JPWO2013099949A1 - 血漿中の酢酸濃度の測定方法 - Google Patents
血漿中の酢酸濃度の測定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2013099949A1 JPWO2013099949A1 JP2013551742A JP2013551742A JPWO2013099949A1 JP WO2013099949 A1 JPWO2013099949 A1 JP WO2013099949A1 JP 2013551742 A JP2013551742 A JP 2013551742A JP 2013551742 A JP2013551742 A JP 2013551742A JP WO2013099949 A1 JPWO2013099949 A1 JP WO2013099949A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasma
- acetic acid
- sodium acetate
- mtbe
- concentration
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 195
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 103
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 64
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 23
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 18
- VMHLLURERBWHNL-YTBWXGASSA-M sodium;acetate Chemical compound [Na+].[13CH3]C([O-])=O VMHLLURERBWHNL-YTBWXGASSA-M 0.000 claims description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 11
- WXHLLJAMBQLULT-UHFFFAOYSA-N 2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]-2-methylpyrimidin-4-yl]amino]-n-(2-methyl-6-sulfanylphenyl)-1,3-thiazole-5-carboxamide;hydrate Chemical compound O.C=1C(N2CCN(CCO)CC2)=NC(C)=NC=1NC(S1)=NC=C1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1S WXHLLJAMBQLULT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- VMHLLURERBWHNL-CGOMOMTCSA-M sodium;acetate Chemical compound [Na+].C[13C]([O-])=O VMHLLURERBWHNL-CGOMOMTCSA-M 0.000 claims description 8
- QRKUHYFDBWGLHJ-UHFFFAOYSA-N N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide Chemical group FC(F)(F)C(=O)N(C)[Si](C)(C)C(C)(C)C QRKUHYFDBWGLHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- VMHLLURERBWHNL-NIIDSAIPSA-M sodium;2,2,2-trideuterioacetate Chemical compound [Na+].[2H]C([2H])([2H])C([O-])=O VMHLLURERBWHNL-NIIDSAIPSA-M 0.000 claims description 6
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 claims description 5
- VMHLLURERBWHNL-AWQJXPNKSA-M sodium;acetate Chemical compound [Na+].[13CH3][13C]([O-])=O VMHLLURERBWHNL-AWQJXPNKSA-M 0.000 claims description 5
- VMHLLURERBWHNL-MZCPDTSISA-M sodium;acetate Chemical compound [Na+].CC([18O-])=[18O] VMHLLURERBWHNL-MZCPDTSISA-M 0.000 claims description 5
- FNJSWIPFHMKRAT-UHFFFAOYSA-N Monomethyl phthalate Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1C(O)=O FNJSWIPFHMKRAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 35
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 34
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 29
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 11
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 9
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 4
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 4
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 4
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 3
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000000451 chemical ionisation Methods 0.000 description 2
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 2
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- VUENSYJCBOSTCS-UHFFFAOYSA-N tert-butyl-imidazol-1-yl-dimethylsilane Chemical compound CC(C)(C)[Si](C)(C)N1C=CN=C1 VUENSYJCBOSTCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N Metaphosphoric acid Chemical compound OP(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000003113 alkalizing effect Effects 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 208000022831 chronic renal failure syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- QLBHNVFOQLIYTH-UHFFFAOYSA-L dipotassium;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical compound [K+].[K+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O QLBHNVFOQLIYTH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000004217 heart function Effects 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960001008 heparin sodium Drugs 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940124549 vasodilator Drugs 0.000 description 1
- 239000003071 vasodilator agent Substances 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/02—Devices for withdrawing samples
- G01N1/10—Devices for withdrawing samples in the liquid or fluent state
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
- G01N30/14—Preparation by elimination of some components
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
- G01N30/7206—Mass spectrometers interfaced to gas chromatograph
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/86—Signal analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
- G01N33/49—Blood
- G01N33/491—Blood by separating the blood components
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N2030/042—Standards
- G01N2030/045—Standards internal
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
- G01N2030/062—Preparation extracting sample from raw material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
- G01N2030/067—Preparation by reaction, e.g. derivatising the sample
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
- G01N2030/8822—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving blood
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/20—Oxygen containing
- Y10T436/200833—Carbonyl, ether, aldehyde or ketone containing
- Y10T436/201666—Carboxylic acid
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Ecology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hydrology & Water Resources (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本発明は、簡便で再現性の高い、ガスクロマトグラフィー/質量分析法(GC/MS法)による血漿中の酢酸濃度の測定法、より詳細には、ガスクロマトグラフィー/質量分析法(GC/MS法)による血漿中の酢酸濃度の測定方法であって、血漿中の酢酸をメチル-tert-ブチルエーテル(MTBE)で抽出する工程を含む、方法の提供に関する。
Description
本特許出願は、日本国特許出願第2011−287835号(出願日:2011年12月28日)について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
本発明は、簡便で再現性の高い、ガスクロマトグラフィー/質量分析法(GC/MS法)による血漿(特にヒト血漿)中の酢酸濃度の測定方法に関する。
本発明は、簡便で再現性の高い、ガスクロマトグラフィー/質量分析法(GC/MS法)による血漿(特にヒト血漿)中の酢酸濃度の測定方法に関する。
慢性腎不全患者などに対して行われる血液浄化方法の中で、最も一般的なものとして血液透析療法がある。血液透析療法は、透析剤により血液中の老廃物の除去、除水などを行うほかに、血清電解質成分の濃度の是正、酸−塩基平衡の是正などを行うことを目的としている。
透析液中のアルカリ化剤として以前は酢酸塩を用いる酢酸透析が行われていたが、酢酸には血管拡張や心機能の抑制といった作用が見られたことから、現在ではアルカリ化剤として炭酸水素ナトリウムを用いた重炭酸透析が主流となっている。しかし、重炭酸透析においても、pH調節剤として8〜12mEq/Lの酢酸が使用され、酢酸の血漿中濃度が上昇することにより顕著なアレルギー反応を示す報告もあることから(非特許文献1)、透析治療中の患者に対し血漿中の酢酸濃度を測定し、挙動を把握することは極めて重要である。しかしながら、現在、日本の医療機関や受託機関において血漿中の酢酸濃度測定による検査は行われていない。
血漿中の酢酸濃度測定法については、酵素法(非特許文献2〜3)、HPLC法(非特許文献4〜6)、GC法(非特許文献7〜9)及びGC/MS法(非特許文献10〜12)が報告されているが、GC/MS法おける測定が最も特異性が高く、高感度である。
GC/MS法による従来の測定方法では、内部標準物質に安定同位体標識酢酸を使用しておらず、操作ごとの結果にばらつきが生じやすいことや(非特許文献10及び12)、抽出前に塩酸を添加しなければならないこと、抽出溶媒に沸点の低いジエチルエーテルを使用していることなど、作業工程が煩雑になるといった問題点がある(非特許文献11及び12)。
芦沢麻美子ら:九州人工透析研究会会誌、26、87、(1998)
Bergmeyer HU、In: Methods of Enzymatic Analysis、3rd ed, vol VI, p628-639
Bartelt U and Kattermann R :J Clin. Chem. Clin. Biochem. 23 : 879-881, 1985.
