は、下記
の方法に従って行った。 （ａ）フェノール試薬法 １％（Ｗ／Ｖ）基質溶液（ケラチンなど）を含む５０ｍ
Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）
０．３ｍｌに対して、試料酵素液０．２ｍｌ加え、６０
分間３０℃で保温した。その後、トリクロロ酢酸溶液
（０．１１Ｍトリクロロ酢酸、０．２２Ｍ酢酸ナトリウ
ム、０．３３Ｍ酢酸）を１ｍｌ加え反応を止めた。３０
分間室温で放置後、遠心（１００００ｒｐｍ、室温、１
０分）し、上清５０μｌに２％炭酸ナトリウム溶液
（０．００１％硫酸銅）０．５ｍｌを加え、３０分放置
した。これに蒸留水で２倍希釈したフェノール試薬溶液
を５０μｌ加え、室温で１時間放置後、６６０ｎｍの吸
収を測定した。
の方法に従って行った。 （ａ）フェノール試薬法 １％（Ｗ／Ｖ）基質溶液（ケラチンなど）を含む５０ｍ
Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）
０．３ｍｌに対して、試料酵素液０．２ｍｌ加え、６０
分間３０℃で保温した。その後、トリクロロ酢酸溶液
（０．１１Ｍトリクロロ酢酸、０．２２Ｍ酢酸ナトリウ
ム、０．３３Ｍ酢酸）を１ｍｌ加え反応を止めた。３０
分間室温で放置後、遠心（１００００ｒｐｍ、室温、１
０分）し、上清５０μｌに２％炭酸ナトリウム溶液
（０．００１％硫酸銅）０．５ｍｌを加え、３０分放置
した。これに蒸留水で２倍希釈したフェノール試薬溶液
を５０μｌ加え、室温で１時間放置後、６６０ｎｍの吸
収を測定した。
【００２９】（ｂ）アゾカゼインによるタンパク質の分
解活性 １％（Ｗ／Ｖ）アゾカゼインを含む５０ｍＭグリシン−
水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）０．３ｍｌに
対して、試料酵素液０．２ｍｌ加え、６０分間３０℃で
保温した。その後、６％トリクロロ酢酸１ｍｌを加える
ことによって反応を止め、室温で約３０分間放置した
後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、室温、１０分）し
た。その上清を分光光度計を用いて、３４０ｎｍの吸光
度を測定した。
解活性 １％（Ｗ／Ｖ）アゾカゼインを含む５０ｍＭグリシン−
水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）０．３ｍｌに
対して、試料酵素液０．２ｍｌ加え、６０分間３０℃で
保温した。その後、６％トリクロロ酢酸１ｍｌを加える
ことによって反応を止め、室温で約３０分間放置した
後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、室温、１０分）し
た。その上清を分光光度計を用いて、３４０ｎｍの吸光
度を測定した。
【００３０】実施例１ 新規微生物のスクリーニング 新規微生物の分離は、寒天平板培地上で行った。石川県
立動物園のゾウ舎付近で採取した土壌を０．１ｇ生理的
食塩水に懸濁し、その上清を原液とし、この原液の１０
2 希釈液を調整した。原液および１０2 希釈液をスクリ
ーニング用寒天平板培地上（ケラチン ２５ｇ／リット
ル、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．１ｇ／リットル、ＮＨ4 ＮＯ3
０．１ｇ／リットル、ＭｇＳＯ4 ０．１ｇ／リット
ル、ＮａＣｌ ０．１ｇ／リットル、ＣａＣｌ2 ０．
１ｇ／リットル、ＦｅＣｌ2 ０．１ｇ／リットル、Ｅ
ＤＴＡ ０．１ｇ／リットル、寒天１５ｇ／リットル）
に散布し、５、１０、または２０℃で７日間培養した。
上記の寒天培地上に生育したコロニーのなかで、生育の
良いものを選びこれを継代培養、および保存培地に植菌
した。
立動物園のゾウ舎付近で採取した土壌を０．１ｇ生理的
食塩水に懸濁し、その上清を原液とし、この原液の１０
2 希釈液を調整した。原液および１０2 希釈液をスクリ
ーニング用寒天平板培地上（ケラチン ２５ｇ／リット
ル、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．１ｇ／リットル、ＮＨ4 ＮＯ3
０．１ｇ／リットル、ＭｇＳＯ4 ０．１ｇ／リット
ル、ＮａＣｌ ０．１ｇ／リットル、ＣａＣｌ2 ０．
１ｇ／リットル、ＦｅＣｌ2 ０．１ｇ／リットル、Ｅ
ＤＴＡ ０．１ｇ／リットル、寒天１５ｇ／リットル）
に散布し、５、１０、または２０℃で７日間培養した。
上記の寒天培地上に生育したコロニーのなかで、生育の
良いものを選びこれを継代培養、および保存培地に植菌
した。
【００３１】菌体外にプロテアーゼを放出しているかど
うかの確認は寒天培地上で行った。上記のスクリーニン
グ用寒天培地に分離し、２０℃、７２時間培養した。そ
の後、菌の生育したケラチンの代わりにカゼイン（１
％）を含むレプリカプレート上に１０％トリクロロ酢酸
