WO2019004430A1 - 大腸がんを検出するためのバイオマーカー - Google Patents

大腸がんを検出するためのバイオマーカー Download PDF

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biomarker
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白水　崇
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デンカ生研株式会社
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    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96486—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • G01N2333/96491—Metalloendopeptidases (3.4.24) with definite EC number
    • G01N2333/96494—Matrix metalloproteases, e. g. 3.4.24.7

Definitions

  • the present invention relates to novel protein or peptide biomarkers that can be used for detection of colorectal cancer.
  • Colorectal cancer is one of the most frequent cancers in the world, and development of effective biomarkers for CRC is essential for improving human survival.
  • diagnostic methods for colorectal cancer currently used are only those with very low accuracy such as fecal occult blood and CEA, and no new biomarkers capable of diagnosing colorectal cancer early with high accuracy have been found, and blood biomarkers Is urgently needed.
  • the present invention aims to provide a biomarker for early detection of colorectal cancer.
  • biomarker candidate proteins found in the literature search, the present inventors narrowed down the candidates to proteins which may exist in the blood EV, and quantified those proteins using the SRM / MRM method. As a result, several biomarker candidates for early diagnosis of CRC have been identified, and the present invention has been completed.
  • a colorectal cancer biomarker for detecting colorectal cancer consisting of at least one of the following 1 to 22 22 proteins, or at least one peptide of 1 to 22 partial peptides: 1. Annexin A11 (Annexin A11) (ANXA 11) (SEQ ID NO: 1); 2. Annexin A3 (Annexin A3) (ANXA 3) (SEQ ID NO: 2); 3. Annexin A4 (Annexin A4) (ANXA 4) (SEQ ID NO: 3); 4. Tenascin-N (Tanascin-N) (TNN) (SEQ ID NO: 4); 5.
  • Transferrin receptor protein 1 (TFRC) (SEQ ID NO: 5); 6. Glucose transporter 1 (GLUT-1) (SLC2A1) (SEQ ID NO: 6); 7. Complement component C9 (C9) (SEQ ID NO: 7); 8. CD88 antigen (CD88 antigen) (C5AR1) (SEQ ID NO: 8); 9. 78 kDa glucose regulated protein (78 kDa glucose-regulated protein) (HSPA5) (SEQ ID NO: 9); 10. alpha-1-acid glycoprotein (ORM1) (SEQ ID NO: 10); 11. Matrix metalloproteinase-9 (MMP9) (SEQ ID NO: 11); 12.
  • Angiopoietin-1 (Angiopoietin-1) (ANGPT1) (SEQ ID NO: 12); 13. CD67 antigen (CD67 antigen) (CEACAM8) (SEQ ID NO: 13); 14. Mucin-5B (Mucin-5B) (MUC5B) (SEQ ID NO: 14); 15. Adapter protein GRB2 (Adapter protein GRB2) (GRB2) (SEQ ID NO: 15); Annexin A5 (Annexin A5) (ANXA 5) (SEQ ID NO: 16); 17. Olfactomedin-4 (OLFM4) (SEQ ID NO: 17); 18. Neutral amino acid transporter B (0) (Neutral amino acid transporter B (0)) (SLC1A5) (SEQ ID NO: 18); 19.
  • Tripeptidyl peptidase 1 (SEQ ID NO: 19); 20. Heat shock related 70 kDa protein 2 (Heat shock-related 70 kDa protein 2) (HSPA2) (SEQ ID NO: 20); 21. 22. Proteasome subunit alpha type-5 (PSMA5) (SEQ ID NO: 21); Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (LCN2) (SEQ ID NO: 22).
  • PSMA5 Proteasome subunit alpha type-5
  • LN2 Neutrophil gelatinase-associated lipocalin
  • Glucose transporter 1 (SEQ ID NO: 6); 8. CD88 antigen (SEQ ID NO: 8); 11. Matrix metalloproteinase 9 (SEQ ID NO: 11); 16. Annexin A5 (SEQ ID NO: 16); 17. Olfactomedin-4 (SEQ ID NO: 17); 19. 22. tripeptidyl peptidase 1 (SEQ ID NO: 19); Neutrophil gelatinase-related lipocalin (SEQ ID NO: 22).
  • [6] [4], which is a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 23 to 34, 37, 38, 43, 44, 53, 54, 56 and 59, [12] ]
  • a colorectal cancer biomarker for detecting colorectal cancer which comprises combining the colorectal cancer biomarker according to any of [1] to [9] with CEA.
  • a method for detecting colon cancer comprising measuring a biomarker for colon cancer according to any one of [1] to [10] in a biological sample.
  • a colorectal cancer is afflicted when a colorectal cancer biomarker of any of [1] to [10] in a biological sample is measured and the biomarker is present at a high concentration as compared to a healthy person How to detect colorectal cancer
  • a kit for detecting colon cancer which comprises an antibody against a colon cancer biomarker according to any one of [1] to [10] in a biological sample.
  • the present specification includes the disclosure content of Japanese Patent Application No. 2017-129941 based on which the priority of the present application is based.
  • the biomarkers of the present invention can detect colon cancer with high sensitivity and high specificity, and in particular, can detect colon cancer at an early stage. Furthermore, by combining biomarkers, more sensitive and specific detection can be achieved.
  • FIG. 6 shows a strategy for searching for colorectal cancer markers in extracellular vesicles (EVs). The figure shows the number of candidate proteins selected in each step.
  • FIG. 6 shows a method of shotgun proteomics analysis for CRC biomarker candidate proteins in EV.
  • FIG. 2a shows the steps of preparation of EV and MS analysis
  • FIG. 2b shows the results of Venn diagram analysis of biomarker candidate proteins and EV proteins identified by shotgun proteome analysis.
  • 356 colorectal cancer biomarker candidate proteins were identified as EV proteins.
  • FIG. 6 shows a list of proteins that were validated with high accuracy (AUC> 0.7).
  • FIG. 5 shows the results of relative quantification of peptides in serum between three groups (N, C and Cm) by SRM analysis.
  • N indicates a non-cancer control patient
  • C indicates a cancer patient without metastasis
  • Cm indicates a cancer patient with metastasis.
  • the dot plot graph shows the peak area ratio of endogenous peptide to SI peptide (*; p ⁇ 0.05, **; p ⁇ 0.01, N.S; no significant difference).
  • the vertical axis represents the area ratio (area ratio).
  • FIG. 5 shows the results of relative quantification of peptides between three groups (N, C and Cm) by SRM analysis (continuation of FIG. 5-1).
  • FIG. 5 shows the results of relative quantification of peptides between three groups (N, C and Cm) by SRM analysis (continuation of Fig. 5-2).
  • Fig. 7 shows the results of relative quantification of peptides between the three groups (N, C and Cm) by SRM analysis (continuation of Fig. 5-3).
  • Fig. 5 shows the results of relative quantification of peptides between the three groups (N, C and Cm) by SRM analysis (continuation of Fig. 5-4).
  • FIG. 5 shows the results of relative quantification of peptides between the three groups (N, C and Cm) by SRM analysis (continuation of FIG. 5-5). It is a figure which shows the result of statistical analysis of a target peptide (the 1).
  • FIG. 5 shows the results of relative quantification of peptides between three groups (N, C and Cm) by SRM analysis (continuation of Fig. 5-2).
  • Fig. 7 shows the results of relative quantification of peptides between
  • FIG. 6-1a shows the results of relative quantification of peptides between 3 groups (N, C and Cm) by SRM analysis.
  • N indicates a non-cancer control
  • C indicates a cancer without metastasis
  • Cm indicates a cancer with metastasis.
  • the dot plot graph shows the peak area ratio of endogenous peptide to SI peptide (*; p ⁇ 0.05, **; p ⁇ 0.01, N.S; no significant difference).
  • the vertical axis represents the area ratio (area ratio).
  • FIG. 6-1 b shows the results of ROC curve analysis for identifying N and C (1) and the results of ROC curve analysis for identifying C and Cm (2).
  • the area under the curve (AUC) for identification is shown in each graph.
  • the vertical axis represents sensitivity, and the horizontal axis represents 1-specificity. It is a figure which shows the result of statistical analysis of a target peptide (the 2).