Yamamoto M, et al : Rinshoukensa 35(8) : 977-880, 1991.
Otake K, et al : HDFryouhou : 266-269, 2008.
Stein J, et al : J. Chromatogr. 576 : 53-61, 1992.
Tollinger CD, et al : Clin. Chem. 25/10 : 1787-1790, 1979.
Brazier M, et al : Clin.Chim.Acta 148 : 261-265 1985.
Murase M, et al : J. Chromatogr.B 664 : 415-420 1995.
Roccchiccioli F, et al : Bio. and Enviro. Mass Sepctrom. 18 : 816-819 1989.
Pouteau E, et al : J. Mass Spectrom. 36 : 798-805 2001.
Moreau NM, et al : J. Chromatogr. B 784 : 395-403 2003.
本発明の課題は、GC/MS法による、簡便で再現性の高い血漿中の酢酸濃度測定法を提供することにある。
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、除蛋白後の遠心分離を行わず、直接液-液抽出することで作業工程を減らし、さらに抽出溶媒に沸点が高く、取り扱いの容易で、抽出効率の高いメチル-tert-ブチルエーテル(MTBE)を用いることにより抽出効率を低下させることなく作業工程を簡便にできることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明には以下のものが含まれる:
[1]ガスクロマトグラフィー/質量分析法(GC/MS法)による血漿中の酢酸濃度の測定方法であって、血漿中の酢酸をメチル-tert-ブチルエーテル(MTBE)で抽出する工程を含む、方法。
[2]抽出前に塩酸を添加する工程を含まない上記[1]に記載の方法。
[3]血漿を除蛋白質剤で処理する工程をさらに含む、上記[1]または[2]に記載の方法。
[4]除蛋白質剤が、スルホサリチル酸を含む、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]血漿を除蛋白質剤で処理する工程後、遠心分離を行わずに、血漿中の酢酸をMTBEで抽出する工程を含む、上記[3]または[4]に記載の方法。
[6]血漿中に安定同位体標識酢酸を添加する工程をさらに含む、上記[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7]安定同位体標識酢酸が、酢酸ナトリウム-1-13C、酢酸ナトリウム-2-13C、酢酸ナトリウム-13C2、酢酸ナトリウム-d3、酢酸ナトリウム-18O2、酢酸ナトリウム-1-13C,d3及び酢酸ナトリウム-2-13C,d3から選択される、上記[6]に記載の方法。
[8]GC/MS法が、イオン化に電子衝撃法を用いる方法である、上記[1]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[9]MTBEを含む、GC/MS法による血漿中の酢酸濃度の測定用キット。
[10]除蛋白質剤をさらに含む、上記[9]に記載のキット。
[11]除蛋白質剤が、スルホサリチル酸を含む、上記[10]に記載のキット。
[12]安定同位体標識酢酸をさらに含む、上記[9]〜[11]のいずれかに記載のキット。
[13]安定同位体標識酢酸が、酢酸ナトリウム-1-13C、酢酸ナトリウム-2-13C、酢酸ナトリウム-13C2、酢酸ナトリウム-d3、酢酸ナトリウム-18O2、酢酸ナトリウム-1-13C,d3及び酢酸ナトリウム-2-13C,d3から選択される、上記[12]に記載のキット。
[14]誘導体化試薬をさらに含む、上記[9]〜[13]のいずれかに記載のキット。
[15]誘導体化試薬が、N-メチル-N-(tert-ブチルジメチルシリル)トリフルオロアセトアミドである、上記[14]に記載のキット。
すなわち、本発明には以下のものが含まれる:
[1]ガスクロマトグラフィー/質量分析法(GC/MS法)による血漿中の酢酸濃度の測定方法であって、血漿中の酢酸をメチル-tert-ブチルエーテル(MTBE)で抽出する工程を含む、方法。
[2]抽出前に塩酸を添加する工程を含まない上記[1]に記載の方法。
[3]血漿を除蛋白質剤で処理する工程をさらに含む、上記[1]または[2]に記載の方法。
[4]除蛋白質剤が、スルホサリチル酸を含む、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]血漿を除蛋白質剤で処理する工程後、遠心分離を行わずに、血漿中の酢酸をMTBEで抽出する工程を含む、上記[3]または[4]に記載の方法。
[6]血漿中に安定同位体標識酢酸を添加する工程をさらに含む、上記[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7]安定同位体標識酢酸が、酢酸ナトリウム-1-13C、酢酸ナトリウム-2-13C、酢酸ナトリウム-13C2、酢酸ナトリウム-d3、酢酸ナトリウム-18O2、酢酸ナトリウム-1-13C,d3及び酢酸ナトリウム-2-13C,d3から選択される、上記[6]に記載の方法。
[8]GC/MS法が、イオン化に電子衝撃法を用いる方法である、上記[1]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[9]MTBEを含む、GC/MS法による血漿中の酢酸濃度の測定用キット。
[10]除蛋白質剤をさらに含む、上記[9]に記載のキット。
[11]除蛋白質剤が、スルホサリチル酸を含む、上記[10]に記載のキット。
[12]安定同位体標識酢酸をさらに含む、上記[9]〜[11]のいずれかに記載のキット。
[13]安定同位体標識酢酸が、酢酸ナトリウム-1-13C、酢酸ナトリウム-2-13C、酢酸ナトリウム-13C2、酢酸ナトリウム-d3、酢酸ナトリウム-18O2、酢酸ナトリウム-1-13C,d3及び酢酸ナトリウム-2-13C,d3から選択される、上記[12]に記載のキット。
