KR20140099304A - 혈장 중의 아세트산 농도의 측정방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 간편해서 재현성의 높은 가스 크로마토그래피/질량분석법(GC/MS법)에 의한 혈장 중의 아세트산 농도의 측정법, 더 상세하게는, 가스 크로마토그래피/질량분석법(GC/MS법)에 의한 혈장 중의 아세트산 농도의 측정방법으로써, 혈장 중의 아세트산을 메틸-tert-부틸에테르(MTBE)으로 추출하는 공정을 포함하는 방법의 제공에 관한 것이다.

Description

혈장 중의 아세트산 농도의 측정방법{METHOD FOR MEASURING ACETIC ACID CONCENTRATION IN BLOOD PLASMA}
본 특허출원은 일본국특허출원 제2011-287835호(출원일: 2011년 12월 28일)에 대해서 우선권을 주장하는 것으로, 여기에 참조하는 것에 의해서, 그 전체가 본 명세서 중에 삽입되는 것으로 한다.
본 발명은 간편하고 재현성이 높은 가스 크로마토그래피/질량분석법(GC/MS법)에 의한 혈장(특히 인간 혈장) 중의 아세트산 농도의 측정방법에 관한 것이다.
만성신부전 환자 등에 대해서 수행되는 혈액정화 방법 중에서, 가장 일반적인 것으로서 혈액투석요법이 있다. 혈액투석요법은 투석제에 의해 혈액 중의 노폐물의 제거, 제수 등을 하는 것 이외에, 혈청 전해질 성분의 농도의 시정, 산-염기 평형의 시정 등을 수행하는 것을 목적으로 하고 있다.
투석액 중의 알칼리화제로서 이전에는 아세트산염을 사용하는 아세트산 투석이 이루어지고 있었지만, 아세트산에는 혈관확장이나 심기능의 억제와 같은 작용이 발현되었기 때문에, 현재에서는 알칼리화제로서 탄산수소나트륨을 사용한 중탄산투석이 주류가 되어 있다. 그러나, 중탄산투석에 있어서도, pH조절제로서 8∼12 mEq/ℓ의 아세트산이 사용되고, 아세트산의 혈장 중 농도가 상승하는 것에 의해 현저한 알러지 반응을 나타내는 보고도 있기 때문에(비특허문헌 1), 투석치료 중의 환자에 대해서 혈장 중의 아세트산 농도를 측정하고, 거동을 파악하는 것은 매우 중요하다. 그렇지만, 현재, 일본의 의료기관이나 수탁기관에 있어서 혈장 중의 아세트산 농도측정에 의한 검사는 이루어지고 있지 않다.
혈장 중의 아세트산 농도 측정법에 대해서는 효소법(비특허문헌 2∼3), HPLC법(비특허문헌 4∼6), GC법(비특허문헌 7∼9) 및 GC/MS법(비특허문헌 10∼12)이 보고되고 있지만, GC/MS법에서의 측정이 가장 특이성이 높고, 고감도이다.
GC/MS법에 의한 종래의 측정방법에서는 내부 표준물질에 안정 동위체 표지 아세트산을 사용하고 있지 않고, 조작단위의 결과에 불균일이 발생하기 쉬운 점이나(비특허문헌 10 및 12), 추출 전에 염산을 첨가해야 하는 점, 추출용매로 비점이 낮은 디에틸에테르를 사용하고 있는 점 등, 작업공정이 번잡해지는 문제점이 있다(비특허문헌 11 및 12).
Ashizawa Mamiko 들 : 큐슈 인공투석연구회 회지, 26, 87, (1998) Bergmeyer HU, In: Methods of Enzymatic Analysis, 3rd ed,vol VI, p628-639 Bartelt U and Kattermann R: J Clin. Chem. Clin. Biochem. 23: 879-881,1985. Yamamoto M, et al: Rinshoukensa 35(8): 977-880, 1991. Otake K, et al: HDFryouhou:266-269,2008. Stein J, et al: J. Chromatogr. 576: 53-61, 1992. Tollinger CD, et al: Clin. Chem. 25/10: 1787-1790, 1979. Brazier M, et al: Clin. Chim. Acta 148: 261-265 1985. Murase M, et al: J. Chromatogr. B 664: 415-420 1995. Roccchiccioli F, et al: Bio. and Enviro. Mass Sepctrom. 18: 816-819 1989. Pouteau E, et al: J. Mass Spectrom. 36: 798-805 2001. Moreau NM, et al: J. Chromatogr. B784: 395-403 2003.
