CN111141863A - 一种抑郁症诊断标志物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于多肽组学的抑郁症诊断标志物，所述标志物由SEQ ID Nos.1‑14中的一种或几种内源性多肽组成。本发明还公开了标志物的筛选方法，首先对生物体液样本进行预处理，采用纳升级超高效液相色谱质谱联用技术(Nano‑LC/MS)获得抑郁症患者及健康对照的生物体液多肽图谱，经过模式识别等组学分析方法，筛选出一组内源性多肽，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID Nos.1‑14，其中有3个多肽在抑郁症组表达上调，11个表达下调。根据代谢通路、蛋白归属等原则选取14个多肽中的几个组成联合标志物，在验证样本里对联合诊断标志物进行验证，所得ROC曲线的曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异性均较高，表明联合标志物可靠且稳定，可用于临床诊断试剂盒。

Description

一种抑郁症诊断标志物及其制备方法
技术领域
本发明属于分析化学及临床检验诊断领域，具体涉及基于多肽组学的抑郁症诊断标志物。
背景技术
抑郁症是一种常见的以反复发作且持久的心境低落，并伴随躯体症状为主要临床特征的精神疾病。据世界卫生组织统计，该病已成为世界第四大疾患。预计到2020年，将成为仅次于冠心病的第二大疾病负担源。在中国，抑郁症的患病率可能已经超过10％，并且呈现逐年增加的趋势，对中国社会产生严重影响，并带来多达上千亿人民币的经济负担。抑郁症导致的自杀率近年来也呈现增加的趋势，给患者家人和社会带来巨大的损失。因此，对抑郁症的诊断和治疗已经成为公众日益关注的健康和社会问题。
抑郁症虽然一直备受国际社会重视，但其诊断仍是制约治疗抑郁症的一大难题。目前对于抑郁症的诊断主要根据患者的主诉和临床表现，结合抑郁症测试表及常规医学和行为学检测等，但受制于患者文化程度、医生临床经验等主观因素影响，往往存在误诊、漏诊和某些患者治疗困难等现象。目前尚无实用的、已明确的用于客观评价抑郁症严重程度、亚型和治疗反馈的有效方法。
实际上，抑郁症作为精神疾病，存在生物学行为高度异质性的现象，其发生和发展具有不同的诱因和作用通路。多肽作为蛋白质合成、加工、降解的产物，可以反映机体内蛋白质的异常代谢过程，蛋白质被剪切成不同的肽段后还可发挥不同的生物学功能；一些多肽作为信使分子，如多肽激素、神经多肽、细胞因子、酶抑制因子等参与调控机体生理生化过程，因此与疾病的产生发展有着密切的联系。神经肽在细胞信号传导中发挥重要作用，参与控制焦虑，抑郁，疼痛，奖励通路及其他与精神障碍有关的过程，且容易从病变组织中释放到体液中而被检测出来，可能是抑郁症诊断的特异性标志物。已有研究表明催产素、P物质等神经肽与抑郁症密切相关，但由于技术上的挑战性，目前尚缺乏多肽组学与重度抑郁症相关性的系统研究。
发明内容
本发明基于多肽组学，运用有机溶剂沉蛋白、固液萃取、液液萃取等方法对样品进行除蛋白和富集处理后，采用纳升级超高效液相色谱质谱联用技术(Nano-LC/MS)获得抑郁症患者及健康对照血液多肽图谱，经过模式识别等组学分析方法，筛选并鉴定了14个内源性多肽标志物，氨基酸序列为SEQ ID Nos.1-14中的一种，或由SEQ ID Nos.1-14中任意几种多肽组合成的联合标志物。
基于以上发明构思，本发明的一个方面提供了一种抑郁症诊断标志物，这种诊断标志物是一种内源性多肽，该内源性多肽的氨基酸序列是SEQ ID Nos.1-14中的至少一种。
本发明的另一方面提供了一种抑郁症诊断的联合标志物，该联合标志物是两种以上的序列是SEQ ID Nos.1-14中的至少一种的内源性多肽的组合物。
在优选的实施方式中，联合标志物是归属于不同蛋白的多肽的组合物。
在另一优选的实施方式中，联合标志物是来自不同代谢通路的多肽的组合物。
在优选的实施方式中，序列是SEQ ID Nos.7、SEQ ID Nos.10和SEQ ID Nos.11的所述抑郁症诊断标志物在抑郁症组表达上调，它们的含量在两组间倍数变化的范围是抑郁症组：健康对照组＝1.01～30：1；
在优选的实施方式中，序列是SEQ ID Nos.1～6、SEQ ID Nos.8～9、SEQ IDNos.12～14的所述抑郁症诊断标志物在抑郁症组表达下调，它们的含量在两组间倍数变化的范围是健康对照组：抑郁症组＝1.01～30：1。
优选地，内源性多肽来源于体液，进一步优选，体液包括血浆、血清、脑脊液或尿液中的至少一种。
