CN112924685B

CN112924685B - 抑郁症生物标志物和包括其的诊断试剂盒

Info

Publication number: CN112924685B
Application number: CN201911236160.5A
Authority: CN
Inventors: 张晓哲; 王翼; 刘欣欣; 刘丹; 程孟春; 赵楠
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2019-12-05
Filing date: 2019-12-05
Publication date: 2022-09-13
Anticipated expiration: 2039-12-05
Also published as: CN112924685A

Abstract

本申请公开了一种抑郁症生物标志物，所述抑郁症生物标志物用于区分抑郁症和非抑郁症，选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的多肽中的至少一种。利用这三个多肽标志物构建的试剂盒可以稳定且可靠地诊断抑郁症，能够克服依靠主观判断来诊断抑郁症的缺陷和不足，对抑郁症的诊断和临床干预有着重要的意义。

Description

抑郁症生物标志物和包括其的诊断试剂盒

技术领域

本申请属于分析化学及临床检验诊断领域，具体涉及基于多肽组学的抑郁症诊断标志物和包括其的诊断试剂盒。

背景技术

抑郁症作为一种常见的心理疾病，在世界范围内抑郁症患者预计超过3亿人。该病具有高复发率以及高自杀率，因此相对于其他精神类疾病，该病造成了较高的伤残调整生命年以及严重的经济负担。虽然抑郁症有行之有效的治疗方法，但是中国仍有较多的抑郁症患者未能接受有效治疗。而抑郁症的临床诊断仍是制约其有效治疗的难点之一。目前抑郁症的诊断主要依据结构式或半结构式的面谈，这十分受限于患者的文化水平以及医生的临床经验等主观因素，往往出现误诊、漏诊等现象。因此，医院迫切需要建立一套客观的标志物系统用于抑郁症的临床诊断。

事实上，抑郁症相关的病理机制的研究一直保持着较高的热度并发现了大量潜在的生物标志物。这些标志物涉及了不同的病理机制假说：单胺缺乏假说、下丘脑-垂体-肾上腺轴失调假说、免疫炎症假说、神经再生减少假说等，但用于抑郁症的诊断仍缺乏特异性和灵敏度。而这些标志物主要是一些基因、蛋白质、代谢物，而肽类标志物研究较少。多肽作为蛋白质合成、加工、降解的产物，可以反映生物体内的前体蛋白以及相关的蛋白酶的异常代谢。蛋白质被剪切成不同的肽段后，具有更好的组织渗透性以及高度功能性。一些肽段可以作为信使分子涉及机体的酶抑制活性、细胞活性以及神经活性的调节。因此与疾病的发生与发展密切相关。但是生物样本中复杂的基质效应、较低的生理浓度、蛋白吸附效应严重干扰了肽类物质的检测。这些技术上的难点限制了多肽组学与抑郁症相关性的系统研究。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本申请针对以上问题，成功实现了生物体液中的多肽组学的研究，确定了抑郁症生物标志物，用将其研发为试剂盒。

本发明的发明人主要利用盐析辅助液液萃取法(SALLE)纯化和富集生物体液多肽分子。

本发明的发明人主要利用纳升级高效液相色谱与二维线性离子阱质谱联用技术(nanoLC-orbitrap/MS)采集生物体液的多肽轮廓。

本发明的发明人为首次利用nanoLC-orbitrap/MS系统测定生物体液的多肽轮廓，选择每个多肽特征在所有样本中的缺失值在50％以内以及质控样本中每个多肽特征整个实验中相对标准偏差在75％以内为稳定的多肽特征。

在本发明的实施例中，发明人针对单电荷特征，并将所有特征对齐后，即保证两个实施例具有相同的特征数，然后进行和归一化，即将样本中所有的特征加和后为该样本的总特征强度，样本中每个特征除以总特征强度后均乘以1000为这个样本中该特征的相对强度，所有的样本均采用相同的操作，可部分消除样本之间的差异。

本发明的发明人利用metaboanalyst软件，将归一化的特征进行对数转换以及帕累托缩放,使多肽特征满足正态分布，然后进行T检验。

在实施例部分，选择实施例中在T检验中显著性水平P小于0.05且健康组平均水平比抑郁症患者平均水平高2倍或者低2倍的特征以及经过多重假设检验(FDR)的显著性水平小于0.05的特征为潜在的生物标志物。