본 발명의 과제는 GC/MS법에 의한, 간편하고 재현성이 높은 혈장 중의 아세트산 농도측정법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구한 결과, 단백질 제거 후의 원심분리를 실시하지 않고, 직접 액-액추출함으로써 작업공정을 감소시키고, 추가로 추출용매로 비점이 높고, 취급이 용이하고, 추출효율이 높은 메틸-tert-부틸에테르(MTBE)를 사용하는 것에 의해 추출효율을 저하시키지 않고, 작업공정을 간편하게 할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명에는 이하의 것이 포함된다:
[1] 가스 크로마토그래피/질량분석법(GC/MS법)에 의한 혈장 중의 아세트산 농도의 측정방법으로써, 혈장 중의 아세트산을 메틸-tert-부틸에테르(MTBE)로 추출하는 공정을 포함한, 방법.
[2] 상기 [1]에서, 추출 전에 염산을 첨가하는 공정을 포함하지 않는 방법.
[3] 상기 [1] 또는 [2]에서, 혈장을 단백질 제거제로 처리하는 공정을 추가로 포함하는 방법.
[4] 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에서, 단백질 제거제가 설포살리실산을 포함하는 방법.
[5] 상기 [3] 또는 [4]에서, 혈장을 단백질 제거제로 처리하는 공정 후, 원심분리를 실시하지 않고, 혈장 중의 아세트산을 MTBE로 추출하는 공정을 포함하는 방법.
[6] 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에서, 혈장 중에 안정 동위체 표지 아세트산을 첨가하는 공정을 추가로 포함하는 방법.
[7] 상기 [6]에서, 안정 동위체 표지 아세트산이 아세트산 나트륨-1-13C, 아세트산 나트륨-2-13C, 아세트산 나트륨-13C2, 아세트산 나트륨-d3, 아세트산 나트륨-18O2, 아세트산 나트륨-1-13C,d3 및 아세트산 나트륨-2-13C,d3으로부터 선택되는 방법.
[8] 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에서, GC/MS 법이 이온화에 전자 충격법을 사용하는 방법인 방법.
[9] MTBE를 포함하는 GC/MS법에 의한 혈장 중의 아세트산 농도의 측정용 키트.
[10] 상기 [9]에서, 단백질 제거제를 추가로 포함하는 키트.
[11] 상기 [10]에서, 단백질 제거제가 설포살리실산을 포함하는 키트.
[12] 상기 [9] 내지 [11] 중 어느 하나에서, 안정 동위체 표지 아세트산을 추가로 포함하는 키트.
[13] 상기 [12]에서, 안정 동위체 표지 아세트산이 아세트산 나트륨-1-13C, 아세트산 나트륨-2-13C, 아세트산 나트륨-13C2, 아세트산 나트륨-d3, 아세트산 나트륨-18O2, 아세트산 나트륨-1-13C,d3 및 아세트산 나트륨-2-13C,d3으로부터 선택되는 키트.
[14] 상기 [9] 내지 [13] 중 어느 하나에서, 유도체화 시약을 추가로 포함하는 키트.
[15] 상기 [14]에서, 유도체화 시약이 N-메틸-N-(tert-부틸디메틸실릴)트리플루오로아세트아미드인 키트.
본 발명에 의하면, 추출용매로 비점이 높은 MTBE를 사용하는 것에 의해, 아세트산의 추출효율을 향상시키고, 간편 또한 재현성이 높은 인간 혈장 중 아세트산 농도를 얻을 수 있다.
또, 본 발명에 의하면, 추출 전에 염산을 첨가 하지 않고, 게다가, 단백질 제거공정 후에 원심분리를 실시하지 않고 직접 용매 추출할 수 있어, 작업공정을 감소시킬 수 있다.
