JPH08214878A - 低温性プロテアーゼおよび低温性細菌 - Google Patents
低温性プロテアーゼおよび低温性細菌Info
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- JPH08214878A JPH08214878A JP7029904A JP2990495A JPH08214878A JP H08214878 A JPH08214878 A JP H08214878A JP 7029904 A JP7029904 A JP 7029904A JP 2990495 A JP2990495 A JP 2990495A JP H08214878 A JPH08214878 A JP H08214878A
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- balustinum
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規な低温性プロテアーゼ、この低温性プロ
テアーゼ産生を有する新規微生物の提供。 【構成】 カゼイン、ジメチルカゼインに作用してそれ
を分解するが、リボヌクレアーゼには作用ぜず、至適作
用温度が約４０℃であり、ｐＨ７、１時間保持の条件下
で、３０℃までの温度ではほとんど失活せず、４０℃で
約４０％失活し、５０℃で急速に失活し約１５分で完全
に失活するプロテアーゼ、およびこのプロテアーゼ産生
能を有するFlavobacterium balustinum 。
テアーゼ産生を有する新規微生物の提供。 【構成】 カゼイン、ジメチルカゼインに作用してそれ
を分解するが、リボヌクレアーゼには作用ぜず、至適作
用温度が約４０℃であり、ｐＨ７、１時間保持の条件下
で、３０℃までの温度ではほとんど失活せず、４０℃で
約４０％失活し、５０℃で急速に失活し約１５分で完全
に失活するプロテアーゼ、およびこのプロテアーゼ産生
能を有するFlavobacterium balustinum 。
Description
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、低温域で高い活性を有するプロテアーゼおよ
びその利用ならびにこのプロテアーゼを産生する低温性
細菌に関する。
びその利用ならびにこのプロテアーゼを産生する低温性
細菌に関する。
【０００２】背景技術 低温性細菌はかなり古くから知られており、その存在は
広く低温環境に確認できる。たとえば土壌、魚介類、乳
製品に加え、人工的に作られた低温環境などからも分離
することができるとされている。従来より食品微生物学
上の必要性から低温性細菌の研究が行われてきたが、そ
れは主として微生物の系統学的研究に関するものにとど
まっていた。
広く低温環境に確認できる。たとえば土壌、魚介類、乳
製品に加え、人工的に作られた低温環境などからも分離
することができるとされている。従来より食品微生物学
上の必要性から低温性細菌の研究が行われてきたが、そ
れは主として微生物の系統学的研究に関するものにとど
まっていた。
【０００３】一方で、低温性細菌から得られる酵素は、
低温に最適温度を持つ低温性酵素であることが期待でき
る。低温で効率よく作用する低温性酵素は、例えば衣料
用洗剤に添加されて、低水温でも利用可能な洗剤を実現
できると思われる。さらに、常温で揮発性である有機溶
媒の存在下での化学反応への利用、腐敗を起こさない温
度での食品の品質改善への利用などが考えられる。ま
た、低温性細菌由来の酵素を検討することで、低温性細
菌の生理学的機能および低温度への適用機構を解明する
上で意義深いものと思われる。
低温に最適温度を持つ低温性酵素であることが期待でき
る。低温で効率よく作用する低温性酵素は、例えば衣料
用洗剤に添加されて、低水温でも利用可能な洗剤を実現
できると思われる。さらに、常温で揮発性である有機溶
媒の存在下での化学反応への利用、腐敗を起こさない温
度での食品の品質改善への利用などが考えられる。ま
た、低温性細菌由来の酵素を検討することで、低温性細
菌の生理学的機能および低温度への適用機構を解明する
上で意義深いものと思われる。
【０００４】
【発明の概要】本発明者は、今般、新規な低温性プロテ
アーゼを産生する新規菌株を見いだした。本発明はかか
る知見に基づくものである。すなわち、本発明は新規な
低温性プロテアーゼの提供をその目的としている。また
本発明は、前記低温性プロテアーゼ産生を有する新規微
生物の提供をその目的としている。さらに本発明は、上
記新規微生物を用いた上記低温性プロテアーゼの製造法
の提供をその目的としている。
アーゼを産生する新規菌株を見いだした。本発明はかか
る知見に基づくものである。すなわち、本発明は新規な
低温性プロテアーゼの提供をその目的としている。また
本発明は、前記低温性プロテアーゼ産生を有する新規微
生物の提供をその目的としている。さらに本発明は、上
記新規微生物を用いた上記低温性プロテアーゼの製造法
の提供をその目的としている。
【０００５】本発明による低温性プロテアーゼは、下記
の理化学的性質を有するもの、である。 ・作用および基質特異性：カゼイン、ジメチルカゼイン
に作用してそれを分解するが、リボヌクレアーゼには作
用しない。 ・至適温度：至適作用温度は約４０℃である。 ・温度安定性：ｐＨ７、１時間保持の条件下で、３０℃
までの温度ではほとんど失活せず、４０℃で約４０％失
活し、５０℃で急速に失活し約１５分で完全に失活す
る。
の理化学的性質を有するもの、である。 ・作用および基質特異性：カゼイン、ジメチルカゼイン
に作用してそれを分解するが、リボヌクレアーゼには作
用しない。 ・至適温度：至適作用温度は約４０℃である。 ・温度安定性：ｐＨ７、１時間保持の条件下で、３０℃
までの温度ではほとんど失活せず、４０℃で約４０％失
活し、５０℃で急速に失活し約１５分で完全に失活す
る。
【０００６】さらに本発明の好ましい態様によれば、本
発明による低温性プロテアーゼは、下記の理化学的性質
をさらに有するもの、である。 ・至適ｐＨ：至適作用ｐＨは７．５ ・安定ｐＨ：２０℃、１時間保持の条件下でｐＨ６．０
〜１０．０において安定である。 ・分子量：約３８ｋＤａである（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよ
びゲル濾過法による）。 ・等電点：約４．５である。
発明による低温性プロテアーゼは、下記の理化学的性質
をさらに有するもの、である。 ・至適ｐＨ：至適作用ｐＨは７．５ ・安定ｐＨ：２０℃、１時間保持の条件下でｐＨ６．０
〜１０．０において安定である。 ・分子量：約３８ｋＤａである（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよ
びゲル濾過法による）。 ・等電点：約４．５である。
【０００７】さらに、本発明による新規微生物は、上記
の低温性プロテアーゼ産生能を有するFlavobacterium b
alustinum である。
の低温性プロテアーゼ産生能を有するFlavobacterium b
alustinum である。
【０００８】またさらに、本発明による低温性プロテア
ーゼの製造法は、上記Flavobacterium balustinum を培
養し、その培養物から上記低温性プロテアーゼを採取す
ることを含んでなるもの、である。
ーゼの製造法は、上記Flavobacterium balustinum を培
養し、その培養物から上記低温性プロテアーゼを採取す
ることを含んでなるもの、である。
【０００９】
【発明の具体的説明】新規プロテアーゼ産生菌 本発明による新規プロテアーゼは、微生物を用いて生産
される。その生産菌としては、Flavobacterium 属に属
し、上記性質を有するプロテアーゼを産生する能力を有
するものであればよい。
される。その生産菌としては、Flavobacterium 属に属
し、上記性質を有するプロテアーゼを産生する能力を有
するものであればよい。
【００１０】本発明によるプロテアーゼを産生する能力
を有する微生物の好ましい具体例としては、Flavobacte
rium balustinum Ｐ１０４株が挙げられる。この菌株
は、本発明者がサケの内蔵から分離した微生物であり、
工業技術院生命工学工業技術研究所に平成７年２月１７
日付けで寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５００６のもと寄託
されている。
を有する微生物の好ましい具体例としては、Flavobacte
rium balustinum Ｐ１０４株が挙げられる。この菌株
は、本発明者がサケの内蔵から分離した微生物であり、
工業技術院生命工学工業技術研究所に平成７年２月１７
日付けで寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５００６のもと寄託
されている。
【００１１】本発明によるFlavobacterium balustinum
Ｐ１０４株の菌学的性質を列挙すれば下記の通りであ
る。 (1) 形態的性質 形状は単桿菌であり、大きさは０．４〜０．５×１．７
〜１．９μｍである。 (2) 培地上での性状 寒天培地上で生育し、黄色色素を生成した。 (3) 生育最適条件 ｐＨ：５〜９の範囲で生育し、最適生育ｐＨは中性付近
であった。 温度：１０〜３０℃の範囲で生育し、最適生育温度は２
０℃付近であった。 (4) 好気性、嫌気性の区別：好気性 (5) グラム染色：陰性 (6) 生化学的性状 Flavobacterium balustinum P104株の主な生化学的性状
は、次の第１表に示されるとおりであった。
Ｐ１０４株の菌学的性質を列挙すれば下記の通りであ
る。 (1) 形態的性質 形状は単桿菌であり、大きさは０．４〜０．５×１．７
〜１．９μｍである。 (2) 培地上での性状 寒天培地上で生育し、黄色色素を生成した。 (3) 生育最適条件 ｐＨ：５〜９の範囲で生育し、最適生育ｐＨは中性付近
であった。 温度：１０〜３０℃の範囲で生育し、最適生育温度は２