[14]誘導体化試薬をさらに含む、上記[9]〜[13]のいずれかに記載のキット。
[15]誘導体化試薬が、N-メチル-N-(tert-ブチルジメチルシリル)トリフルオロアセトアミドである、上記[14]に記載のキット。
本発明によれば、抽出溶媒に沸点の高いMTBEを使用することにより、酢酸の抽出効率を向上させ、簡便かつ再現性の高いヒト血漿中酢酸濃度を得ることができる。
また、本発明によれば、抽出前に塩酸を添加することなく、さらには、除蛋白質工程後に遠心分離を行わずに直接溶媒抽出することができ、作業工程を減らすことができる。
また、本発明によれば、抽出前に塩酸を添加することなく、さらには、除蛋白質工程後に遠心分離を行わずに直接溶媒抽出することができ、作業工程を減らすことができる。
本発明は、ガスクロマトグラフィー/質量分析法(GC/MS法)による血漿中の酢酸濃度の測定方法であって、血漿中の酢酸をメチル-tert-ブチルエーテル(MTBE)で抽出する工程を含む、方法(以下、「本発明の方法」とも称する。)に関する。
血漿とは血液に含まれる液体成分の一つで血液の55%を占める。血清とフィブリノーゲンから成り、物質の輸送、ガス交換、血液凝固、免疫に関与するほか、浸透圧や水素イオン濃度の調節などによって内部環境を整えるのに重要な役割を果たしている。本発明において測定対象となる「血漿」としては、特に限定されず、ヒト、ラット、マウス、イヌ、サルなどの哺乳動物の血液由来のものが挙げられる。また、その調製方法も特に限定されず、従来既知の方法を用いることができる。好ましくは、採血後、抗凝固剤(ヘパリンナトリウム、EDTA−2Na、EDTA−2K等)入りのプラスチックチューブに移し、氷冷化で保存し、4℃で遠心分離後、採取する。
ガスクロマトグラフィー/質量分析法(GC/MS法)は有機化合物(特に低分子量成分)の定性、定量を行う分析装置であり、ガスクロマトグラフィー(GC)と質量分析(MS)装置を結合した複合装置である。GCで分離した単一成分についてMSスペクトルを測定することにより成分の定性を行い、MSにより検出されたイオンの強度により定量を行う。本発明における「ガスクロマトグラフィー/質量分析法(GC/MS法)」としては、特に限定されず、物質の同定、定量などに一般的に用いられるものが挙げられる。好ましくは、イオン化に電子衝撃(EI)法を用いる方法、化学イオン化(CI)法を用いる方法などが挙げられる(例えば、上記非特許文献10、11、12)。
本発明の方法は、血漿中の酢酸をメチル-tert-ブチルエーテル(MTBE)で抽出する工程を含む。
従来、血漿中の酢酸を抽出するためには、ヘキサン、ジエチルエーテルなどが用いられてきた。しかしながら、ジエチルエーテルは沸点が低く、取扱いに十分注意する必要があった。また、ヘキサンは酢酸の抽出効率が低いこと、一方、ジエチルエーテルは抽出前に所定量の塩酸(例えば、塩酸として濃塩酸(12N)を使用した場合、除蛋白質後の溶液1mLに対して0.025〜0.125mL)を添加する必要があることなどの問題もあり、結果として、これらの溶媒を用いた場合、作業工程が煩雑になっていた。
これに対して、MTBEは、ジエチルエーテルよりも沸点が高く、かつ、酢酸の抽出効率がジエチルエーテルやヘキサンと比較して高いことから、従来の抽出溶媒における上記問題は生じない。
従来、血漿中の酢酸を抽出するためには、ヘキサン、ジエチルエーテルなどが用いられてきた。しかしながら、ジエチルエーテルは沸点が低く、取扱いに十分注意する必要があった。また、ヘキサンは酢酸の抽出効率が低いこと、一方、ジエチルエーテルは抽出前に所定量の塩酸(例えば、塩酸として濃塩酸(12N)を使用した場合、除蛋白質後の溶液1mLに対して0.025〜0.125mL)を添加する必要があることなどの問題もあり、結果として、これらの溶媒を用いた場合、作業工程が煩雑になっていた。
これに対して、MTBEは、ジエチルエーテルよりも沸点が高く、かつ、酢酸の抽出効率がジエチルエーテルやヘキサンと比較して高いことから、従来の抽出溶媒における上記問題は生じない。
本発明において、MTBEの使用量は、血漿の量に基づいて定めることができる。通常、血漿0.4mLに対して、MTBEを0.004〜40mL、好ましくは0.04〜4mL使用することができる。
上記MTBEで抽出する工程は、通常、次のように行う。まず、血漿に対して所定量のMTBEを混合し、該混合物を所定の時間攪拌する。攪拌時間及び温度は、特に限定されないが、例えば、撹拌時間は30秒〜1分、温度は15〜30℃とすることができる。その後、遠心分離して沈殿を除き、上清を採取する。遠心分離は、例えば、10000rpm、5〜10分、4〜20℃の条件で行うことができる。
上記操作により、血漿中の酢酸は、上清(MTBE)中に抽出される。
上記操作により、血漿中の酢酸は、上清(MTBE)中に抽出される。
従来、抽出溶媒としてジエチルエーテルを用いた場合、所定量の塩酸(例えば、塩酸として濃塩酸(12N)を使用した場合、除蛋白質後の溶液1mLに対して0.025〜0.125mL)を抽出前に血漿中に予め添加する必要があった。これは、ジエチルエーテルを用いた場合、水溶液を酸性にする必要があったためである。しかしながら、今回の比較検討の結果、抽出溶媒としてMTBEを使用することにより、塩酸を必要とせず、かつ、ジエチルエーテルよりも高い抽出効率が得られることが判明した。したがって、本発明の方法は、従来の方法よりも簡便かつ高収率である。
本発明の方法は、血漿を除蛋白質剤で処理する工程をさらに含んでいてもよい。本発明の方法で使用する除蛋白質剤としては、例えば、スルホサリチル酸、過塩素酸、メタリン酸等が挙げられ、好ましくはスルホサリチル酸が挙げられる。
血漿を除蛋白質剤により処理することで、血漿中の蛋白質は、凝固し、血漿中に懸濁することになる。その結果、血漿中の蛋白質が実質的に除かれる(除蛋白質工程)。従来、血漿中に懸濁した蛋白質は、GC/MS法等による測定において、悪影響を及ぼすと考えられていたため、遠心分離により沈殿させて取り除き、その上清のみが測定に用いられていた。
本発明者らは、驚くべきことに、遠心分離を行わずに、直接、上記のMTBEによる酢酸の抽出工程に使用できることを見出した。すなわち、本発明において、除蛋白質剤による処理後の遠心分離工程は必要ではなく、作業工程はその分少なくてすむことから、100検体を測定する場合、従来の方法よりも約60分も作業工程を短縮することができる。