  • FIG. 6-2c shows the results of relative quantification of peptides between 3 groups (N, C and Cm) by SRM analysis. N indicates a non-cancer control, C indicates a cancer without metastasis, and Cm indicates a cancer with metastasis.
  • the dot plot graph shows the peak area ratio of endogenous peptide to SI peptide (*; p ⁇ 0.05, **; p ⁇ 0.01, N.S; no significant difference).
  • the vertical axis represents the area ratio (area ratio).
  • FIG. 6-2 d shows the results (1) of ROC curve analysis for identifying N and C and the results (2) of ROC curve analysis for identifying C and Cm.
  • the area under the curve (AUC) for identification is shown in each graph.
  • the vertical axis represents sensitivity, and the horizontal axis represents 1-specificity.
  • the area under the curve (AUC) for identification is shown in each graph.
  • the vertical axis represents sensitivity, and the horizontal axis represents 1-specificity.
  • Fig. 7 shows ROC curves (1) for identifying N and C and ROC curves (2) for identifying C and Cm (continuation of Fig. 7-1).
  • FIG. 7 shows ROC curves (1) for identifying N and C and ROC curves (2) for identifying C and Cm (continuation of Fig. 7-1).
  • FIG. 7 shows ROC curves (1) for identifying N and C and ROC curves (2) for identifying C and Cm (continuation of FIG. 7-2).
  • FIG. 7B shows an ROC curve (1) for identifying N and C and an ROC curve (2) for identifying C and Cm (continuation of FIG. 7-3). It is a figure which shows the ROC curve (1) for identifying N and C, and the ROC curve (2) for identifying C and Cm (continuation of FIG. 7-4).
  • FIG. 7 shows ROC curves (1) for identifying N and C and ROC curves (2) for identifying C and Cm (continuation of FIG. 7-5). It is a figure which shows the result of ROC curve analysis of the combination of target peptide (the 1).
  • FIG. 5 shows the results of ROC curve analysis of combinations of target peptides. Diagnostic sensitivity when combining peptides was assessed between N and C. The area under the curve (AUC), sensitivity and specificity are shown in the respective graphs.
  • FIG. 9 shows the combination of high accuracy (AUC> 0.9). Other combinations are shown in FIGS.
  • the sensitivity when the cutoff value (Cutoff) is set to the maximum peak area of N is calculated as a proportion of the sample (dotted line indicates that the specificity is 100%).
  • the sensitivity in discrimination between N and C shows the top three peptides.
  • the vertical axis of the graph for the three peptides indicates the area ratio.
  • Other peptides more sensitive than CEA are shown in FIGS. 10-1 to 10-3.
  • the present invention is a protein or a partial peptide thereof as a biomarker for detecting colorectal cancer (CRC).
  • the present invention is also a method of detecting colorectal cancer using the biomarker.
  • the present invention is a method of acquiring auxiliary data for diagnosing colon cancer using the biomarker. By using the biomarker of the present invention, colon cancer can be detected at an early stage.
  • the biomarkers used in the present invention can be searched, for example, by proteome analysis techniques. For example, it can search in the following steps.
  • proteins that are candidates for biomarkers are searched by quantitative shotgun proteomics using tissues of colorectal cancer patients.
  • comparative quantification is carried out between the large intestine tissue or benign large tumor tissue of a healthy individual and the tissue of a large intestine cancer case without metastasis and the tissue of a large intestine cancer case with metastasis, and proteins showing variation between tissues are It can be narrowed down as candidate proteins.
  • the search for biomarker candidate proteins can also be performed by using proteins said to be associated with the onset and progression of colorectal cancer in the previous research.
  • biomarker candidates protein-derived peptides that target within complex samples by selectively destroying parent ions of a specific mass and detecting specific ions in the generated daughter ions SRM / MRM (Selected reaction monitoring) / Multiple reaction monitoring (multiple reaction monitoring) method (Gillette MA et al., Nat Methods. 2013; 10: 28-34) that can be detected with high sensitivity
  • SRM / MRM Select reaction monitoring
  • Multiple reaction monitoring multiple reaction monitoring
  • Complement component C9 (C9) (SEQ ID NO: 7) 8.
  • CD88 antigen (CD88 antigen) (C5AR1) (SEQ ID NO: 8) 9.78 kDa glucose regulatory protein (78 kDa glucose-regulated protein) (HSPA5) (SEQ ID NO: 9) 10.
  • Alpha-1-acid Glycoprotein (ORM1) (SEQ ID NO: 10) Matrix metalloproteinase-9 (MMP9) (SEQ ID NO: 11) 12.
  • Angiopoietin-1 Angiopoietin-1) (ANGPT1) (SEQ ID NO: 12) 13.
  • CD67 antigen (CD67 antigen) (CEACAM8) (SEQ ID NO: 13) 14.
  • Mucin-5B (Mucin-5B) (MUC5B) (SEQ ID NO: 14) 15.
  • Adapter protein GRB2 Adapter protein GRB2 (Adapter protein GRB2) (GRB2) (SEQ ID NO: 15) 16.
  • Annexin A5 (Annexin A5) (ANXA 5) (SEQ ID NO: 16) 17.
  • Olfactomedin-4 (OLFM4) (SEQ ID NO: 17) 18.
  • Neutral amino acid transporter B (0) (Neutral amino acid transporter B (0)) (SLC1A5) (SEQ ID NO: 18) 19.
  • Tripeptidyl peptidase 1 (TPP 1) (SEQ ID NO: 19) 20.
  • Heat shock related 70 kDa protein 2 (Heat shock-related 70 kDa protein 2) (HSPA2) (SEQ ID NO: 20) 21.
  • HSPA2 Heat shock-related 70 kDa protein 2
  • PSMA5 Proteasome subunit alpha type-5
  • LPN2 Neutrophil gelatinase-associated lipocalin
  • a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 or 24 (partial peptide of annexin A11), A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 or 26 (partial peptide of annexin A3), A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 or 28 (partial peptide of annexin A4), A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 or 30 (partial peptide of tenascin-N), A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31 or 32 (partial peptide of transferrin receptor protein 1), A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 or 34 (a partial peptide of glucose transporter 1), A peptide consisting of the amino acid sequence
  • the above-mentioned protein or a partial peptide of the protein is used as a biomarker, but in the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 59, amino acids in which one or several amino acids are deleted, substituted or added It also comprises proteins or peptides consisting of sequences, which proteins or peptides can also be used as biomarkers in the method of the invention.
  • “one or several” means “one or three", “one or two", or "one”.
  • a peptide is a peptide in which amino acids having a molecular weight of 10,000 or less are linked by a peptide bond, and the number of amino acid residues is several to about 50 or less.
  • a protein or a partial peptide thereof can be used as a biomarker, and when referring to a partial peptide, it is a peptide having a partial amino acid sequence of a part of the amino acid sequence possessed by the protein and the molecular weight is not limited. Preferably the thing of 10,000 or less is said.
  • the partial peptide may be produced in the expression synthesis process by transcription / translation, or may be produced as a digested / degraded product peptide by being digested and degraded in vivo after being synthesized as a protein.
  • colon cancer can be detected with good detection sensitivity and specificity, glucose transporter 1, transferrin receptor protein 1, annexin A5, matrix metalloproteinase 9 , Annexin A4, annexin A11, tenascin-N, annexin A3, olfactomedin-4, CD88 antigen, neutrophil gelatinase-related lipocalin or tripeptidyl peptidase 1, or a partial peptide thereof is a biomarker for colon cancer detection It is preferred to use as Furthermore, it is preferable to use annexin A4 or annexin A11, or a partial peptide thereof as a biomarker for colon cancer detection.
  • At least one of the above 22 proteins and partial peptides and / or partial peptides can be used as a biomarker, but preferably two or more, more preferably three or more, four or more. 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, 11 or more, 12 or more, 13 or more, 14 or more, 15 or more, 16 or more, 17
  • Colon cancer can be detected with higher accuracy by using 18 or more kinds, 19 or more kinds, 20 or more kinds, 21 or more kinds, or 22 kinds of proteins or partial peptides.
  • it may be a combination of different proteins, or a combination of a certain protein and a partial peptide or partial peptide of a protein other than the protein.
  • only a plurality of intact proteins may be used as a biomarker.
  • colon cancer can be detected more accurately, and the progress of colon cancer can be accurately determined.