本发明的另一方面提供了一种筛选抑郁症诊断标志物的方法，该方法至少包括以下步骤：
采集抑郁症患者及健康对照志愿者生物体液样本；
对生物体液样本进行预处理，采用纳升级超高效液相色谱质谱联用技术获得抑郁症患者及健康对照生物体液多肽图谱；
筛选出一组内源性多肽，将所述内源性多肽中的一种作为单一标志物，观察在患者组以及对照组表达上调或者下调；
鉴定所述内源性多肽的氨基酸序列为SEQ ID Nos.1-14；
获得受试者工作特征ROC曲线、曲线下面积AUC及灵敏度和特异性值。
优选地，样品预处理的方法包括有机溶剂沉蛋白、固液萃取、液液萃取。
在优选的实施方式中，单一标志物的受试者工作特征ROC曲线的曲线下面积(AUC)值为0.6～0.999，灵敏度为60％～99.99％，特异性为 60％～99.99％。
在优选的实施方式中，上述方法还包括将所述多肽以不同方式组合成联合标志物。
在优选的实施方式中，组合方式包括将归属于不同蛋白的多肽组合或者将来自不同代谢通路的多肽组合。
在优选的实施方式中，联合标志物的受试者工作特征ROC曲线的曲线下面积(AUC)值为0.6～0.999，灵敏度为60％～99.99％，特异性为 60％～99.99％。
序列是SEQ ID Nos.7、SEQ ID Nos.10和SEQ ID Nos.11的所述抑郁症诊断标志物在抑郁症组表达上调，它们的含量在两组间倍数变化的范围是抑郁症组：健康对照组＝1.01～30：1；
序列是SEQ ID Nos.1～6、SEQ ID Nos.8～9、SEQ ID Nos.12～14的所述抑郁症诊断标志物在抑郁症组表达下调，它们的含量在两组间倍数变化的范围是健康对照组：抑郁症组＝1.01～30：1。
本发明的再一方面，提供了一种抑郁症诊断标志物，该郁症诊断标志物根据上述方法筛选和制备。
本发明的又一方面，提供了一种抑郁症诊断试剂盒，该试剂盒至少包单一诊断标志物或联合标志物。
本发明的又一方面，公开了根据本发明的抑郁症诊断标志物在抑郁症诊断试剂盒中的应用。
本发明能够产生的有益效果：
本发明基于多肽组学技术发现并验证了14个内源性多肽在抑郁症组与健康对照组之间存在显著差异，可作为抑郁症的生物标志物；通过二元逻辑回归模型发现并验证了一组联合标志物，对于抑郁症的预测具有高灵敏度和高特异性，具有开发为抑郁症临床诊断试剂盒的前景。
目前对于抑郁症的诊断主要根据患者的主诉和临床表现，结合抑郁症测试表及常规医学和行为学检测等，较容易受主管因素的影响，很容易造成误诊、漏诊等，本发明通过测定内源性多肽相对含量，采用联合标志物对抑郁症患者进行预测，能够克服以上缺陷，对抑郁症的诊断和临床干预有着重要的意义。
附图说明
图1为抑郁症与健康对照PLS-DA分析图；
图2A图为实施例1中联合标志物受试者工作特征ROC曲线，图2B 为单一多肽标志物ROC曲线与联合标志物ROC曲线的比较；
图3为实施例2中联合标志物受试者工作特征ROC曲线；
图4为实施例1和实施例2中5个多肽标志物在抑郁症组和健康对照组的相对含量变化；数据以均值±标准误表示，***P<0.001，**P<0.01， *P<0.05。
具体实施方式
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
1.样本采集
所有志愿者均于上午7:00～8:00空腹采血。用含酶抑制剂及抗凝剂的真空采血管收集全血，3000rpm离心十分钟，取上层血浆分装后置-80℃保存备用。所有志愿者均签署知情同意书。抑郁症患者的诊断根据汉密尔顿抑郁量表(HDRS)进行评估，根据评估结果分为重度抑郁症(S-MDD) 和中度抑郁症(M-MDD)。样品的具体来源和分组如表1所示。
表1
Figure BDA0001855932180000051
2.样品预处理
可以采用诸如有机溶剂沉蛋白、固液萃取和液液萃取等常用技术对样品预处理。在本发明的实施仅以示例的方式示出采用盐析辅助液液萃取法(SALLE)对样品进行预处理的方法，也可采用其他常用的预处理技术搭载后续的纳升级超高效液相色谱质谱分析对标志物多肽进行筛选和鉴定。在盐析辅助液液萃取法(SALLE)中：用5％磷酸(v/v)对体液样本进行解吸附；加4mL 4M磷酸氢二钾和4mL异丙醇萃取；转移萃取液，40℃下氮气吹干；用1mL异丙醇复溶以除盐，转移上清液，40℃下氮气吹干；加入45μL 15％乙腈(v/v)(含0.2％甲酸(v/v))和30μL二氯甲烷，除脂后取上清液待分析。
3.纳升级超高效液相色谱质谱分析
色谱条件：分析柱采用内径为75μm，长20cm，一端带有10μm喷针的PicoFrit系列的毛细管柱，C18(3μm，
Figure BDA0001855932180000052