本发明的发明人利用PEAKS检索多肽特征的氨基酸序列，并通过保留时间以及质量窗口确定潜在的多肽标志物。

本申请选择受试者特性曲线选择曲线下面积(AUC)在0.6至0.999的多肽特征，通过二元逻辑回归模型建立组合模型诊断抑郁症。

本发明确定的三个多肽标志物(SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3)诊断抑郁症，在发现组和验证组中取得了较好的灵敏度和特异性。此外，将它们作为联合标志物使用，获得更优的灵敏度和特异性。

尽管本发明利用非靶向质谱法测定了这三个多肽标志物的相对含量，也可通过ELISA法、western-blot法、荧光法、色谱法、靶向质谱法测定这三个标志物的相对含量。

利用单一标志物或联合标志物建立的试剂盒，可用于临床抑郁症的诊断，可提供更客观的诊断结果。不仅适用于血浆体系，还适用于血清、全血、尿液、汗液、唾液、精液、泪液等生物体液。

本发明的一方面提供了抑郁症生物标志物，所述抑郁症生物标志物用于区分抑郁症和非抑郁症，选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的多肽中的至少一种。

在优选的实施方式中，所述抑郁症生物标志物为由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的多肽组成的联合标志物。

在优选的实施方式中，所述联合生物标志物预测抑郁症患者的受试者工作特性曲线的曲线下面积为0.6～0.999。

在优选的实施方式中，所述抑郁症生物标志物具有在T检验中显著性水平小于0.05且健康组平均水平比抑郁症患者平均水平高2倍或者低2倍的特征或T检验中经多重假设检验(FDR)的显著性水平小于0.05的特征。

在优选的实施方式中，所述抑郁症生物标志物的相对含量通过非靶向质谱法、ELISA法、western-blot法、荧光法、色谱法或靶向质谱法测定。

本发明的另一方面提供了抑郁症诊断试剂盒，所述试诊断剂盒包括上述抑郁症生物标志物。

在优选的实施方式中，所述诊断试剂盒适用于根据汉密顿评分表划分抑郁症的严重程度的判断。

在优选的实施方式中，所述诊断试剂盒适用于不同性别的人群抑郁症的诊断。

在优选的实施方式中，所述诊断试剂盒适用于18～100周岁不同年龄阶层的人群抑郁症的诊断。

在优选的实施方式中，所述诊断试剂盒用于血浆、血清、全血、尿液、汗液、唾液、精液或泪液中的至少一种体液样本的检测。

本申请能产生的有益效果包括：

1)本发明基于多肽组学技术，确定了3个多肽标志物，可以作为抑郁症的生物标志物以及用于诊断抑郁症的试剂盒的开发。利用这三个多肽标志物建立的联合诊断模型可以稳定且可靠地诊断抑郁症。

2)本发明通过测定内源性多肽相对含量，采用单一或者联合标志物对抑郁症患者进行预测，能够克服依靠主观判断来诊断抑郁症的缺陷和不足，对抑郁症的诊断和临床干预有着重要的意义。

附图说明

图1示出实施例1中单电荷多肽特征用以区分临床样本标签的PLSDA模型的得分图；

图2示出实施例1中联合标志物的临床诊断性能以及样本分布信息；

图3示出实施例2中单一标志物的临床诊断性能以及样本分布信息；

图4示出实施例3中联合标志物的临床诊断性能以及样本分布信息；

图5示出实施例4中联合标志物的临床诊断性能以及样本分布信息。

具体实施方式

下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

实施例中包括的实验步骤如下：

1.样本入组

本发明的所有临床实验通过了大连市第七人民医院道德委员的审查，所有志愿者均签署知情同意书。在实施例1中，组间的年龄、性别均匹配，无显著性差别。实施例2中，不考虑组间的年龄以及性别的匹配。

2.样本采集

所有志愿者均于上午空腹采血。用含酶抑制剂及抗凝剂的真空采血管收集全血，3000rpm离心十分钟，取上层血浆分装后置-80℃保存备用。抑郁症患者的诊断根据汉密尔顿抑郁量表(HDRS)进行评估，根据评估结果分为重度抑郁症(S-MDD)和中轻度抑郁症(M-MDD)。样品的具体来源和分组如表1所示。

表1

3.样品预处理

可以采用诸如有机溶剂沉蛋白、固液萃取和液液萃取等常用技术对样品预处理。在本发明的实施仅以示例的方式示出采用盐析辅助液液萃取法(SALLE)对样品进行预处理的方法，也可采用其他常用的预处理技术搭载后续的纳升级超高效液相色谱质谱分析对标志物多肽进行筛选和鉴定。在盐析辅助液液萃取法(SALLE)中：用5％磷酸(v/v)对体液样本进行解吸附；加4mL 4M磷酸氢二钾和4mL异丙醇萃取；转移萃取液，40℃下氮气吹干；用1mL异丙醇复溶以除盐，转移上清液，40℃下氮气吹干；加入45μL 15％乙腈(v/v)(含0.2％甲酸(v/v))和30μL二氯甲烷，除脂后取上清液待分析。

