JPWO2013099949A1 - 血漿中の酢酸濃度の測定方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、簡便で再現性の高い、ガスクロマトグラフィー／質量分析法（ＧＣ／ＭＳ法）による血漿中の酢酸濃度の測定法、より詳細には、ガスクロマトグラフィー／質量分析法（ＧＣ／ＭＳ法）による血漿中の酢酸濃度の測定方法であって、血漿中の酢酸をメチル-tert-ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で抽出する工程を含む、方法の提供に関する。
Description
本特許出願は、日本国特許出願第２０１１−２８７８３５号（出願日：２０１１年１２月２８日）について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
本発明は、簡便で再現性の高い、ガスクロマトグラフィー／質量分析法（ＧＣ／ＭＳ法）による血漿（特にヒト血漿）中の酢酸濃度の測定方法に関する。
本発明は、簡便で再現性の高い、ガスクロマトグラフィー／質量分析法（ＧＣ／ＭＳ法）による血漿（特にヒト血漿）中の酢酸濃度の測定方法に関する。
慢性腎不全患者などに対して行われる血液浄化方法の中で、最も一般的なものとして血液透析療法がある。血液透析療法は、透析剤により血液中の老廃物の除去、除水などを行うほかに、血清電解質成分の濃度の是正、酸−塩基平衡の是正などを行うことを目的としている。
透析液中のアルカリ化剤として以前は酢酸塩を用いる酢酸透析が行われていたが、酢酸には血管拡張や心機能の抑制といった作用が見られたことから、現在ではアルカリ化剤として炭酸水素ナトリウムを用いた重炭酸透析が主流となっている。しかし、重炭酸透析においても、ｐＨ調節剤として８〜１２ｍＥｑ／Ｌの酢酸が使用され、酢酸の血漿中濃度が上昇することにより顕著なアレルギー反応を示す報告もあることから（非特許文献１）、透析治療中の患者に対し血漿中の酢酸濃度を測定し、挙動を把握することは極めて重要である。しかしながら、現在、日本の医療機関や受託機関において血漿中の酢酸濃度測定による検査は行われていない。
血漿中の酢酸濃度測定法については、酵素法（非特許文献２〜３）、ＨＰＬＣ法（非特許文献４〜６）、ＧＣ法（非特許文献７〜９）及びＧＣ／ＭＳ法（非特許文献１０〜１２）が報告されているが、ＧＣ／ＭＳ法おける測定が最も特異性が高く、高感度である。
ＧＣ／ＭＳ法による従来の測定方法では、内部標準物質に安定同位体標識酢酸を使用しておらず、操作ごとの結果にばらつきが生じやすいことや（非特許文献１０及び１２）、抽出前に塩酸を添加しなければならないこと、抽出溶媒に沸点の低いジエチルエーテルを使用していることなど、作業工程が煩雑になるといった問題点がある（非特許文献１１及び１２）。
芦沢麻美子ら：九州人工透析研究会会誌、26、87、(1998)
Bergmeyer HU、In: Methods of Enzymatic Analysis、3rd ed, vol VI, p628-639
Bartelt U and Kattermann R :J Clin. Chem. Clin. Biochem. 23 : 879-881, 1985.
Yamamoto M, et al : Rinshoukensa 35(8) : 977-880, 1991.
Otake K, et al : HDFryouhou : 266-269, 2008.
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Tollinger CD, et al : Clin. Chem. 25/10 : 1787-1790, 1979.
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Roccchiccioli F, et al : Bio. and Enviro. Mass Sepctrom. 18 : 816-819 1989.
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Moreau NM, et al : J. Chromatogr. B 784 : 395-403 2003.
本発明の課題は、ＧＣ／ＭＳ法による、簡便で再現性の高い血漿中の酢酸濃度測定法を提供することにある。
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、除蛋白後の遠心分離を行わず、直接液-液抽出することで作業工程を減らし、さらに抽出溶媒に沸点が高く、取り扱いの容易で、抽出効率の高いメチル-tert-ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）を用いることにより抽出効率を低下させることなく作業工程を簡便にできることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明には以下のものが含まれる：