  • a combination of glucose transporter 1 and transferrin receptor protein 1, a combination of glucose transporter 1 and angiopoietin-1, a combination of matrix metalloproteinase 9 and transferrin receptor protein 1, transferrin receptor protein 1 and neutrophil gelatinase association Lipocalin combination, transferrin receptor protein 1 and angiopoietin-1 combination, transferrin receptor protein 1 and adapter protein combination, 78 kDa glucose regulatory protein and tripeptidyl peptidase 1 combination, tenascin-N and neutrophil gelatinase related lipocalin Combination, combination of transferrin receptor protein 1 and neutrophil gelatinase-related lipocalin and angiopoietin-1, transferase Phosphorus receptor protein 1 and olfactomedin-4 combination, tenascin-N and angiopoietin-1 combination, olfactomedin-4 and angiopoietin-1 combination, tenascin-N
  • CEA cancer epidermal growth factor
  • a biomarker for colorectal cancer detection it can be detected with higher sensitivity and higher specificity than those used in the above-mentioned protein or partial peptide in combination with CEA (carcinoembryonic antigen), which is conventionally known as a biomarker for colorectal cancer, as a biomarker for colorectal cancer detection, It can be detected with higher sensitivity and higher specificity than those used in
  • the expression of the protein or partial peptide is elevated in colon cancer patients. Therefore, these proteins or partial peptides in blood may be quantified.
  • blood includes serum and plasma.
  • the protein is present in extracellular vesicles (EV).
  • EV extracellular vesicles
  • the EV present in the blood may be isolated, and if necessary concentrated after detection of the protein or partial peptide in the EV.
  • the EV can be separated as an EV fraction, for example, by ultracentrifugation.
  • Markers of EV include CD9, CD63, CD81 and the like, which can be separated using magnetic beads and the like to which an antibody against these markers is bound.
  • phosphatidylserine as another EV marker And may be separated using magnetic beads or the like to which a phosphatidylserine binding protein having an affinity for phosphatidylserine is bound.
  • phosphatidylserine binding proteins include T cell immunoglobulin and mucin domain-containing molecule 4 (Tim 4), annexin A 5 (Annexin A 5), annexin V (Annexin V), milk fat globule-EGF factor protein 8 (MFG-E8), etc. is there.
  • a protein / partial peptide profile in a biological sample is examined, but the biological sample used is not limited.
  • a fluid sample that can be collected from a living body for example, a bodily fluid such as whole blood, serum, plasma, urine, saliva and the like can be mentioned.
  • proteins, partial proteins and partial peptides in the biological sample may be further degraded, so it is preferable to use the biological sample without repeating freezing and thawing.
  • a protease inhibitor or the like may be added to the biological sample.
  • the exosome can be separated using the marker as a marker using FACS or a flow cytometer.
  • a protein or peptide may be extracted from the isolated exosome, and the above-mentioned protein or peptide may be measured.
  • Proteins or partial peptides can be detected in various ways. Although illustrated below, it is not limited to them.
  • immunoassay it can be measured by an immunoassay using an antibody against each protein or partial peptide to be detected.
  • immunological assays include solid phase immunoassay (RIA, EIA, FIA, CLIA, etc.), dot blotting, latex agglutination (LA: Agglutination-Turbidimetric Immunoassay), immunochromatography, etc. .
  • the antibody can be immobilized on a substrate and used.
  • the ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) method which is a type of EIA (Enzyme Immunoassay) method, is preferable from the viewpoint of quantitative property.
  • a sample is added to a well of a microtiter plate on which an antibody is immobilized, an antigen-antibody reaction is performed, an enzyme-labeled antibody is added, an antigen-antibody reaction is performed, and after washing, an enzyme substrate
  • the reaction, color development, absorbance can be measured to detect the marker protein or partial peptide in the sample, and the protein or partial peptide concentration in the sample can be calculated from the measured value.
  • fluorescence may be measured after an antigen-antibody reaction using a fluorescently labeled antibody.
  • the antigen-antibody reaction can be carried out at 4 ° C. to 45 ° C., more preferably 20 ° C. to 40 ° C., further preferably 25 ° C. to 38 ° C., and the reaction time is 10 minutes to 18 hours, more preferably 10 minutes It is preferably about 1 hour, more preferably about 30 minutes to 1 hour.
  • the antibody against the marker protein or partial peptide used in the immunological method may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, and use a monoclonal antibody Fab, F (ab '), F (ab') 2 or other binding active fragment. You can also.
  • the present invention also encompasses a test reagent or kit for colon cancer detection, which comprises an antibody against one or more of the above-described 22 types of proteins or partial peptides thereof.
  • the biomarker protein or its partial peptide for colon cancer detection can also be analyzed by mass spectrometry using a mass spectrometer. Mass spectrometry is particularly suitable for the detection of partial peptides.
  • the mass spectrometer includes a sample introduction unit, an ionization chamber, an analysis unit, a detection unit, a recording unit, and the like.
  • a mass spectrometer includes a sample introduction unit, an ionization chamber, an analysis unit, a detection unit, a recording unit, and the like.
  • EI electron impact ionization
  • CI chemical ionization
  • FD field desorption
  • SIMS secondary ionization
  • FAB fast atom collision
  • MALDI matrix-assisted laser desorption ionization
  • ESI electrospray ionization
  • a double focusing mass spectrometer a quadrupole mass spectrometer, a time of flight mass spectrometer, a Fourier transform mass spectrometer, an ion cyclotron mass spectrometer, etc. are used.
  • a tandem mass spectrometer (MS / MS) can also be used, with two mass spectrometers coupled for precision analysis.
  • the mass spectrometer may be used alone, or may be connected to a separation instrument such as liquid chromatography or a measurement instrument, and may be liquid chromatograph mass spectrometry (LC / MS, LC / MS) in combination with high performance liquid chromatography. Can be analyzed by MS / MS).
  • Mass spectrometry is selected reaction monitoring (SRM: Selected reaction monitoring) by a triple quadrupole mass spectrometer of an LC / MS (LC / MS / MS) system widely used in the field for quantitative detection of peptides. (SRM) or multiple reaction monitoring (MRM). With SRM / MRM, multiple factors can be measured simultaneously, and hundreds of proteins and peptides can be measured simultaneously in one measurement.
  • biomarker protein or partial peptide is present in a sample collected from a subject, that is, if it is positive, it can be judged that the subject suffers from colon cancer.
  • samples collected from healthy individuals may be simultaneously measured as negative subjects.
  • the concentration of the biomarker protein or partial peptide in the sample of the subject is increased as compared to that of a healthy person, so the concentration of the biomarker protein or partial peptide in the subject is If there are more than healthy people, the biomarker protein or partial peptide is judged as positive, and it can be judged that the subject suffers from colon cancer.
  • Whether the biomarker protein or partial peptide in the sample is positive or not is determined by the ratio of the peak area value of the biomarker peptide peak detected by the SRM / MRM method in advance to the area value of the stable isotope labeled peptide peak as an internal standard.
  • a cutoff value may be determined for the antibody measurement value, and when the cutoff value is exceeded and the cutoff value is exceeded, it may be determined as positive.
  • the cutoff value can be determined by, for example, ROC (receiver operating characteristic curve) analysis.
  • ROC analysis can determine diagnostic accuracy (sensitivity and specificity) according to the method of the present invention.
  • ROC analysis measures biomarker protein or partial peptide for a sample collected from a patient with colorectal cancer as a sample and a sample collected from a healthy person, and the sensitivity and false positive rate (1-specificity) at each cutoff value are calculated. Calculate the horizontal axis and 1-specificity, and plot the vertical axis as the sensitivity.
  • the area under the curve (AUC) when the diagnostic accuracy is analyzed by ROC analysis for the measurement results of the method of the present invention is as high as 0.9 or more, and the sensitivity is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably Is 85% or more, more preferably 90% or more, and the specificity is 70% or more, preferably 75% or more, more preferably 80% or more. According to the method of the present invention, early colon cancer can be detected with very high accuracy.
  • Serum of colon cancer patients and healthy subjects and cultured colon cancer cells [0200] Serum (collected at Chiba University of Medicine) of 51 colon cancer patients and 26 healthy subjects was collected. Each sample serum sample was stored at -80 ° C until analysis.