溶液を散布し、コロニーのまわりの透明斑の有無の存在
によりプロテアーゼを菌体外に放出するものかを確認し
た。
うかの確認は寒天培地上で行った。上記のスクリーニン
グ用寒天培地に分離し、２０℃、７２時間培養した。そ
の後、菌の生育したケラチンの代わりにカゼイン（１
％）を含むレプリカプレート上に１０％トリクロロ酢酸
溶液を散布し、コロニーのまわりの透明斑の有無の存在
によりプロテアーゼを菌体外に放出するものかを確認し
た。
【００３２】菌の生育活性を安定化させるために、菌株
を下記の培養培地１５０ｍｌ（１００ｍｌ三角フラスコ
６本に分注）に接種し、２０℃、７２時間、トリプルシ
ェイカーＮＲ−８０（タイテック社）を用いて、１４０
ｒｐｍで回転振盪培養した。本培養は、ラボラトリーフ
ァーメンターＬＳ−５（オリエンタル酵母工業株式会
社）を用いて、下記の培養培地３リットルに前培養液１
５０ｍｌ接種し、１０℃、９６時間、１４０ｒｐｍで回
転培養した。
を下記の培養培地１５０ｍｌ（１００ｍｌ三角フラスコ
６本に分注）に接種し、２０℃、７２時間、トリプルシ
ェイカーＮＲ−８０（タイテック社）を用いて、１４０
ｒｐｍで回転振盪培養した。本培養は、ラボラトリーフ
ァーメンターＬＳ−５（オリエンタル酵母工業株式会
社）を用いて、下記の培養培地３リットルに前培養液１
５０ｍｌ接種し、１０℃、９６時間、１４０ｒｐｍで回
転培養した。
【００３３】培養培地の組成 ケラチン ２．５％ （Ｗ／Ｖ） Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．０１％ ＮＨ4 ＮＯ3 ０．０１％ ＭｇＳＯ4 ０．０１％ ＮａＣｌ ０．０１％ ＣａＣｌ2 ０．０１％ ＦｅＣｌ2 ０．０１％ ＥＤＴＡ ０．０１％ ｐＨ１０．５ 培地等は、主としてオートクレーブで１．２ｋｇｆ／ｃ
ｍ2 ｇａｕｇｅ（１２１℃）、１５分間、高圧蒸気殺菌
した。
ｍ2 ｇａｕｇｅ（１２１℃）、１５分間、高圧蒸気殺菌
した。
【００３４】実施例２ 酵素の精製 すべてのプロテアーゼの精製操作は、４℃において行っ
た。 （ａ）イオン交換クロマトグラフィー 上記実施例１で得られた培養液を、遠心分離（８，００
０×ｇ、４℃、１５分）を行い菌体と粗酵素に分けた。
その粗酵素液をイオン交換クロマトグラフィーで精製を
行った。カラムは、DEAE Sepharose Fast Flow陰イオン
交換体（ファルマシアバイオテク社）を２リットル充填
したＩＮｄＥＸ１００カラム（ファルマシアバイオテク
社）を用いた。上記のカラムに２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩
酸緩衝液（ｐＨ９．０）を用いて、線速度（１５０ｃｍ
／ｈ）でゲル体積の５倍以上（１０リットル）の緩衝液
をもちいて平衡化した。
た。 （ａ）イオン交換クロマトグラフィー 上記実施例１で得られた培養液を、遠心分離（８，００
０×ｇ、４℃、１５分）を行い菌体と粗酵素に分けた。
その粗酵素液をイオン交換クロマトグラフィーで精製を
行った。カラムは、DEAE Sepharose Fast Flow陰イオン
交換体（ファルマシアバイオテク社）を２リットル充填
したＩＮｄＥＸ１００カラム（ファルマシアバイオテク
社）を用いた。上記のカラムに２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩
酸緩衝液（ｐＨ９．０）を用いて、線速度（１５０ｃｍ
／ｈ）でゲル体積の５倍以上（１０リットル）の緩衝液
をもちいて平衡化した。
【００３５】粗酵素液を線速度１００ｃｍ／ｈで添加し
た。溶出は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ
９．０）に０．２Ｍ、０．４Ｍ、および０．６Ｍ Ｎａ
Ｃｌを加えたものをそれぞれ３リットルづつ用いて、線
速度１００ｃｍ／ｈで溶出し、ＵＶ計でタンパク質が検
出された部分だけを分取した。
た。溶出は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ
９．０）に０．２Ｍ、０．４Ｍ、および０．６Ｍ Ｎａ
Ｃｌを加えたものをそれぞれ３リットルづつ用いて、線
速度１００ｃｍ／ｈで溶出し、ＵＶ計でタンパク質が検
出された部分だけを分取した。
【００３６】（ｂ）硫安塩析 上記で得られた分画に対し、氷冷下で硫安を８０％飽和
になるように加えた。低温室で４℃に保ち一晩ゆっくり
と攪拌した後、遠心分離（１８，０００×ｇ、４℃、３
０分）して酵素を沈殿させ、飽和分画を得た。硫安の添
加量は、２５℃での飽和濃度添加量を用いた。
になるように加えた。低温室で４℃に保ち一晩ゆっくり
と攪拌した後、遠心分離（１８，０００×ｇ、４℃、３
０分）して酵素を沈殿させ、飽和分画を得た。硫安の添
加量は、２５℃での飽和濃度添加量を用いた。
【００３７】（ｃ）ゲル濾過 次に、HiLoad 16/60 Superdex 200 prep gradeカラム