［１］ガスクロマトグラフィー／質量分析法（ＧＣ／ＭＳ法）による血漿中の酢酸濃度の測定方法であって、血漿中の酢酸をメチル-tert-ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で抽出する工程を含む、方法。
［２］抽出前に塩酸を添加する工程を含まない上記［１］に記載の方法。
［３］血漿を除蛋白質剤で処理する工程をさらに含む、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］除蛋白質剤が、スルホサリチル酸を含む、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］血漿を除蛋白質剤で処理する工程後、遠心分離を行わずに、血漿中の酢酸をＭＴＢＥで抽出する工程を含む、上記［３］または［４］に記載の方法。
［６］血漿中に安定同位体標識酢酸を添加する工程をさらに含む、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］安定同位体標識酢酸が、酢酸ナトリウム-１-１３Ｃ、酢酸ナトリウム-２-１３Ｃ、酢酸ナトリウム-１３Ｃ２、酢酸ナトリウム-ｄ３、酢酸ナトリウム-１８Ｏ２、酢酸ナトリウム-１-１３Ｃ，ｄ３及び酢酸ナトリウム-２-１３Ｃ，ｄ３から選択される、上記［６］に記載の方法。
［８］ＧＣ／ＭＳ法が、イオン化に電子衝撃法を用いる方法である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］ＭＴＢＥを含む、ＧＣ／ＭＳ法による血漿中の酢酸濃度の測定用キット。
［１０］除蛋白質剤をさらに含む、上記［９］に記載のキット。
［１１］除蛋白質剤が、スルホサリチル酸を含む、上記［１０］に記載のキット。
［１２］安定同位体標識酢酸をさらに含む、上記［９］〜［１１］のいずれかに記載のキット。
［１３］安定同位体標識酢酸が、酢酸ナトリウム-１-１３Ｃ、酢酸ナトリウム-２-１３Ｃ、酢酸ナトリウム-１３Ｃ２、酢酸ナトリウム-ｄ３、酢酸ナトリウム-１８Ｏ２、酢酸ナトリウム-１-１３Ｃ，ｄ３及び酢酸ナトリウム-２-１３Ｃ，ｄ３から選択される、上記［１２］に記載のキット。
［１４］誘導体化試薬をさらに含む、上記［９］〜［１３］のいずれかに記載のキット。
［１５］誘導体化試薬が、N-メチル-N-(tert-ブチルジメチルシリル)トリフルオロアセトアミドである、上記［１４］に記載のキット。
すなわち、本発明には以下のものが含まれる：
［１］ガスクロマトグラフィー／質量分析法（ＧＣ／ＭＳ法）による血漿中の酢酸濃度の測定方法であって、血漿中の酢酸をメチル-tert-ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で抽出する工程を含む、方法。
［２］抽出前に塩酸を添加する工程を含まない上記［１］に記載の方法。
［３］血漿を除蛋白質剤で処理する工程をさらに含む、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］除蛋白質剤が、スルホサリチル酸を含む、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］血漿を除蛋白質剤で処理する工程後、遠心分離を行わずに、血漿中の酢酸をＭＴＢＥで抽出する工程を含む、上記［３］または［４］に記載の方法。
［６］血漿中に安定同位体標識酢酸を添加する工程をさらに含む、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］安定同位体標識酢酸が、酢酸ナトリウム-１-１３Ｃ、酢酸ナトリウム-２-１３Ｃ、酢酸ナトリウム-１３Ｃ２、酢酸ナトリウム-ｄ３、酢酸ナトリウム-１８Ｏ２、酢酸ナトリウム-１-１３Ｃ，ｄ３及び酢酸ナトリウム-２-１３Ｃ，ｄ３から選択される、上記［６］に記載の方法。
［８］ＧＣ／ＭＳ法が、イオン化に電子衝撃法を用いる方法である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］ＭＴＢＥを含む、ＧＣ／ＭＳ法による血漿中の酢酸濃度の測定用キット。
［１０］除蛋白質剤をさらに含む、上記［９］に記載のキット。
［１１］除蛋白質剤が、スルホサリチル酸を含む、上記［１０］に記載のキット。
［１２］安定同位体標識酢酸をさらに含む、上記［９］〜［１１］のいずれかに記載のキット。
［１３］安定同位体標識酢酸が、酢酸ナトリウム-１-１３Ｃ、酢酸ナトリウム-２-１３Ｃ、酢酸ナトリウム-１３Ｃ２、酢酸ナトリウム-ｄ３、酢酸ナトリウム-１８Ｏ２、酢酸ナトリウム-１-１３Ｃ，ｄ３及び酢酸ナトリウム-２-１３Ｃ，ｄ３から選択される、上記［１２］に記載のキット。