4.纳升级超高效液相色谱质谱分析

色谱条件：分析柱采用内径为75μm，长20cm，一端带有10μm喷针的PicoFrit系列的毛细管柱，C18(3μm，

)填料装填。捕集柱为150μm内径，5cm长的毛细管柱，C18(5μm，

)填料装填。流动相A为0.1％甲酸(v/v)，流动相B为80％乙腈(v/v)(含0.2％甲酸(v/v))。上样量5μL，通过loading泵以3μL/mL的流速上样7min，2％B等度洗脱；上样后6通阀切换到分析模式，将样品正向冲洗到分析柱上，洗脱梯度：0～8min，5％B；8～10min，5～25％B；10～47min，25～80％B；47～50min，80～95％B；50～52min，95％B。流速为0.28μL/mL。

质谱条件：电喷雾(ESI)离子源正离子模式，喷雾电压为1.5kV，加热毛细管温度为320℃，在FTMS模式下设置一个scan event，扫描范围分别是300～2000。采用Xcalibur软件记录总离子流图与MS谱图。二级分析采用HCD裂解模式，碰撞能量为18-27V。

5.模式识别及标志物筛选

5.1数据预处理

将Nano-LC/MS获得的原始质谱数据导入Progenesis QI软件(Waters)进行峰识别、峰对齐和峰提取；利用Excel对数据进行筛选、补值、删除冗余，然后采用MetaboAnalyst3.0软件对数据进行总和归一化、对数转换和pareto缩放。

5.2统计分析

数据经过预处理后，进行T-test单因素统计分析以及倍数分析选择差异显著的标志物。利用多变量分析的方法——最小偏二乘法判别分析，通过Q²以及R²判断这些多肽特征对样本标签的预测能力。

5.3标志物筛选与鉴定

T-test以及倍数分析的结果筛选差异离子，通过时间窗口以及质量窗口匹配具有二级谱图的差异离子，用PEAKS Studio软件，以Swiss-prot中人源数据库中的蛋白序列为数据库进行检索，得到鉴定结果，确认差异多肽分子的氨基酸序列。

5.4联合诊断标志物

选择多肽标志物预测抑郁症患者的受试者工作特性曲线(ROC曲线)的曲线下面积(AUC)在0.6-0.999的特征，同时在实施例1以及实施例2中满足该要求，使用SPSS软件进一步将这些多肽特征组合成合适数目的标志物系统，并建立二元逻辑回归模型。将这些多肽标志物的相对含量回归为联合标识变量P，P越接近于1，表明该样本的标签是抑郁症的可能性越大，P越接近于0，表示该样本的标签是健康的可能性越大。根据联合标志物变量P值做受试者工作特征曲线(ROC曲线)，其曲线下面积AUC值越接近1表示模型预测能力越强，其横纵坐标分别代表假阳性率和真阳性率。

5.5联合诊断标志物的验证

为了进一步对标志物进行验证，利用实施例2的数据验证标志物系统对抑郁症的预测能力，当实施例2中联合标志物受试者工作特征曲线(ROC曲线)的曲线下面积AUC值、灵敏度与特异性同样较高时，认为联合标志物能够可靠且稳定的对抑郁症进行预测。

5.6诊断标志物系统的验证

为了进一步对标志物系统的有效性进行验证，利用实施例3、4的数据验证不同组合的标志物系统对抑郁症的预测能力，当实施例3、4中联合标志物受试者工作特征曲线(ROC曲线)的曲线下面积AUC值、灵敏度与特异性同样较高时，认为联合标志物能够可靠且稳定的对抑郁症进行预测。

实施例1

1.样品采集

收集了包括抑郁症患者(MDD)和健康对照(HC)各60例，性别、年龄及抑郁症患病程度信息见上表1，组间无显著性差异。

2.样品预处理

采用盐析辅助液液萃取法(SALLE)对样品进行预处理：

1)解吸附：取分装好的血浆500μL置于离心管，加入200μL 5％磷酸(v/v)，涡旋；

2)萃取与除杂：加4mL 4M磷酸氢二钾，涡旋，加入4mL异丙醇，涡旋，3000rpm离心10min，将上清液转移至离心管，40℃下氮气吹干；

3)除盐：将2)所得样品中加入1mL异丙醇，超声，涡旋，7000rpm离心20min，将上清液转移至离心管；

4)质控样本：吸取各样本上述上清液混合后分装成6份，作为质控样本；

5)除脂与复溶：将3)和4)所得上清液在40℃下氮气吹干，加入45μL 15％乙腈(v/v)(含0.2％甲酸(v/v))和30μL二氯甲烷，超声，涡旋，15000rpm离心，取上清液20μL待分析。