血漿を除蛋白質剤により処理することで、血漿中の蛋白質は、凝固し、血漿中に懸濁することになる。その結果、血漿中の蛋白質が実質的に除かれる(除蛋白質工程)。従来、血漿中に懸濁した蛋白質は、GC/MS法等による測定において、悪影響を及ぼすと考えられていたため、遠心分離により沈殿させて取り除き、その上清のみが測定に用いられていた。
本発明者らは、驚くべきことに、遠心分離を行わずに、直接、上記のMTBEによる酢酸の抽出工程に使用できることを見出した。すなわち、本発明において、除蛋白質剤による処理後の遠心分離工程は必要ではなく、作業工程はその分少なくてすむことから、100検体を測定する場合、従来の方法よりも約60分も作業工程を短縮することができる。
本発明において、除蛋白質剤の使用量は、血漿の量に基づいて定めることができる。通常、血漿0.4mLに対して、例えば10%スルホサリチル酸を用いる場合、0.001〜10mL、好ましくは0.01〜1mL使用することができる。また、除蛋白質剤の濃度は適宜変更することができ、それにより収率を変えることが可能である。
上記除蛋白質剤で処理する工程は、通常、次のように行う。まず、血漿に対して所定量の除蛋白質剤を混合し、該混合物を所定の時間攪拌する。攪拌時間及び温度は、特に限定されないが、例えば、撹拌時間30秒〜1分、温度15〜30℃とすることができる。これにより、血漿中の蛋白質は、凝固し、懸濁物となる。
従来の方法では、ここで遠心分離を行い、懸濁した蛋白質を沈殿として取り除く。これに対して、本発明の方法では、除蛋白質剤で処理後、遠心分離を行わずに、次の工程(通常、MTBE抽出工程)を行うことができる。
また、本発明の方法において、除蛋白質剤処理工程は、通常、血漿中の酢酸をMTBEで抽出する工程の前に行う。これにより、MTBEによる抽出工程において、蛋白質による妨害を防ぐことができる。
従来の方法では、ここで遠心分離を行い、懸濁した蛋白質を沈殿として取り除く。これに対して、本発明の方法では、除蛋白質剤で処理後、遠心分離を行わずに、次の工程(通常、MTBE抽出工程)を行うことができる。
また、本発明の方法において、除蛋白質剤処理工程は、通常、血漿中の酢酸をMTBEで抽出する工程の前に行う。これにより、MTBEによる抽出工程において、蛋白質による妨害を防ぐことができる。
本発明の方法は、血漿中に安定同位体標識酢酸を添加する工程をさらに含んでいてもよい。安定同位体とは、放射線を出さず且つ半永久的に存在量も変わらずに存在する同位体であり、標識に用いる安定同位体としては炭素(12C及び13C)のほか、水素(1H及び2H(D))、酸素安定同位体(16O、17O、18O)等が存在する。安定同位体標識酢酸は、内部標準物質として利用され、これにより、測定操作ごとの結果のばらつきを修正することができる。
本発明における「安定同位体標識酢酸」としては、例えば、酢酸ナトリウム-1-13C、酢酸ナトリウム-2-13C、酢酸ナトリウム-13C2、酢酸ナトリウム-d3、酢酸ナトリウム-18O2、酢酸ナトリウム-1-13C,d3及び酢酸ナトリウム-2-13C,d3等が挙げられ、好ましくは酢酸ナトリウム-2-13C,d3等が挙げられる。これらは、市販されており、例えば、ISOTEC社、Cambridge Isotope Laboratories社等から購入することができる。
また、本発明の方法において、血漿中への安定同位体標識酢酸の添加は、内部標準物質が測定操作ごとのばらつきを修正するために使用されるものであることから、通常、除蛋白質剤処理工程またはMTBE抽出工程の前に行う。
本発明における「安定同位体標識酢酸」としては、例えば、酢酸ナトリウム-1-13C、酢酸ナトリウム-2-13C、酢酸ナトリウム-13C2、酢酸ナトリウム-d3、酢酸ナトリウム-18O2、酢酸ナトリウム-1-13C,d3及び酢酸ナトリウム-2-13C,d3等が挙げられ、好ましくは酢酸ナトリウム-2-13C,d3等が挙げられる。これらは、市販されており、例えば、ISOTEC社、Cambridge Isotope Laboratories社等から購入することができる。
また、本発明の方法において、血漿中への安定同位体標識酢酸の添加は、内部標準物質が測定操作ごとのばらつきを修正するために使用されるものであることから、通常、除蛋白質剤処理工程またはMTBE抽出工程の前に行う。
本発明の方法において、上記各工程後に得られた試料に対して、通常、誘導体化試薬を添加して試料中の酢酸を誘導体化し、GC/MS法を用いて試料中の酢酸濃度を測定する。本発明における誘導体化試薬としては、特に限定されないが、例えば、N-メチル-N-(tert-ブチルジメチルシリル)トリフルオロアセトアミド(MTBSTFA)、t-ブチルジメチルシリルイミダゾール(TBDMS)等が挙げられる。これらは、市販されており、例えば、Sigma-Aldrich社、Fulka社、Pierce社等から購入することができる。
本発明は、さらに、上述した本発明のGC/MS法による血漿中の酢酸濃度の測定方法に使用することができる、血漿中の酢酸濃度の測定用キットを提供する。
本発明のキットは、上述した本発明の方法に使用される各種の試薬を含むことができ、特に、MTBE、除蛋白質剤、安定同位体標識酢酸、GC/MS法用の誘導体化試薬、酢酸ナトリウム等を一種またはそれ以上含むことができる。
本発明のキットは、上述した本発明の方法に使用される各種の試薬を含むことができ、特に、MTBE、除蛋白質剤、安定同位体標識酢酸、GC/MS法用の誘導体化試薬、酢酸ナトリウム等を一種またはそれ以上含むことができる。
〔実施例1〕
1.酢酸標準液の調製
酢酸ナトリウム(SIGMA ALDRICH社製、Lot No. MKBD4171V)82mgを電子天秤(メトラートレド社製、AX205DR)で精密に量りとり、精製水で溶解して正確に10mLとし、100mmol/L溶液(S)を調製した。さらに表1に示すように、メスフラスコを用いて標準液(W1〜W8)を用時調製した。
1.酢酸標準液の調製
酢酸ナトリウム(SIGMA ALDRICH社製、Lot No. MKBD4171V)82mgを電子天秤(メトラートレド社製、AX205DR)で精密に量りとり、精製水で溶解して正確に10mLとし、100mmol/L溶液(S)を調製した。さらに表1に示すように、メスフラスコを用いて標準液(W1〜W8)を用時調製した。