  • HCT116 ATCC; CCL-247
  • DLD-1 ATCC; CCL-221
  • SW480 ATCC; CCL-228
  • SW620 ATCC; CCL-227
  • RPMI-1640 medium Gibco Laboratories
  • Each cell was maintained at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator until the cells grew to subconfluency, and was allowed to grow to subconfluence. These cultured cells were then washed with FBS-free medium and fresh FBS-free medium was added. After further culturing in an incubator for 48 hours, the conditioned supernatant medium was collected, and EV (extracellular vesicle) was used as a sample for isolation.
  • EV extracellular vesicle
  • Isolation of EV extracellular vesicles
  • Isolation of EV was performed by ultracentrifugation.
  • a sucrose buffer By placing a sucrose buffer on the bottom of the centrifuge tube, low density contaminants can be efficiently separated at the time of EV recovery.
  • 100 ⁇ l of serum was centrifuged at 300 g for 10 minutes to remove large contaminants.
  • the recovered supernatant was then passed through a 0.22 ⁇ m spin filter (Agilent Technologies, Santa Clara, Calif.) And centrifuged at 100,000 g for 90 minutes with 30% sucrose / D 2 O buffer.
  • the buffer was recovered, and twice subjected to ultracentrifugation at 100,000 g for 70 minutes twice, and the EV fraction precipitated in the centrifuge tube was recovered.
  • Protein Extraction and Digestion from EV Protein extraction and protein digestion were performed according to the Phase Transfer Surfactant (PTS) protocol (Masuda T et al. J. Proteome Res. 7, 731-740 (2008)).
  • EV fraction protein is dissolved with MPEX PTS reagent kit (GL Science, Japan), then dithiothreitol is added at a final concentration of 5 mM, reduction reaction is performed at room temperature for 30 minutes, and iodoacetamide is added at a final concentration of 20 mM for alkylation. Reaction was performed.
  • PTS Phase Transfer Surfactant
  • the samples were then digested with 1% (w / w) trypsin (proteomics grade; Roche Mannheim, Germany) at 37 ° C. overnight. After digestion, equal volumes of ethyl acetate and 1% final concentration of trifluoroacetate were added and vortexed to separate the surfactant in the solution into the organic layer. After centrifugation, the aqueous phase containing the peptide was recovered and desalted by Stage Tips (Rappsilber J. et al., Nat. Protoc. 2, 1896-1906 (2007)).
  • the mobile phase of LC is composed of buffer A (0.1% formic acid and 2% acetonitrile) and B (0.1% formic acid and 90% acetonitrile).
  • the digested peptide was dissolved in buffer A and loaded on a trap column 0.075 ⁇ 20 mm, Acclaim PepMap RSLC Nano-Trap Column (Thermo Scientific).
  • the nano LC was pumped at 280 nL / min and the mobile phase was developed with a 5-35% B gradient in 120 minutes.
  • Mass spectrometry Full MS scan (350 to 1800 m / z, ion integration 3 ⁇ 10 6 resolution 70,000) and MS / MS scan (Top 10 precursor ion, injection time 120 ms, resolution 35,000, MS / MS ion selection threshold 5 ⁇ 10 4 counts , The separation width of 3.0 Da). Analysis of the data file was performed by MaxQuant software (Ver 1.5.1.2). The search engine performed search of peak list against Andromeda, UniProt human protein database. The precursor mass error range was set to 7 ppm, and the fragment ion mass error range was set to 0.01 Da. Identification proteins and peptides were determined at a false positive rate (FDR 1%>) less than 1% against the reverse database.
  • LC-SRM / MRM analysis was performed according to previously reported methods (Kume, H. et al., Mol. Cell. Proteomics 13, 1471-1484 (2014): Muraoka, S. et. al., J. Proteome Res. 11, 4201-4210 (2012): Narumi, R. et al., J. Proteome Res. 11, 5311-5322 (2012)).
  • the digested peptide is dissolved in a 2% acetonitrile solution containing 0.1% trifluoroacetic acid (TFA), and then a triple quadrupole mass spectrometer TSQ-Vantage coupled with nanoflow LC Paradigm MS2 (Michrom BioResources, Auburn, CA) Analysis was performed using (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • TSQ-Vantage coupled with nanoflow LC Paradigm MS2 (Michrom BioResources, Auburn, CA) Analysis was performed using (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany).
  • the sample was introduced into a mass spectrometer using a self-made analytical column in which a 1.9 ⁇ m C18-AQ resin was sealed on a needle with an inner diameter of 75 ⁇ m and a length of 100 mm.
  • the mobile phase of LC is composed of buffer A (0.1% formic acid and 2% acetonitrile) and B (0.1% formic acid and 90% acetonitrile).
  • the digested peptide was dissolved in buffer A and loaded on a trap column 0.075 ⁇ 20 mm, Acclaim PepMap RSLC Nano-Trap Column (Thermo Scientific).
  • the nano LC was pumped at 280 nL / min and the mobile phase was developed with a 5-35% B gradient in 60 minutes.
  • the analysis in the SRM mode was performed under the following conditions (Q1 Peak Width 0.7 FWHM, Cycle time: 1 sec, Collision Gass Pressure 1.8 mTorr).
  • the collision energy was optimized for each SRM transition, and the intensity of each transition was measured in schedule mode with a peak duration of 5 minutes.
  • SI-peptide Stable isotope-labeled peptide having the same sequence as the target peptide as an internal standard into EV prepared from each sample serum, and using SRM.
  • the peak area ratio (Peak Area Ratio) of endogenous peptide / SI-peptide detected by analysis was calculated.
  • the spiked amount of SI-peptide of the same sequence as the target peptide was adjusted to be close to the endogenous peptide by performing pre-analysis.
  • FIG. 1 shows a strategy for searching for biomarker candidate in the present case.
  • a list of candidate CRC biomarker proteins was obtained from the PubMed Database of the medical and biological literature.
  • a literature search was performed on a database from 2003 to 2014 using “cancer” AND “colorectal” AND “expression” as a search formula, and colorectal cancer-related 687 proteins were listed as candidate CRC biomarkers.
  • Selection of candidate proteins was performed according to the following criteria (1) to (4). (1) Protein expression in human CRC tissue or blood is confirmed by Western blot, ELISA or immunohistochemistry. (2) It has been confirmed that the target protein is upregulated in cancer.
  • Serum EV was collected from 8 healthy patients, 8 cancer patients without metastasis, and 8 cancer patients with metastasis.
  • Cultured cell supernatants were collected from 4 CRC cells (HCT116, DLD-1, SW480, SW620).
  • the extracted proteins were digested by using the phase transfer lysis reagent (PTS) method and then fractionated by a C-18 Stage SCX Tip column (Masuda, T et al., J. Proteome Res. 7, 731-740 ( 2008); Adachi, J. et al. Anal. Chem. 88, 7899-7903 (2016)).
  • SRM candidate peptides were selected from those identified by shotgun proteomics. The following (1) to (3) were used as criteria for candidate peptide selection.
  • the identified protein is a peptide sequence unique to the protein, and in the case of multiple proteins, a high-intensity target was selected in shotgun analysis.
  • Peptides that are too long (> 20 amino acids) were excluded from the target peptides because it is difficult to synthesize stable isotope labeled peptides (SI-peptides).
  • the peptide meeting these criteria was the 3316 peptide (346 proteins) among all identified peptides.
  • Target peptides with peak areas increased significantly (p ⁇ 0.01) by two or more times among the pooled samples (N vs C or C vs Cm) were selected as marker candidate peptides.
  • N vs C or C vs Cm For proteins in which two or more candidate peptides were detected, two peptides with high peak intensity in SRM analysis were selected. Given these criteria, 71 peptides (46 proteins) were selected as target peptides for biomarker candidates (FIG. 3).
  • SRM Quantification of Target Peptides in Serum EV Fraction Quantitative analysis by SRM was performed on 37 biomarker candidate peptides in EV fractions prepared from individual patient sera.
  • Colorectal cancer can be detected at an early stage by the method of the present invention.

