CN110208411B - 用于药物代谢检测的羧酸酯酶抑制剂制剂 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种用于药物代谢检测的羧酸酯酶抑制剂制剂，所述羧酸酯酶抑制剂制剂由苯甲基磺酰氟和氯化钙组成，该羧酸酯酶抑制剂制剂抑制率高，且不受抗凝血剂肝素的影响，可以与肝素配合制成血液保存剂。
Description
技术领域
本申请属于药物代谢领域和生物血液样本检测领域，具体地，本申请提供了一种用于药物代谢检测的羧酸酯酶抑制剂制剂，所述羧酸酯酶抑制剂制剂由苯甲基磺酰氟和氯化钙组成，该羧酸酯酶抑制剂制剂抑制率高，且不受抗凝血剂肝素的影响，可以与肝素配合制成血液保存剂。
背景技术
羧酸酯酶(carboxylesterase，CES)属于B族酯酶家族，广泛分布于各种生物中，动物中的羧酸酯酶可以分为CES1-CES5五个家族，以肝脏、肠和肺中含量最高。
羧酸酯酶是一种能催化酯键、酰胺键和硫酯键断裂的水解酶，其作用底物广泛(羧酸酯酶的水解特性尚未研究清楚)，除了执行解毒外源毒素等生物自身的生理功能外，羧酸酯酶在药物代谢中也起到重要作用，羧酸酯酶可以水解大量含酯键、酰胺键和硫酯键的药物或前药，包括血管紧张肽转化酶抑制剂如替莫普利、西拉普利、喹那普利，抗肿瘤药如伊利替康、喜明替康、卡培他滨，麻醉药如、利多卡因、丁卡因、布比卡因、普鲁卡因、可卡因、海洛因。
包括人在内的多数哺乳动物血浆中均存在羧酸酯酶，在研究上述药物以及其他含酯键、酰胺键和硫酯键的已知或未知药物的代谢时，必需考虑血浆中的羧酸酯酶影响，一般考虑取血样后尽快加入羧酸酯酶抑制剂如双(对硝基苯基)磷酸酯(BNPP)，苯甲基磺酰氟(PMSF)，氟化钠等羧酸酯酶抑制剂不可逆地抑制羧酸酯酶活性，其中双(对硝基苯基)磷酸酯(BNPP)由于超过99％的高抑制效率成为首选抑制剂(ZL201010260758.0，Wadkins RM等，Discover y of novel selective inhibitors of human intestinal carboxylesterasefor the am elioration of irinotecan-induced diarrhea:synthesis,quantitativestructure-ac tivity relationship analysis,and biological activity，Mol.Pharmacol，2004年，第65卷，第6期)。苯甲基磺酰氟(PMSF)作为一种广谱的酯酶/蛋白酶抑制剂，虽然对羧酸酯酶有抑制效果，但抑制率不足无法满足药物代谢检测水平的需求，一般仅用作胆碱酯酶抑制剂/提取蛋白时的蛋白酶抑制剂。
药物或药物代谢物的测定一般需要以离心后获得的血浆作为检测样本，离心过程所需的离心机以及洁净的移液环境操作虽然在实验室和医院中容易获得，但是对于条件较差的采血点或移动采血方式，特别是需要在这些不良条件下由少量操作人员大量处理样本时，一般就需要先采用抗凝管采血抑制血液凝固等待到实验室或医院批量进行处理。
申请人在进行药物代谢研究时发现，使用常用的肝素、EDTA抗凝剂采血管采血时加入双(对硝基苯基)磷酸酯(BNPP)抑制羧酸酯酶保存血液样本会很大程度地降低羧酸酯酶抑制效果(抑制效果降低50％左右)，导致样品中相应药物检测结果严重失真。而不使用抗凝采血管采血，则必须对每份样本在10几分钟的时间内完成加入BNPP，混合，离心、取血浆这一系列工作，这在实验室条件下处理少量样本时并无问题，但是在样本量大，特别是需要在较差的条件(如实验动物饲养地、住院患者/行动不便患者采血时)下处理大量样本时，给实验组织带来很大的困难。而现有的其他羧酸酯酶抑制剂如苯甲基磺酰氟、氟化钠、哌唑嗪、噻吩甲酰三氟丙酮由于抑制率，干扰后续检测等原因并不适合此类检测。
因此，本领域有需要开发一种能有效抑制羧酸酯酶活性并与不受抗凝血剂影响的新型羧酸酯酶抑制剂。
发明内容