2.内部標準液の調製
安定同位体標識酢酸ナトリウム(ISOTEC社製、Lot No. EK1873:酢酸ナトリウム-2-13C,d3)8.6mgを精密に量りとり、精製水で溶解して正確に10mLとし、10mmol/L溶液(IS)を調製した。次に10mmol/L溶液(IS)2mLをメスフラスコに採取し、精製水にて正確に10mLとし、2mmol/L溶液(IS−W1)を調製した。
安定同位体標識酢酸ナトリウム(ISOTEC社製、Lot No. EK1873:酢酸ナトリウム-2-13C,d3)8.6mgを精密に量りとり、精製水で溶解して正確に10mLとし、10mmol/L溶液(IS)を調製した。次に10mmol/L溶液(IS)2mLをメスフラスコに採取し、精製水にて正確に10mLとし、2mmol/L溶液(IS−W1)を調製した。
3.検量線用試料
検量線用試料として、標準液W3〜8を用いた。
検量線用試料として、標準液W3〜8を用いた。
4.試料前処理法及び測定方法
ポリプロピレンチューブに各試料(検量線用試料、ヒト血漿)400μLをそれぞれ採取し、内部標準液IS−W1 100μLを添加した。さらに10%スルホサリチル酸(和光純薬工業製、試薬特級品)溶液100μLを添加し撹拌した。この溶液にMTBE(和光純薬工業製、Lot No. EPF0734)400μLを添加し、1分間攪拌した。その後、遠心分離(トミー精工製、RX-200)(毎分10000回転、5分間、4℃)し、上清200μLを別のガラスバイアルに採取した。次に採取液にN-メチル-N-(tert-ブチルジメチルシリル)トリフルオロアセトアミド(MTBSTFA)(ALDRICH社製、Lot No. BCBC7878)5〜10μLを添加し、ブロックヒーター(タイテック社製、DTU-2B)で60℃、1〜2時間加温した。その後、GC/MS(日本電子社製、JMS-AMII150)にて以下の条件で測定した。
ポリプロピレンチューブに各試料(検量線用試料、ヒト血漿)400μLをそれぞれ採取し、内部標準液IS−W1 100μLを添加した。さらに10%スルホサリチル酸(和光純薬工業製、試薬特級品)溶液100μLを添加し撹拌した。この溶液にMTBE(和光純薬工業製、Lot No. EPF0734)400μLを添加し、1分間攪拌した。その後、遠心分離(トミー精工製、RX-200)(毎分10000回転、5分間、4℃)し、上清200μLを別のガラスバイアルに採取した。次に採取液にN-メチル-N-(tert-ブチルジメチルシリル)トリフルオロアセトアミド(MTBSTFA)(ALDRICH社製、Lot No. BCBC7878)5〜10μLを添加し、ブロックヒーター(タイテック社製、DTU-2B)で60℃、1〜2時間加温した。その後、GC/MS(日本電子社製、JMS-AMII150)にて以下の条件で測定した。
実施例1の方法による検量線試料の酢酸及び内部標準物質のSIMクロマトグラムを図1に示した。それぞれ7.45及び7.41分付近に溶出し、内部標準物質と酢酸とを分離している。
ヒト血漿と共に検量線用試料を実施例1と同様に前処理して測定し、内部標準物質の溶出位置における妨害ピークの有無を双方のマスクロマトグラムを比較し評価した。図2にヒト血漿と検量線試料(20μmol/L)とを比較したSIMクロマトグラムを示した。内部標準物質の溶出位置に血漿由来の妨害ピークは認められなかった。
検量線用試料(標準液W3〜8)を実施例1の方法で前処理して測定し、検量線各濃度の相対誤差(%RE)及び直線性を検討し、図3に検量線の結果を示した。20〜1000μmol/Lの濃度範囲において、検量線の直線性は相関係数(r)0.999であり、かつ検量線各濃度の%REはそれぞれ−5.4〜7.5%となった。
次いで、塩酸前処理の有無による酢酸及び安定同位体標識酢酸のピーク面積を比較した。各試料添加量を下記に示す。
〔比較例1〕標準液での検討
1mmol/L酢酸Na標準液 400μL
2mmol/L安定同位体標識酢酸Na 100μL
10%スルホサリチル酸 100μL
MTBEまたはジエチルエーテル(DEE) 400μL
6N HClまたはH2O 50μL
上記の試料を実施例1の方法に従ってピーク面積を得た。その結果を表2に示す。
1mmol/L酢酸Na標準液 400μL
2mmol/L安定同位体標識酢酸Na 100μL
10%スルホサリチル酸 100μL
MTBEまたはジエチルエーテル(DEE) 400μL
6N HClまたはH2O 50μL
上記の試料を実施例1の方法に従ってピーク面積を得た。その結果を表2に示す。
〔比較例2〕血漿検体での検討
血漿検体 400μL
2mmol/L安定同位体標識酢酸Na 100μL
10%スルホサリチル酸 100μL
MTBEまたはジエチルエーテル(DEE) 400μL
6N HClまたはH2O 50μL
上記の試料を実施例1の方法に従ってピーク面積を得た。その結果を表3に示す。
血漿検体 400μL
2mmol/L安定同位体標識酢酸Na 100μL
10%スルホサリチル酸 100μL
MTBEまたはジエチルエーテル(DEE) 400μL
6N HClまたはH2O 50μL
上記の試料を実施例1の方法に従ってピーク面積を得た。その結果を表3に示す。
上記表2及び3より、標準液及び血漿共に、塩酸非添加のMTBEによる抽出が最も抽出効率がよいという結果が得られた。
〔実施例2〕
1.標準液の調製
実施例1の1.酢酸標準液の調製において調製したW1〜8を使用した。
2.内部標準液の調製
実施例1の2.内部標準液の調製において調製したIS−W1を使用した。
3.検量線用試料
標準液W3〜8を検量線用試料とした。
1.標準液の調製
実施例1の1.酢酸標準液の調製において調製したW1〜8を使用した。
2.内部標準液の調製
実施例1の2.内部標準液の調製において調製したIS−W1を使用した。
3.検量線用試料
標準液W3〜8を検量線用試料とした。
4.酢酸添加血漿試料
標準液S 180μLを10mLのメスフラスコに採取し、ヒト血漿にてメスアップし、酢酸1800μmol/L添加血漿(P1)を調製した。さらに以下に示すように市販ヒト血漿を用いて酢酸添加血漿(P2〜5)を調製した。