)填料装填。捕集柱为150μm 内径，5cm长的毛细管柱，C18(5μm，
Figure BDA0001855932180000053
)填料装填。流动相A为0.1％甲酸(v/v)，流动相B为80％乙腈(v/v)(含0.2％甲酸(v/v))。上样量5 μL，通过loading泵以3μL/mL的流速上样7min，2％B等度洗脱；上样后6通阀切换到分析模式，将样品正向冲洗到分析柱上，洗脱梯度：0～8min， 5％B；8～10min，5～25％B；10～47min，25～80％B；47～50min，80～95％ B；50～52min，95％B。流速为0.28μL/mL。
质谱条件：电喷雾(ESI)离子源正离子模式，喷雾电压为1.5V，加热毛细管温度为320℃，在FTMS模式下设置2个scan event，扫描范围分别是300～2000/504～509.5。采用Xcalibur软件记录总离子流图与MS谱图。二级分析采用HCD裂解模式，碰撞能量为22-26V。
4.模式识别及标志物筛选
4.1数据预处理
将Nano-LC/MS获得的原始质谱数据导入Progenesis QI软件(Waters) 进行峰识别、峰对齐和峰提取；采用MetaboAnalyst 3.0软件对数据进行总和归一化、对数转换和pareto缩放。
4.2统计分析
数据经过预处理后，进行T-test单因素统计分析，在多因素统计分析中，采用MetaboAnalyst 3.0软件对数据进行偏最小二乘法判别分析 (PLS-DA)，PLS-DA是一种有监督的模式识别方法。
4.3标志物筛选与鉴定
根据PLS-DA模型得到的变量权重值(VIP)和T-test的结果筛选差异离子，对差异离子进行靶向二级质谱分析，用PEAKS Studio软件，以 Swiss-prot中human中的多肽序列为数据库进行检索，假阳性率FDR设为 1％，得到鉴定结果。
4.4联合诊断标志物
从筛选得到的差异多肽中按照代谢通路、蛋白归属等原则选取几个组成联合标志物，使用SPSS软件进一将这些多肽的相对含量回归为联合标识变量P，根据联合标志物变量P值做受试者工作特征曲线(ROC曲线)，其曲线下面积AUC值越接近1表示模型预测能力越强，其横纵坐标分别代表假阳性率和真阳性率。
4.5联合诊断标志物的验证
为了进一步对标志物进行验证，以相同方法对验证集的样本进行测定，当验证集联合标志物受试者工作特征曲线(ROC曲线)的曲线下面积AUC 值、灵敏度与特异性同样较高时，认为联合标志物能够可靠且稳定的对抑郁症进行预测。
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
实施例1
1.样品采集
所有志愿者均于上午7:00～8:00空腹采血。用含酶抑制剂及抗凝剂的真空采血管收集全血，3000rpm离心十分钟，取上层血浆分装后置-80℃保存备用。所有志愿者均签署知情同意书。抑郁症患者的诊断根据汉密尔顿抑郁量表(HDRS)进行评估，根据评估结果分为重度抑郁症(S-MDD) 和中度抑郁症(M-MDD)。
包括抑郁症患者和健康对照(HC)各60例，性别、年龄及抑郁症患病程度信息见表1。
2.样品预处理
采用盐析辅助液液萃取法(SALLE)对样品进行预处理：
1)解吸附：取分装好的血浆500μL置于10mL离心管，加入20μL 5 ng/mL的内标溶液(同位素标记的催产素)，涡旋30s，加入200μL 5％磷酸(v/v)，涡旋30s；
2)萃取与除杂：加4mL 4M磷酸氢二钾，涡旋30s，加入4mL异丙醇，涡旋1min，3000rpm离心10min，将上清液4.5mL转移至5mL离心管，40℃下氮气吹干；
3)除盐：将2)所得样品中加入1mL异丙醇，超声30s，涡旋30s， 7000rpm离心20min，将上清液950μL转移至1.5mL离心管；
4)质控样本：吸取各样本上述上清液90μL混合后分装成6份，作为质控样本；
5)除脂与复溶：将3)和4)所得上清液在40℃下氮气吹干，加入45 μL 15％乙腈(v/v)(含0.2％甲酸(v/v))和30μL二氯甲烷，超声30s，涡旋30s，15000rpm离心1h，取上清液20μL待分析。
3.纳升级超高效液相色谱质谱分析(Nano-LC/MS)
色谱条件：分析柱采用内径为75μm，长20cm，一端带有10μm喷针的PicoFrit系列的毛细管柱，C18(3μm，
Figure BDA0001855932180000071
)填料装填。捕集柱为150μm 内径，5cm长的毛细管柱，C18(5μm，
Figure BDA0001855932180000072