发明人对上述问题研究中发现，苯甲基磺酰氟配合一定量钙离子组成的羧酸酯酶抑制剂制剂能够有效增强苯甲基磺酰氟对羧酸酯酶的抑制作用，并且由于肝素对钙离子没有/几乎没有螯合作用，该羧酸酯酶抑制剂制剂不受常用肝素抗凝血剂的干扰，可以与肝素配合成血液保存剂一起使用。我们推测这可能是由于钙离子与血液中的CES结合使得CES在三级结构上更好地暴露与苯甲基磺酰氟作用的位置相关。
一方面，本申请提供了一种羧酸酯酶抑制剂制剂，其包含苯甲基磺酰氟和钙离子。
进一步地，所述羧酸酯酶抑制剂制剂由质量比5：1的苯甲基磺酰氟和氯化钙组成。
另一方面，本申请提供了一种用于药物代谢检测的血液保存试剂，包括上述羧酸酯酶抑制剂制剂以及抗凝血剂。
进一步地，所述抗凝血剂为肝素。
进一步地，所述血液保存试剂中苯甲基磺酰氟、氯化钙、肝素的质量比为15：3：1。
进一步地，所述药物为喜树碱类药物。
另一方面，本申请提供了苯甲基磺酰氟、氯化钙和肝素在制备血液保存试剂中的应用。
进一步地，苯甲基磺酰氟、氯化钙、肝素的质量比为15：3：1。
另一方面，本申请提供了一种检测血液中受羧酸酯酶影响的药物浓度的方法，包括向采集的血液样本中加入苯甲基磺酰氟、氯化钙、肝素。
进一步地，苯甲基磺酰氟、氯化钙、肝素的质量比为15：3：1。
本领域技术人员可以理解，苯甲基磺酰氟、氯化钙、肝素可以选用各不同厂家出品的进口和国产产品，只要其纯度或其他性能满足检测所需即可。
本领域技术人员可以理解，所检测的受羧酸酯酶影响的药物包括但不限于，血管紧张肽转化酶抑制剂如替莫普利、西拉普利、喹那普利，抗肿瘤药如伊利替康、喜明替康、卡培他滨，麻醉药如、利多卡因、丁卡因、布比卡因、普鲁卡因、可卡因、海洛因等含酯键、酰胺键和硫酯键的药物或前药。本领域技术人员可以根据本领域现有药物结构特性知识确认。
本领域技术人员可以理解，除肝素类抗凝剂外，其他不大量螯合钙离子的抗凝剂也可以用于本发明。
本领域技术人员可以理解，除苯甲基磺酰氟、氯化钙、肝素外，本申请的羧酸酯酶抑制剂制剂/血液保存剂还可以根据检测目的的要求包含如pH调节剂、等渗剂、防冻剂、抗氧化剂等成分。
本领域技术人员可以理解，本申请羧酸酯酶抑制剂制剂/血液保存剂可以以多种形式存在，包括但不限于液体、固体粉末，用于多种类型的血液收集保存装置中，包括但不限于玻璃类/塑料类材质采血管/真空采血管、采血袋、以及血液检测仪器中的配套容器部件。
本申请的羧酸酯酶抑制剂制剂/血液保存剂，在抗凝血的同时保证了对羧酸酯酶的抑制效果，保证采血后血液储存一段时间后再离心处理取血浆检测仍然能有较高的准确度，使得检测受羧酸酯酶影响的药物的血药浓度时的采血过程大大简化，方便了动物实验过程和临床实验过程。
具体实施方式
所用的主要试剂和仪器如下：
抗凝采血管1：购自江苏康捷，肝素锂抗凝剂；
苯甲基磺酰氟、氯化钙、肝素购自SIGMA(现MERCK)；
伊立替康标准品、7-乙基-10羟基喜树碱(伊立替康仅CES处理后的活性代谢物)标准品购自Toronto Research Chemicals。
HPLC设备购自Waters(717plus进样器、2475检测器)；色谱柱：购自Agilent(Agilent Eclipse Plus C18)，色谱条件为流动相磷酸氢二钠：甲醇：三乙胺50:50:0.07，pH 4.0，激发波长380nm，发射波长550nm，流速0.8mL·min-1，进样量20微升；
雄性SD大鼠：购自广东省医学实验动物中心；
其他设备和试剂采用常规国产或进口型号。
HPLC检测过程
伊立替康标准品配制成50、100、200、500、1000、2000ng·mL-1，7-乙基-10羟基喜树碱标准品配制成5、10、20、60、100、200、400ng·mL-1。按照实施例前述HPLC步骤检测，计算标准曲线，两者标准曲线在50-2000ng·mL-1和5-400ng·mL-1范围内均具有良好的线性关系(r为0.9985和0.9991)。
实施例1抗凝剂对羧酸酯酶抑制剂抑制效果干扰的发现