０℃付近であった。 (4) 好気性、嫌気性の区別：好気性 (5) グラム染色：陰性 (6) 生化学的性状 Flavobacterium balustinum P104株の主な生化学的性状
は、次の第１表に示されるとおりであった。
【００１２】
【表１】
【００１３】以上の性質から、本菌株は、Flavobacteri
um indologenesと判断されたが、後記する実施例３に記
載したような１６ＳリボソームＲＮＡをコードするＤＮ
Ａの塩基配列を既知の微生物と比較したところ、本菌株
はFlavobacterium balustinum に分類されるのが適切と
判断された。
um indologenesと判断されたが、後記する実施例３に記
載したような１６ＳリボソームＲＮＡをコードするＤＮ
Ａの塩基配列を既知の微生物と比較したところ、本菌株
はFlavobacterium balustinum に分類されるのが適切と
判断された。
【００１４】本発明に使用される菌株の培養にあたって
は、培地は液体でも固体でもよいが通常は液体培地によ
る振とう培養、または通気攪拌培養が用いられる。
は、培地は液体でも固体でもよいが通常は液体培地によ
る振とう培養、または通気攪拌培養が用いられる。
【００１５】この微生物を培養する培地としては、生育
に適し、プロテアーゼを生産し得るものであればどのよ
うなものでもよい。すなわち炭素源としては、例えばグ
ルコース、トレハロース、フラクトース、マルトース、
シュークロース、澱粉、マルトオリゴ糖等が用いられ
る。窒素源としては例えばペプトン、酵母エキス、麦芽
エキス、肉エキス、大豆粉、綿実粉、コーンステイープ
リカー、各種アミノ酸類、及びその塩類、硝酸塩等が用
いられる。その他、燐酸マグネシウム、カルシウム、ナ
トリウム、カリウム、鉄、マンガン等の無機塩類、さら
に必要に応じてその他の栄養物を程よく含有する合成培
地または天然培地を使用する事ができる。
に適し、プロテアーゼを生産し得るものであればどのよ
うなものでもよい。すなわち炭素源としては、例えばグ
ルコース、トレハロース、フラクトース、マルトース、
シュークロース、澱粉、マルトオリゴ糖等が用いられ
る。窒素源としては例えばペプトン、酵母エキス、麦芽
エキス、肉エキス、大豆粉、綿実粉、コーンステイープ
リカー、各種アミノ酸類、及びその塩類、硝酸塩等が用
いられる。その他、燐酸マグネシウム、カルシウム、ナ
トリウム、カリウム、鉄、マンガン等の無機塩類、さら
に必要に応じてその他の栄養物を程よく含有する合成培
地または天然培地を使用する事ができる。
【００１６】培地のｐＨ、培養温度などの培養条件はプ
ロテアーゼを生産する範囲内で適宜変更し得るが、液体
振とう培養、または通気攪拌培養の場合は、ｐＨは中性
付近、培養温度は２０℃付近の培養が適当である。
ロテアーゼを生産する範囲内で適宜変更し得るが、液体
振とう培養、または通気攪拌培養の場合は、ｐＨは中性
付近、培養温度は２０℃付近の培養が適当である。
【００１７】本発明において利用されるトレハラーゼは
菌体の細胞壁、菌体内、培養上清に存在し、その使用形
態としては、菌体、菌体や培養上清等からの粗酵素、あ
るいは抽出精製酵素などいずれの形態でも良い。また公
知の方法により固定化したものも利用できる。
菌体の細胞壁、菌体内、培養上清に存在し、その使用形
態としては、菌体、菌体や培養上清等からの粗酵素、あ
るいは抽出精製酵素などいずれの形態でも良い。また公
知の方法により固定化したものも利用できる。
【００１８】酵素の採取 上記培養液からの本発明によるプロテアーゼの採取、精
製には、既知の精製法が単独もしくは併用して利用でき
る。本発明によるプロテアーゼは、主として菌体外、す
なわち培養液中に分泌されるため、例えば瀘過または遠
心分離により菌体を除去することによって容易に粗酵素
液を得ることができる。この粗酵素は、さらに既知の精
製法によって精製することができる。好ましい精製法と
しては、硫安などによる塩析、有機溶媒（例えば、メタ
ノール、エタノール、アセトンなど）による沈殿法、生
デンプンによる吸着法、限外瀘過、ゲル瀘過クロマトグ
ラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、その他の各
種クロマトグラフィーなどが挙げられる。好ましい精製
法の具体例は後記する実施例において記載する。
製には、既知の精製法が単独もしくは併用して利用でき
る。本発明によるプロテアーゼは、主として菌体外、す
なわち培養液中に分泌されるため、例えば瀘過または遠
心分離により菌体を除去することによって容易に粗酵素
液を得ることができる。この粗酵素は、さらに既知の精
製法によって精製することができる。好ましい精製法と
しては、硫安などによる塩析、有機溶媒（例えば、メタ
ノール、エタノール、アセトンなど）による沈殿法、生
デンプンによる吸着法、限外瀘過、ゲル瀘過クロマトグ
ラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、その他の各
種クロマトグラフィーなどが挙げられる。好ましい精製
法の具体例は後記する実施例において記載する。
【００１９】酵素の性質 本発明によるプロテアーゼの性質を検討した。その結果
は次に示される通りである。
は次に示される通りである。
【００２０】 作用および基質特異性 本酵素はカゼインやジメチルカゼインといった高分子タ
ンパク質や変性タンパク質をよく分解し、またコラーゲ
ン変性タンパク質のゼラチンもカゼインに比べ約５０％
分解した。しかし、その他の天然タンパク質にはあまり
作用せず、特にリボヌクレアーゼは全く作用しなかっ
た。
ンパク質や変性タンパク質をよく分解し、またコラーゲ
ン変性タンパク質のゼラチンもカゼインに比べ約５０％
分解した。しかし、その他の天然タンパク質にはあまり
作用せず、特にリボヌクレアーゼは全く作用しなかっ
た。
【００２１】工業的に使用されているサブチリシンにな
どは基質特異性がなく、ほとんどのタンパク質に作用す
るとされている。一方で、本酵素は比較的酵素タンパク
質が入り込みやすい高分子タンパク質や変性タンパク質
のみに作用すると考えられる。
どは基質特異性がなく、ほとんどのタンパク質に作用す
るとされている。一方で、本酵素は比較的酵素タンパク
質が入り込みやすい高分子タンパク質や変性タンパク質
のみに作用すると考えられる。
【００２２】この本酵素と類似している低温菌Pseudomo
nas fluorescens 由来のプロテアーゼもまた同様にカゼ
インやジメチルカゼインなどの高分子タンパク質や変性
タンパク質をよく分解した。しかしながら、本酵素と異
なり、これは天然球状タンパク質であるヘモグロビンや
ウシ血清アルブミンなどもジメチルカゼインとの比較に
おいて約４０％程度分解する性質を有している。従っ
て、本酵素はこの公知の酵素よりも基質特異性が高いと
思われる。
nas fluorescens 由来のプロテアーゼもまた同様にカゼ
インやジメチルカゼインなどの高分子タンパク質や変性
タンパク質をよく分解した。しかしながら、本酵素と異
なり、これは天然球状タンパク質であるヘモグロビンや
ウシ血清アルブミンなどもジメチルカゼインとの比較に
おいて約４０％程度分解する性質を有している。従っ
て、本酵素はこの公知の酵素よりも基質特異性が高いと
思われる。
【００２３】 至適温度および安定温度 本酵素の作用温度は約４０℃である。また、ｐＨ７、１
時間保持の条件下で、３０℃までの温度ではほとんど失
活せず、４０℃で約４０％失活し、５０℃で急速に失活
し約１５分で完全に失活する。従って、本酵素は低温で
効率よく触媒作用を示す、いわゆる低温酵素である。
時間保持の条件下で、３０℃までの温度ではほとんど失
活せず、４０℃で約４０％失活し、５０℃で急速に失活
し約１５分で完全に失活する。従って、本酵素は低温で
効率よく触媒作用を示す、いわゆる低温酵素である。
【００２４】 至適ｐＨおよび安定ｐＨ 本酵素の至適作用ｐＨは７．５である。また、本酵素
は、２０℃、１時間保持の条件下でｐＨ６．０〜１０．
０において安定である。従って、本酵素は中性プロテア
ーゼであり、極端な酸性、アルカリ性では作用しなくな
る。また、極端な酸性またはアルカリ性下で保存すると
失活する。
は、２０℃、１時間保持の条件下でｐＨ６．０〜１０．
０において安定である。従って、本酵素は中性プロテア
ーゼであり、極端な酸性、アルカリ性では作用しなくな
る。また、極端な酸性またはアルカリ性下で保存すると
失活する。
【００２５】 分子量 本酵素の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲル濾過法
によって測定したところ、約３８ｋＤａであった。
によって測定したところ、約３８ｋＤａであった。
【００２６】 等電点 本酵素の等電点を等電点電気泳動法で測定したところ、
等電点は約４．５であった。
等電点は約４．５であった。
【００２７】 活性の阻害 本酵素は、フェニルメチルスルフォニルフルオライド、
ヨードアセトアミドによってそのプロテアーゼ活性を阻
害されることはなく、エチレンジアミン四酢酸、２，２
−ビピリジル、クエン酸、シュウ酸によって顕著に阻害
された。このことから、プロテアーゼ活性は金属イオン
に依存することが分かり、本酵素は金属プロテアーゼで
あることが示唆された。またクエン酸およびシュウ酸で
阻害さることから、カルシウムにプロテアーゼ活性が依
存していると考えられる。
ヨードアセトアミドによってそのプロテアーゼ活性を阻
害されることはなく、エチレンジアミン四酢酸、２，２
−ビピリジル、クエン酸、シュウ酸によって顕著に阻害
された。このことから、プロテアーゼ活性は金属イオン
に依存することが分かり、本酵素は金属プロテアーゼで
あることが示唆された。またクエン酸およびシュウ酸で
阻害さることから、カルシウムにプロテアーゼ活性が依
存していると考えられる。
【００２８】また本酵素は、Ａｇ+ 、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、
Ｃｏ2+およびＦｅ2+により顕著にそのプロテアーゼ活性