（ファルマシアバイオテク社）を用いてゲル濾過を行っ
た。装置はHiLoad System 50（ファルマシアバイオテク
社）を用いた。HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade
カラムに線速度約６０ｃｍ／ｈでゲル体積の３倍以上
（４００ｍｌ）のＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）
を流し平衡化した。硫安塩析後の試料酵素液をカラムに
Superloop を用いて５ｍｌ添加した。溶出液はＴｒｉｓ
−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を用いて、線速度６０ｃｍ
／ｈで溶出し、５ｍｌづつ分取した。ゲルクロマトグラ
フィーによる分子量測定の結果は、図１に示される通り
であった。
（ファルマシアバイオテク社）を用いてゲル濾過を行っ
た。装置はHiLoad System 50（ファルマシアバイオテク
社）を用いた。HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade
カラムに線速度約６０ｃｍ／ｈでゲル体積の３倍以上
（４００ｍｌ）のＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）
を流し平衡化した。硫安塩析後の試料酵素液をカラムに
Superloop を用いて５ｍｌ添加した。溶出液はＴｒｉｓ
−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を用いて、線速度６０ｃｍ
／ｈで溶出し、５ｍｌづつ分取した。ゲルクロマトグラ
フィーによる分子量測定の結果は、図１に示される通り
であった。
【００３８】実施例３ 酵素反応へのｐＨの影響 実施例２で精製した酵素を用いて、アゾカゼインの分解
反応を種々のｐＨにおいて実施した。反応液の緩衝液の
組成は、それぞれ１００ｍＭの、ＭＥＳ（２−モルホリ
ノエタンスルホン酸一水和物）緩衝液（ｐＨ５．５−
６．５）、ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン
酸）緩衝液（ｐＨ６．５−８．０）、ＴＡＰＳ（Ｎ−ト
リス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパン
スルホン酸）緩衝液（ｐＨ８．０−９．０）、ＣＨＥＳ
（Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸）
緩衝液（ｐＨ９．０−１０．０）、ＣＡＰＳ（Ｎ−シク
ロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸）緩衝液
（ｐＨ１０．０−１１．０）、およびグリシン−塩化ナ
トリウム−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１．０−１
３．０）であった。結果は、図２に示される通りであっ
た。
反応を種々のｐＨにおいて実施した。反応液の緩衝液の
組成は、それぞれ１００ｍＭの、ＭＥＳ（２−モルホリ
ノエタンスルホン酸一水和物）緩衝液（ｐＨ５．５−
６．５）、ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン
酸）緩衝液（ｐＨ６．５−８．０）、ＴＡＰＳ（Ｎ−ト
リス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパン
スルホン酸）緩衝液（ｐＨ８．０−９．０）、ＣＨＥＳ
（Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸）
緩衝液（ｐＨ９．０−１０．０）、ＣＡＰＳ（Ｎ−シク
ロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸）緩衝液
（ｐＨ１０．０−１１．０）、およびグリシン−塩化ナ
トリウム−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１．０−１
３．０）であった。結果は、図２に示される通りであっ
た。
【００３９】至適ｐＨはｐＨ９．５〜１０．５の間であ
った。また、最大活性の約６０％の活性がｐＨ７で維持
された。よって、本発明による酵素は、アルカリ性ｐＨ
を至適としてかなり広範囲に作用することが分かった。
った。また、最大活性の約６０％の活性がｐＨ７で維持
された。よって、本発明による酵素は、アルカリ性ｐＨ
を至適としてかなり広範囲に作用することが分かった。
【００４０】実施例４ 酵素のｐＨ安定性 実施例２で精製した酵素を下記の緩衝液を用いて３０℃
で１時間保温し、残存プロテアーゼ活性を調べた。反応
液の緩衝液の組成は、それぞれ２０ｍＭの、クエン酸ナ