［１４］誘導体化試薬をさらに含む、上記［９］〜［１３］のいずれかに記載のキット。
［１５］誘導体化試薬が、N-メチル-N-(tert-ブチルジメチルシリル)トリフルオロアセトアミドである、上記［１４］に記載のキット。
本発明によれば、抽出溶媒に沸点の高いＭＴＢＥを使用することにより、酢酸の抽出効率を向上させ、簡便かつ再現性の高いヒト血漿中酢酸濃度を得ることができる。
また、本発明によれば、抽出前に塩酸を添加することなく、さらには、除蛋白質工程後に遠心分離を行わずに直接溶媒抽出することができ、作業工程を減らすことができる。
また、本発明によれば、抽出前に塩酸を添加することなく、さらには、除蛋白質工程後に遠心分離を行わずに直接溶媒抽出することができ、作業工程を減らすことができる。
本発明は、ガスクロマトグラフィー／質量分析法（ＧＣ／ＭＳ法）による血漿中の酢酸濃度の測定方法であって、血漿中の酢酸をメチル-tert-ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で抽出する工程を含む、方法（以下、「本発明の方法」とも称する。）に関する。
血漿とは血液に含まれる液体成分の一つで血液の５５％を占める。血清とフィブリノーゲンから成り、物質の輸送、ガス交換、血液凝固、免疫に関与するほか、浸透圧や水素イオン濃度の調節などによって内部環境を整えるのに重要な役割を果たしている。本発明において測定対象となる「血漿」としては、特に限定されず、ヒト、ラット、マウス、イヌ、サルなどの哺乳動物の血液由来のものが挙げられる。また、その調製方法も特に限定されず、従来既知の方法を用いることができる。好ましくは、採血後、抗凝固剤（ヘパリンナトリウム、ＥＤＴＡ−２Ｎａ、ＥＤＴＡ−２Ｋ等）入りのプラスチックチューブに移し、氷冷化で保存し、４℃で遠心分離後、採取する。
ガスクロマトグラフィー／質量分析法（ＧＣ／ＭＳ法）は有機化合物（特に低分子量成分）の定性、定量を行う分析装置であり、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）と質量分析(ＭＳ)装置を結合した複合装置である。ＧＣで分離した単一成分についてＭＳスペクトルを測定することにより成分の定性を行い、ＭＳにより検出されたイオンの強度により定量を行う。本発明における「ガスクロマトグラフィー／質量分析法（ＧＣ／ＭＳ法）」としては、特に限定されず、物質の同定、定量などに一般的に用いられるものが挙げられる。好ましくは、イオン化に電子衝撃（ＥＩ）法を用いる方法、化学イオン化（ＣＩ）法を用いる方法などが挙げられる（例えば、上記非特許文献１０、１１、１２）。
本発明の方法は、血漿中の酢酸をメチル-tert-ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で抽出する工程を含む。
従来、血漿中の酢酸を抽出するためには、ヘキサン、ジエチルエーテルなどが用いられてきた。しかしながら、ジエチルエーテルは沸点が低く、取扱いに十分注意する必要があった。また、ヘキサンは酢酸の抽出効率が低いこと、一方、ジエチルエーテルは抽出前に所定量の塩酸（例えば、塩酸として濃塩酸（１２Ｎ）を使用した場合、除蛋白質後の溶液１ｍＬに対して０．０２５〜０．１２５ｍＬ）を添加する必要があることなどの問題もあり、結果として、これらの溶媒を用いた場合、作業工程が煩雑になっていた。
これに対して、ＭＴＢＥは、ジエチルエーテルよりも沸点が高く、かつ、酢酸の抽出効率がジエチルエーテルやヘキサンと比較して高いことから、従来の抽出溶媒における上記問題は生じない。
従来、血漿中の酢酸を抽出するためには、ヘキサン、ジエチルエーテルなどが用いられてきた。しかしながら、ジエチルエーテルは沸点が低く、取扱いに十分注意する必要があった。また、ヘキサンは酢酸の抽出効率が低いこと、一方、ジエチルエーテルは抽出前に所定量の塩酸（例えば、塩酸として濃塩酸（１２Ｎ）を使用した場合、除蛋白質後の溶液１ｍＬに対して０．０２５〜０．１２５ｍＬ）を添加する必要があることなどの問題もあり、結果として、これらの溶媒を用いた場合、作業工程が煩雑になっていた。
これに対して、ＭＴＢＥは、ジエチルエーテルよりも沸点が高く、かつ、酢酸の抽出効率がジエチルエーテルやヘキサンと比較して高いことから、従来の抽出溶媒における上記問題は生じない。
本発明において、ＭＴＢＥの使用量は、血漿の量に基づいて定めることができる。通常、血漿０．４ｍＬに対して、ＭＴＢＥを０．００４〜４０ｍＬ、好ましくは０．０４〜４ｍＬ使用することができる。
上記ＭＴＢＥで抽出する工程は、通常、次のように行う。まず、血漿に対して所定量のＭＴＢＥを混合し、該混合物を所定の時間攪拌する。攪拌時間及び温度は、特に限定されないが、例えば、撹拌時間は３０秒〜１分、温度は１５〜３０℃とすることができる。その後、遠心分離して沈殿を除き、上清を採取する。遠心分離は、例えば、１００００ｒｐｍ、５〜１０分、４〜２０℃の条件で行うことができる。