が阻害された。とりわけ、Ａｇ+ による阻害が強かっ
た。また、Ｍｇ2+およびＣａ2+によっては全く阻害され
なかった。
Ｃｏ2+およびＦｅ2+により顕著にそのプロテアーゼ活性
が阻害された。とりわけ、Ａｇ+ による阻害が強かっ
た。また、Ｍｇ2+およびＣａ2+によっては全く阻害され
なかった。
【００２９】 酵素反応速度論 本酵素は基質（例えばカゼイン）濃度に対してMichaeli
s-Menten型の反応速度を示す。温度の上昇とともにＫm
値が減少し、Ｖmax 値が上昇しする。さらに、本酵素の
Ｋcat 値は１０〜４０℃の範囲で著しく高い値を示す。
一般的には酵素は基質過剰になると阻害されていく傾向
が見られる。しかし、本酵素の場合、至適作用温度に近
づくことで、Ｋcat 値が増加していくことにから、消化
物による阻害があまり見られなくなる点で有利である。
また、本酵素のLineweaver-Burkプロットから、温度に
よる阻害形式は混合型であると思われる。すなわち、温
度による影響が非競争型阻害か不競争型阻害であり、消
化物による影響が競争型阻害であると思われる。
s-Menten型の反応速度を示す。温度の上昇とともにＫm
値が減少し、Ｖmax 値が上昇しする。さらに、本酵素の
Ｋcat 値は１０〜４０℃の範囲で著しく高い値を示す。
一般的には酵素は基質過剰になると阻害されていく傾向
が見られる。しかし、本酵素の場合、至適作用温度に近
づくことで、Ｋcat 値が増加していくことにから、消化
物による阻害があまり見られなくなる点で有利である。
また、本酵素のLineweaver-Burkプロットから、温度に
よる阻害形式は混合型であると思われる。すなわち、温
度による影響が非競争型阻害か不競争型阻害であり、消
化物による影響が競争型阻害であると思われる。
【００３０】酵素の利用 本発明による低温性プロテアーゼは、低温に最適温度を
持つ。そこで、本発明による低温性プロテアーゼによれ
ば、低温環境においてタンパク質の分解反応を行うこと
が可能となる。例えば、衣類用洗剤組成物に添加するこ
とで、低水温でも利用可能な洗剤を実現できる。この洗
剤組成物は、本発明による低温性プロテアーゼが添加さ
れた以外は、常法に従って構成することができる。すな
わち、洗剤用界面活性剤、漂白剤、ビルダーなど通常の
洗剤組成物成分と組み合わせて構成することができる。
持つ。そこで、本発明による低温性プロテアーゼによれ
ば、低温環境においてタンパク質の分解反応を行うこと
が可能となる。例えば、衣類用洗剤組成物に添加するこ
とで、低水温でも利用可能な洗剤を実現できる。この洗
剤組成物は、本発明による低温性プロテアーゼが添加さ
れた以外は、常法に従って構成することができる。すな
わち、洗剤用界面活性剤、漂白剤、ビルダーなど通常の
洗剤組成物成分と組み合わせて構成することができる。
【００３１】さらに、本発明による低温性プロテアーゼ
は、低温で反応を進行させることができる。従って、反
応系に常温で揮発性である有機溶媒が存在する場合であ
っても、その有機溶媒成分を揮発させることのない低温
下で反応を行うことができる。またさらに、本発明によ
るプロテアーゼを用いて食品の品質改善を行う場合、低
温で反応が進むことから、食品の腐敗を有効に防止でき
る点でも有利である。また、本発明によるプロテアーゼ
が提供されたことで、低温性細菌の生理学的機能および
低温度への適用機構を解明が進むことが期待される。
は、低温で反応を進行させることができる。従って、反
応系に常温で揮発性である有機溶媒が存在する場合であ
っても、その有機溶媒成分を揮発させることのない低温
下で反応を行うことができる。またさらに、本発明によ
るプロテアーゼを用いて食品の品質改善を行う場合、低
温で反応が進むことから、食品の腐敗を有効に防止でき
る点でも有利である。また、本発明によるプロテアーゼ
が提供されたことで、低温性細菌の生理学的機能および
低温度への適用機構を解明が進むことが期待される。
【００３２】
【実施例】以下に、具体的な実施例を示し本発明をより
詳細に説明するが、本発明がこれらの実施例に限定され
ないことは言うまでもない。
詳細に説明するが、本発明がこれらの実施例に限定され
ないことは言うまでもない。
【００３３】なお、特に断らない限り以下において、タ
ンパク質量の定量は色素結合法であるバイオラッドプロ
テインアッセイを用いて行った。また、クロマトグラム
のタンパク質の溶出は２８０ｎｍ紫外部の吸収を測定し
た。
ンパク質量の定量は色素結合法であるバイオラッドプロ
テインアッセイを用いて行った。また、クロマトグラム
のタンパク質の溶出は２８０ｎｍ紫外部の吸収を測定し
た。
【００３４】また、プロテアーゼ活性の測定は次のよう
に行った。 （ａ）アゾカゼインによるタンパク質の分解活性 １％（Ｗ／Ｖ）アゾカゼインを含む０．０６７Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）０．３ｍＬに対して、試料酵素液
０．０５ｍＬ加え、３０分間、３０℃で保温した。その
後、６％トリクロロ酢酸溶液で反応を止め、約１５分後
遠心分離（１４０００ｒｐｍ、室温、５分）した。その
上清を分光光度計にて３４０ｎｍの吸光度を測定した。
この酵素活性の算出は１分間に３４０ｎｍの吸光度が
０．００１増加したとき１ＡＣＵ（azocasein digestio
n unit）とした。
に行った。 （ａ）アゾカゼインによるタンパク質の分解活性 １％（Ｗ／Ｖ）アゾカゼインを含む０．０６７Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）０．３ｍＬに対して、試料酵素液
０．０５ｍＬ加え、３０分間、３０℃で保温した。その
後、６％トリクロロ酢酸溶液で反応を止め、約１５分後
遠心分離（１４０００ｒｐｍ、室温、５分）した。その
上清を分光光度計にて３４０ｎｍの吸光度を測定した。
この酵素活性の算出は１分間に３４０ｎｍの吸光度が
０．００１増加したとき１ＡＣＵ（azocasein digestio
n unit）とした。
【００３５】（ｂ）改良Ａｎｓｏｎ法によるタンパク質
の分解活性 １％（Ｗ／Ｖ）のタンパク質を含む０．０６７Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）０．３ｍＬに対して、試料酵素液
０．０５ｍＬ加え、３０分間、３０℃で保温した。その
後、７．５％トリクロロ酢酸溶液で反応を止め、約３０
分後遠心分離（１４０００ｒｐｍ、室温、５分）した。
その上清を分光光度計にて２８０ｎｍの吸光度を測定し
た。この酵素活性の算出は１分間にチロシンが１μｍｏ
ｌ生成したときを１ＡＵ（modified Anson unit ）とし
た。
の分解活性 １％（Ｗ／Ｖ）のタンパク質を含む０．０６７Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）０．３ｍＬに対して、試料酵素液
０．０５ｍＬ加え、３０分間、３０℃で保温した。その
後、７．５％トリクロロ酢酸溶液で反応を止め、約３０
分後遠心分離（１４０００ｒｐｍ、室温、５分）した。
その上清を分光光度計にて２８０ｎｍの吸光度を測定し
た。この酵素活性の算出は１分間にチロシンが１μｍｏ
ｌ生成したときを１ＡＵ（modified Anson unit ）とし
た。
【００３６】実施例１ （１）新規菌株のスクリーニング 新規菌株の分離は、寒天平板培地上で行った。分離試料
（サケの内臓）を１％（Ｗ／Ｖ）になるよう生理的食塩
水に懸濁し、その上清を原液とした。この原液の１０2
希釈液を調整した。原液および１０2 希釈液をスクリー
ニング用寒天平板培地上（ポリペプトン ３ｇ／Ｌ、酵
母エキス １０ｇ／Ｌ カゼインナトリウム １０ｇ／
Ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２ｇ／Ｌ、寒天 ２．
０ｇ／Ｌ、９ｃｍペトリ皿）に０．２ｍＬずつ散布し、
１０℃で、３日間培養した。上記の寒天平板上に生育し
たコロニーの中で、よく生育したものを選び継体培養
し、同時に保存寒天平板にも植菌した。
（サケの内臓）を１％（Ｗ／Ｖ）になるよう生理的食塩
水に懸濁し、その上清を原液とした。この原液の１０2
希釈液を調整した。原液および１０2 希釈液をスクリー
ニング用寒天平板培地上（ポリペプトン ３ｇ／Ｌ、酵
母エキス １０ｇ／Ｌ カゼインナトリウム １０ｇ／
Ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２ｇ／Ｌ、寒天 ２．
０ｇ／Ｌ、９ｃｍペトリ皿）に０．２ｍＬずつ散布し、
１０℃で、３日間培養した。上記の寒天平板上に生育し
たコロニーの中で、よく生育したものを選び継体培養
し、同時に保存寒天平板にも植菌した。
【００３７】菌体外酵素活性検定は寒天平板培地上で行
った。上記スクリーニング用寒天平板培地に分離した菌
株を画線で植菌し、１０℃で、３日間培養した。その
後、菌の生育した寒天平板培地に１０％トリクロロ酢酸
溶液を散布し、コロニー周辺の透明斑の有無によりプロ
テアーゼ生成菌であるか検定した。
った。上記スクリーニング用寒天平板培地に分離した菌
株を画線で植菌し、１０℃で、３日間培養した。その
後、菌の生育した寒天平板培地に１０％トリクロロ酢酸
溶液を散布し、コロニー周辺の透明斑の有無によりプロ
テアーゼ生成菌であるか検定した。
【００３８】（２）分離菌株の培養および酵素の生成 菌の生育活性を安定させるために、前培養培地２５ｍＬ
（ポリペプトン １０ｇ／Ｌ、内エキス １０ｇ／Ｌ、
ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０、１
００ｍＬ三角フラスコ）に分離菌を保存培地より接種
し、１０℃、４８時間、１５０ｒｐｍで回転浸盪培養
（TAITECNR-80)した。本培養は酵素生成用培地２５ｍＬ
（ポリペプトン ５ｇ／Ｌ、酵母エキス ２．５ｇ／
Ｌ、カゼインナトリウム ５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ ０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０、１００ｍＬ三角フラ