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Abstract

大腸がんを早期に検出するためのバイオマーカーの提供。以下の１～２２の２２個のタンパク質の少なくとも１つのタンパク質、または１～２２のタンパク質の部分ペプチドの少なくとも１つのペプチドからなる大腸がん検出のための大腸がんバイオマーカー：１．アネキシンA11；２．アネキシンA3；３．アネキシンA4；４．テネイシン-N；５．トランスフェリン受容体タンパク質１；６．グルコーストランスポーター１；７．補体成分C9；８．CD88 抗原；９．78kDa グルコース制御タンパク質；１０．α-1-酸性グリコプロテイン；１１．マトリックスメタロプロテアーゼ９；１２．アンジオポエチン－１；１３．CD67 抗原；１４．ムチン-5B；１５．アダプタータンパク質 GRB2；１６．アネキシンA5；１７．オルファクトメジン-４；１８．中性アミノ酸トランスポーターB(0)；１９．トリペプチジルペプチダーゼ１；２０．熱ショック関連70kDa タンパク質２；２１．プロテアソームサブユニットαタイプ-５；または２２．好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン。

Description

大腸がんを検出するためのバイオマーカー
　本発明は、大腸がんの検出に用い得る新規なタンパク質又はペプチドバイオマーカに関する。
　大腸がん（CRC）は、世界で最も頻度の高いがんの1つであり、CRCのための効果的バイオマーカーの開発は、ヒトの生存率向上に不可欠である。しかし、現在用いられる大腸がんの診断法は便潜血やCEAなど非常に精度の低いものばかりで、大腸がんを早期に高精度に診断できる新しいバイオマーカーは見つかっておらず、血中バイオマーカーが切実に求められている。
　これまで大規模なオミクス研究により、多数のがん関連因子およびがんのバイオマーカー候補が発見されてきたにもかかわらず、臨床応用に至った血中バイオマーカーは未だ存在しない。それを裏付ける証拠として、近年の、米食品医薬品局（FDA）により承認されたバイオマーカーは、毎年２件以下と極めて少ない。この停滞の原因の１つは、バイオマーカー開発の戦略に深刻な問題があると考えられている。
　従来、多くの臨床検査において、タンパク質バイオマーカーの検出は抗体ベースの定量化分析法（主に酵素結合抗体免疫測定法（ELISA）を用いた）によって行われてきた。これらの方法は抗体の品質に大きく依存しているので、精度、特に特異度に問題があり、また多項目のマーカー候補を同時に評価することは難しい。
　質量分析計（MS）の最近の進歩によりは、臨床検査法が大きく変わる可能性が出てきた。その理由として、ターゲットプロテオミクスを代表する手法である選択反応モニタリング/多重反応モニタリング法(SRM/MRM)は、高精度でバイオマーカータンパク質の定量ができるだけでなく、多項目のマーカーを同時に定量することができるからである。以前の報告で、Whiteakerらは、SRM/MRM法を用いて患者血漿中の多項目の乳がんバイオマーカー候補タンパク質の定量を実施した（非特許文献１を参照）。それ以外にも、SRM/MRM法を使って種々のがんのバイオマーカー候補タンパク質を検証した例は本発明者らのグループの報告も含めていくつか報告されている（非特許文献２～４を参照）。
　このように、SRM/MRM法を用いたターゲットプロテオミクスは、バイオマーカー発見のための強力なツールとなる。
Whiteaker, J. et al., Nat. BIotechnol. 29, 625-634 (2011) Kume, H. et al., Mol. Cell. Proteomics 13, 1471-1484 (2014) Muraoka, S. et al., J. Proteome Res. 11, 4201-4210 (2012) Narumi, R. et al., J. Proteome Res. 11, 5311-5322 (2012)
　本発明は、大腸がんを早期に検出するためのバイオマーカーの提供を目的とする。
　本発明者らは、まずPubMedの文献検索からCRCバイオマーカー候補タンパク質を検索した。それらのバイオマーカー候補タンパク質を血中で検出するために、血中の細胞外小胞（EV）に着目した。なぜならば、EVは細胞間コミュニケーションの仲介者として働くことが最近注目されているだけでなく、種々の病気の発症や進展に関わると言われ、バイオマーカー候補を多く含んでいると考えられているからである。また、質量分析計を用いて血中の微量なタンパク質を検出しようとする際に、アルブミン等の血中に多量に存在する夾雑タンパク質により、微量なマーカー候補タンパク質の検出が阻害されることがある。しかし、血中のEVを精製する際に、多量な夾雑タンパク質が除去されるので、EV中の微量なバイオマーカー候補タンパク質の検出が可能になる。従って、EV含有タンパク質は有望なバイオマーカー候補であると考えられた。
　本発明者らは文献検索で見つかったバイオマーカー候補タンパク質の中で、血中EVに存在する可能性があるタンパク質に候補を絞り、SRM/MRM法を用いてそれらのタンパク質の定量を行った。その結果として、CRCの早期診断のためのいくつかのバイオマーカー候補を特定し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明の態様は以下のとおりである。
[１]　以下の１～２２の２２個のタンパク質の少なくとも１つのタンパク質、または１～２２のタンパク質の部分ペプチドの少なくとも１つのペプチドからなる大腸がん検出のための大腸がんバイオマーカー：
１．アネキシンA11（Annexin A11) (ANXA 11)（配列番号１）；
２．アネキシンA3（Annexin A3) (ANXA 3)（配列番号２）；
３．アネキシンA4（Annexin A4) (ANXA 4)（配列番号３）；
４．テネイシン-N（Tanascin-N) (TNN)（配列番号４）；
５．トランスフェリン受容体タンパク質１（Transferrin receptor protein 1) (TFRC)（配列番号５）；
６．グルコーストランスポーター１（GLUT-1）(SLC2A1)（配列番号６）；
７．補体成分C9（Complement component C9) (C9)（配列番号７）；
８．CD88抗原（CD88 antigen) (C5AR1)（配列番号８）；
９．78kDa グルコース制御タンパク質（78kDa glucose-regulated protein) (HSPA5)（配列番号９）；
１０．α-1-酸性グリコプロテイン（α-1-acid glycoprotein) (ORM1)（配列番号１０）；
１１．マトリックスメタロプロテアーゼ９（Matrix metalloproteinase-9) (MMP9)（配列番号１１）；
１２．アンジオポエチン－１（Angiopoietin-1） (ANGPT1)（配列番号１２）；
１３．CD67抗原（CD67 antigen) (CEACAM8)（配列番号１３）；
１４．ムチン-5B（Mucin-5B) (MUC5B)（配列番号１４）；
１５．アダプタータンパク質 GRB2（Adapter protein GRB2) (GRB2)（配列番号１５）；１６．アネキシンA5（Annexin A5)（ANXA 5)（配列番号１６）；
１７．オルファクトメジン-４（Olfactomedin-4) (OLFM4)（配列番号１７）；
１８．中性アミノ酸トランスポーターB(0)（Neutral amino acid transporter B(0))(SLC1A5)（配列番号１８）；
１９．トリペプチジルペプチダーゼ１（Tripeptidyl-peptidase 1) (TPP1)（配列番号１９）；
２０．熱ショック関連70kDaタンパク質２（Heat shock-related 70kDa protein 2）(HSPA2)（配列番号２０）；
２１．プロテアソームサブユニットαタイプ-５（Proteasome subunit alpha type-5) (PSMA5)（配列番号２１）；または
２２．好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（Neutrophil gelatinase-associated lipocalin) (LCN2)（配列番号２２）。
[２]　[１]の１～２２の２２個のタンパク質の２以上のタンパク質、または１～２２のタンパク質の部分ペプチドの２以上のペプチドを組合せてなる、[１]の大腸がん検出のための大腸がんバイオマーカー。
[３]　[１]の１～２２のタンパク質の部分ペプチドが配列番号２３～５９で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、[１]または[２]の大腸がん検出のための大腸がんバイオマーカー。
[４]　以下の１２個のタンパク質の少なくとも１つのタンパク質、または該１２個のタンパク質の部分ペプチドの少なくとも１つのペプチドからなる、[１]の大腸がん検出のための大腸がんバイオマーカー：
１．アネキシンA11（配列番号１）；
２．アネキシンA3（配列番号２）；
３．アネキシンA4（配列番号３）；
４．テネイシン-N（配列番号４）；
５．トランスフェリン受容体タンパク質１（配列番号５）；
６．グルコーストランスポーター１（配列番号６）；
８．CD88抗原（配列番号８）；
１１．マトリックスメタロプロテアーゼ９（配列番号１１）；
１６．アネキシンA5（配列番号１６）；
１７．オルファクトメジン-４（配列番号１７）；
１９．トリペプチジルペプチダーゼ１（配列番号１９）；または
２２．好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（配列番号２２）。