上記操作により、血漿中の酢酸は、上清（ＭＴＢＥ）中に抽出される。
上記操作により、血漿中の酢酸は、上清（ＭＴＢＥ）中に抽出される。
従来、抽出溶媒としてジエチルエーテルを用いた場合、所定量の塩酸（例えば、塩酸として濃塩酸（１２Ｎ）を使用した場合、除蛋白質後の溶液１ｍＬに対して０．０２５〜０．１２５ｍＬ）を抽出前に血漿中に予め添加する必要があった。これは、ジエチルエーテルを用いた場合、水溶液を酸性にする必要があったためである。しかしながら、今回の比較検討の結果、抽出溶媒としてＭＴＢＥを使用することにより、塩酸を必要とせず、かつ、ジエチルエーテルよりも高い抽出効率が得られることが判明した。したがって、本発明の方法は、従来の方法よりも簡便かつ高収率である。
本発明の方法は、血漿を除蛋白質剤で処理する工程をさらに含んでいてもよい。本発明の方法で使用する除蛋白質剤としては、例えば、スルホサリチル酸、過塩素酸、メタリン酸等が挙げられ、好ましくはスルホサリチル酸が挙げられる。
血漿を除蛋白質剤により処理することで、血漿中の蛋白質は、凝固し、血漿中に懸濁することになる。その結果、血漿中の蛋白質が実質的に除かれる（除蛋白質工程）。従来、血漿中に懸濁した蛋白質は、ＧＣ／ＭＳ法等による測定において、悪影響を及ぼすと考えられていたため、遠心分離により沈殿させて取り除き、その上清のみが測定に用いられていた。
本発明者らは、驚くべきことに、遠心分離を行わずに、直接、上記のＭＴＢＥによる酢酸の抽出工程に使用できることを見出した。すなわち、本発明において、除蛋白質剤による処理後の遠心分離工程は必要ではなく、作業工程はその分少なくてすむことから、１００検体を測定する場合、従来の方法よりも約６０分も作業工程を短縮することができる。
血漿を除蛋白質剤により処理することで、血漿中の蛋白質は、凝固し、血漿中に懸濁することになる。その結果、血漿中の蛋白質が実質的に除かれる（除蛋白質工程）。従来、血漿中に懸濁した蛋白質は、ＧＣ／ＭＳ法等による測定において、悪影響を及ぼすと考えられていたため、遠心分離により沈殿させて取り除き、その上清のみが測定に用いられていた。
本発明者らは、驚くべきことに、遠心分離を行わずに、直接、上記のＭＴＢＥによる酢酸の抽出工程に使用できることを見出した。すなわち、本発明において、除蛋白質剤による処理後の遠心分離工程は必要ではなく、作業工程はその分少なくてすむことから、１００検体を測定する場合、従来の方法よりも約６０分も作業工程を短縮することができる。
本発明において、除蛋白質剤の使用量は、血漿の量に基づいて定めることができる。通常、血漿０．４ｍＬに対して、例えば１０％スルホサリチル酸を用いる場合、０．００１〜１０ｍＬ、好ましくは０．０１〜１ｍＬ使用することができる。また、除蛋白質剤の濃度は適宜変更することができ、それにより収率を変えることが可能である。
上記除蛋白質剤で処理する工程は、通常、次のように行う。まず、血漿に対して所定量の除蛋白質剤を混合し、該混合物を所定の時間攪拌する。攪拌時間及び温度は、特に限定されないが、例えば、撹拌時間３０秒〜１分、温度１５〜３０℃とすることができる。これにより、血漿中の蛋白質は、凝固し、懸濁物となる。
従来の方法では、ここで遠心分離を行い、懸濁した蛋白質を沈殿として取り除く。これに対して、本発明の方法では、除蛋白質剤で処理後、遠心分離を行わずに、次の工程（通常、ＭＴＢＥ抽出工程）を行うことができる。
また、本発明の方法において、除蛋白質剤処理工程は、通常、血漿中の酢酸をＭＴＢＥで抽出する工程の前に行う。これにより、ＭＴＢＥによる抽出工程において、蛋白質による妨害を防ぐことができる。
従来の方法では、ここで遠心分離を行い、懸濁した蛋白質を沈殿として取り除く。これに対して、本発明の方法では、除蛋白質剤で処理後、遠心分離を行わずに、次の工程（通常、ＭＴＢＥ抽出工程）を行うことができる。
また、本発明の方法において、除蛋白質剤処理工程は、通常、血漿中の酢酸をＭＴＢＥで抽出する工程の前に行う。これにより、ＭＴＢＥによる抽出工程において、蛋白質による妨害を防ぐことができる。
本発明の方法は、血漿中に安定同位体標識酢酸を添加する工程をさらに含んでいてもよい。安定同位体とは、放射線を出さず且つ半永久的に存在量も変わらずに存在する同位体であり、標識に用いる安定同位体としては炭素（１２Ｃ及び１３Ｃ）のほか、水素（１Ｈ及び２Ｈ（Ｄ））、酸素安定同位体（１６Ｏ、１７Ｏ、１８Ｏ）等が存在する。安定同位体標識酢酸は、内部標準物質として利用され、これにより、測定操作ごとの結果のばらつきを修正することができる。
本発明における「安定同位体標識酢酸」としては、例えば、酢酸ナトリウム-１-１３Ｃ、酢酸ナトリウム-２-１３Ｃ、酢酸ナトリウム-１３Ｃ２、酢酸ナトリウム-ｄ３、酢酸ナトリウム-１８Ｏ２、酢酸ナトリウム-１-１３Ｃ，ｄ３及び酢酸ナトリウム-２-１３Ｃ，ｄ３等が挙げられ、好ましくは酢酸ナトリウム-２-１３Ｃ，ｄ３等が挙げられる。これらは、市販されており、例えば、ISOTEC社、Cambridge Isotope Laboratories社等から購入することができる。