スコ）に前培養液０．２５ｍＬを接種し、１０℃、７２
時間、１５０ｒｐｍで回転浸盪培養した。なお、培地は
主としてオートクレーブで１．２ｋｇｆ／ｃｍ２ｇａｕ
ｇｅ（１２１℃）、１５分間、高圧蒸気殺菌した。分離
した菌株は保存用寒天平板培地を用いて、１０℃で保存
した。なお２週間〜１ケ月で継体培養した。
（ポリペプトン １０ｇ／Ｌ、内エキス １０ｇ／Ｌ、
ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０、１
００ｍＬ三角フラスコ）に分離菌を保存培地より接種
し、１０℃、４８時間、１５０ｒｐｍで回転浸盪培養
（TAITECNR-80)した。本培養は酵素生成用培地２５ｍＬ
（ポリペプトン ５ｇ／Ｌ、酵母エキス ２．５ｇ／
Ｌ、カゼインナトリウム ５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ ０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０、１００ｍＬ三角フラ
スコ）に前培養液０．２５ｍＬを接種し、１０℃、７２
時間、１５０ｒｐｍで回転浸盪培養した。なお、培地は
主としてオートクレーブで１．２ｋｇｆ／ｃｍ２ｇａｕ
ｇｅ（１２１℃）、１５分間、高圧蒸気殺菌した。分離
した菌株は保存用寒天平板培地を用いて、１０℃で保存
した。なお２週間〜１ケ月で継体培養した。
【００３９】（３）プロテアーゼ活性の測定 上記（２）で得られた培養液を、遠心分離（１７０００
×ｇ、４℃、１５分）により清澄した。その上清を粗酵
素液とした。プロテアーゼ活性はアゾカゼインの分解に
より測定した。１％（Ｗ／Ｖ）アゾカゼインを含む００
６７Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を０．３ｍＬに対し
て、粗酵素液０．０５ｍＬ加え３０分間、２０℃で保温
した。その後６％トリクロロ酢酸溶液で反応を止め、約
１５分後遠心分離（１４０００ｒｐｍ、室温、５分）し
た。その上清を分光光度計（ベックマンＤＵ６４０）に
て３４０ｎｍの吸光度を測定した。この酵素活性は、１
分間に３４０ｎｍの吸光度が０．００１増加したとき１
ＡＣＵ（azocasein digestion unit ）とした。
×ｇ、４℃、１５分）により清澄した。その上清を粗酵
素液とした。プロテアーゼ活性はアゾカゼインの分解に
より測定した。１％（Ｗ／Ｖ）アゾカゼインを含む００
６７Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を０．３ｍＬに対し
て、粗酵素液０．０５ｍＬ加え３０分間、２０℃で保温
した。その後６％トリクロロ酢酸溶液で反応を止め、約
１５分後遠心分離（１４０００ｒｐｍ、室温、５分）し
た。その上清を分光光度計（ベックマンＤＵ６４０）に
て３４０ｎｍの吸光度を測定した。この酵素活性は、１
分間に３４０ｎｍの吸光度が０．００１増加したとき１
ＡＣＵ（azocasein digestion unit ）とした。
【００４０】以上の（１）〜（３）の結果、プロテアー
ゼ活性を有する菌株Ｐ１０４が分離された。この菌株の
プロテアーゼ活性は次の表に示される通りであった。な
お、生育度は分譲株であるCytophaga xantha IFO 14972
の生育の様子を＋＋として比較したものである。 プロテアーゼ活性を有する菌株 菌 株 生育度 プロテアーゼ活性 ( ×103 ACU/mL) Ｐ１０４ ＋＋＋ ０．９８２
ゼ活性を有する菌株Ｐ１０４が分離された。この菌株の
プロテアーゼ活性は次の表に示される通りであった。な
お、生育度は分譲株であるCytophaga xantha IFO 14972
の生育の様子を＋＋として比較したものである。 プロテアーゼ活性を有する菌株 菌 株 生育度 プロテアーゼ活性 ( ×103 ACU/mL) Ｐ１０４ ＋＋＋ ０．９８２
【００４１】実施例２：Ｐ１０４のプロテアーゼ活性 プロテアーゼ生成菌株Ｐ１０４株の培養液を用い、反応
温度を０〜６０℃まで変化させた酵素活性の影響を調べ
た。なお、市販酵素のBacillus licheniformis由来のプ
ロテアーゼであるサブチリシン・カールスベルグ（Subt
ilisin Carlsberg Sigma）についても同様に温度特性を
調べた。
温度を０〜６０℃まで変化させた酵素活性の影響を調べ
た。なお、市販酵素のBacillus licheniformis由来のプ
ロテアーゼであるサブチリシン・カールスベルグ（Subt
ilisin Carlsberg Sigma）についても同様に温度特性を
調べた。
【００４２】その結果は、図１に示される通りであっ
た。図中で、□はＰ１０４株、そして△はサブチリシン
・カールスベルグを表す。
た。図中で、□はＰ１０４株、そして△はサブチリシン
・カールスベルグを表す。
【００４３】それぞれのプロテアーゼの最適温度は、Ｐ
１０４株の菌体外プロテアーゼが４０℃、サブチリシン
・カールスベルグが６０℃以上であった。Ｐ１０４株の
菌体外プロテアーゼの菌体外プロテアーゼは２０℃付近
で最適温度の４０％以上のプロテアーゼ活性を保持して
いたのに対し、サブチリシン・カールスベルグは最適温
度の約１０％のプロテアーゼ活性しか保持していなかっ
た。
１０４株の菌体外プロテアーゼが４０℃、サブチリシン
・カールスベルグが６０℃以上であった。Ｐ１０４株の
菌体外プロテアーゼの菌体外プロテアーゼは２０℃付近
で最適温度の４０％以上のプロテアーゼ活性を保持して
いたのに対し、サブチリシン・カールスベルグは最適温
度の約１０％のプロテアーゼ活性しか保持していなかっ
た。
【００４４】またさらに、それぞれの菌体外プロテアー
ゼの酵素反応の１０〜４０℃までの活性化エネルギーを
求めた。その結果は次の表に示される通りであった。
ゼの酵素反応の１０〜４０℃までの活性化エネルギーを
求めた。その結果は次の表に示される通りであった。
【００４５】 菌体 活性化エネルギー （kJ/mol） Ｐ１０４ ３９．８ Bacillus subtillis ５８．３
【００４６】実施例３：１６ＳリボソームＲＮＡをコー
ドするＤＮＡ塩基配列によるＰ１０４株の同定 実施例２で得られた培養液を、１．５ｍＬマイクロチュ
ーブに取り遠心分離により集菌した。ゲノムＤＮＡを抽
出し、ＰＣＲ（polymerase chain reaction ）により１
６ＳリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ塩基配列を増
幅した。その後、サンガー法を用いたＤＮＡシークエン
スにより塩基配列を決定し、ＧｅｎＢａｎｋのデータベ
ースと比較し、同定した。使用したプライマーは下記の
通りであり、ＰＣＲには１Ｆ−Linkおよび５Ｒ−Linkを
用いた。
ドするＤＮＡ塩基配列によるＰ１０４株の同定 実施例２で得られた培養液を、１．５ｍＬマイクロチュ
ーブに取り遠心分離により集菌した。ゲノムＤＮＡを抽
出し、ＰＣＲ（polymerase chain reaction ）により１
６ＳリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ塩基配列を増
幅した。その後、サンガー法を用いたＤＮＡシークエン
スにより塩基配列を決定し、ＧｅｎＢａｎｋのデータベ
ースと比較し、同定した。使用したプライマーは下記の
通りであり、ＰＣＲには１Ｆ−Linkおよび５Ｒ−Linkを
用いた。
【００４７】プライマー １Ｆ−Link：５′−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡ
ＧＴＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧ−３′ ３Ｒ−Link：５′−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡ
ＣＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＴ−３′ ３Ｆ−Link：５′−ＴＧＴＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣ
ＡＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＧＴＡ−３′ ５Ｒ−Link：５′−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡ
ＧＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡ−３′
ＧＴＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧ−３′ ３Ｒ−Link：５′−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡ
ＣＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＴ−３′ ３Ｆ−Link：５′−ＴＧＴＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣ
ＡＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＧＴＡ−３′ ５Ｒ−Link：５′−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡ
ＧＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡ−３′
【００４８】Genbank のデータベースと比較した結果は
次の表に示される通りであった。表中、Query はＰ１０
４株由来の16S リボゾームＲＮＡ遺伝子であり、Subjec
tはGenbank nucleic acid sequence database Release