도 1은 검량선 시료의 아세트산 및 내부 표준물질의 선택이온 검출법(SIM) 크로마토그램을 나타내고 있다. 아세트산 및 내부 표준물질은 각각 7.45 및 7.41분 부근에 용출하고, 분리되고 있었다. 도 1중의 각 기호는 다음과 같다: (a) 아세트산, (b) 내부 표준물질
도 2는 인간 혈장과 검량선 시료(20μmol/ℓ)를 비교한 SIM 크로마토그램을 나타내고 있다. 내부 표준물질의 용출위치에 혈장유래의 방해 피크는 인정되지 않았다. 도 2 중의 각 기호는 다음과 같다: (a)아세트산, (b)내부 표준물질
도 3은 GC/MS법에 있어서의 검량선의 결과를 나타내고 있다. 20∼1000μmol/L의 농도범위에 있어서, 검량선의 직선성은 상관계수(r) 0.999이며, 또한 검량선 각 농도의 상대오차(%RE)는 각각 -5.4∼7.5%이었다.
도 4는 효소법에 있어서의 검량선의 결과를 나타내고 있다.
도 5는 횡축에 GC/MS법을 종축에 효소법의 측정값을 플롯한 결과를 나타내고 있다. 양자의 값은 양호한 상관성을 가지고 있었다(r=0.9922).
도 6은 횡축에 GC/MS법을 100으로 했을 때의 효소법의 값을 플롯한 결과를 나타내고 있다. GC/MS 법의 측정값이 높은 값이 될 수록 양자의 값이 근접하는 경향이 있었다.
본 발명은 가스 크로마토그래피/질량분석법(GC/MS법)에 의한 혈장 중의 아세트산 농도의 측정방법으로써, 혈장 중의 아세트산을 메틸-tert-부틸에테르(MTBE)로 추출하는 공정을 포함하는 방법(이하, 「본 발명의 방법」이라고도 언급한다.)에 관한 것이다.
혈장이란 혈액에 포함되는 액체성분의 하나로 혈액의 55%를 차지한다. 혈청과 피브리노겐으로 이루어지고, 물질의 수송, 가스교환, 혈액응고, 면역에 관여하는 것 이외에, 삼투압이나 수소이온 농도의 조절 등에 의해 내부환경을 조절하는데 중요한 역할을 하고 있다. 본 발명에 있어서 측정대상이 되는 「혈장」으로서는 특별하게 한정되지 않고, 인간, 랫트, 마우스, 개, 원숭이 등의 포유동물의 혈액유래의 것을 들 수 있다. 또, 그 조제방법도 특별하게 한정되지 않고, 종래 공지방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는 채혈 후, 항응고제(헤파린소듐, EDTA-2Na, EDTA-2K 등)가 들어있는 플래스틱 튜브로 옮기고, 빙냉화에서 보존하고, 4℃에서 원심분리 후, 채취한다.
가스 크로마토그래피/질량분석법(GC/MS법)은 유기 화합물(특히 저분자량 성분)의 정성, 정량을 실시하는 분석장치로, 가스 크로마토그래피(GC)와 질량분석(MS) 장치를 결합한 복합장치이다. GC에서 분리한 단일성분에 대해서 MS스펙트럼을 측정하는 것에 의해 성분의 정성을 실시하고, MS에 의해 검출된 이온의 강도에 의해 정량을 실시한다. 본 발명에 있어서의 「가스 크로마토그래피/질량분석법(GC/MS법)」로서는 특별하게 한정되지 않고, 물질의 동정, 정량 등에 일반적으로 사용할 수 있는 것을 들 수 있다. 바람직하게는 이온화에 전자충격(EI)법을 사용하는 방법, 화학이온화(CI)법을 사용하는 방법 등을 들 수 있다(예를 들면, 상기 비특허문헌 10, 11, 12).
본 발명의 방법은 혈장 중의 아세트산을 메틸-tert-부틸에테르(MTBE)로 추출하는 공정을 포함한다.
종래, 혈장 중의 아세트산을 추출하기 위해서는, 헥산, 디에틸에테르 등이 사용되어 왔다. 그렇지만, 디에틸에테르는 비점이 낮아, 취급에 충분하게 주의할 필요가 있었다. 또, 헥산은 아세트산의 추출효율이 낮은 것, 한편, 디에틸에테르는 추출 전에 소정량의 염산(예를 들면, 염산으로서 농염산(12N)을 사용했을 경우, 단백질 제거후의 용액 1㎖에 대해서 0.025∼0.125㎖)을 첨가할 필요가 있는 것 등의 문제도 있어, 결과적으로, 이것들의 용매를 사용했을 경우, 작업공정이 번잡해지고 있었다.