また、本発明の方法において、血漿中への安定同位体標識酢酸の添加は、内部標準物質が測定操作ごとのばらつきを修正するために使用されるものであることから、通常、除蛋白質剤処理工程またはＭＴＢＥ抽出工程の前に行う。
本発明における「安定同位体標識酢酸」としては、例えば、酢酸ナトリウム-１-１３Ｃ、酢酸ナトリウム-２-１３Ｃ、酢酸ナトリウム-１３Ｃ２、酢酸ナトリウム-ｄ３、酢酸ナトリウム-１８Ｏ２、酢酸ナトリウム-１-１３Ｃ，ｄ３及び酢酸ナトリウム-２-１３Ｃ，ｄ３等が挙げられ、好ましくは酢酸ナトリウム-２-１３Ｃ，ｄ３等が挙げられる。これらは、市販されており、例えば、ISOTEC社、Cambridge Isotope Laboratories社等から購入することができる。
また、本発明の方法において、血漿中への安定同位体標識酢酸の添加は、内部標準物質が測定操作ごとのばらつきを修正するために使用されるものであることから、通常、除蛋白質剤処理工程またはＭＴＢＥ抽出工程の前に行う。
本発明の方法において、上記各工程後に得られた試料に対して、通常、誘導体化試薬を添加して試料中の酢酸を誘導体化し、ＧＣ／ＭＳ法を用いて試料中の酢酸濃度を測定する。本発明における誘導体化試薬としては、特に限定されないが、例えば、N-メチル-N-(tert-ブチルジメチルシリル)トリフルオロアセトアミド（ＭＴＢＳＴＦＡ）、t-ブチルジメチルシリルイミダゾール（ＴＢＤＭＳ）等が挙げられる。これらは、市販されており、例えば、Sigma-Aldrich社、Fulka社、Pierce社等から購入することができる。
本発明は、さらに、上述した本発明のＧＣ／ＭＳ法による血漿中の酢酸濃度の測定方法に使用することができる、血漿中の酢酸濃度の測定用キットを提供する。
本発明のキットは、上述した本発明の方法に使用される各種の試薬を含むことができ、特に、ＭＴＢＥ、除蛋白質剤、安定同位体標識酢酸、ＧＣ／ＭＳ法用の誘導体化試薬、酢酸ナトリウム等を一種またはそれ以上含むことができる。
本発明のキットは、上述した本発明の方法に使用される各種の試薬を含むことができ、特に、ＭＴＢＥ、除蛋白質剤、安定同位体標識酢酸、ＧＣ／ＭＳ法用の誘導体化試薬、酢酸ナトリウム等を一種またはそれ以上含むことができる。
〔実施例１〕
１．酢酸標準液の調製
酢酸ナトリウム（SIGMA ALDRICH社製、Lot No. MKBD4171V）８２ｍｇを電子天秤（メトラートレド社製、AX205DR）で精密に量りとり、精製水で溶解して正確に１０ｍＬとし、１００ｍｍｏｌ／Ｌ溶液（Ｓ）を調製した。さらに表１に示すように、メスフラスコを用いて標準液（Ｗ１〜Ｗ８）を用時調製した。
１．酢酸標準液の調製
酢酸ナトリウム（SIGMA ALDRICH社製、Lot No. MKBD4171V）８２ｍｇを電子天秤（メトラートレド社製、AX205DR）で精密に量りとり、精製水で溶解して正確に１０ｍＬとし、１００ｍｍｏｌ／Ｌ溶液（Ｓ）を調製した。さらに表１に示すように、メスフラスコを用いて標準液（Ｗ１〜Ｗ８）を用時調製した。
２．内部標準液の調製
安定同位体標識酢酸ナトリウム（ISOTEC社製、Lot No. EK1873：酢酸ナトリウム-２-１３Ｃ，ｄ３）８．６ｍｇを精密に量りとり、精製水で溶解して正確に１０ｍＬとし、１０ｍｍｏｌ／Ｌ溶液（ＩＳ）を調製した。次に１０ｍｍｏｌ／Ｌ溶液（ＩＳ）２ｍＬをメスフラスコに採取し、精製水にて正確に１０ｍＬとし、２ｍｍｏｌ／Ｌ溶液（ＩＳ−Ｗ１）を調製した。
安定同位体標識酢酸ナトリウム（ISOTEC社製、Lot No. EK1873：酢酸ナトリウム-２-１３Ｃ，ｄ３）８．６ｍｇを精密に量りとり、精製水で溶解して正確に１０ｍＬとし、１０ｍｍｏｌ／Ｌ溶液（ＩＳ）を調製した。次に１０ｍｍｏｌ／Ｌ溶液（ＩＳ）２ｍＬをメスフラスコに採取し、精製水にて正確に１０ｍＬとし、２ｍｍｏｌ／Ｌ溶液（ＩＳ−Ｗ１）を調製した。
３．検量線用試料
検量線用試料として、標準液Ｗ３〜８を用いた。
検量線用試料として、標準液Ｗ３〜８を用いた。
４．試料前処理法及び測定方法
ポリプロピレンチューブに各試料（検量線用試料、ヒト血漿）４００μＬをそれぞれ採取し、内部標準液ＩＳ−Ｗ１ １００μＬを添加した。さらに１０％スルホサリチル酸（和光純薬工業製、試薬特級品）溶液１００μＬを添加し撹拌した。この溶液にＭＴＢＥ（和光純薬工業製、Lot No. EPF0734）４００μＬを添加し、１分間攪拌した。その後、遠心分離（トミー精工製、RX-200）（毎分１００００回転、５分間、４℃）し、上清２００μＬを別のガラスバイアルに採取した。次に採取液にN-メチル-N-(tert-ブチルジメチルシリル)トリフルオロアセトアミド（ＭＴＢＳＴＦＡ）（ALDRICH社製、Lot No. BCBC7878）５〜１０μＬを添加し、ブロックヒーター（タイテック社製、DTU-2B）で６０℃、１〜２時間加温した。その後、ＧＣ／ＭＳ（日本電子社製、JMS-AMII150）にて以下の条件で測定した。