85.0 のFlavacterium balustinum 16S リボゾームＲＮ
Ａ(FVBRR16SH) である。その結果、同菌株はFlavobacte
rium balustinum と同定された。よってＰ１０４株をFl
avobacterium balustinum Ｐ１０４と表記することとし
た。
次の表に示される通りであった。表中、Query はＰ１０
４株由来の16S リボゾームＲＮＡ遺伝子であり、Subjec
tはGenbank nucleic acid sequence database Release
85.0 のFlavacterium balustinum 16S リボゾームＲＮ
Ａ(FVBRR16SH) である。その結果、同菌株はFlavobacte
rium balustinum と同定された。よってＰ１０４株をFl
avobacterium balustinum Ｐ１０４と表記することとし
た。
【００４９】
【表２】
【００５０】
【表３】
【００５１】
【表４】
【００５２】
【表５】
【００５３】
【表６】
【００５４】実施例４：Flavobacterium balustinum Ｐ
１０４の培養 （１）菌体濃度の測定 実施例２で得られた培養液をバクテリアカウンターの１
セル中に０〜５細胞になるように生理的食塩水で希釈し
た。その試料を光学顕微鏡を用いて、細胞の数を数え
た。その希釈培養液をそれぞれ分光光度計を用いて６６
０ｎｍにて懸濁を測定し、細胞の数と懸濁の相関を得
た。
１０４の培養 （１）菌体濃度の測定 実施例２で得られた培養液をバクテリアカウンターの１
セル中に０〜５細胞になるように生理的食塩水で希釈し
た。その試料を光学顕微鏡を用いて、細胞の数を数え
た。その希釈培養液をそれぞれ分光光度計を用いて６６
０ｎｍにて懸濁を測定し、細胞の数と懸濁の相関を得
た。
【００５５】Flavobacterium balustinum Ｐ１０４株に
対する懸濁と菌体濃度の関係は次式で与えられた。 （cell／ｍＬ）＝１．１３×１０９×Ａｂｓ．６６０ｎ
ｍ １．１３×１０9 ：検量線から得られるファクターで
ある。
対する懸濁と菌体濃度の関係は次式で与えられた。 （cell／ｍＬ）＝１．１３×１０９×Ａｂｓ．６６０ｎ
ｍ １．１３×１０9 ：検量線から得られるファクターで
ある。
【００５６】（２）ｐＨの影響 Flav.balustinum Ｐ１０４株培養時に、初発ｐＨが菌体
外プロテアーゼ活性および増殖に与える影響を調べるた
め、プロテアーゼ生産培地の初発ｐＨを５〜９まで変化
させ菌株を培養した。その結果は図２に示される通りで
あった。アルカリｐＨではかなり増殖が低下し、プロテ
アーゼ活性も低かった。また酸性ｐＨでは増殖およびプ
ロテアーゼ活性にはあまり大差はなかったが、中性ｐＨ
で最もよく増殖し、プロテアーゼ活性も最も高かった。
外プロテアーゼ活性および増殖に与える影響を調べるた
め、プロテアーゼ生産培地の初発ｐＨを５〜９まで変化
させ菌株を培養した。その結果は図２に示される通りで
あった。アルカリｐＨではかなり増殖が低下し、プロテ
アーゼ活性も低かった。また酸性ｐＨでは増殖およびプ
ロテアーゼ活性にはあまり大差はなかったが、中性ｐＨ
で最もよく増殖し、プロテアーゼ活性も最も高かった。
【００５７】（３）培養温度の影響 Flav.balustinum Ｐ１０４株の培養温度を１０〜３０℃
まで変化させ、培養経過における菌株体外プロテアーゼ
活性の変化およびその増殖を調べた。その結果は図３に
示される通りであった。１０℃および２０℃では良好に
生育した。しかし、３０℃では１０℃、２０℃の定常期
に比べ、約半数しか増殖しなかった。増殖速度は２０℃
が最も速く、培養最適温度は２０℃付近であると思われ
る。
まで変化させ、培養経過における菌株体外プロテアーゼ
活性の変化およびその増殖を調べた。その結果は図３に
示される通りであった。１０℃および２０℃では良好に
生育した。しかし、３０℃では１０℃、２０℃の定常期
に比べ、約半数しか増殖しなかった。増殖速度は２０℃
が最も速く、培養最適温度は２０℃付近であると思われ
る。
【００５８】実施例５：Flav. balustinumＰ１０４株
由来プロテアーゼの精製 （１）菌株の培養 菌の生育活性を安定させるために、分離菌株を下記の保
存培地より、下記の前培養培地２５ｍＬ（１００ｍＬ三
角フラスコ）に接種し、１０℃、４８時間、１５０ｒｐ
ｍで回転振盪培養（TAITEC NR-80）した。本培養は、下
記の本培養培地２５ｍＬ（１０ｍＬ三角フラスコ）に前
培養液０．２５ｍＬ接種し、１０℃、７２時間、１５０
ｒｐｍで回転振盪培養した。
由来プロテアーゼの精製 （１）菌株の培養 菌の生育活性を安定させるために、分離菌株を下記の保
存培地より、下記の前培養培地２５ｍＬ（１００ｍＬ三
角フラスコ）に接種し、１０℃、４８時間、１５０ｒｐ
ｍで回転振盪培養（TAITEC NR-80）した。本培養は、下
記の本培養培地２５ｍＬ（１０ｍＬ三角フラスコ）に前
培養液０．２５ｍＬ接種し、１０℃、７２時間、１５０
ｒｐｍで回転振盪培養した。
【００５９】保存培地： ポリペプトン ３ｇ／Ｌ 酵母エキス ２．５ｇ／Ｌ カゼインナトリウム ２０ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2 Ｏ ０．２ｇ／Ｌ 寒天 ２０ｇ／Ｌ ｐＨ ７．０
【００６０】前培養培地： ポリペプトン ３ｇ／Ｌ 酵母エキス ２．５ｇ／Ｌ カゼインナトリウム １ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2 Ｏ ０．２ｇ／Ｌ ｐＨ ７．０
【００６１】本培養培地： ポリペプトン ３ｇ／Ｌ 酵母エキス ２．５ｇ／Ｌ カゼインナトリウム ５ｇ／Ｌ ＫＨ2 ＰＯ4 ７Ｈ2 Ｏ ３ｇ／L ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2 Ｏ ０．２ｇ／Ｌ ｐＨ ７．０
【００６２】培地等は主としてオートクレープで１．２
kgf/cm2 gauge （１２１℃）、１５分間、高圧蒸気殺菌
した。Flav. balustinumＰ１０４株は保存用寒天平板培
地を用いて、１０℃で保存したなお、２週間〜１ヶ月で
継体培養した。
kgf/cm2 gauge （１２１℃）、１５分間、高圧蒸気殺菌
した。Flav. balustinumＰ１０４株は保存用寒天平板培
地を用いて、１０℃で保存したなお、２週間〜１ヶ月で
継体培養した。
【００６３】（２）プロテアーゼの精製 （ａ）硫安塩析 上記（１）で得られた培養液を、遠心分離（１７０００
×ｇ、４℃、１５分）により清澄にした。その上清を粗
酵素液とした。その粗酵素液に対し、氷冷下で、硫安を
５０％飽和になるように加えた。０℃に保ち、１時間ゆ
っくりと攪拌したのち遠心分離（１７０００×ｇ、４
℃、１５分）して沈殿させ、０〜５０％飽和画分を得
た。硫安の添加量は、２５℃での飽和濃度添加量を用い
た。
×ｇ、４℃、１５分）により清澄にした。その上清を粗
酵素液とした。その粗酵素液に対し、氷冷下で、硫安を
５０％飽和になるように加えた。０℃に保ち、１時間ゆ
っくりと攪拌したのち遠心分離（１７０００×ｇ、４
℃、１５分）して沈殿させ、０〜５０％飽和画分を得
た。硫安の添加量は、２５℃での飽和濃度添加量を用い
た。
【００６４】（ｂ）ゲル濾過 次に、HiLoad 16/60 Superdex 200 prep gradeカラムに
よるゲル濾過を行った。すべてのカラムクロマトグラフ
ィーの操作は４℃で行い、装置はHiLoad System 50（フ
ァルマシアバイオテク社製）を用いた。HiLoad 16/60 S
uperdex 200 prep gradeカラムに、線速度約６０ｃｍ／
ｈでゲル体積の３倍以上（４００ｍＬ）の２０ｍＭ Ｂ
ｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０）を流し平衡化し
た。硫安塩析後の試料酵素液をカラムにSuperloop を用
いて５ｍＬ添加した。溶出液２０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉ
ｓ緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて線速度約６０ｃｍ／ｈ
で溶出し、５ｍＬずつ分取した。
よるゲル濾過を行った。すべてのカラムクロマトグラフ
ィーの操作は４℃で行い、装置はHiLoad System 50（フ
ァルマシアバイオテク社製）を用いた。HiLoad 16/60 S
uperdex 200 prep gradeカラムに、線速度約６０ｃｍ／
ｈでゲル体積の３倍以上（４００ｍＬ）の２０ｍＭ Ｂ
ｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０）を流し平衡化し
た。硫安塩析後の試料酵素液をカラムにSuperloop を用
いて５ｍＬ添加した。溶出液２０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉ
ｓ緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて線速度約６０ｃｍ／ｈ
で溶出し、５ｍＬずつ分取した。
【００６５】溶出曲線は図４に示されるとおりであっ
た。排除限界には培養液に含まれていた高分子量の黄色
透明色のタンパク質が溶出した。その後の２８０ｎｍの
紫外部吸収のピークは無色透明のタンパク質が溶出し
た。この画分プロテアーゼ活性を含んでおり、プロテア
ーゼに付着しているフラグメントを除くことができたと
思われる。
た。排除限界には培養液に含まれていた高分子量の黄色
透明色のタンパク質が溶出した。その後の２８０ｎｍの
紫外部吸収のピークは無色透明のタンパク質が溶出し
た。この画分プロテアーゼ活性を含んでおり、プロテア
ーゼに付着しているフラグメントを除くことができたと
思われる。
【００６６】（ｃ）カラムクロマトグラフィー 次に、Q Sepharose HPカラムによるイオン交換クロマト
グラフィーを行った。カラムは、HiTrapQ(１ｍＬ）を５