トリウム（sodium citrate）（ｐＨ５−７）、トリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７−９）、およびグリシン−ＮａＯＨ
（ｐＨ９−１１）であった。
で１時間保温し、残存プロテアーゼ活性を調べた。反応
液の緩衝液の組成は、それぞれ２０ｍＭの、クエン酸ナ
トリウム（sodium citrate）（ｐＨ５−７）、トリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７−９）、およびグリシン−ＮａＯＨ
（ｐＨ９−１１）であった。
【００４１】結果は、図３に示されるとおりであった。
【００４２】本発明による酵素は、３０℃、１時間の条
件で、ｐＨ１０でほとんど失活せず、ｐＨ６〜９の範囲
およびｐＨ１１で約７０％の残存活性があった。残存活
性（％）はｐＨ１０、３０℃における活性（１００％）
に基いている。
件で、ｐＨ１０でほとんど失活せず、ｐＨ６〜９の範囲
およびｐＨ１１で約７０％の残存活性があった。残存活
性（％）はｐＨ１０、３０℃における活性（１００％）
に基いている。
【００４３】実施例５ 酵素反応への温度の影響 実施例２で精製した酵素を用いてアゾカゼインの分解反
応を５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
１０．５）中、種々の温度下において実施した。反応温
度は１０から７０℃まで変化させた。結果を図４に示し
た。
応を５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
１０．５）中、種々の温度下において実施した。反応温
度は１０から７０℃まで変化させた。結果を図４に示し
た。
【００４４】本発明による酵素の至適温度は、ｐＨ１
０．５において５０℃であった。３０℃においては、５
０℃における活性のほぼ３０％以上の活性を、４０℃で
は約４０％の活性を有していた。
０．５において５０℃であった。３０℃においては、５
０℃における活性のほぼ３０％以上の活性を、４０℃で
は約４０％の活性を有していた。
【００４５】実施例６ 酵素の温度安定性 実施例２で精製した酵素を１時間保持の条件下におい
て、１０℃〜６０℃で保温した。その活性の経時変化は
図５に示されるとおりであった。図中で□は１０℃、◇
は２０℃、○は３０℃、△は５０℃、●は６０℃であ
る。
て、１０℃〜６０℃で保温した。その活性の経時変化は
図５に示されるとおりであった。図中で□は１０℃、◇
は２０℃、○は３０℃、△は５０℃、●は６０℃であ
る。
【００４６】本発明による酵素は、ｐＨ１０．５の条件
下で１時間保持した場合、１０℃では活性の低下は見ら
れなかった。一方、３０℃において約４０％の失活が見
られた。６０℃では時間とともに急速に失活し、２０分
保持した場合には６０％以上失活した。
下で１時間保持した場合、１０℃では活性の低下は見ら
れなかった。一方、３０℃において約４０％の失活が見
られた。６０℃では時間とともに急速に失活し、２０分
保持した場合には６０％以上失活した。
【００４７】実施例７ プロテアーゼの基質特異性 水可溶性基質タンパク質として、カゼイン、ヘモグロビ
ン、アルブミンを用いた。水に対して難溶あるいは不溶
な基質タンパク質としてケラチン（人および動物の毛髪
由来）、コラーゲン、エラスチンを用いた。フェノール
試薬を用いてこれらのタンパク質の分解活性を測定し
た。その結果は、表２に示される通りであった。
ン、アルブミンを用いた。水に対して難溶あるいは不溶
な基質タンパク質としてケラチン（人および動物の毛髪
由来）、コラーゲン、エラスチンを用いた。フェノール
試薬を用いてこれらのタンパク質の分解活性を測定し
た。その結果は、表２に示される通りであった。
【００４８】 表２ プロテアーゼＥＫ３の基質特異性 基 質 相対活性 カゼイン*1 １００ ケラチン（人の毛髪由来）*2 １９０ ケラチン（動物の毛髪由来）*3 ２７５ ヘモグロビン ８７ アルブミン ５２ コラーゲン ３０ エラスチン ２９ 注）*1：Hammarsten氏による方法により精製 *2：和光純薬 コード Ｋ０００１ *3：半井化学 コード １９８−４４
【００４９】反応温度：３０℃、反応ｐＨ：ｐＨ１０．
５、反応時間：６０分であった。基質はいずれも１％で
あった。
５、反応時間：６０分であった。基質はいずれも１％で
あった。
【００５０】本発明による酵素は、ケラチンを特異的に
分解する。特に、動物の毛髪由来のケラチンに対しては
カゼインの２．７５倍もの活性を示した。
分解する。特に、動物の毛髪由来のケラチンに対しては
カゼインの２．７５倍もの活性を示した。
【図１】実施例２において実施したゲルクロマトグラフ
ィーの結果を示した図である。
ィーの結果を示した図である。
【図２】本発明による酵素の酵素活性へのｐＨの影響を
示したものである。□：ＭＥＳ、◇：ＭＯＰＳ、○：Ｔ