ポリプロピレンチューブに各試料（検量線用試料、ヒト血漿）４００μＬをそれぞれ採取し、内部標準液ＩＳ−Ｗ１ １００μＬを添加した。さらに１０％スルホサリチル酸（和光純薬工業製、試薬特級品）溶液１００μＬを添加し撹拌した。この溶液にＭＴＢＥ（和光純薬工業製、Lot No. EPF0734）４００μＬを添加し、１分間攪拌した。その後、遠心分離（トミー精工製、RX-200）（毎分１００００回転、５分間、４℃）し、上清２００μＬを別のガラスバイアルに採取した。次に採取液にN-メチル-N-(tert-ブチルジメチルシリル)トリフルオロアセトアミド（ＭＴＢＳＴＦＡ）（ALDRICH社製、Lot No. BCBC7878）５〜１０μＬを添加し、ブロックヒーター（タイテック社製、DTU-2B）で６０℃、１〜２時間加温した。その後、ＧＣ／ＭＳ（日本電子社製、JMS-AMII150）にて以下の条件で測定した。
実施例１の方法による検量線試料の酢酸及び内部標準物質のＳＩＭクロマトグラムを図１に示した。それぞれ７．４５及び７．４１分付近に溶出し、内部標準物質と酢酸とを分離している。
ヒト血漿と共に検量線用試料を実施例１と同様に前処理して測定し、内部標準物質の溶出位置における妨害ピークの有無を双方のマスクロマトグラムを比較し評価した。図２にヒト血漿と検量線試料（２０μｍｏｌ／Ｌ）とを比較したＳＩＭクロマトグラムを示した。内部標準物質の溶出位置に血漿由来の妨害ピークは認められなかった。
検量線用試料（標準液Ｗ３〜８）を実施例１の方法で前処理して測定し、検量線各濃度の相対誤差（％ＲＥ）及び直線性を検討し、図３に検量線の結果を示した。２０〜１０００μｍｏｌ／Ｌの濃度範囲において、検量線の直線性は相関係数（ｒ）０．９９９であり、かつ検量線各濃度の％ＲＥはそれぞれ−５．４〜７．５％となった。
次いで、塩酸前処理の有無による酢酸及び安定同位体標識酢酸のピーク面積を比較した。各試料添加量を下記に示す。
〔比較例１〕標準液での検討
１ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸Ｎａ標準液 ４００μＬ
２ｍｍｏｌ／Ｌ安定同位体標識酢酸Ｎａ １００μＬ
１０％スルホサリチル酸 １００μＬ
ＭＴＢＥまたはジエチルエーテル（ＤＥＥ） ４００μＬ
６Ｎ ＨＣｌまたはＨ２Ｏ ５０μＬ
上記の試料を実施例１の方法に従ってピーク面積を得た。その結果を表２に示す。
１ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸Ｎａ標準液 ４００μＬ
２ｍｍｏｌ／Ｌ安定同位体標識酢酸Ｎａ １００μＬ
１０％スルホサリチル酸 １００μＬ
ＭＴＢＥまたはジエチルエーテル（ＤＥＥ） ４００μＬ
６Ｎ ＨＣｌまたはＨ２Ｏ ５０μＬ
上記の試料を実施例１の方法に従ってピーク面積を得た。その結果を表２に示す。
〔比較例２〕血漿検体での検討
血漿検体 ４００μＬ
２ｍｍｏｌ／Ｌ安定同位体標識酢酸Ｎａ １００μＬ
１０％スルホサリチル酸 １００μＬ
ＭＴＢＥまたはジエチルエーテル（ＤＥＥ） ４００μＬ
６Ｎ ＨＣｌまたはＨ２Ｏ ５０μＬ
上記の試料を実施例１の方法に従ってピーク面積を得た。その結果を表３に示す。
血漿検体 ４００μＬ
２ｍｍｏｌ／Ｌ安定同位体標識酢酸Ｎａ １００μＬ
１０％スルホサリチル酸 １００μＬ
ＭＴＢＥまたはジエチルエーテル（ＤＥＥ） ４００μＬ
６Ｎ ＨＣｌまたはＨ２Ｏ ５０μＬ
上記の試料を実施例１の方法に従ってピーク面積を得た。その結果を表３に示す。
上記表２及び３より、標準液及び血漿共に、塩酸非添加のＭＴＢＥによる抽出が最も抽出効率がよいという結果が得られた。
〔実施例２〕
１．標準液の調製
実施例１の１．酢酸標準液の調製において調製したＷ１〜８を使用した。
２．内部標準液の調製
実施例１の２．内部標準液の調製において調製したＩＳ−Ｗ１を使用した。
３．検量線用試料
標準液Ｗ３〜８を検量線用試料とした。
１．標準液の調製
実施例１の１．酢酸標準液の調製において調製したＷ１〜８を使用した。
２．内部標準液の調製
実施例１の２．内部標準液の調製において調製したＩＳ−Ｗ１を使用した。
３．検量線用試料
標準液Ｗ３〜８を検量線用試料とした。
４．酢酸添加血漿試料
標準液Ｓ １８０μＬを１０ｍＬのメスフラスコに採取し、ヒト血漿にてメスアップし、酢酸１８００μｍｏｌ／Ｌ添加血漿（Ｐ１）を調製した。さらに以下に示すように市販ヒト血漿を用いて酢酸添加血漿（Ｐ２〜５）を調製した。
標準液Ｓ １８０μＬを１０ｍＬのメスフラスコに採取し、ヒト血漿にてメスアップし、酢酸１８００μｍｏｌ／Ｌ添加血漿（Ｐ１）を調製した。さらに以下に示すように市販ヒト血漿を用いて酢酸添加血漿（Ｐ２〜５）を調製した。