個直列に連結し、φ０．７×１２．５ｃｍのカラムを用
いた。上記のカラムに２０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝
液（ｐＨ６．０）を用いて、線速度約３５ｃｍ／ｈでゲ
ル体積の５倍以上（２５ｍＬ）平衡化した。
グラフィーを行った。カラムは、HiTrapQ(１ｍＬ）を５
個直列に連結し、φ０．７×１２．５ｃｍのカラムを用
いた。上記のカラムに２０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝
液（ｐＨ６．０）を用いて、線速度約３５ｃｍ／ｈでゲ
ル体積の５倍以上（２５ｍＬ）平衡化した。
【００６７】上記のゲル濾過で溶出したプロテアーゼ活
性画分の試料酵素液を、カラムにSuperloop を用いて線
速度約１７．５ｃｍ／ｈで添加した。溶出は２０ｍＭ
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液に１Ｍ ＮａＣｌを加えたもの
を用いて、直線型イオン強度増加勾配（０〜１５０ｍ
Ｍ）により線速度約３５ｃｍ／ｈ、８０ｍＬで溶出し、
２ｍＬずつ分取した。溶出曲線は図５に示されるとおり
であった。なお、以上の精製の概要は次の表に示される
とおりであった。
性画分の試料酵素液を、カラムにSuperloop を用いて線
速度約１７．５ｃｍ／ｈで添加した。溶出は２０ｍＭ
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液に１Ｍ ＮａＣｌを加えたもの
を用いて、直線型イオン強度増加勾配（０〜１５０ｍ
Ｍ）により線速度約３５ｃｍ／ｈ、８０ｍＬで溶出し、
２ｍＬずつ分取した。溶出曲線は図５に示されるとおり
であった。なお、以上の精製の概要は次の表に示される
とおりであった。
【００６８】
【表７】
【００６９】実施例６：プロテアーゼの精製純度および
分子量の測定 （１）電気泳動 （ａ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ） 支持体として１ｍｍ厚の１０％ポリアクリルアミドゲル
を用いた。電気泳動は２０ｍＡ通電し、ブロモフェノー
ルブルー（ＢＰＢ）が下端まで泳動するまで行った。染
色方法は３０％メタノール、１０％酢酸水溶液に０．０
２％クーマシーブリリアントブルーＲ２５０を溶解した
ものに１時間染色し、脱色液（３０％メタノール、１０
％酢酸）で一晩脱色した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子
量の測定は、ホスホリラーゼ、アルブミン、オブアルブ
ミン、カルボニックアンヒドラーゼ、トリプシンインヒ
ビター、α−ラクタブミンをマーカとして行った。ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥの結果および検量線はそれぞれ図６および
７に示されるとおりであった。本酵素は単一バンドであ
ったため、サブユニット構造ではない単一タンパク質で
あると思われる。
分子量の測定 （１）電気泳動 （ａ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ） 支持体として１ｍｍ厚の１０％ポリアクリルアミドゲル
を用いた。電気泳動は２０ｍＡ通電し、ブロモフェノー
ルブルー（ＢＰＢ）が下端まで泳動するまで行った。染
色方法は３０％メタノール、１０％酢酸水溶液に０．０
２％クーマシーブリリアントブルーＲ２５０を溶解した
ものに１時間染色し、脱色液（３０％メタノール、１０
％酢酸）で一晩脱色した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子
量の測定は、ホスホリラーゼ、アルブミン、オブアルブ
ミン、カルボニックアンヒドラーゼ、トリプシンインヒ
ビター、α−ラクタブミンをマーカとして行った。ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥの結果および検量線はそれぞれ図６および
７に示されるとおりであった。本酵素は単一バンドであ
ったため、サブユニット構造ではない単一タンパク質で
あると思われる。
【００７０】（ｂ）ゲル濾過法 Hiprep 16/60 Sephacryl S-100 HR を用いてゲル濾過法
により分子量を測定した。平衡化は線速度約３０ｃｍ／
ｈでゲル体積の３倍以上（４００ｍＬ）の５０ｍＭリン
酸緩衝液に０．１５Ｍ ＮａＣｌを加えたもの（ｐＨ
７．０）を用いて行った。その後、試料酵素液を１ｍＬ
添加し、線速度約３０ｃｍ／ｈで同様の緩衝液を用いて
溶出し、２ｍＬずつ分取した。排除体積の測定はブルー
デキストラン２０００、標準タンパク質はアルブミン
（６７ｋＤａ）、オブアルブミン（４３ｋＤａ）、キモ
トリプシノーゲンＡ（２５ｋＤａ）、リボヌクレアーゼ
Ａ（１３．７ｋＤａ）を用いた。
により分子量を測定した。平衡化は線速度約３０ｃｍ／
ｈでゲル体積の３倍以上（４００ｍＬ）の５０ｍＭリン
酸緩衝液に０．１５Ｍ ＮａＣｌを加えたもの（ｐＨ
７．０）を用いて行った。その後、試料酵素液を１ｍＬ
添加し、線速度約３０ｃｍ／ｈで同様の緩衝液を用いて
溶出し、２ｍＬずつ分取した。排除体積の測定はブルー
デキストラン２０００、標準タンパク質はアルブミン
（６７ｋＤａ）、オブアルブミン（４３ｋＤａ）、キモ
トリプシノーゲンＡ（２５ｋＤａ）、リボヌクレアーゼ
Ａ（１３．７ｋＤａ）を用いた。
【００７１】結果は、図８に示されるとおりであった。
なお、タンパク質による２８０ｎｍの紫外部吸収と酵素
活性が一致した。また、本酵素の紫外部吸収曲線は吸収
極大が２７８ｎｍであり、可視部の吸収はなかった。こ
れらにより、本酵素の性質を調べるには十分な精製度で
あると考えられた。
なお、タンパク質による２８０ｎｍの紫外部吸収と酵素
活性が一致した。また、本酵素の紫外部吸収曲線は吸収
極大が２７８ｎｍであり、可視部の吸収はなかった。こ
れらにより、本酵素の性質を調べるには十分な精製度で
あると考えられた。
【００７２】実施例７：等電点電気泳動 等電点電気泳動（IEF isoelectric focusing）をPhast
system（ファルマシアバイオテク社製）を用いて行っ
た。ゲルとしてＩＥＦ３−９を用い、試料は陽極より３
ｃｍ離れたゲル上に添加した。電気泳動は２０００Ｖ、
２．５ｍＡ、１５℃、４１０Ｖｈで行った。染色方法
は、２０％ＴＣＡ溶液により、２０℃で５分固定し、洗
浄・脱色液（３０％メタノール、１０％酢酸）にて２分
洗浄した。次に洗浄・脱色液に０．０２％クーマシーブ
リリアントブルーＲ２５０を溶解したものにより、５０
℃で１０分脱色した。ｐＩマーカーはBroad pI Calibra
tionkit（ファルマシアバイオテク社製）を用いた。等
電点電気泳動の結果及び検量線は図９および１０に示さ
れるとおりであった。本酵素はほとんど単一バンドとし
て染色され、その等電点はｐＨ４．５であった。
system（ファルマシアバイオテク社製）を用いて行っ
た。ゲルとしてＩＥＦ３−９を用い、試料は陽極より３
ｃｍ離れたゲル上に添加した。電気泳動は２０００Ｖ、
２．５ｍＡ、１５℃、４１０Ｖｈで行った。染色方法
は、２０％ＴＣＡ溶液により、２０℃で５分固定し、洗
浄・脱色液（３０％メタノール、１０％酢酸）にて２分
洗浄した。次に洗浄・脱色液に０．０２％クーマシーブ
リリアントブルーＲ２５０を溶解したものにより、５０
℃で１０分脱色した。ｐＩマーカーはBroad pI Calibra
tionkit（ファルマシアバイオテク社製）を用いた。等
電点電気泳動の結果及び検量線は図９および１０に示さ
れるとおりであった。本酵素はほとんど単一バンドとし
て染色され、その等電点はｐＨ４．５であった。
【００７３】実施例８：酵素反応へのｐＨによる影響 本酵素を用いてアゾカゼインの分解反応を種々のｐＨに
おいて実施した。反応液の緩衝液の組成はそれぞれ６７
ｍＭで、酢酸緩衝液（ｐＨ４−５．５）、ＫＨ2 ＰＯ4
−Ｎａ2 ＨＰＯ4 （ｐＨ６．０−８．０）、Ｎａ2
Ｂ4 Ｏ7−ＨＣｌ（ｐＨ８．０−９．０）、Ｎａ2 Ｂ4
Ｏ7 −ＮａＯＨ（ｐＨ９．５−１０．０）、Ｎａ2 Ｈ
ＰＯ4 −ＮａＯＨ（ｐＨ１０．５−１２．０）とし
た。その結果は、図１１に示されるとおりであった。
おいて実施した。反応液の緩衝液の組成はそれぞれ６７
ｍＭで、酢酸緩衝液（ｐＨ４−５．５）、ＫＨ2 ＰＯ4
−Ｎａ2 ＨＰＯ4 （ｐＨ６．０−８．０）、Ｎａ2
Ｂ4 Ｏ7−ＨＣｌ（ｐＨ８．０−９．０）、Ｎａ2 Ｂ4
Ｏ7 −ＮａＯＨ（ｐＨ９．５−１０．０）、Ｎａ2 Ｈ
ＰＯ4 −ＮａＯＨ（ｐＨ１０．５−１２．０）とし
た。その結果は、図１１に示されるとおりであった。
【００７４】至適ｐＨであるｐＨ７．５の相対活性がｐ
Ｈ６．０〜ｐＨ１０．０まで約８０％以上で維持され
た。よって、本酵素は中性ｐＨを中心としてかなり広範
囲に作用することが分かった。しかし、ｐＨ５．５以下
の酸性ｐＨやｐＨ１０．５以上のアルカリｐＨではあま
り作用せず、ｐＨ１２ではプロテアーゼ活性は失活して
しまった。
Ｈ６．０〜ｐＨ１０．０まで約８０％以上で維持され
た。よって、本酵素は中性ｐＨを中心としてかなり広範
囲に作用することが分かった。しかし、ｐＨ５．５以下
の酸性ｐＨやｐＨ１０．５以上のアルカリｐＨではあま
り作用せず、ｐＨ１２ではプロテアーゼ活性は失活して
しまった。
【００７５】実施例９：プロテアーゼのｐＨ安定性 本酵素をＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ（バイオラッド社製）を用
いてそれぞれのｐＨの緩衝液に交換した。用いた緩衝液
はそれぞれ６７ｍＭで、酢酸緩衝液（ｐＨ４−５）、Ｋ
Ｈ2 ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 （ｐＨ６−８）、グリ
シン−ＮａＯＨ（ｐＨ９−１０）、Ｎａ2 ＨＰＯ4 −
ＮａＯＨ（ｐＨ１１−１２）を用いた。緩衝液を交換し
た後、２０℃で１時間保温し、残存プロテアーゼ活性を