標準液S 180μLを10mLのメスフラスコに採取し、ヒト血漿にてメスアップし、酢酸1800μmol/L添加血漿(P1)を調製した。さらに以下に示すように市販ヒト血漿を用いて酢酸添加血漿(P2〜5)を調製した。
5.試料前処理法及び測定方法
実施例1の4.試料前処理法及び測定方法と同様に試料を前処理し、その後、GC/MS(アジレント社製、5975C GCMSD)にて以下の条件で測定した。
実施例1の4.試料前処理法及び測定方法と同様に試料を前処理し、その後、GC/MS(アジレント社製、5975C GCMSD)にて以下の条件で測定した。
7.検量線
実施例1で使用した検量線を用いた。
実施例1で使用した検量線を用いた。
〔比較例3〕酵素法(アセチルCoAシンターゼ法)
1.検量線用試料
上記実施例2において調製したW2〜8を用いた。
2.酢酸添加血漿試料
上記実施例2において調製したP1〜5を用いた。
3.透析患者血漿試料
酢酸含有透析液使用患者における透析開始2及び4時間後の血漿試料(n=45)を用いた。
1.検量線用試料
上記実施例2において調製したW2〜8を用いた。
2.酢酸添加血漿試料
上記実施例2において調製したP1〜5を用いた。
3.透析患者血漿試料
酢酸含有透析液使用患者における透析開始2及び4時間後の血漿試料(n=45)を用いた。
4.酢酸測定キット(F−キット 酢酸)による測定
キュベットに各試料(検量線用試料、ヒト血漿、酢酸添加血漿試料及び透析患者血漿試料)200μLを採取し、精製水800μLを添加した後、F−キット 酢酸(株式会社 J.K.インターナショナル、Lot/Ch.-B.:12670700)の添付文書に記載されている方法に準じて操作を行った。ただし、キット付属の使用試薬溶液は半量とした。
〔測定波長〕
波長:340nm
キュベットに各試料(検量線用試料、ヒト血漿、酢酸添加血漿試料及び透析患者血漿試料)200μLを採取し、精製水800μLを添加した後、F−キット 酢酸(株式会社 J.K.インターナショナル、Lot/Ch.-B.:12670700)の添付文書に記載されている方法に準じて操作を行った。ただし、キット付属の使用試薬溶液は半量とした。
〔測定波長〕
波長:340nm
5.検量線
検量線用試料(W2〜8、n=1)のΔEから、最小二乗法を用いて検量線(Y=aX+b、Y:ΔE、X:濃度μmol/L)を作成した。検量線の重み付けは行わなかった。得られた検量線を図4に示す。定量範囲は、20〜2000μmol/Lとした。
検量線用試料(W2〜8、n=1)のΔEから、最小二乗法を用いて検量線(Y=aX+b、Y:ΔE、X:濃度μmol/L)を作成した。検量線の重み付けは行わなかった。得られた検量線を図4に示す。定量範囲は、20〜2000μmol/Lとした。
〔実施例2及び比較例3の結果の比較〕
1.濃度算出方法
各試料の測定値は、ピーク面積比またはΔEを検量線に当てはめて小数点第2位を四捨五入し、算出した。
2.相対誤差(RE)の算出方法
以下の式に従って算出した。
1.濃度算出方法
各試料の測定値は、ピーク面積比またはΔEを検量線に当てはめて小数点第2位を四捨五入し、算出した。
2.相対誤差(RE)の算出方法
以下の式に従って算出した。
4.血漿及び酢酸添加血漿試料
GC/MS法(実施例2)及び酵素法(比較例3)による血漿及び酢酸添加血漿の測定結果を以下の表6及び7に示した。GC/MS法においては、いずれの酢酸添加濃度においても回収率は92%以上であり、良好な値であった。一方、酵素法においては、酢酸添加濃度50及び150μmol/Lにおいて90%以下であった。
次に両者の測定値を比較した結果を以下の表8に示した。いずれの試料においても酵素法に比べ、GC/MS法の値が高値であり、また、酢酸添加濃度が高い試料ほど両者の測定値は近づく傾向にあった。
GC/MS法(実施例2)及び酵素法(比較例3)による血漿及び酢酸添加血漿の測定結果を以下の表6及び7に示した。GC/MS法においては、いずれの酢酸添加濃度においても回収率は92%以上であり、良好な値であった。一方、酵素法においては、酢酸添加濃度50及び150μmol/Lにおいて90%以下であった。
次に両者の測定値を比較した結果を以下の表8に示した。いずれの試料においても酵素法に比べ、GC/MS法の値が高値であり、また、酢酸添加濃度が高い試料ほど両者の測定値は近づく傾向にあった。
5.透析患者血漿試料
酢酸含有透析液を使用している透析患者血漿(n=45)を酵素法(比較例3)で測定した値と同一検体をGC/MS法(実施例2)で測定した値を表9に示した。45例中43例においてGC/MS法による測定値高値を示した。また、横軸にGC/MS法を、縦軸に酵素法の測定値をプロットした結果を図5に示した。両者の値は良好な相関性を有していた(r=0.9922)。
次に横軸にGC/MS法に得られた値、縦軸にGC/MS法を100としたときの酵素法の値を示した結果を図6に示した。GC/MS法の測定値が高値になるほど両者の値が近づく傾向にあった。
酢酸含有透析液を使用している透析患者血漿(n=45)を酵素法(比較例3)で測定した値と同一検体をGC/MS法(実施例2)で測定した値を表9に示した。45例中43例においてGC/MS法による測定値高値を示した。また、横軸にGC/MS法を、縦軸に酵素法の測定値をプロットした結果を図5に示した。両者の値は良好な相関性を有していた(r=0.9922)。
次に横軸にGC/MS法に得られた値、縦軸にGC/MS法を100としたときの酵素法の値を示した結果を図6に示した。GC/MS法の測定値が高値になるほど両者の値が近づく傾向にあった。
以上より、GC/MS法(実施例2)は酵素法(比較例3)よりも感度及び特異性に優れており、血漿中酢酸濃度測定において有用な測定法であると考えられた。
なお、酵素法は血漿中の妨害物質の影響を受けやすいと報告されており(Bergmeyer HU and Mollering H : In:Methods of Enzymatic Analysis (ed by Bergmeyrer HU, et al), 3rd ed,vol VI, p.628-645, W2-einheim, Deerfield Beach, Florida, Verlag Chimemine, 184. (1985)参照)、得られた結果もそのことを示唆するものであった。