[５]　[４]の１２個のタンパク質の２以上のタンパク質、または該１２個のタンパク質の部分ペプチドの２以上のペプチドを組合せてなる、[４]の大腸がん検出のための大腸がんバイオマーカー。
[６]　[４]の１２個のタンパク質の部分ペプチドが配列番号２３～３４、３７、３８、４３、４４、５３、５４、５６および５９で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、[４]または[５]の大腸がん検出のための大腸がんバイオマーカー。
[７]　アネキシンA4若しくはアネキシンA11、またはそれらの部分ペプチドからなる、[１]の大腸がん検出のための大腸がんバイオマーカー。
[８]　アネキシンA4とアネキシンA11、またはアネキシンA4の部分ペプチドとアネキシンA11の部分ペプチドを組合せてなる、[７]の大腸がん検出のための大腸がんバイオマーカー。
[９]　アネキシンA4およびアネキシンA11の部分ペプチドが配列番号２３、２４、２７および２８で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、[７]または[８]に記載の大腸がん検出のための大腸がんバイオマーカー。
[１０]　[１]～[９]のいずれかの大腸がんバイオマーカーとCEAとを組合せてなる、大腸がん検出のための大腸がんバイオマーカー。
[１１]　生体試料中の[１]～[１０]のいずれかの大腸がんバイオマーカーを測定することを含む大腸がんの検出方法。
[１２]　生体試料中の[１]～[１０]のいずれかの大腸がんバイオマーカーを測定し、該バイオマーカーが健常人と比較して高濃度で存在する場合に、大腸がんに罹患していると判断する、大腸がんの検出方法。
[１３]　生体試料が血液中の細胞外小胞(EV)である、[１１]または[１２]の大腸がんの検出方法。
[１４]　検出が免疫学的測定法または質量分析法により行われる、[１１]～[１３]のいずれかの大腸がんの検出方法。
[１５]　生体試料中の[１]～[１０]のいずれかの大腸がんバイオマーカーに対する抗体を含む大腸がんの検出キット。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2017-129941号の開示内容を包含する。
　本発明のバイオマーカーにより大腸がんを高感度かつ高特異的に検出することができ、特に早期の大腸がんを検出することができる。さらに、バイオマーカーを組合せることにより、さらに高感度かつ高特異的な検出することができる。
細胞外小胞（EV)中の大腸がんマーカーの探索のための戦略を示す図である。図中には、それぞれの工程で選抜された候補タンパク質の数を示す。 EVにおける、CRCバイオマーカー候補タンパク質のためのショットガン・プロテオミクス分析の方法を示す図である。図２aはEVの調製及びMS分析の工程を示し、図２bはショットガンプロテオーム解析によって同定されたバイオマーカー候補タンパク質及びEVタンパク質のベン図解析の結果を示す。 血清又は細胞培養上清から同定されたEVタンパク質のうち、356個の大腸がんバイオマーカー候補タンパク質がEVタンパク質として同定された。 SRM標的タンパク質（46）及びペプチド(71）を示す図である。 高度の正確さ（AUC>0.7)で検証されたタンパク質のリストを示す図である。 SRM分析による３群（N、C及びCm)の間の血清中ペプチドの相対的定量の結果を示す図である。Nは非がん対照患者を示し、Cは転移のないがん患者を示し、Cmは転移のあるがん患者を示す。ドットプロットグラフは、SIペプチドに対する内在的ペプチドのピーク面積比を示す(*; p<0.05, **; p<0.01, N.S; 有意差なし)。縦軸はArea Ratio(面積比）を示す。 SRM分析による３群（N、C及びCm)の間のペプチドの相対的定量の結果を示す図である（図５－１の続き）。 SRM分析による３群（N、C及びCm)の間のペプチドの相対的定量の結果を示す図である（図５－２の続き）。 SRM分析による３群（N、C及びCm)の間のペプチドの相対的定量の結果を示す図である（図５－３の続き）。 SRM分析による３群（N、C及びCm)の間のペプチドの相対的定量の結果を示す図である（図５－４の続き）。 SRM分析による３群（N、C及びCm)の間のペプチドの相対的定量の結果を示す図である（図５－５の続き）。 標的ペプチドの統計的解析の結果を示す図である（その１）。図６－１aはSRM分析による３群（N、C及びCm)の間のペプチドの相対的定量の結果を示す。Nは非がん対照を示し、Cは転移のないがんを示し、Cmは転移のあるがんを示す。ドットプロットグラフは、SIペプチドに対する内在的ペプチドのピーク面積比を示す(*; p<0.05, **; p<0.01, N.S; 有意差なし)。縦軸はArea Ratio(面積比）を示す。図６－１bはNとCを識別するためのROC曲線分析の結果（１）及びCとCmを識別するためのROC曲線分析の結果（２）を示す。識別のための曲線下の面積（AUC)をそれぞれのグラフに示す。縦軸はsensitivity(感度）を示し、横軸は１－specificity（特異性）を示す。 標的ペプチドの統計的解析の結果を示す図である（その２）。図６－２cはSRM分析による３群（N、C及びCm)の間のペプチドの相対的定量の結果を示す。Nは非がん対照を示し、Cは転移のないがんを示し、Cmは転移のあるがんを示す。ドットプロットグラフは、SIペプチドに対する内在的ペプチドのピーク面積比を示す(*; p<0.05, **; p<0.01, N.S; 有意差なし)。縦軸はArea Ratio(面積比）を示す。図６－２dはNとCを識別するためのROC曲線分析の結果（１）及びCとCmを識別するためのROC曲線分析の結果（２）を示す。識別のための曲線下の面積（AUC)をそれぞれのグラフに示す。縦軸はsensitivity(感度）を示し、横軸は１－specificity（特異性）を示す。 NとCを識別するためのROC曲線（１）及びCとCmを識別するためのROC曲線（２）を示す図である（その１）。識別のための曲線下の面積（AUC)をそれぞれのグラフに示す。縦軸はsensitivity(感度）を示し、横軸は１－specificity（特異度）を示す。 NとCを識別するためのROC曲線（１）及びCとCmを識別するためのROC曲線（２）を示す図である（図７－１の続き）。 NとCを識別するためのROC曲線（１）及びCとCmを識別するためのROC曲線（２）を示す図である（図７－２の続き）。 NとCを識別するためのROC曲線（１）及びCとCmを識別するためのROC曲線（２）を示す図である（図７－３の続き）。 NとCを識別するためのROC曲線（１）及びCとCmを識別するためのROC曲線（２）を示す図である（図７－４の続き）。 NとCを識別するためのROC曲線（１）及びCとCmを識別するためのROC曲線（２）を示す図である（図７－５の続き）。 標的ペプチドの組合せのROC曲線分析の結果を示す図である（その１）。ペプチドを組合せたときの診断の感度をNとCの間で評価した。曲線下の面積（AUC)、感度（sensitivity)及び特異度(specificity)をそれぞれのグラフに示した。 標的ペプチドの組合せのROC曲線分析の結果を示す図である（その２）。ペプチドを組合せたときの診断の感度をNとCの間で評価した。曲線下の面積（AUC)、感度（sensitivity)及び特異性(specificity)をそれぞれのグラフに示した。 標的ペプチドの組合せのROC曲線分析の結果を示す図である。ペプチドの組合せたときの診断の感度をNとCの間で評価した。曲線下の面積（AUC)、感度(sensitivity)及び特異度(specificity)をそれぞれのグラフに示した。図９は、高い正確性（AUC＞0.9）の組合せを示す。他の組合せは図８－１及び図８－２に示した。 標的ペプチドとCEAの感度(sensitivity)の比較の結果を示す図である。カットオフ値をNの最大ピーク面積に設定した場合の感度は、サンプルの割合として算出される（点線は、特異度が100％であることを示す）。縦軸はArea Ratio(面積比）を示す。 標的ペプチドとCEAの感度(sensitivity)の比較の結果を示す図である（図１０－１の続き）。 標的ペプチドとCEAの感度(sensitivity)の比較の結果を示す図である（図１０－２の続き）。 標的ペプチドとCEAの感度の比較の結果を示す図である。カットオフ値（Cutoff)をNの最大ピーク面積に設定した場合の感度（sensitivity)は、サンプルの割合として算出される（点線は、特異性が100％であることを示す）。図１１においては、NとCの識別における感度がトップ３つのペプチドを示す。３つのぺプチドについてのグラフの縦軸はArea Ratio(面積比)を示す。CEAより感度が高い他のペプチドは図１０－１～１０－３に示した。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、大腸がん（CRC：colorectal cancer)を検出するためのバイオマーカーとしてのタンパク質又はその部分ペプチドである。また本発明は、該バイオマーカーを用いて大腸がんを検出する方法である。さらに本発明は、該バイオマーカーを用いて大腸がんを診断するための補助的データを取得する方法である。本発明のバイオマーカーを用いることにより、大腸がんを早期で検出することが可能である。
　本発明で用いるバイオマーカーは、例えば、プロテオーム解析技術により探索することができる。例えば、以下の工程で探索することができる。