3.纳升级超高效液相色谱质谱分析(Nano-LC/MS)

)填料装填。捕集柱为150μm内径，5cm长的毛细管柱，C18(5μm，

质谱条件：电喷雾(ESI)离子源正离子模式，喷雾电压为1.5kV，加热毛细管温度为320℃，在FTMS模式下设置2个scan event，扫描范围分别是300～2000。采用Xcalibur软件记录总离子流图与MS谱图。二级分析采用HCD裂解模式，碰撞能量为18-27V。

每个样品重复分析两次，样品进样顺序为C1、C1、D1、D1、C2、C2、D2、D2……(C为健康对照，D为抑郁症组)，每分析20个样品，分析质控样品1次，以监控系统稳定性和重复性。

4.模式识别及标志物筛选

4.1数据预处理

将Nano-LC/MS获得的原始质谱数据导入Progenesis QI软件(Waters)进行峰识别、峰对齐和峰提取，filter strength为0.8，剔除absolute ion intensity小于10000的离子。将多电荷特征剔除同时将同位素分布峰仅提取到一个的单电荷特征删除，将m/z值在10ppm以内，且保留时间在±2min以内的特征合并在一起，合并规则如下：计算每个特征的平均强度(实施例1中所有样本)，计算样本缺失值的个数(特征峰响应强度<10000的样本)，计算未缺失值样本个数在所有样本中的占比与平均强度的乘积为优化后的平均强度，保留平均强度最大的特征。若样本中该特征的响应强度小于10000，则取合并特征中峰响应强度最大的替换该样本中的取值。然后将特征样本总数缺失值大于50％的特征删除以及质控样本RSD大于75％的特征删除。将特征质量值在10ppm以内，且保留时间在±2min以内的特征合并在一起，合并规则同上，但不需要替换。然后利用特征质量值在10ppm以内，且保留时间在±2min，保留实施例1中特征能在实施例2中一一对应的特征。

将离子导入MetaboAnalyst 3.0软件进行总和归一化、对数转换和pareto缩放。

4.2统计分析

数据经过预处理后，进行T-test单因素统计分析，择实施例中T检验中显著性水平P小于0.05且健康组平均水平比抑郁症患者平均水平高2倍或者低2倍的特征以及经过多重假设检验(FDR)的显著性水平小于0.05的特征为潜在的生物标志物。利用多变量分析的方法——最小偏二乘法判别分析(PLSDA)，通过Q²以及R²判断这些多肽特征对样本标签的预测能力。这些单电荷多肽特征建立的PLSDA模型的Q²,R²分别为0.85,0.76，说明单电荷多肽特征可以很好预测样本标签，且具有较好的预测性能。

4.3标志物筛选与鉴定

4.4联合诊断标志物

选择多肽标志物预测抑郁症患者的受试者工作特性曲线(ROC曲线)的曲线下面积(AUC)在0.6-0.999的特征，同时在实施例1以及实施例2中满足该要求，使用SPSS软件进一将这些多肽特征组合成合适数目的标志物系统，并建立二元逻辑回归模型，这3个多肽分别为：TPK(+14.02)STFLTT(P1：SEQ ID NO：1),SILLGNGT(P2：SEQ ID NO：2),LPVLTST(P3：SEQID NO：3),具体信息见表2。这3个多肽的相对含量见表3，与健康对照组相比均有显著性差异。使用SPSS软件进一将这些多肽的相对含量回归为联合标志变量P，回归方程如下：

P＝1/(1+e^{-(-137.038+9.501a-173.140b+143.572c})

其中，a、b、c分别代表上述3个多肽(P1～P3)的相对含量，该变量可以用于辅助判断抑郁症。根据联合标志物变量P值做受试者工作特征曲线(ROC曲线)，如图1所示，曲线下面积AUC值为1.0，灵敏度与特异性分别为100％和100％，联合标志物的AUC高于单一多肽作为诊断标志物的AUC，如图1所示。

表2

^§表示实施例1中FDR<0.05,^*表示实施例1中P<0.05∩(FC>2 or FC<0.5),

翻译后修饰,+14.02(甲基化)