なお、酵素法は血漿中の妨害物質の影響を受けやすいと報告されており(Bergmeyer HU and Mollering H : In:Methods of Enzymatic Analysis (ed by Bergmeyrer HU, et al), 3rd ed,vol VI, p.628-645, W2-einheim, Deerfield Beach, Florida, Verlag Chimemine, 184. (1985)参照)、得られた結果もそのことを示唆するものであった。
Claims (15)
- ガスクロマトグラフィー/質量分析法(GC/MS法)による血漿中の酢酸濃度の測定方法であって、血漿中の酢酸をメチル-tert-ブチルエーテル(MTBE)で抽出する工程を含む、方法。
- 抽出前に塩酸を添加する工程を含まない請求項1に記載の方法。
- 血漿を除蛋白質剤で処理する工程をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 除蛋白質剤が、スルホサリチル酸を含む、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 血漿を除蛋白質剤で処理する工程後、遠心分離を行わずに、血漿中の酢酸をMTBEで抽出する工程を含む、請求項3または4に記載の方法。
- 血漿中に安定同位体標識酢酸を添加する工程をさらに含む、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 安定同位体標識酢酸が、酢酸ナトリウム-1-13C、酢酸ナトリウム-2-13C、酢酸ナトリウム-13C2、酢酸ナトリウム-d3、酢酸ナトリウム-18O2、酢酸ナトリウム-1-13C,d3及び酢酸ナトリウム-2-13C,d3から選択される、請求項6に記載の方法。
- GC/MS法が、イオン化に電子衝撃法を用いる方法である、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- MTBEを含む、GC/MS法による血漿中の酢酸濃度の測定用キット。
- 除蛋白質剤をさらに含む、請求項9に記載のキット。
- 除蛋白質剤が、スルホサリチル酸を含む、請求項10に記載のキット。
- 安定同位体標識酢酸をさらに含む、請求項9〜11のいずれかに記載のキット。
- 安定同位体標識酢酸が、酢酸ナトリウム-1-13C、酢酸ナトリウム-2-13C、酢酸ナトリウム-13C2、酢酸ナトリウム-d3、酢酸ナトリウム-18O2、酢酸ナトリウム-1-13C,d3及び酢酸ナトリウム-2-13C,d3から選択される、請求項12に記載のキット。
- 誘導体化試薬をさらに含む、請求項9〜13のいずれかに記載のキット。
- 誘導体化試薬が、N-メチル-N-(tert-ブチルジメチルシリル)トリフルオロアセトアミドである、請求項14に記載のキット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013551742A JPWO2013099949A1 (ja) | 2011-12-28 | 2012-12-26 | 血漿中の酢酸濃度の測定方法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011287835 | 2011-12-28 | ||
JP2011287835 | 2011-12-28 | ||
JP2013551742A JPWO2013099949A1 (ja) | 2011-12-28 | 2012-12-26 | 血漿中の酢酸濃度の測定方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2013099949A1 true JPWO2013099949A1 (ja) | 2015-05-11 |
Family
ID=48697430
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013551742A Pending JPWO2013099949A1 (ja) | 2011-12-28 | 2012-12-26 | 血漿中の酢酸濃度の測定方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20140315322A1 (ja) |
JP (1) | JPWO2013099949A1 (ja) |
KR (1) | KR20140099304A (ja) |
AU (1) | AU2012361692A1 (ja) |
WO (1) | WO2013099949A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020517929A (ja) * | 2017-04-20 | 2020-06-18 | メタボロン,インコーポレイテッド | 有機酸代謝物を検出かつ定量する質量分析法 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016208741A1 (ja) * | 2015-06-24 | 2016-12-29 | マイクロブロット株式会社 | 簡便な微量生体試料の脂質解析法 |
CN113167776B (zh) * | 2018-11-29 | 2024-02-27 | 株式会社岛津制作所 | 试样测定装置及测定参数设定支持装置 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4940658A (en) * | 1986-11-20 | 1990-07-10 | University Patents, Inc. | Assay for sulfhydryl amino acids and methods for detecting and distinguishing cobalamin and folic acid deficency |
-
2012
- 2012-12-26 WO PCT/JP2012/083663 patent/WO2013099949A1/ja active Application Filing
- 2012-12-26 JP JP2013551742A patent/JPWO2013099949A1/ja active Pending
- 2012-12-26 US US14/367,047 patent/US20140315322A1/en not_active Abandoned