５．試料前処理法及び測定方法
実施例１の４．試料前処理法及び測定方法と同様に試料を前処理し、その後、ＧＣ／ＭＳ（アジレント社製、5975C GCMSD）にて以下の条件で測定した。
実施例１の４．試料前処理法及び測定方法と同様に試料を前処理し、その後、ＧＣ／ＭＳ（アジレント社製、5975C GCMSD）にて以下の条件で測定した。
７．検量線
実施例１で使用した検量線を用いた。
実施例１で使用した検量線を用いた。
〔比較例３〕酵素法（アセチルCoAシンターゼ法）
１．検量線用試料
上記実施例２において調製したＷ２〜８を用いた。
２．酢酸添加血漿試料
上記実施例２において調製したＰ１〜５を用いた。
３．透析患者血漿試料
酢酸含有透析液使用患者における透析開始２及び４時間後の血漿試料（ｎ＝４５）を用いた。
１．検量線用試料
上記実施例２において調製したＷ２〜８を用いた。
２．酢酸添加血漿試料
上記実施例２において調製したＰ１〜５を用いた。
３．透析患者血漿試料
酢酸含有透析液使用患者における透析開始２及び４時間後の血漿試料（ｎ＝４５）を用いた。
４．酢酸測定キット（Ｆ−キット 酢酸）による測定
キュベットに各試料（検量線用試料、ヒト血漿、酢酸添加血漿試料及び透析患者血漿試料）２００μＬを採取し、精製水８００μＬを添加した後、Ｆ−キット 酢酸（株式会社 J.K.インターナショナル、Lot/Ch.-B.：12670700）の添付文書に記載されている方法に準じて操作を行った。ただし、キット付属の使用試薬溶液は半量とした。
〔測定波長〕
波長：３４０ｎｍ
キュベットに各試料（検量線用試料、ヒト血漿、酢酸添加血漿試料及び透析患者血漿試料）２００μＬを採取し、精製水８００μＬを添加した後、Ｆ−キット 酢酸（株式会社 J.K.インターナショナル、Lot/Ch.-B.：12670700）の添付文書に記載されている方法に準じて操作を行った。ただし、キット付属の使用試薬溶液は半量とした。
〔測定波長〕
波長：３４０ｎｍ
５．検量線
検量線用試料（Ｗ２〜８、ｎ＝１）のΔＥから、最小二乗法を用いて検量線（Ｙ＝ａＸ＋ｂ、Ｙ：ΔＥ、Ｘ：濃度μｍｏｌ／Ｌ）を作成した。検量線の重み付けは行わなかった。得られた検量線を図４に示す。定量範囲は、２０〜２０００μｍｏｌ／Ｌとした。
検量線用試料（Ｗ２〜８、ｎ＝１）のΔＥから、最小二乗法を用いて検量線（Ｙ＝ａＸ＋ｂ、Ｙ：ΔＥ、Ｘ：濃度μｍｏｌ／Ｌ）を作成した。検量線の重み付けは行わなかった。得られた検量線を図４に示す。定量範囲は、２０〜２０００μｍｏｌ／Ｌとした。
〔実施例２及び比較例３の結果の比較〕
１．濃度算出方法
各試料の測定値は、ピーク面積比またはΔＥを検量線に当てはめて小数点第２位を四捨五入し、算出した。
２．相対誤差（ＲＥ）の算出方法
以下の式に従って算出した。
１．濃度算出方法
各試料の測定値は、ピーク面積比またはΔＥを検量線に当てはめて小数点第２位を四捨五入し、算出した。
２．相対誤差（ＲＥ）の算出方法
以下の式に従って算出した。
３．検量線
ＧＣ／ＭＳ法（実施例２）及び酵素法（比較例３）の検量線用試料の測定結果を以下の表４及び５に示した。双方とも良好な結果が得られた。
ＧＣ／ＭＳ法（実施例２）及び酵素法（比較例３）の検量線用試料の測定結果を以下の表４及び５に示した。双方とも良好な結果が得られた。
４．血漿及び酢酸添加血漿試料
ＧＣ／ＭＳ法（実施例２）及び酵素法（比較例３）による血漿及び酢酸添加血漿の測定結果を以下の表６及び７に示した。ＧＣ／ＭＳ法においては、いずれの酢酸添加濃度においても回収率は９２％以上であり、良好な値であった。一方、酵素法においては、酢酸添加濃度５０及び１５０μｍｏｌ／Ｌにおいて９０％以下であった。
次に両者の測定値を比較した結果を以下の表８に示した。いずれの試料においても酵素法に比べ、ＧＣ／ＭＳ法の値が高値であり、また、酢酸添加濃度が高い試料ほど両者の測定値は近づく傾向にあった。
ＧＣ／ＭＳ法（実施例２）及び酵素法（比較例３）による血漿及び酢酸添加血漿の測定結果を以下の表６及び７に示した。ＧＣ／ＭＳ法においては、いずれの酢酸添加濃度においても回収率は９２％以上であり、良好な値であった。一方、酵素法においては、酢酸添加濃度５０及び１５０μｍｏｌ／Ｌにおいて９０％以下であった。
次に両者の測定値を比較した結果を以下の表８に示した。いずれの試料においても酵素法に比べ、ＧＣ／ＭＳ法の値が高値であり、また、酢酸添加濃度が高い試料ほど両者の測定値は近づく傾向にあった。
５．透析患者血漿試料
酢酸含有透析液を使用している透析患者血漿（ｎ＝４５）を酵素法（比較例３）で測定した値と同一検体をＧＣ／ＭＳ法（実施例２）で測定した値を表９に示した。４５例中４３例においてＧＣ／ＭＳ法による測定値高値を示した。また、横軸にＧＣ／ＭＳ法を、縦軸に酵素法の測定値をプロットした結果を図５に示した。両者の値は良好な相関性を有していた（ｒ＝０．９９２２）。