　最初に、大腸がん患者の組織を用いて定量ショットガン・プロテオミクスによりバイオマーカーの候補となるタンパク質を探索する。この際、健常人の大腸組織若しくは大腸良性腫瘍組織と転移のない大腸がん症例の組織と転移のある大腸がん症例の組織の間で比較定量を行い、組織間で変動が認められるタンパク質を候補タンパク質として絞ることができる。また、バイオマーカー候補タンパク質の探索は、先行研究において、大腸がんの発症や進展に関連すると言われたタンパク質を用いることによっても行える。それらのバイオマーカー候補に対して、特定の質量の親イオンを選択的に破壊し、生成した娘イオンの中の特定のイオンを検出することにより複雑なサンプル内から標的とするタンパク質由来のペプチドを高感度に検出することができるSRM/MRM（Selected reaction monitoring（選択反応モニタリング）/Multiple reaction monitoring（多重反応モニタリング）)法（Gillette MA et al., Nat Methods. 2013; 10:28-34)を用いたターゲットプロテオミクス法により組織間での発現量の変動の検証を行うことができる。この検証により、大腸がんバイオマーカーの最終候補を選抜することができる。次いで、これらのバイオマーカー候補が血液等の生体試料中で検出、定量ができるかを確認する。この際、好ましくは血中の細胞外小胞（EV)画分中で検出、定量を行う。
　本発明の方法において、以下のタンパク質が大腸がん検出のためのバイオマーカーとして挙げられる。
１．アネキシンA11（Annexin A11) (ANXA 11)（配列番号１）
２．アネキシンA3（Annexin A3) (ANXA 3)（配列番号２）
３．アネキシンA4（Annexin A4) (ANXA 4)（配列番号３）
４．テネイシン-N（Tanascin-N) (TNN)（配列番号４）
５．トランスフェリン受容体タンパク質１（Transferrin receptor protein 1) (TFRC)（配列番号５）
６．グルコーストランスポーター１（GLUT-1）(SLC2A1)（配列番号６）
７．補体成分C9（Complement component C9) (C9)（配列番号７）
８．CD88抗原（CD88 antigen) (C5AR1)（配列番号８）
９．78kDa グルコース制御タンパク質（78kDa glucose-regulated protein) (HSPA5)（配列番号９）
１０．α-1-酸性グリコプロテイン（α-1-acid glycoprotein) (ORM1)（配列番号１０）１１．マトリックスメタロプロテアーゼ９（Matrix metalloproteinase-9) (MMP9)（配列番号１１）
１２．アンジオポエチン－１（Angiopoietin-1） (ANGPT1)（配列番号１２）
１３．CD67抗原（CD67 antigen) (CEACAM8)（配列番号１３）
１４．ムチン-5B（Mucin-5B) (MUC5B)（配列番号１４）
１５．アダプタータンパク質 GRB2（Adapter protein GRB2) (GRB2)（配列番号１５）
１６．アネキシンA5（Annexin A5)（ANXA 5)（配列番号１６）
１７．オルファクトメジン-４（Olfactomedin-4) (OLFM4)（配列番号１７）
１８．中性アミノ酸トランスポーターB(0)（Neutral amino acid transporter B(0))(SLC1A5)（配列番号１８）
１９．トリペプチジルペプチダーゼ１（Tripeptidyl-peptidase 1) (TPP1)（配列番号１９）
２０．熱ショック関連70kDaタンパク質２（Heat shock-related 70kDa protein 2）(HSPA2)（配列番号２０）
２１．プロテアソームサブユニットαタイプ-５（Proteasome subunit alpha type-5) (PSMA5)（配列番号２１）
２２．好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（Neutrophil gelatinase-associated lipocalin) (LCN2)（配列番号２２）
　また、大腸がん検出のためのバイオマーカーとして用い得る上記タンパク質の部分ペプチドとして、
配列番号２３若しくは２４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（アネキシンA11の部分ペプチド）、
配列番号２５若しくは２６で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（アネキシンA3の部分ペプチド）、
配列番号２７若しくは２８で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（アネキシンA4の部分ペプチド）、
配列番号２９若しくは３０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（テネイシン-Nの部分ペプチド）、
配列番号３１若しくは３２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（トランスフェリン受容体タンパク質１の部分ペプチド）、
配列番号３３若しくは３４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（グルコーストランスポーター１の部分ペプチド）、
配列番号３５若しくは３６で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（補体成分C9の部分ペプチド）、
配列番号３７若しくは３８で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（CD88抗原の部分ペプチド）、
配列番号３９若しくは４０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（78kDa グルコース制御タンパク質の部分ペプチド）、
配列番号４１若しくは４２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（α-1-酸性グリコプロテインの部分ペプチド）、
配列番号４３若しくは４４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（マトリックスメタロプロテアーゼ９の部分ペプチド）、
配列番号４５若しくは４６で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（アンジオポエチン－１の部分ペプチド）、
配列番号４７若しくは４８で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（CD67抗原の部分ペプチド）、
配列番号４９若しくは５０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ムチン-5Bの部分ペプチド）、
配列番号５１若しくは５２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（アダプタータンパク質 GRB2の部分ペプチド）、
配列番号５３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（アネキシンA5の部分ペプチド）、
配列番号５４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（オルファクトメジン-４の部分ペプチド）、
配列番号５５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（中性アミノ酸トランスポーターB(0)の部分ペプチド）、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（トリペプチジルペプチダーゼ１の部分ペプチド）、
配列番号５７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（熱ショック関連70kDaタンパク質２の部分ペプチド）、
配列番号５８で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（プロテアソームサブユニットαタイプ-５の部分ペプチド）、
配列番号５９で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンの部分ペプチド）等が挙げられる。
　本発明においては、上記のタンパク質あるいはそのタンパク質の部分ペプチドをバイオマーカーとして用いるが、配列番号１～５９に表されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加したアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチドも含み、これらのタンパク質又はペプチドも本発明の方法においてバイオマーカーとして用いることができる。ここで、「１個若しくは数個」とは「１個若しくは３個」、「１個若しくは２個」又は「１個」をいう。
　ペプチドは、一般的には分子量１万以下のアミノ酸がペプチド結合により連結したものをいい、アミノ酸残基の数としては数個から50個以下程度のものをいう。本明細書においては、タンパク質又はその部分ペプチドをバイオマーカーとして用いることができ、部分ペプチドという場合、タンパク質の有するアミノ酸配列の一部の部分的アミノ酸配列を有するペプチドであって分子量は限定されないが、好ましくは１万以下のものをいう。部分ペプチドは、転写・翻訳による発現合成過程で生成する場合もあり、またタンパク質として合成された後に、生体内で消化分解を受けて消化分解産物ペプチドとして生成する場合もある。