- 2012-12-26 KR KR1020147017905A patent/KR20140099304A/ko not_active Application Discontinuation
- 2012-12-26 AU AU2012361692A patent/AU2012361692A1/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020517929A (ja) * | 2017-04-20 | 2020-06-18 | メタボロン,インコーポレイテッド | 有機酸代謝物を検出かつ定量する質量分析法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2013099949A1 (ja) | 2013-07-04 |
KR20140099304A (ko) | 2014-08-11 |
AU2012361692A1 (en) | 2014-07-17 |
US20140315322A1 (en) | 2014-10-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Motojyuku et al. | Determination of glyphosate, glyphosate metabolites, and glufosinate in human serum by gas chromatography–mass spectrometry | |
Funk et al. | Enrichment of cysteinyl adducts of human serum albumin | |
JP2017049024A (ja) | 最終糖化産物分析のための試料の調製方法及び最終糖化産物の分析方法 | |
Shirkhanloo et al. | Dispersive liquid-liquid microextraction based on task-specific ionic liquids for determination and speciation of chromium in human blood | |
WO2013099949A1 (ja) | 血漿中の酢酸濃度の測定方法 | |
Zhao | A simple, rapid and reliable high performance liquid chromatography method for the simultaneous determination of creatinine and uric acid in plasma and urine | |
WO2024016761A1 (zh) | 一种饮用水中卤乙酸的气相色谱-质谱分析方法 | |
Panhwar et al. | Ultrasonic-assisted ionic liquid-based microextraction for preconcentration and determination of aluminum in drinking water, blood and urine samples of kidney failure patients: a multivariate study | |
Jones et al. | HPLC analysis of asymmetric dimethylarginine, symmetric dimethylarginine, homoarginine and arginine in small plasma volumes using a Gemini-NX column at high pH | |
JP6255234B2 (ja) | 生体試料中のビオチンまたはその関連物質の測定方法 | |
Ordóñez et al. | Species specific isotope dilution versus internal standardization strategies for the determination of Cu, Zn-superoxide dismutase in red blood cells | |
US20200393472A1 (en) | Haemoglobin analysis method | |
EP1860440B1 (en) | Pretreatment agent for limulus test | |
Tremblay et al. | Adding polyvinylpyrrolidone to low level protein samples significantly improves peptide recovery in FASP digests: An inexpensive and simple modification to the FASP protocol | |
JP2008157905A (ja) | 添加法による生体試料中蛋白・ペプチドの定量方法 | |
Sen et al. | Development and validation of a simple and robust method for arsenic speciation in human urine using HPLC/ICP-MS | |
CN111141863A (zh) | 一种抑郁症诊断标志物及其制备方法 | |
CN115436542A (zh) | 一种鉴别猪肠粘膜肝素中羊来源肝素掺杂比例的方法 | |
CN111505182A (zh) | 衍生化气相色谱-质谱联用测定药物中硫酸二甲酯的方法 | |
WO2011152339A1 (ja) | 慢性腎臓病の病期を判定する方法又は装置若しくはその作動方法 | |
CN112964814A (zh) | 一种生物体液总同型半胱氨酸的检测方法 | |
CN111505178A (zh) | 一种卷烟中烟碱旋光异构体迁移率的分离测定方法 | |
CN104897821A (zh) | 提取样品中肌醇的方法、试剂盒及其用途 | |
CN115326990B (zh) | 生物样本中硫化氢的检测方法及其应用 | |
CN115165986B (zh) | 一种高稳定性的电解质分析仪配套试剂 |