)填料装填。流动相A为0.1％甲酸(v/v)，流动相B为80％乙腈(v/v)(含0.2％甲酸(v/v))。上样量5 μL，通过loading泵以3μL/mL的流速上样7min，2％B等度洗脱；上样后6通阀切换到分析模式，将样品正向冲洗到分析柱上，洗脱梯度：0～8min， 5％B；8～10min，5～25％B；10～47min，25～80％B；47～50min，80～95％ B；50～52min，95％B。流速为0.28μL/mL。
质谱条件：电喷雾(ESI)离子源正离子模式，喷雾电压为1.5V，加热毛细管温度为320℃，在FTMS模式下设置2个scan event，扫描范围分别是300～2000/504～509.5。采用Xcalibur软件记录总离子流图与MS谱图。二级分析采用HCD裂解模式，碰撞能量为22-26V。
每个样品重复分析两次，样品进样顺序为C1、C1、D1、D1、C2、 C2、D2、D2……(C为健康对照，D为抑郁症组)，每分析20个样品，分析质控样品1次，以监控系统稳定性和重复性。
4.模式识别及标志物筛选
4.1数据预处理
将Nano-LC/MS获得的原始质谱数据导入Progenesis QI软件(Waters) 进行峰识别、峰对齐和峰提取，filter strength为0.8，剔除absolute ion intensity小于10000的离子。数据经过80％规则筛选后，将m/z≥2的离子导入MetaboAnalyst 3.0软件进行总和归一化、对数转换和pareto缩放。
4.2统计分析
数据经过预处理后，筛选出质控样本中相对标准偏差(RSD)小于75％的1069个离子，进行T-test单因素统计分析，其中p<0.05的离子有123 个；在多因素统计分析中，采用MetaboAnalyst 3.0软件对数据进行偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)，PLS-DA是一种有监督的模式识别方法，结果见附图1，PLS-DA模型中有2个主成分，可以区分重度抑郁症组和对照组，表示模型解释能力的参数R2Y＝0.87，表示模型预测能力的参数Q2Y＝ 0.72，以上参数表明该模型可靠，不存在过拟合现象。
4.3标志物筛选与鉴定
根据PLS-DA模型得到的变量权重值(VIP)筛选VIP>1的离子177 个，并采用T-test进行验证，共得到14个差异离子。对差异离子进行靶向二级质谱分析，用PEAKS Studio软件，以Swiss-prot中human中的多肽序列为数据库进行检索，假阳性率FDR设为1％，鉴定结果在表2中示出，其中有3个多肽在MDD组表达上调，11个表达下调。
4.4联合诊断标志物
从归属于同一蛋白的多肽中选取一个组成联合标志物：LAAPPGHQLHRAHYDLRHTFMG(SEQ ID NoS.8)、 VSETESRGSESGIFTNTKESSSHHPGIAEFPSRG(SEQID NoS.14)、 VHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALGRL(SEQ ID NoS.12)、 FVELGTQPATQ(SEQID NoS.2)、DAHKSEVAHRFKDLGEENFKAL(SEQ ID NoS.9)，这5个多肽的相对含量如附图4所示，与健康对照组相比均有显著性差异。使用SPSS软件进一将这些多肽的相对含量回归为联合标志变量P，回归方程如下：
P＝1/(1+e-(3.727+0.02a-0.674b+1.22c-0.867d-2.885e))
其中，a、b、c、d和e分别代表上述5个多肽的相对含量，该变量可以用于辅助判断抑郁症。根据联合标志物变量P值做受试者工作特征曲线 (ROC曲线)，如附图2A所示，曲线下面积AUC值为0.949，灵敏度与特异性分别为93.3％和83.3％，联合标志物的AUC高于单一多肽作为诊断标志物的AUC(附图2B)。
实施例2
为了进一步对标志物进行验证，以相同方法测定了实施例2中的样品。 1.样品采集
样品采集方法同实施例1，实施例2包括58个抑郁症患者和60例健康对照，性别、年龄及抑郁症患病程度信息见表1。
2.样品预处理
同实施例1。
3.纳升级超高效液相色谱质谱分析(Nano-LC/MS)
同实施例1。
4.联合诊断标志物的验证
实施例2作为验证组，采用与实施例1相同的数据处理方法，验证结果与实施例1一致，如附图4所示，用实施例1中的联合标志物建立二元逻辑回归模型以获得ROC曲线，结果如附图3所示，曲线下面积为0.806，灵敏度与特异性分别为78.0％和72.5％，表明实施例1中的联合标志物能够可靠且稳定的对抑郁症进行预测。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