申请人在进行某现有喜树碱类(出于保密原因，暂不公开其具体名称和实验方案)药物代谢研究时发现一种普遍存在的现象，对于同一患者施用药物后同一时间点所取血样，使用肝素采血管加BNPP后处理后保存8-10小时取血浆检测的血药浓度，与采血直接加入BNPP后处理后立即(数分钟)取血浆检测的血药浓度相比仅有50-70％。
实施例2不同抗凝剂对羧酸酯酶抑制剂抑制效果的干扰
取SD大鼠新鲜血液样本，进行不同的如下处理(每个处理三份重复)：
处理方法1
使用不加抗凝剂采血管，加入伊立替康标准品乙腈溶液配制成约245ng·mL-1的血液样品，直接离心取血浆，零下70摄氏度保存72h后检测；
处理方法2
使用不加抗凝剂采血管，加入伊立替康标准品乙腈溶液配制成约245ng·mL-1的血液样品，加入BNPP 5mg·mL-1，直接离心取血浆，零下70摄氏度保存72h后检测；
处理方法3
使用抗凝采血管1，加入伊立替康标准品乙腈溶液配制成约245ng·mL-1的血液样品，加入BNPP 5mg·mL-1，零下4摄氏度保存8小时后离心取血浆，零下70摄氏度保存72h后检测；处理方法4
使用不加抗凝剂采血管，加入伊立替康标准品乙腈溶液配制成约245ng·mL-1的血液样品，加入苯甲基磺酰氟5mg·mL-1，直接离心取血浆，零下70摄氏度保存72h后检测；
处理方法5
使用自制抗凝采血管(其中加入有对应采血量0.2mg·mL-1的肝素)，加入伊立替康标准品乙腈溶液配制成约245ng·mL-1的血液样品，加入苯甲基磺酰氟5mg·mL-1，零下4摄氏度保存8小时后离心取血浆，零下70摄氏度保存72h后检测；
处理方法6
使用自制抗凝采血管(其中加入有对应采血量0.2mg·mL-1的肝素)，加入伊立替康标准品乙腈溶液配制成约245ng·mL-1的血液样品，加入苯甲基磺酰氟8mg·mL-1，零下4摄氏度保存8小时后离心取血浆，零下70摄氏度保存72h后检测；
处理方法7
使用自制抗凝采血管(其中加入有对应采血量0.2mg·mL-1的肝素和0.2mg·mL-1的氯化钙)，加入伊立替康标准品乙腈溶液配制成约245ng·mL-1的血液样品，加入苯甲基磺酰氟5mg·mL-1，零下4摄氏度保存8小时后离心取血浆，零下70摄氏度保存72h后检测；
结果如下表：
表1：不同羧酸酯酶抑制剂—抗凝剂的效果-1
结果表明肝素等抗凝剂对BNPP的抑制作用有着很强的干扰，使得抑制效果降低了一半左右，完全不能满足药物代谢检测的需要。而苯甲基磺酰氟抑制效果本身不佳，仅有约70％左右，而且这种不佳的抑制效果无法通过简单的提高用量来克服。而肝素、钙离子和苯甲基磺酰氟的组合则在抗凝血的同时取得了很好的抑制效果，虽然8.437的伊立替康浓度：7-乙基-10羟基喜树碱浓度仍然不能满足药物代谢检测的要求，但可以进一步研究优化(除氯化钙外，申请人还使用了其他多种可溶性钙盐，如磷酸二氢钙和硝酸钙，但效果不稳定，仅有一半左右的样品能达到8左右的伊立替康浓度：7-乙基-10羟基喜树碱浓度比例，因此，理论上各种能提供钙离子的钙盐均可以使用，但实践中还需要进一步研究摸索比例、处理条件、其他成分等)。
进一步比例筛选实验(每个处理三份重复，部分比例筛选实验省略，仅保留有代表性的结果)
处理方法7-1
使用自制抗凝采血管(其中加入有对应采血量0.2mg·mL-1的肝素和0.2mg·mL-1的氯化钙)，加入伊立替康标准品乙腈溶液配制成约245ng·mL-1的血液样品，加入苯甲基磺酰氟8mg·mL-1，零下4摄氏度保存8小时后离心取血浆，零下70摄氏度保存72h后检测；
处理方法7-2
使用自制抗凝采血管(其中加入有对应采血量0.2mg·mL-1的肝素和0.1mg·mL-1的氯化钙)，加入伊立替康标准品乙腈溶液配制成约245ng·mL-1的血液样品，加入苯甲基磺酰氟5mg·mL-1，零下4摄氏度保存8小时后离心取血浆，零下70摄氏度保存72h后检测；
处理方法7-3