ＡＰＳ、△：ＣＨＥＳ、●：ＣＡＰＳ。
示したものである。□：ＭＥＳ、◇：ＭＯＰＳ、○：Ｔ
ＡＰＳ、△：ＣＨＥＳ、●：ＣＡＰＳ。
【図３】本発明による酵素のｐＨ安定性を示した図であ
る。□：クエン酸ナトリウム（ｐＨ５−７）、◇：Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７−９）、○：グリシン−ＮａＯＨ
（ｐＨ９−１１）。
る。□：クエン酸ナトリウム（ｐＨ５−７）、◇：Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７−９）、○：グリシン−ＮａＯＨ
（ｐＨ９−１１）。
【図４】本発明による酵素の酵素活性への温度の影響を
示した図である。
示した図である。
【図５】本発明による酵素の温度安定性を示した図であ
る。□：１０℃、◇：２０℃、○：３０℃、△：５０
℃、●：６０℃。
る。□：１０℃、◇：２０℃、○：３０℃、△：５０
℃、●：６０℃。
【図６】Xanthomonas maltophilia ＥＫ３株の生育温度
並びに生産されたプロテアーゼの活性を示した図であ
る。
並びに生産されたプロテアーゼの活性を示した図であ
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:64） (71)出願人 592043805 ＯＮＥ ＰＲＯＣＴＥＲ ＆ ＧＡＮＢＬ Ｅ ＰＬＡＺＡ，ＣＩＮＣＩＮＮＡＴＩ, ＯＨＩＯ，ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ
Claims (9)
- 【請求項１】下記の理化学的性質を有するプロテアー
ゼ。 (a) 作用及び基質特異性：カゼイン並びにヒト及び動物
の毛髪由来のケラチンを特に分解する。カゼイン分解活
性よりもケラチン分解活性の方が高い。 (b) 至適ｐＨ：ｐＨ１０．０のアルカリ条件で最大活性
を示す。ｐＨ７の中性付近で、約６０％の活性を有す
る。 (c) ｐＨ安定性：温度３０℃の条件下で１時間保持した
場合、ｐＨ１０ではほとんど失活せず、ｐＨ６〜９で約
７０％の活性を有する。 - 【請求項２】下記の理化学的性質をさらに有する、請求
項１に記載のプロテアーゼ。 (d) 至適温度：ｐＨ１０．５で５０℃である。 (e) 温度安定性：ｐＨ１０．５で１時間保持した場合、
１０℃では活性の低下は見られず、３０℃において約４
０％の失活が見られた。５０℃以上では時間とともに急
速に失活し、１時間保持した場合には６０％以上失活し
た。 - 【請求項３】ゲルクロマトグラフィーによる分子量が約
３０ｋＤａである、請求項１に記載のプロテアーゼ。 - 【請求項４】請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロ
テアーゼを産生する、Xanthomonas属に属する微生物。 - 【請求項５】１０℃から３０℃で良好に生育できる、請
求項４に記載の微生物。 - 【請求項６】Xanthomonas maltophilia ＥＫ３株であ
る、請求項４に記載の微生物。 - 【請求項７】ＦＥＲＭ ＢＰ−５８０６の受託番号のも
と寄託された微生物。 - 【請求項８】請求項４〜７のいずれか一項に記載の微生
物を培養し、その培養物から請求項１〜３のいずれか一
項に記載のプロテアーゼを採取することを含む、請求項
１〜３のいずれか一項に記載のプロテアーゼの製造法。 - 【請求項９】請求項４〜７のいずれか一項に記載の微生
物により産生される、以下の理化学的性質を有するプロ
テアーゼ。 (a) 作用及び基質特異性：カゼイン並びにヒト及び動物
の毛髪由来のケラチンを分解する。カゼイン分解活性よ
りもケラチン分解活性の方が高い。 (b) 至適ｐＨ：ｐＨ１０．０のアルカリ条件で最大活性
を示す。ｐＨ７の中性付近で、約６０％の活性を有す
る。 (c) ｐＨ安定性：温度３０℃の条件下で１時間保持した
場合、ｐＨ１０ではほとんど失活せず、ｐＨ６〜９で約
７０％の活性を有する。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9059491A JPH10248564A (ja) | 1997-03-13 | 1997-03-13 | ケラチン分解能を有するプロテアーゼＥＫ３および細菌Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ＥＫ３株 |
| PCT/IB1998/000318 WO1998040473A1 (en) | 1997-03-13 | 1998-03-12 | Keratinolytic protease ek3 and xanthomonas maltophilia ek3 |
| AU61105/98A AU6110598A (en) | 1997-03-13 | 1998-03-12 | Keratinolytic protease ek3 and xanthomonas maltophilia ek3 |