实施例2

为了进一步对标志物进行验证，以相同方法测定了实施例2中的样品。

1.样品采集

样品采集方法同实施例1，实施例2包括58个抑郁症患者和60例健康对照，性别、年龄及抑郁症患病程度信息见附表1,组间性别以及年龄有显著性差异。

2.样品预处理

同实施例1。

3.纳升级超高效液相色谱质谱分析(Nano-LC/MS)

同实施例1。

4.联合诊断标志物的验证

实施例2作为验证组，采用与实施例1相同的数据处理方法，验证结果与实施例1一致，如附图2所示，用实施例1中的联合标志物建立二元逻辑回归模型以获得ROC曲线，结果如附图2所示，曲线下面积为0.844，灵敏度与特异性分别为84.5％和75.0％，表明实施例1中的联合标志物能够可靠且稳定的对抑郁症进行预测。使用SPSS软件进一将这些多肽的相对含量回归为联合标志变量P，回归方程如下：

P＝1/(1+e^{-(-1.072+0.181*a-0.944*b+0.735*c}))

其中，a、b、c分别代表上述3个多肽(P1～P3)的相对含量

表3

AVE1：表示在健康组(HC)中平均含量，AVE2：表示在疾病组(MDD)的平均含量，S.D.:表示标准偏差，AUC：表示曲线下的面积，AUC’：表示联合诊断标志物的曲线下的面积，CI：表示置信区间。

实施例3

为了进一步验证单一标志物对疾病有较好的诊断性能，以相同方法测定了实施例3中的样品。

1.样品采集

同实施例1。

2.样品预处理

同实施例1。

3.纳升级超高效液相色谱质谱分析(Nano-LC/MS)

同实施例1。

4.单一诊断标志物的验证

从四个标志物中，挑选四个标志物中的P3:SEQ ID NO：3，建立二元逻辑回归模型以获得ROC曲线，结果如图4所示，曲线下面积为0.952，灵敏度与特异性分别为100％和86.7％，表明实施例3中的P3标志物能够可靠且稳定的对抑郁症进行预测。其余单一标志物可进行类似预测。

实施例4

为了进一步验证双组合标志物对疾病有较好的诊断性能，以相同方法测定了实施例4中的样品。

1.样品采集

同实施例1。

2.样品预处理

同实施例1。

3.纳升级超高效液相色谱质谱分析(Nano-LC/MS)

同实施例1。

4.双组合诊断标志物的验证

从四个标志物中，挑选四个标志物中的P2:SEQ ID NO：2以及P3:SEQ ID NO：3，建立二元逻辑回归模型以获得ROC曲线，结果如图5所示，曲线下面积为0.997，灵敏度与特异性分别为100％和96.7％，表明实施例4中的P2以及P3组合标志物能够可靠且稳定的对抑郁症进行预测。其余双组合标志物可进行类似预测。

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

序列表

<110> 中国科学院大连化学物理研究所

<120> 抑郁症生物标志物和包括其的诊断试剂盒

<130> DD190569I

<141> 2019-12-05

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> Human

<400> 1

Thr Pro Lys Ser Thr Phe Leu Thr Thr

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Human

<400> 2

Ser Ile Leu Leu Gly Asn Gly Thr

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> Human

<400> 3

Leu Pro Val Leu Thr Ser Thr

1 5

Claims

1.抑郁症生物标志物诊断试剂盒，其特征在于，所述抑郁症生物标志物用于区分抑郁症和非抑郁症，为SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示的多肽组成的联合标志物。

2.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述抑郁症生物标志物为由SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示的多肽组成的联合标志物。

3.根据权利要求2所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述联合标志物预测抑郁症患者的受试者工作特性曲线的曲线下面积为0.6～0.999。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述抑郁症生物标志物具有在T检验中显著性水平小于0.05且健康组平均水平比抑郁症患者平均水平高2倍或者低2倍的特征或T检验中经多重假设检验的显著性水平小于0.05的特征。

5.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述抑郁症生物标志物的相对含量通过非靶向质谱法、ELISA法、western-blot法、荧光法、色谱法或靶向质谱法测定。

6.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒包括所述的抑郁症生物标志物。

7.根据权利要求6所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒适用于根据汉密顿评分表划分抑郁症的严重程度的判断。

8.根据权利要求6所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒适用于不同性别的人群抑郁症的诊断。

9.根据权利要求6所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒适用于18～100周岁不同年龄阶层的人群抑郁症的诊断。

10.根据权利要求6所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒用于血浆、血清、全血、尿液、汗液、唾液、精液或泪液中的至少一种体液样本的检测。