使用自制抗凝采血管(其中加入有对应采血量0.2mg·mL-1的肝素和1.0mg·mL-1的氯化钙)，加入伊立替康标准品乙腈溶液配制成约245ng·mL-1的血液样品，加入苯甲基磺酰氟5mg·mL-1，零下4摄氏度保存8小时后离心取血浆，零下70摄氏度保存72h后检测；
处理方法7-4
使用自制抗凝采血管(其中加入有对应采血量0.2mg·mL-1的肝素和0.6mg·mL-1的氯化钙)，加入伊立替康标准品乙腈溶液配制成约245ng·mL-1的血液样品，加入苯甲基磺酰氟5mg·mL-1，零下4摄氏度保存8小时后离心取血浆，零下70摄氏度保存72h后检测；
处理方法7-5
使用自制抗凝采血管(其中加入有对应采血量0.2mg·mL-1的肝素和0.6mg·mL-1的氯化钙)，加入伊立替康标准品乙腈溶液配制成约245ng·mL-1的血液样品，加入苯甲基磺酰氟3mg·mL-1，零下4摄氏度保存8小时后离心取血浆，零下70摄氏度保存72h后检测；
结果如下表：
表2：不同羧酸酯酶抑制剂—抗凝剂的效果-2
结果表明，即使在钙离子存在的情况下，而且苯甲基磺酰氟不佳的抑制效果无法通过简单的提高用量来克服。肝素与氯化钙的质量比以1：3为最佳，在此比例下，适当减少苯甲基磺酰氟的用量反而可以提高抑制效果，100.684的伊立替康：7-乙基-10羟基喜树碱比例接近处理方法2，可以用于实际药物检测。
实施例3本申请羧酸酯酶抑制剂制剂/血液保存剂的实际应用效果
将本申请的羧酸酯酶抑制剂制剂/血液保存剂实际用于伊立替康、喜明替康大鼠血药浓度实验。取得了与加入BNPP后立即取血浆检测基本类似的结果。各取一个代表性个体检测结果如下：
表3本申请保存剂用于伊立替康、喜明替康大鼠血药浓度实验
多个个体内的结果类似表3，结果表明，本申请的血液保存剂可以在多种喜树碱类药物检测中有效的同时抗凝并抑制羧酸酯酶活性，8-12小时后(基本满足大量样品采集—运输到实验室所需时间)所保存样品的检测结果与即时处理后的检测结果基本相同，适合用于多种喜树碱类药物的实际检测。
Claims (2)
1.一种检测血液中受羧酸酯酶影响的药物浓度的方法，包括向采集的血液样本中加入血液保存试剂；所述血液保存试剂由质量比15：3：1的苯甲基磺酰氟、氯化钙、肝素组成；所述受羧酸酯酶影响的药物为喜树碱类药物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受羧酸酯酶影响的药物为伊立替康或喜明替康。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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Address after: 310018 room 1-1203, Heda Medicine Valley Center, 291 Fucheng Road, Xiasha street, Qiantang new area, Hangzhou, Zhejiang Applicant after: Zhejiang Longchuan Biomedical Technology Co.,Ltd. Address before: 404c, No. 3, Taiji Road, Yuhang Economic and Technological Development Zone, Hangzhou, Zhejiang 311100 Applicant before: Hangzhou Biyitaide Medical Technology Co.,Ltd. |
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| CB02 | Change of applicant information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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