| ARP980101139A AR011983A1 (es) | 1997-03-13 | 1998-03-13 | Proteasa queratinolitica ek3 y xanthomonas malthopilia ek3. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9059491A JPH10248564A (ja) | 1997-03-13 | 1997-03-13 | ケラチン分解能を有するプロテアーゼＥＫ３および細菌Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ＥＫ３株 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10248564A true JPH10248564A (ja) | 1998-09-22 |
Family
ID=13114826
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9059491A Withdrawn JPH10248564A (ja) | 1997-03-13 | 1997-03-13 | ケラチン分解能を有するプロテアーゼＥＫ３および細菌Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ＥＫ３株 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10248564A (ja) |
| AR (1) | AR011983A1 (ja) |
| AU (1) | AU6110598A (ja) |
| WO (1) | WO1998040473A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2377337A1 (en) | 1999-06-25 | 2001-01-04 | The Penn State Research Foundation | Stain removing composition containing particular isolated and pure proteolytic enzymes |
| AU5635400A (en) * | 1999-06-25 | 2001-01-31 | Jean E. Brenchley | Low temperature enzymes derived from particular bacterial strain |
| US7319112B2 (en) | 2000-07-14 | 2008-01-15 | The Procter & Gamble Co. | Non-halogenated antibacterial agents and processes for making same |
| US20050101002A1 (en) * | 2003-11-06 | 2005-05-12 | Council Of Scientific & Industrial Research | Process for production of low temperature active alkaline protease from a deep-sea fungus |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05211868A (ja) * | 1991-03-26 | 1993-08-24 | Hokkaido Togyo Kk | アルカリプロテアーゼの製造方法 |
-
1997
- 1997-03-13 JP JP9059491A patent/JPH10248564A/ja not_active Withdrawn
-
1998
- 1998-03-12 WO PCT/IB1998/000318 patent/WO1998040473A1/en active Application Filing
- 1998-03-12 AU AU61105/98A patent/AU6110598A/en not_active Abandoned
- 1998-03-13 AR ARP980101139A patent/AR011983A1/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU6110598A (en) | 1998-09-29 |
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| WO1998040473A1 (en) | 1998-09-17 |
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