調べた。その結果は、図１２に示される通りであった。
いてそれぞれのｐＨの緩衝液に交換した。用いた緩衝液
はそれぞれ６７ｍＭで、酢酸緩衝液（ｐＨ４−５）、Ｋ
Ｈ2 ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 （ｐＨ６−８）、グリ
シン−ＮａＯＨ（ｐＨ９−１０）、Ｎａ2 ＨＰＯ4 −
ＮａＯＨ（ｐＨ１１−１２）を用いた。緩衝液を交換し
た後、２０℃で１時間保温し、残存プロテアーゼ活性を
調べた。その結果は、図１２に示される通りであった。
【００７６】本酵素は、２０℃、１時間の条件下で、ｐ
Ｈ６．０〜ｐＨ１０．０の範囲で安定であり、ｐＨ４．
０およびｐＨ１２．０では上記の条件で失活することが
分かった。
Ｈ６．０〜ｐＨ１０．０の範囲で安定であり、ｐＨ４．
０およびｐＨ１２．０では上記の条件で失活することが
分かった。
【００７７】実施例１０：酵素反応への温度の影響 本酵素を用いてアゾカゼインの分解反応を種々の温度下
において実施した。反応温度は０〜７０℃までせ変化さ
せた。
において実施した。反応温度は０〜７０℃までせ変化さ
せた。
【００７８】また、市販酵素のサブチリシン・カールス
ベルグ、Staphylococcus aurcub Ｖ８由来のプロテアー
ゼであるＶ８プロテアーゼ、サビナーゼ（ノボノルディ
スク）およびアルカラーゼ（ノボノルディスク）につい
ても同様の反応を行った。基質過剰量で、酵素すべてが
酵素基質複合体として存在していると考えた場合のＫca
t で表した結果を図１３に示す。図中で、□は本酵素、
◇はＶ８プロテアーゼ、○はサブチリシン・カールスベ
ルグ、△はサビナーゼ、そして▽はアルカラーゼであ
る。
ベルグ、Staphylococcus aurcub Ｖ８由来のプロテアー
ゼであるＶ８プロテアーゼ、サビナーゼ（ノボノルディ
スク）およびアルカラーゼ（ノボノルディスク）につい
ても同様の反応を行った。基質過剰量で、酵素すべてが
酵素基質複合体として存在していると考えた場合のＫca
t で表した結果を図１３に示す。図中で、□は本酵素、
◇はＶ８プロテアーゼ、○はサブチリシン・カールスベ
ルグ、△はサビナーゼ、そして▽はアルカラーゼであ
る。
【００７９】本酵素の至適作用温度は４０℃であった。
至適作用温度以上の酵素反応温度では急速に失活してい
ことが分かった。そして市販のプロテアーゼはどの酵素
も至適作用温度が５０℃以上であった。また、Ｋcat 値
は本酵素が比較したどのプロテアーゼより１０〜４０℃
の範囲で著しく高い値を示した。
至適作用温度以上の酵素反応温度では急速に失活してい
ことが分かった。そして市販のプロテアーゼはどの酵素
も至適作用温度が５０℃以上であった。また、Ｋcat 値
は本酵素が比較したどのプロテアーゼより１０〜４０℃
の範囲で著しく高い値を示した。
【００８０】実施例１１：プロテアーゼの温度安定性 本酵素を２０〜５０℃で保温した。その活性の経時的変
化は図１４に示されるとおりであった。図中で、□は２
０℃、◇は３０℃、○は４０℃、そして△は５０℃であ
る。
化は図１４に示されるとおりであった。図中で、□は２
０℃、◇は３０℃、○は４０℃、そして△は５０℃であ
る。
【００８１】本酵素は１時間の２０℃、３０℃での保温
ではあまり失活はしなかった。しかし、４０℃での保温
では徐々に失活していき、１時間後には約６０％しか残
存プロテアーゼ活性がなかった。そして、５０℃での保
温では急速に失活していき１５分後に完全に失活してし
まった。前実験で比較した他のプロテアーゼではまだ至
適温度より低い温度であるので本酵素は熱に対して不安
定であると考えられる。
ではあまり失活はしなかった。しかし、４０℃での保温
では徐々に失活していき、１時間後には約６０％しか残
存プロテアーゼ活性がなかった。そして、５０℃での保
温では急速に失活していき１５分後に完全に失活してし
まった。前実験で比較した他のプロテアーゼではまだ至
適温度より低い温度であるので本酵素は熱に対して不安
定であると考えられる。
【００８２】実施例１２：阻害剤による影響 阻害剤としては、セリンプロテアーゼに作用するフェニ
ルメチルスルフォニルフルオライド（phenylmethlsulfo
ny flouride PMSF）、システインプロテアーゼに作用す
るヨードアセトアミド（iodoacetamide IAA ）、金属プ
ロテアーゼに作用するエチレンジアミン四酢酸（ethyle
nediaminetetraacetic acid EDTA）、ｏ−フェナントロ
リン（ｏ−phenanthroline）、２，２−ビピリジル
（２，２−bipyridyl ）、およびカルシウムに特異的に
作用するクエン酸（citrate ）、シュウ酸（oxalate ）
を用いた。種々の終濃度になるように阻害剤を加えた
後、２０℃で１時間保温し、残存プロテアーゼ活性を調
べた。
ルメチルスルフォニルフルオライド（phenylmethlsulfo
ny flouride PMSF）、システインプロテアーゼに作用す
るヨードアセトアミド（iodoacetamide IAA ）、金属プ
ロテアーゼに作用するエチレンジアミン四酢酸（ethyle
nediaminetetraacetic acid EDTA）、ｏ−フェナントロ
リン（ｏ−phenanthroline）、２，２−ビピリジル
（２，２−bipyridyl ）、およびカルシウムに特異的に
作用するクエン酸（citrate ）、シュウ酸（oxalate ）
を用いた。種々の終濃度になるように阻害剤を加えた
後、２０℃で１時間保温し、残存プロテアーゼ活性を調
べた。
【００８３】その結果は、次の表に示されるとおりであ
った。 阻害剤による影響 阻害剤 濃 度 残存活性（％） なし １００ ＰＭＳＦ １０ｍＭ ９９ ヨードアセトアミド １０ｍＭ ９４ ＥＤＴＡ １０ｍＭ ８ Ｏ−フェナントロリン １０ｍＭ ９１ ２，２′−ビピリジル １０ｍＭ ３９ クエン酸 １０ｍＭ ４１ １００ｍＭ ０ シュウ酸 １０ｍＭ ４５ １００ｍＭ ０ 本酵素はＰＭＳＦ、ＩＡＡによりプロテアーゼ活性を阻
害されることはなく、ＥＤＴＡ、２，２−ビピリジル、
クエン酸、シュウ酸により顕著に阻害された。このこと
から、プロテアーゼ活性は金属イオンに依存することが
分かり、本酵素は金属プロテアーゼであることが示唆さ
れた。またクエン酸およびシュウ酸で阻害さることか
ら、カルシウムにプロテアーゼ活性が依存していると考
えられる。
った。 阻害剤による影響 阻害剤 濃 度 残存活性（％） なし １００ ＰＭＳＦ １０ｍＭ ９９ ヨードアセトアミド １０ｍＭ ９４ ＥＤＴＡ １０ｍＭ ８ Ｏ−フェナントロリン １０ｍＭ ９１ ２，２′−ビピリジル １０ｍＭ ３９ クエン酸 １０ｍＭ ４１ １００ｍＭ ０ シュウ酸 １０ｍＭ ４５ １００ｍＭ ０ 本酵素はＰＭＳＦ、ＩＡＡによりプロテアーゼ活性を阻
害されることはなく、ＥＤＴＡ、２，２−ビピリジル、
クエン酸、シュウ酸により顕著に阻害された。このこと
から、プロテアーゼ活性は金属イオンに依存することが
分かり、本酵素は金属プロテアーゼであることが示唆さ
れた。またクエン酸およびシュウ酸で阻害さることか
ら、カルシウムにプロテアーゼ活性が依存していると考
えられる。
【００８４】実施例１３：タンパク質変性剤による影響 タンパク質変性剤としてＳＤＳおよび尿素を用いた。そ
れぞれの濃度になるようにタンパク質変性剤を加えた
後、２０℃で１時間保温し、残存プロテアーゼ活性を調
べた。
れぞれの濃度になるようにタンパク質変性剤を加えた
後、２０℃で１時間保温し、残存プロテアーゼ活性を調
べた。
【００８５】それらの結果は、ＳＤＳおよび尿素につい
て、それぞれ図１５および図１６に示されるとおりであ
った。
て、それぞれ図１５および図１６に示されるとおりであ
った。
【００８６】ＳＤＳ濃度による影響はかなりの低濃度か
らプロテアーゼ活性を阻害することが分かり０．２５％
の濃度で完全に失活した。尿素濃度による影響は２Ｍま
で全くプロテアーゼ活性を阻害することがなかったが３
Ｍで約４０％の阻害がみられ、４Ｍで完全に失活した。
らプロテアーゼ活性を阻害することが分かり０．２５％
の濃度で完全に失活した。尿素濃度による影響は２Ｍま
で全くプロテアーゼ活性を阻害することがなかったが３
Ｍで約４０％の阻害がみられ、４Ｍで完全に失活した。
【００８７】実施例１４：金属イオンによる影響 金属イオン源として、ＡｇＮＯ3 、ＣｕＳＯ4 、ＺｎＳ
Ｏ4 、ＣｏＳＯ4 、ＦｅＳＯ4 、ＭｎＳＯ4 、ＣａＣｌ
2 、およびＭｇＳＯ4 を用いて添加した。それぞれ１ｍ
Ｍの終濃度になるように金属塩を加えた後、２０℃で１
時間保温し、残存プロテアーゼ活性を調べた。その結果
は、次の表に示されるとおりであった。
Ｏ4 、ＣｏＳＯ4 、ＦｅＳＯ4 、ＭｎＳＯ4 、ＣａＣｌ
2 、およびＭｇＳＯ4 を用いて添加した。それぞれ１ｍ
Ｍの終濃度になるように金属塩を加えた後、２０℃で１
時間保温し、残存プロテアーゼ活性を調べた。その結果
は、次の表に示されるとおりであった。
【００８８】金属イオンによる影響 金属イオン 残存活性（％） なし １００ Ａｇ＋ １１ Ｃｕ２＋ ４４ Ｚｎ２＋ ６１ Ｃｏ２＋ ６３ Ｆｅ２＋ ７６ Ｍｎ２＋ ９５ Ｃａ２＋ １００Ｍｇ２＋ １００
【００８９】本酵素は、Ａｇ+ 、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｃｏ
2+およびＦｅ2+により顕著にプロテアーゼ活性を阻害さ
れた。とりわけ、Ａｇ+ による阻害の結果約１０％のプ
ロテアーゼ活性しか残存しなかった。また、Ｍｇ2+およ
びＣａ2+によっては全く阻害されなかった。
2+およびＦｅ2+により顕著にプロテアーゼ活性を阻害さ
れた。とりわけ、Ａｇ+ による阻害の結果約１０％のプ
ロテアーゼ活性しか残存しなかった。また、Ｍｇ2+およ
びＣａ2+によっては全く阻害されなかった。
【００９０】実施例１５：基質特異性 基質タンパク質として、カゼイン（Hammarsten）、ジメ
チルカゼイン（dimethylcasein）、ゼラチン（gelatin
e）、ヘモグロビン（hemoglobin）、ウシ血清アルブミ