이에 대해서 MTBE는 디에틸에테르보다도 비점이 높고, 또한, 아세트산의 추출효율이 디에틸에테르나 헥산과 비교해서 높기 때문에, 종래의 추출용매에 있어서의 상기 문제는 발생하지 않는다.
본 발명에 있어서, MTBE의 사용량은 혈장의 양에 의거해서 정할 수 있다. 통상, 혈장 0.4㎖에 대해서, MTBE를 0.004∼40㎖, 바람직하게는 0.04∼4㎖ 사용할 수 있다.
상기 MTBE로 추출하는 공정은 통상, 다음과 같이 실시한다. 우선, 혈장에 대해서 소정량의 MTBE를 혼합하고, 그 혼합물을 소정의 시간 교반한다. 교반시간 및 온도는 특별하게 한정되지 않지만, 예를 들면, 교반시간은 30초∼1분, 온도는 15∼30℃로 할 수 있다. 그 후에 원심분리해서 침전을 제거하고, 상청액을 채취한다. 원심분리는 예를 들면, 10000rpm, 5∼10분, 4∼20℃의 조건으로 실시할 수 있다.
상기 조작에 의해, 혈장 중의 아세트산은 상청액(MTBE) 중에 추출된다.
종래, 추출용매로서 디에틸에테르를 사용했을 경우, 소정량의 염산(예를 들면, 염산으로서 농염산(12N)을 사용했을 경우, 단백질 제거후의 용액 1㎖에 대해서 0.025∼0.125㎖)을 추출 전에 혈장 중에 미리 첨가해 둘 필요가 있었다. 이것은, 디에틸에테르를 사용했을 경우, 수용액을 산성으로 할 필요가 있었기 때문이다. 그렇지만, 이번의 비교 토의 결과, 추출용매로서 MTBE를 사용하는 것에 의해, 염산을 필요로 하지 않고, 또한, 디에틸에테르보다도 높은 추출효율이 수득되는 것이 밝혀졌다. 따라서 본 발명의 방법은 종래의 방법보다도 간편 또한 고수율이다.
본 발명의 방법은 혈장을 단백질 제거제로 처리하는 공정을 추가로 포함할 수도 있다. 본 발명의 방법에서 사용하는 단백질 제거제로서는 예를 들면, 설포살리실산, 과염소산, 메타인산 등을 들 수 있고, 바람직하게는 설포살리실산을 들 수 있다.
혈장을 단백질 제거제에 의해 처리함으로써, 혈장 중의 단백질은 응고하고, 혈장 중에 현탁하게 된다. 그 결과, 혈장 중의 단백질이 실질적으로 제거된다 (단백질 제거공정). 종래, 혈장 중에 현탁한 단백질은, GC/MS법 등에 의한 측정에 있어서, 악영향을 미치게 된다고 생각되고 있었기 때문에, 원심분리에 의해 침전시켜서 제거하고, 그 상청액만이 측정에 사용되고 있었다.
본 발명자들은 놀랍게도, 원심분리를 실시하지 않고, 직접, 상기의 MTBE에 의한 아세트산의 추출공정에 사용할 수 있는 것임을 발견했다. 즉, 본 발명에 있어서, 단백질 제거제에 의한 처리후의 원심분리 공정은 필요가 없고, 작업공정은 그 만큼 적어도 되기 때문에, 100검체를 측정하는 경우, 종래의 방법보다도 약 60분이나 작업공정을 단축할 수 있다.
본 발명에 있어서, 단백질 제거제의 사용량은 혈장의 양에 의거해서 정할 수 있다. 통상, 혈장 0.4㎖에 대해서, 예를 들면 10% 설포살리실산을 사용하는 경우, 0.001∼10㎖, 바람직하게는 0.01∼1㎖ 사용할 수 있다. 또, 단백질 제거제의 농도는 적당하게 변경할 수 있고, 그것에 의해 수율을 바꾸는 것이 가능하다.