Figure BDA0001855932180000111
序列表
<110> 中国科学院大连化学物理研究所
<120> 一种抑郁症诊断标志物及其制备方法
<130> DD180468I
<141> 2018-11-06
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Human
<400> 1
Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu
1 5
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> Human
<400> 2
Phe Val Glu Leu Gly Thr Gln Pro Ala Thr Gln
1 5 10
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Human
<400> 3
Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe
1 5 10
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> Human
<400> 4
Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His Lys Tyr
1 5 10 15
His
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> Human
<400> 5
Tyr Ser Ile Ile Thr Pro Asn Ile Leu Arg Leu Glu Ser Glu Glu Thr
1 5 10 15
<210> 6
<211> 18
<212> PRT
<213> Human
<400> 6
Ala Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His Lys
1 5 10 15
Tyr His
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> Human
<400> 7
Thr Val Phe Leu Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro
1 5 10 15
Lys
<210> 8
<211> 22
<212> PRT
<213> Human
<400> 8
Leu Ala Ala Pro Pro Gly His Gln Leu His Arg Ala His Tyr Asp Leu
1 5 10 15
Arg His Thr Phe Met Gly
20
<210> 9
<211> 22
<212> PRT
<213> Human
<400> 9
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu
20
<210> 10
<211> 23
<212> PRT
<213> Human
<400> 10
Trp Ser Gly Glu Pro Pro Arg Arg Asn Ser His Thr Phe Asn Cys Arg
1 5 10 15
Met Leu Val Lys Pro Leu Pro
20
<210> 11
<211> 33
<212> PRT
<213> Human
<400> 11
Arg Gly Ala Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Ile Pro
1 5 10 15
Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly
20 25 30
Pro
<210> 12
<211> 31
<212> PRT
<213> Human
<400> 12
Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp Gly
1 5 10 15
Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu
20 25 30
<210> 13
<211> 32
<212> PRT
<213> Human
<400> 13