ン（bovine serum albumin）、およびリボヌクレアーゼ
（ribonuclease）を用い、改良Anson 法によってタンパ
ク質分解活性を測定した。また、アゾ化合物修飾タンパ
ク質としてアゾカゼインおよびアゾブルブミンを用い
た。その結果は、次の表に示されるとおりであった。
チルカゼイン（dimethylcasein）、ゼラチン（gelatin
e）、ヘモグロビン（hemoglobin）、ウシ血清アルブミ
ン（bovine serum albumin）、およびリボヌクレアーゼ
（ribonuclease）を用い、改良Anson 法によってタンパ
ク質分解活性を測定した。また、アゾ化合物修飾タンパ
ク質としてアゾカゼインおよびアゾブルブミンを用い
た。その結果は、次の表に示されるとおりであった。
【００９１】基質特異性 基質（１％） 加水分解率（％） カゼイン（Hammarsten) １００ ジメチルカゼイン ９３ ゼラチン ５３ ヘモグロビン １８ ウシ血清アルブミン １７リボヌクレアーゼ ０ アゾカゼイン １００アゾアルブミン ２０
【００９２】本酵素は、カゼイン、ジメチルカゼインな
どの高分子タンパク質および変性タンパク質をよく分解
し、またコラーゲン変性タンパク質のゼラチンについて
も、カゼインと比較し、べ約５０％分解した。しかし、
その他の天然タンパク質にはあまり作用せず、特にリボ
ヌクレアーゼは全く作用しなかった。
どの高分子タンパク質および変性タンパク質をよく分解
し、またコラーゲン変性タンパク質のゼラチンについて
も、カゼインと比較し、べ約５０％分解した。しかし、
その他の天然タンパク質にはあまり作用せず、特にリボ
ヌクレアーゼは全く作用しなかった。
【００９３】実施例１６：カゼインによる酵素反応速度
論 基質としてカゼインを０．０５〜１％まで濃度を変化さ
せた溶液を用い、５〜４０℃まで変化させたLineweaver
-Burk プロットを作成した。それは図１７に示されると
おりであった。図中で、上のグラフ（Ａ）は１／ｖが０
〜２．０の範囲についてであり、また下のグラフ（Ｂ）
は１／ｖが０〜０．２の範囲についてである。また、□
は５℃、◇は１０℃、○は２０℃、△は３０℃、そして
▽は４０℃の場合を表す。また、このLineweaver-Burk
プロットから酵素反応速度定数を求めた。それらは次の
表に示されるとおりであった。
論 基質としてカゼインを０．０５〜１％まで濃度を変化さ
せた溶液を用い、５〜４０℃まで変化させたLineweaver
-Burk プロットを作成した。それは図１７に示されると
おりであった。図中で、上のグラフ（Ａ）は１／ｖが０
〜２．０の範囲についてであり、また下のグラフ（Ｂ）
は１／ｖが０〜０．２の範囲についてである。また、□
は５℃、◇は１０℃、○は２０℃、△は３０℃、そして
▽は４０℃の場合を表す。また、このLineweaver-Burk
プロットから酵素反応速度定数を求めた。それらは次の
表に示されるとおりであった。
【００９４】基質特異性 基質（１％） 加水分解率（％） カゼイン（Hammarsten) １００ ジメチルカゼイン ９３ ゼラチン ５３ ヘモグロビン １８ ウシ血清アルブミン １７リボヌクレアーゼ ０ アゾカゼイン １００アゾアルブミン ２０
【００９５】上記表から明らかなように、本酵素はカゼ
インの濃度に対してMichaelis-Menten型の反応速度を示
した。温度の上昇とともにＫm 値が減少していき、Ｖma
x 値が上昇していった。５℃および１０℃では高濃度の
カゼインで酵素活性が阻害されていた。一般的には酵素
は基質過剰になると阻害されていく傾向が見られる。し
かし、反応温度を上昇させていくと１％のカゼインでは
阻害されなくなった。これは、至適作用温度に近づくこ
とで、Ｋcat 値が増加していくことにより、カゼインの
消化物による阻害があまり見られなくなるためと考えら
れる。また、Lineweaver-Burk プロットから、温度によ
る阻害形式は混合型であると思われる。すなわち、温度
による影響が非競争型阻害か不競争型阻害であり、カゼ
イン消化物による影響が競争型阻害であると思われる。
インの濃度に対してMichaelis-Menten型の反応速度を示
した。温度の上昇とともにＫm 値が減少していき、Ｖma
x 値が上昇していった。５℃および１０℃では高濃度の
カゼインで酵素活性が阻害されていた。一般的には酵素
は基質過剰になると阻害されていく傾向が見られる。し
かし、反応温度を上昇させていくと１％のカゼインでは
阻害されなくなった。これは、至適作用温度に近づくこ
とで、Ｋcat 値が増加していくことにより、カゼインの
消化物による阻害があまり見られなくなるためと考えら
れる。また、Lineweaver-Burk プロットから、温度によ
る阻害形式は混合型であると思われる。すなわち、温度
による影響が非競争型阻害か不競争型阻害であり、カゼ
イン消化物による影響が競争型阻害であると思われる。
【図１】実施例２の結果を表すグラフである。すなわ
ち、Ｐ１０４株由来およびサブチリシン・カールスベル
グ由来のプロテアーゼと温度の関係を示す。
ち、Ｐ１０４株由来およびサブチリシン・カールスベル
グ由来のプロテアーゼと温度の関係を示す。
【図２】実施例４（２）の結果を表すグラフである。す
なわち、初発ｐＨが、Flav.balustinum Ｐ１０４株の菌
体外プロテアーゼ活性および増殖に与える影響を示す。
なわち、初発ｐＨが、Flav.balustinum Ｐ１０４株の菌
体外プロテアーゼ活性および増殖に与える影響を示す。
【図３】実施例４（３）の結果を表すグラフである。す
なわち、Flav.balustinum Ｐ１０４株の培養温度が、菌
体外プロテアーゼ活性および増殖に与える影響を示す。
なわち、Flav.balustinum Ｐ１０４株の培養温度が、菌
体外プロテアーゼ活性および増殖に与える影響を示す。
【図４】実施例５（２）（ｂ）のゲル濾過の溶出結果を
表すグラフである。
表すグラフである。
【図５】実施例５（２）（ｃ）のクロマトグラフの溶出
結果を表すグラフである。
結果を表すグラフである。
【図６】実施例６の分子量測定のためのＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅの結果を表す。
Ｅの結果を表す。
【図７】実施例６の分子量測定のための検量線である。
【図８】実施例６の分子量測定のためのゲル濾過の検量
線である。
線である。
【図９】実施例７の等電点電気泳動の結果を表す。
【図１０】実施例７の等電点電気泳動の検量線である。
【図１１】実施例８の結果を表すグラフである。すなわ
ち、本酵素の酵素反応へのｐＨの影響を示す。
ち、本酵素の酵素反応へのｐＨの影響を示す。
【図１２】実施例９の結果を表すグラフである。すなわ
ち、本酵素のｐＨ安定性を示す。
ち、本酵素のｐＨ安定性を示す。
【図１３】実施例１０の結果を表すグラフである。すな
わち、本酵素の酵素反応への温度の影響を示す。
わち、本酵素の酵素反応への温度の影響を示す。
【図１４】実施例１１の結果を表すグラフである。すな
わち、本酵素の温度安定性を示す。
わち、本酵素の温度安定性を示す。
【図１５】実施例１３の結果を表すグラフである。すな
わち、本酵素へのタンパク質変性剤ＳＤＳの影響を示す
グラフである。
わち、本酵素へのタンパク質変性剤ＳＤＳの影響を示す
グラフである。
【図１６】実施例１３の結果を表すグラフである。すな
わち、本酵素へのタンパク質変性剤尿素の影響を示すグ
ラフである。
わち、本酵素へのタンパク質変性剤尿素の影響を示すグ
ラフである。
【図１７】実施例１６において検討した、本酵素Linewe
aver-Burk プロットである。
aver-Burk プロットである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:20）
Claims (8)
- 【請求項１】下記の理化学的性質を有する低温性プロテ
アーゼ。 （ａ）作用および基質特異性：カゼイン、ジメチルカゼ
インに作用してそれを分解するが、リボヌクレアーゼに
は作用しない。 （ｂ）至適温度：至適作用温度は約４０℃である。 （ｃ）温度安定性：ｐＨ７、１時間保持の条件下で、３
０℃までの温度ではほとんど失活せず、４０℃で約４０
％失活し、５０℃で急速に失活し約１５分で完全に失活
する。 - 【請求項２】下記の理化学的性質をさらに有する、請求
項１記載の低温性プロテアーゼ。 （ｄ）至適ｐＨ：至適作用ｐＨは７．５ （ｅ）安定ｐＨ：２０℃、１時間保持の条件下でｐＨ
６．０〜１０．０において安定である。 - 【請求項３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲル濾過法による
分子量が約３８ｋＤａである、請求項１記載の低温性プ
ロテアーゼ。 - 【請求項４】等電点電気泳動法による等電点が約４．５
である、請求項１記載の低温性プロテアーゼ。 - 【請求項５】請求項１〜４いずれか一項記載の低温性プ
ロテアーゼ産生能を有する、Flavobacterium balustinu
m 。 - 【請求項６】１０〜２０℃で良好に生育可能な、請求項
５記載のFlavobacterium balustinum 。 - 【請求項７】Flavobacterium balustinum Ｐ１０４株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−５００６）である、請求項５記載の
Flavobacterium balustinum 。 - 【請求項８】請求項５〜７のいずれか一項記載のFlavob
acterium balustinum を培養し、その培養物から請求項
１記載の低温性プロテアーゼを採取することを含んでな
る、低温性プロテアーゼの製造法。
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|---|---|---|---|
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