상기 단백질 제거제로 처리하는 공정은, 통상, 다음과 같이 실시한다. 우선, 혈장에 대해서 소정량의 단백질 제거제를 혼합하고, 그 혼합물을 소정의 시간 교반한다. 교반시간 및 온도는 특별하게 한정되지 않지만, 예를 들면, 교반시간 30초∼1분, 온도 15∼30℃로 할 수 있다. 이에 따라 혈장 중의 단백질은 응고하고, 현탁물이 된다.
종래의 방법에서는, 여기에서 원심분리를 실시하고, 현탁한 단백질을 침전으로서 제거한다. 이에 대해서 본 발명의 방법에서는 단백질 제거제로 처리 후, 원심분리를 실시하지 않고, 다음 공정(통상, MTBE 추출공정)을 실시할 수 있다.
또, 본 발명의 방법에 있어서, 단백질 제거제 처리공정은 통상, 혈장 중의 아세트산을 MTBE로 추출하는 공정 전에 실시한다. 이에 따라 MTBE에 의한 추출 공정에 있어서, 단백질에 의한 방해를 방지할 수 있다.
본 발명의 방법은 혈장 중에 안정 동위체 표지 아세트산을 첨가하는 공정을 추가로 포함할 수도 있다. 안정 동위체란 방사선을 내지 않고, 또한 반영구적으로 존재량도 변하지 않고 존재하는 동위체로, 표지에 사용하는 안정 동위체로서는 탄소(12C 및 13C) 이외에, 수소(1H 및 2H(D)), 산소안정 동위체(16O, 17O, 18O) 등이 존재한다. 안정 동위체 표지 아세트산은 내부 표준물질로서 이용되고, 이것에 의해, 측정 조작단위의 결과의 불균일을 수정할 수 있다.
본 발명에 있어서의 「안정 동위체 표지 아세트산」으로서는 예를 들면, 아세트산 나트륨-1-13C, 아세트산 나트륨-2-13C, 아세트산 나트륨-13C2, 아세트산 나트륨-d3, 아세트산 나트륨-18O2, 아세트산 나트륨-1-13C,d3 및 아세트산 나트륨-2-13C,d3 등을 들 수 있고, 바람직하게는 아세트산 나트륨-2-13C,d3 등을 들 수 있다. 이것들은 시판되고 있으며, 예를 들면, ISOTEC사, Cambridge Isotope Laboratories사 등으로부터 구입할 수 있다.
또, 본 발명의 방법에 있어서, 혈장 중으로의 안정 동위체 표지 아세트산의 첨가는 내부 표준물질이 측정 조작단위의 불균일을 수정하기 위해서 사용되기 때문에, 통상, 단백질 제거제 처리공정 또는 MTBE 추출공정 전에 실시한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 각 공정 후에 수득된 시료에 대해서, 통상, 유도체화 시약을 첨가해서 시료 중의 아세트산을 유도체화하고, GC/MS 법을 사용해서 시료 중의 아세트산 농도를 측정한다. 본 발명에 있어서의 유도체화 시약으로서는 특별하게 한정되지 않지만, 예를 들면, N-메틸-N-(tert-부틸디메틸 실릴)트리플루오로아세트아미드(MTBSTFA), t-부틸디메틸실릴이미다졸(TBDMS) 등을 들 수 있다. 이것들은, 시판되고 있으며, 예를 들면, Sigma-Aldrich사, Fulka사, Pierce사 등으로부터 구입할 수 있다.
본 발명은 추가로, 상기한 본 발명의 GC/MS법에 의한 혈장 중의 아세트산 농도의 측정방법에 사용할 수 있는 혈장 중의 아세트산 농도의 측정용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 상기한 본 발명의 방법에 사용되는 각종 시약을 포함할 수 있으며, 특히, MTBE, 단백질 제거제, 안정 동위체 표지 아세트산, GC/MSHoyo의 유도체화 시약, 아세트산 나트륨 등을 1종 또는 그것 이상 포함할 수 있다.