Val Leu Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly Lys
1 5 10 15
Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg Met
20 25 30
<210> 14
<211> 34
<212> PRT
<213> Human
<400> 14
Val Ser Glu Thr Glu Ser Arg Gly Ser Glu Ser Gly Ile Phe Thr Asn
1 5 10 15
Thr Lys Glu Ser Ser Ser His His Pro Gly Ile Ala Glu Phe Pro Ser
20 25 30
Arg Gly

Claims (10)

1.一种抑郁症诊断标志物，其特征在于，所述诊断标志物是一种内源性多肽，所述内源性多肽的氨基酸序列是SEQ ID Nos.1-14中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的抑郁症诊断标志物，其特征在于，所述抑郁症诊断标志物是联合标志物，所述联合标志物是两种以上的序列是SEQ ID Nos.1-14中的至少一种的内源性多肽的组合物；
优选地，所述联合标志物是归属于不同蛋白的多肽的组合物；
优选地，所述联合标志物是来自不同代谢通路的多肽的组合物。
3.根据权利要求1所述的抑郁症诊断标志物，其特征在于，序列是SEQ ID Nos.7、SEQID Nos.10和SEQ ID Nos.11的所述抑郁症诊断标志物在抑郁症组表达上调，它们的含量在两组间倍数变化的范围是抑郁症组：健康对照组＝1.01～30：1；
优选地，序列是SEQ ID Nos.1～6、SEQ ID Nos.8～9、SEQ ID Nos.12～14的所述抑郁症诊断标志物在抑郁症组表达下调，它们的含量在两组间倍数变化的范围是健康对照组：抑郁症组＝1.01～30：1。
4.根据权利要求1所述的抑郁症诊断标志物，其特征在于，所述内源性多肽来源于体液，优选地，所述体液包括血浆、血清、脑脊液或尿液中的至少一种。
5.一种筛选抑郁症诊断标志物的方法，其特征在于，所述方法至少包括以下步骤：
采集抑郁症患者及健康对照志愿者生物体液样本；
对生物体液样本进行预处理，采用纳升级超高效液相色谱质谱联用技术获得抑郁症患者及健康对照生物体液多肽图谱；
筛选出一组内源性多肽，将所述内源性多肽中的一种作为单一标志物，观察在患者组以及对照组表达上调或者下调；
鉴定所述内源性多肽的氨基酸序列为SEQ ID Nos.1-14；
获得受试者工作特征ROC曲线、曲线下面积AUC及灵敏度和特异性值；
优选地，所述样品预处理的方法包括有机溶剂沉蛋白、固液萃取、液液萃取；
优选地，所述单一标志物的受试者工作特征ROC曲线的曲线下面积AUC值为0.6～0.999，灵敏度为60％～99.99％，特异性为60％～99.99％。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述多肽以不同方式组合成联合标志物；
优选地，所述组合方式包括将归属于不同蛋白的多肽组合或者将来自不同代谢通路的多肽组合；
优选地，所述联合标志物的受试者工作特征ROC曲线的曲线下面积AUC值为0.6～0.999，灵敏度为60％～99.99％，特异性为60％～99.99％。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，序列是SEQ ID Nos.7、SEQ ID Nos.10和SEQ ID Nos.11的所述抑郁症诊断标志物在抑郁症组表达上调，它们的含量在两组间倍数变化的范围是抑郁症组：健康对照组＝1.01～30：1；
优选地，序列是SEQ ID Nos.1～6、SEQ ID Nos.8～9、SEQ ID Nos.12～14的所述抑郁症诊断标志物在抑郁症组表达下调，它们的含量在两组间倍数变化的范围是健康对照组：抑郁症组＝1.01～30：1。
8.一种抑郁症诊断标志物，其特征在于，所述抑郁症诊断标志物根据权利要求5至7中任一项所述的方法制备。
9.一种抑郁症诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括权利要求1所述的诊断标志物或权利要求2所述的联合标志物。
10.权利要求1至4或权利要求8中任一项所述的抑郁症诊断标志物在抑郁症诊断试剂盒中的应用。
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