次に横軸にＧＣ／ＭＳ法に得られた値、縦軸にＧＣ／ＭＳ法を１００としたときの酵素法の値を示した結果を図６に示した。ＧＣ／ＭＳ法の測定値が高値になるほど両者の値が近づく傾向にあった。
酢酸含有透析液を使用している透析患者血漿（ｎ＝４５）を酵素法（比較例３）で測定した値と同一検体をＧＣ／ＭＳ法（実施例２）で測定した値を表９に示した。４５例中４３例においてＧＣ／ＭＳ法による測定値高値を示した。また、横軸にＧＣ／ＭＳ法を、縦軸に酵素法の測定値をプロットした結果を図５に示した。両者の値は良好な相関性を有していた（ｒ＝０．９９２２）。
次に横軸にＧＣ／ＭＳ法に得られた値、縦軸にＧＣ／ＭＳ法を１００としたときの酵素法の値を示した結果を図６に示した。ＧＣ／ＭＳ法の測定値が高値になるほど両者の値が近づく傾向にあった。
以上より、ＧＣ／ＭＳ法（実施例２）は酵素法（比較例３）よりも感度及び特異性に優れており、血漿中酢酸濃度測定において有用な測定法であると考えられた。
なお、酵素法は血漿中の妨害物質の影響を受けやすいと報告されており（Bergmeyer HU and Mollering H : In:Methods of Enzymatic Analysis (ed by Bergmeyrer HU, et al), 3rd ed,vol VI, p.628-645, W2-einheim, Deerfield Beach, Florida, Verlag Chimemine, 184. (1985)参照）、得られた結果もそのことを示唆するものであった。
なお、酵素法は血漿中の妨害物質の影響を受けやすいと報告されており（Bergmeyer HU and Mollering H : In:Methods of Enzymatic Analysis (ed by Bergmeyrer HU, et al), 3rd ed,vol VI, p.628-645, W2-einheim, Deerfield Beach, Florida, Verlag Chimemine, 184. (1985)参照）、得られた結果もそのことを示唆するものであった。
Claims (15)
- ガスクロマトグラフィー／質量分析法（ＧＣ／ＭＳ法）による血漿中の酢酸濃度の測定方法であって、血漿中の酢酸をメチル-tert-ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で抽出する工程を含む、方法。
- 抽出前に塩酸を添加する工程を含まない請求項１に記載の方法。
- 血漿を除蛋白質剤で処理する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
- 除蛋白質剤が、スルホサリチル酸を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- 血漿を除蛋白質剤で処理する工程後、遠心分離を行わずに、血漿中の酢酸をＭＴＢＥで抽出する工程を含む、請求項３または４に記載の方法。
- 血漿中に安定同位体標識酢酸を添加する工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
- 安定同位体標識酢酸が、酢酸ナトリウム-１-１３Ｃ、酢酸ナトリウム-２-１３Ｃ、酢酸ナトリウム-１３Ｃ２、酢酸ナトリウム-ｄ３、酢酸ナトリウム-１８Ｏ２、酢酸ナトリウム-１-１３Ｃ，ｄ３及び酢酸ナトリウム-２-１３Ｃ，ｄ３から選択される、請求項６に記載の方法。
- ＧＣ／ＭＳ法が、イオン化に電子衝撃法を用いる方法である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
- ＭＴＢＥを含む、ＧＣ／ＭＳ法による血漿中の酢酸濃度の測定用キット。
- 除蛋白質剤をさらに含む、請求項９に記載のキット。
- 除蛋白質剤が、スルホサリチル酸を含む、請求項１０に記載のキット。
- 安定同位体標識酢酸をさらに含む、請求項９〜１１のいずれかに記載のキット。
- 安定同位体標識酢酸が、酢酸ナトリウム-１-１３Ｃ、酢酸ナトリウム-２-１３Ｃ、酢酸ナトリウム-１３Ｃ２、酢酸ナトリウム-ｄ３、酢酸ナトリウム-１８Ｏ２、酢酸ナトリウム-１-１３Ｃ，ｄ３及び酢酸ナトリウム-２-１３Ｃ，ｄ３から選択される、請求項１２に記載のキット。
- 誘導体化試薬をさらに含む、請求項９〜１３のいずれかに記載のキット。
- 誘導体化試薬が、N-メチル-N-(tert-ブチルジメチルシリル)トリフルオロアセトアミドである、請求項１４に記載のキット。
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| JP2011287835 | 2011-12-28 | ||
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