실시예
[실시예 1]
1. 아세트산 표준액의 조제
아세트산 나트륨(SIGMAALDRICH사, Lot No. MKBD4171V) 82mg을 전자천평칭(Mettler-Toledo International Inc., AX205DR)으로 정밀하게 칭량하고, 정제수로 용해해서 정확하게 10㎖로 하고, 100mmol/ℓ 용액(S)을 조제했다. 추가로, 표 1에 나타내는 바와 같이 메스플라스크를 사용해서 표준액(W1∼W8)을 용시조제했다.
Figure pct00001
2. 내부 표준액의 조제
안정 동위체 표지 아세트산 나트륨(ISOTEC사, Lot No. EK1873: 아세트산 나트륨-2-13C,d3) 8.6mg을 정밀하게 칭량하고, 정제수로 용해해서 정확하게 10㎖로 하고, 10mmol/ℓ 용액(IS)을 조제했다. 다음에 10mmol/ℓ 용액(IS) 2㎖을 메스플라스크에 채취하고, 정제수로 정확하게 10㎖로 하고, 2mmol/ℓ 용액(IS-W1)을 조제했다.
3. 검량선용 시료
검량선용 시료로서 표준액 W3∼8을 사용했다.
4. 시료 전처리법 및 측정방법
폴리프로필렌 튜브에 각 시료(검량선용 시료, 인간 혈장) 400㎕을 각각 채취하고, 내부 표준액 IS-W1 100㎕을 첨가했다. 추가로, 10%설포살리실산(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 시약 특급품) 용액 100㎕을 첨가해 교반했다. 이 용액에 MTBE(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Lot No. EPF0734) 400㎕을 첨가하고, 1분간 교반했다. 그 후에 원심분리(TOMY SEIKO CO., LTD., RX-200)(매분 10000회전, 5분간, 4℃)하고, 상청액 200㎕을 다른 유리병에 채취했다. 다음에 채취액에 N-메틸-N-(tert-부틸디메틸실릴)트리플루오로아세트아미드(MTBSTFA)(ALDRICH사, Lot No. BCBC7878) 5∼10㎕을 첨가하고, 블록히터(TIETECH Co.,Ltd., DTU-2B)로 60℃, 1∼2시간 가온했다. 그 후에 GC/MS(JEOL Ltd., JMS-AMII150)로 이하의 조건에 의해 측정했다.
Figure pct00002

실시예 1의 방법에 의한 검량선 시료의 아세트산 및 내부 표준물질의 SIM 크로마토그램을 도 1에 나타냈다. 각각 7.45 및 7.41분 부근에 용출하고, 내부 표준물질과 아세트산을 분리하고 있다.
인간 혈장과 함께 검량선용 시료를 실시예 1과 마찬가지로 전처리해서 측정하고, 내부 표준물질의 용출위치에 있어서의 방해 피크의 유무를 쌍방의 셀 크로마토그램을 비교해서 평가했다. 도 2에 인간 혈장과 검량선 시료(20μmol/ℓ)를 비교한 SIM 크로마토그램을 나타냈다. 내부 표준물질의 용출위치에 혈장유래의 방해피크는 인정되지 않았다.
검량선용 시료(표준액 W3∼8)를 실시예 1의 방법으로 전처리해서 측정하고, 검량선 각 농도의 상대오차(%RE) 및 직선성을 검토해서 도 3에 검량선의 결과를 나타냈다. 20∼1000μmol/ℓ의 농도범위에 있어서, 검량선의 직선성은 상관계수(r) 0.999이며, 또한 검량선 각 농도의 %RE는 각각 -5.4∼7.5%가 되었다.
이어서, 염산 전처리의 유무에 의한 아세트산 및 안정 동위체 표지 아세트산의 피크 면적을 비교했다. 각 시료 첨가량을 하기에 나타낸다.
[비교예 1] 표준액에서의 검토
1mmol/ℓ 아세트산Na 표준액 400㎕
2mmol/ℓ 안정 동위체 표지 아세트산Na 100㎕
10% 설포살리실산 100㎕
MTBE 또는 디에틸에테르(DEE) 400㎕
6N HCl 또는 H2O 50㎕
상기의 시료를 실시예 1의 방법에 따라서 피크 면적을 얻었다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.
[비교예 2] 혈장검체에서의 검토
혈장검체 400㎕
2mmol/ℓ 안정 동위체 표지 아세트산Na 100㎕
10% 설포살리실산 100㎕
MTBE 또는 디에틸에테르(DEE) 400㎕
6N HCl 또는 H2O 50㎕
상기의 시료를 실시예 1의 방법에 따라서 피크 면적을 얻었다. 그 결과를 표 3에 나타낸다.
Figure pct00003
Figure pct00004
상기 표 2 및 3에서, 표준액 및 혈장 모두, 염산 비첨가의 MTBE에 의한 추출이 가장 추출효율이 좋다고 하는 결과가 수득되었다.
[실시예 2]
1. 표준액의 조제
실시예 1의 1. 아세트산 표준액의 조제에 있어서 조제한 W1∼8을 사용했다.
2. 내부 표준액의 조제
실시예 1의 2. 내부 표준액의 조제에 있어서 조제한 IS-W1을 사용했다.
3. 검량선용 시료
표준액 W3∼8을 검량선용 시료로 했다.
4. 아세트산 첨가 혈장시료
표준액 S180㎕을 10㎖의 메스플라스크에 채취하고, 인간 혈장으로 메스업하고, 아세트산 1800μmol/L 첨가혈장(P1)을 조제했다. 또한 이하에 나타낸 바와 같이 시판의 인간 혈장을 사용해서 아세트산 첨가혈장(P2∼5)을 조제했다.
5. 시료 전처리법 및 측정방법
실시예 1의 4. 시료 전처리법 및 측정방법과 동일하게 시료를 전처리하고, 그 후에 GC/MS(agitation Lent사, 5975CGCMSD)로 이하의 조건에 의해 측정했다.
Figure pct00006
7. 검량선
실시예 1에서 사용한 검량선을 사용했다.
[비교예 3] 효소법(아세틸CoA신타아제법)
1. 검량선용 시료
상기 실시예 2에 있어서 조제한 W2∼8을 사용했다.
2. 아세트산첨가 혈장시료
상기 실시예2에 있어서 조제한 P1∼5을 사용했다.
3. 투석 환자혈장시료
아세트산 함유 투석액 사용환자에 있어서의 투석개시 2 및 4시간 후의 혈장시료(n=45)를 사용했다.
4. 아세트산측정 키트(F-키트 아세트산)에 의한 측정
큐벳에 각 시료(검량선용 시료, 인간 혈장, 아세트산 첨가 혈장시료 및 투석환자 혈장시료) 200㎕을 채취하고, 정제수 800㎕를 첨가한 후, F-키트 아세트산(J.K international사, Lot/Ch.-B.: 12670700)의 첨부문서에 기재되어 있는 방법에 준해서 조작을 실시했다. 단, 키트 부속의 사용 시약 용액은 반량으로 했다.
[측정파장]
파장: 340nm
5. 검량선
검량선용 시료(W2∼8, n=1)의 ΔE로부터, 최소이승법을 사용해서 검량선(Y=aX+b, Y:ΔE, X: 농도 μmol/L)을 작성했다. 검량선의 가중은 실시하지 않았다. 수득된 검량선을 도 4에 나타낸다. 정량범위는 20∼2000μmol/ℓ으로 했다.
[실시예 2 및 비교예 3의 결과의 비교]
1. 농도산출 방법
각 시료의 측정값은 피크 면적비 또는 ΔE를 검량선에 적용시켜서 소수점 2자릿수를 사사오입하고, 산출했다.
2. 상대오차(RE)의 산출방법
이하의 식에 따라서 산출했다.
Figure pct00007
3. 검량선
GC/MS 법(실시예 2) 및 효소법(비교예 3)의 검량선용 시료의 측정결과를 이하의 표 4 및 5에 나타냈다. 양쪽 모두 양호한 결과가 수득되었다.
Figure pct00008
Figure pct00009
4. 혈장 및 아세트산 첨가 혈장시료
GC/MS법(실시예 2) 및 효소법(비교예 3)에 의한 혈장 및 아세트산 첨가 혈장의 측정결과를 이하의 표6 및 7에 나타냈다. GC/MS 법에 있어서는, 어느 쪽의 아세트산 첨가 농도에 있어서도 회수율은 92% 이상으로 양호한 값이었다. 한편, 효소법에 있어서는 아세트산 첨가농도 50 및 150μmol/ℓ에 있어서 90% 이하이었다.
다음에 양자의 측정값을 비교한 결과를 이하의 표 8에 나타냈다. 어느 쪽의 시료에 있어서도 효소법에 비해서, GC/MS 법의 값이 높은 값이고, 또, 아세트산 첨가 농도가 높은 시료일 수록 양자의 측정값은 근접하는 경향에 있었다.
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
5. 투석환자 혈장시료
아세트산 함유 투석액을 사용하고 있는 투석 환자혈장(n=45)을 효소법(비교예 3)으로 측정한 값과 동일검체를 GC/MS법(실시예 2)으로 측정한 값을 표 9에 나타냈다. 45예 중 43예에 있어서 GC/MS법에 의한 측정값이 높은 값을 나타냈다. 또, 횡축에 GC/MS법을 종축에 효소법의 측정값을 플롯한 결과를 도 5에 나타냈다. 양자의 값은 양호한 상관성을 가지고 있었다(r=0.9922).
다음에, 횡축에 GC/MS법에서 수득된 값, 종축에 GC/MS법을 100으로 했을 때의 효소법의 값을 나타낸 결과를 도 6에 나타냈다. GC/MS 법의 측정값이 높은 값이 될 수록 양자의 값이 근접하는 경향에 있었다.
Figure pct00013
이상에서, GC/MS법(실시예 2)은 효소법(비교예 3)보다도 감도 및 특이성이 뛰어나고 있고, 혈장 중 아세트산 농도측정에 있어서 유용한 측정법으로 생각되었다.
또, 효소법은 혈장 중의 방해 물질의 영향을 받기 쉽다고 보고되어 있고 (Bergmeyer HU and Mollering H: In: Methods of Enzymatic Analysis(ed by Bergmeyrer HU, et al), 3rded, vol VI, p.628-645, W2-einheim, Deerfield Beach, Florida, Verlag Chimemine, 184.(1985) 참조), 수득된 결과도 그것을 시사하는 것 이었다.

Claims (15)

  1. 혈장 중의 아세트산을 메틸-tert-부틸에테르(MTBE)로 추출하는 공정을 포함하는, 가스 크로마토그래피/질량분석법(GC/MS법)에 의한 혈장 중의 아세트산 농도의 측정방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 추출 전에 염산을 첨가하는 공정을 포함하지 않는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 혈장을 단백질 제거제로 처리하는 공정을 추가로 포함하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 제거제가 설포살리실산을 포함하는 방법.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 혈장을 단백질 제거제로 처리하는 공정 후, 원심분리를 실시하지 않고, 혈장 중의 아세트산을 MTBE로 추출하는 공정을 포함하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 혈장 중에 안정 동위체 표지 아세트산을 첨가하는 공정을 추가로 포함하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 안정 동위체 표지 아세트산이 아세트산 나트륨-1-13C, 아세트산 나트륨-2-13C, 아세트산 나트륨-13C2, 아세트산 나트륨-d3, 아세트산 나트륨-18O2, 아세트산 나트륨-1-13C,d3 및 아세트산 나트륨-2-13C,d3으로부터 선택되는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, GC/MS법이 이온화에 전자 충격법을 사용하는 방법인 방법.
  9. MTBE를 포함하는 GC/MS법에 의한 혈장 중의 아세트산 농도의 측정용 키트.
  10. 제 9 항에 있어서, 단백질 제거제를 추가로 포함하는 키트.
  11. 제 10 항에 있어서, 단백질 제거제가 설포살리실산을 포함하는 키트.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 안정 동위체 표지 아세트산을 추가로 포함하는 키트.
  13. 제 12 항에 있어서, 안정 동위체 표지 아세트산이 아세트산 나트륨-1-13C, 아세트산 나트륨-2-13C, 아세트산 나트륨-13C2, 아세트산 나트륨-d3, 아세트산 나트륨-18O2, 아세트산 나트륨-1-13C,d3 및 아세트산 나트륨-2-13C,d3으로부터 선택되는 키트.
  14. 제 9 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 유도체화 시약을 추가로 포함하는 키트.
  15. 제 14 항에 있어서, 유도체화 시약이 N-메틸-N-(tert-부틸디메틸실릴)트리플루오로아세트아미드인 키트.
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