　これらのタンパク質及びペプチドの中でもROC解析の結果、良好な検出感度及び特異度で大腸がんを検出し得ることが判明した、グルコーストランスポーター１、トランスフェリン受容体タンパク質１、アネキシンA5、マトリックスメタロプロテアーゼ９、アネキシンA4、アネキシンA11、テネイシン-N、アネキシンA3、オルファクトメジン-４、CD88抗原、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン若しくはトリペプチジルペプチダーゼ１、又はそれらの部分ペプチドが大腸がん検出のためのバイオマーカーとして用いるのが好ましい。さらに、アネキシンA4若しくはアネキシンA11、又はそれらの部分ペプチドを大腸がん検出のためのバイオマーカーとして用いるのが好ましい。
　本発明において、バイオマーカーとして上記の２２個のタンパク質及び部分ペプチドのうち少なくとも一つのタンパク質および／または部分ペプチドを用いることができるが、好ましくは２種類以上、さらに好ましくは３種類以上、４種類以上、５種類以上、６種類以上、７種類以上、８種類以上、９種類以上、１０種類以上、１１種類以上、１２種類以上、１３種類以上、１４種類以上、１５種類以上、１６種類以上、１７種類以上、１８種類以上、１９種類以上、２０種類以上、２１種類以上、又は２２種類のタンパク質または部分ペプチドを用いるとより高精度で大腸がんを検出することができる。この場合、異なるタンパク質の組合わせでもよいし、あるタンパク質とそのタンパク質以外のタンパク質の部分ペプチドあるいは部分ペプチドの組合わせであってもよい。また、複数のインタクトなタンパク質のみをバイオマーカーとしてもよい。このように、複数のタンパク質または部分ペプチドをバイオマーカーとして用いることにより、大腸がんをより正確に検出することができ、また大腸がんの進行状態を的確に判断することができる。
　例えば、グルコーストランスポーター１とトランスフェリン受容体タンパク質１の組合せ、グルコーストランスポーター１とアンジオポエチン－１の組合せ、マトリックスメタロプロテアーゼ９とトランスフェリン受容体タンパク質１の組合せ、トランスフェリン受容体タンパク質１と好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンの組合せ、トランスフェリン受容体タンパク質１とアンジオポエチン－１の組合せ、トランスフェリン受容体タンパク質１とアダプタータンパク質の組合せ、78kDa グルコース制御タンパク質とトリペプチジルペプチダーゼ１の組合せ、テネイシン-Nと好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンの組合せ、トランスフェリン受容体タンパク質１と好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンとアンジオポエチン－１の組合せ、トランスフェリン受容体タンパク質１とオルファクトメジン-４の組合せ、テネイシン-Nとアンジオポエチン－１の組合せ、オルファクトメジン-４とアンジオポエチン－１の組合せ、テネイシン-Nとオルファクトメジン-４の組合せ、オルファクトメジン-４とトリペプチジルペプチダーゼ１の組合せ等が挙げられる。それぞれのタンパク質の部分ペプチドの組合せでもよい。
　また、上記のタンパク質又は部分ペプチドを、従来より大腸がんのバイオマーカーとして知られているCEA（がん胎児性抗原）と組合わせて大腸がん検出のためのバイオマーカーとして用いることにより、単独で用いるよりも高感度かつ高特異度で検出することができる。
　大腸がん患者において、上記タンパク質又は部分ペプチドの発現が上昇する。従って、血液中のこれらのタンパク質又は部分ペプチドを定量すればよい。ここで、血液は、血清及び血漿を含む。また、上記タンパク質は細胞外小胞(EV)中に存在する。従って、血中に存在するEVを単離し、必要ならば濃縮後、EV中のタンパク質又は部分ペプチドを検出してもよい。EVは、例えば、超遠心分離によりEV画分として分離することができる。また、EVに特異的なマーカーにより単離することができる。EVのマーカーとして、CD9、CD63、CD81等が挙げられ、これらのマーカーに対する抗体を結合させた磁気ビーズ等を利用して分離することができる。また、他のEVのマーカーとしてホスファチジルセリン（PS）
が挙げられ、ホスファチジルセリンに対して親和性を有するホスファチジルセリン結合蛋白を結合させた磁気ビーズ等を利用して分離することができる。 ホスファチジルセリン結合蛋白としては例えばT細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子4（Tim4）、アネキシンA5（Annexin A5)、アネキシンV（Annexin V)、乳脂肪球-EGF因子蛋白8（MFG-E8）などがある。
　本発明の方法において、生体試料中のタンパク質／部分ペプチドプロファイルを調べるが、用いる生体試料は限定されない。例えば、生体から採取し得る液体試料、例えば全血、血清、血しょう、尿、唾液等の体液が挙げられる。なお、生体試料の保存状態によっては、生体試料中のタンパク質、部分タンパク質および部分ペプチドがさらに分解を受けることもあるので、生体試料は凍結融解を繰り返さずに用いるのが好ましい。また、生体試料中にプロテアーゼインヒビター等を添加してもよい。あるいは、FACS又はフローサイトメーターを用いて、上記マーカーを指標にエクソソームを分離することもできる。
　単離したエクソソームからタンパク質やペプチドを抽出し、上記タンパク質又はペプチドを測定すればよい。
　タンパク質又は部分ぺプチドは種々の方法で検出することができる。以下に例示するが、それらには限定されない。
　例えば、検出しようとするそれぞれのタンパク質又は部分ペプチドに対する抗体を用いた免疫学的測定法により測定することができる。免疫学的測定法としては、例えば、固相免疫測定法（RIA、EIA、FIA、CLIA等）、ドット・ブロッティング法、ラテックス凝集法（LA：Latex Agglutination-Turbidimetric Immunoassay）、イムノクロマト法などが挙げられる。抗体は基板上に固定化し用いることができる。
　この中でも、定量性の観点からEIA(Enzyme Immunoassay)法の１種であるELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法が好ましい。ELISA法では、抗体を固相化したマイクロタイタープレートのウェルに検体を添加し、抗原・抗体反応を行わせ、さらに酵素標識した抗体を添加し、抗原・抗体反応をさせ、洗浄後、酵素基質と反応・発色させ、吸光度を測定してサンプル中のマーカータンパク質又は部分ペプチドを検出すると共に、その測定値から検体中のタンパク質又は部分ペプチド濃度を算出することができる。また、蛍光標識した抗体を用いて、抗原・抗体反応をさせた後に蛍光を測定してもよい。抗原抗体反応は4℃～45℃、より好ましくは20℃～40℃、さらに好ましくは25℃～38℃で行うことができ、また、反応時間は、10分～18時間、より好ましくは10分～1時間、さらに好ましくは30分～1時間程度である。
　免疫学的方法において用いられるマーカータンパク質又は部分ペプチドに対する抗体は、モノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体のFab、F(ab')、F(ab')2等の結合活性断片を用いることもできる。
　本発明は上記の２２種のタンパク質あるいはその部分ベプチドの1つ又は複数に対する抗体を含む、大腸がん検出用検査試薬又はキットをも包含する。
　大腸がん検出のためのバイオマーカータンパク質又はその部分ペプチドを質量分析計を用いた質量分析法により解析することもできる。質量分析法は、特に部分ペプチドの検出に適している。
　また、質量分析計を用いて検出することもできる。特に、バイオマーカータンパク質の部分ペプチドの検出には質量分析計の利用が適している。質量分析計は、試料導入部、イオン化室、分析部、検出部、記録部等を含む。イオン化法としては電子衝撃イオン化（EI）法、化学イオン化（CI）法、フィールドデソープション（FD）法、二次イオン化（SIMS）法、高速原子衝突（FAB）法、matrix-assisted laser desorption ionization（MALDI）法、エレクトロスプレーイオン化（ESI）法等を用いればよい。また、分析部は、二重収束質量分析計、四重極型質量分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計等が用いられる。精密な分析のために質量分析計を２台結合した、タンデム質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）を用いることもできる。
　質量分析計は単独で用いられてもよいし、液体クロマトグラフィーなどの分離機器や測定機器などと接続してもよく、高速液体クロマトグラフィーと組み合わせた液体クロマトグラフ質量分析（LC/MS、LC/MS/MS）で分析することができる。質量分析はペプチドの定量的検出のために当分野において広く用いられているLC/MS（LC/MS/MS)システムの、トリプル四重極型質量分析計による選択反応モニタリング(SRM：Selected reaction monitoring, SRM)または多重反応モニタリング（MRM：Multiple reaction monitoring)）によって行うことができる。SRM/MRMにより、多因子を同時に測定することができ、１回の測定で数百種類のタンパク質やペプチドを同時に測定することができる。
　被験体から採取したサンプル中に上記バイオマーカータンパク質又は部分ペプチドが多く存在している場合、すなわち陽性である場合、該被験体は大腸がんに罹患していると判断することができる。
　本発明においては、健常人から採取したサンプルを陰性対象として同時に測定してもよい。この場合、被験体が大腸がんに罹患している場合、被験体の検体中のバイオマーカータンパク質又は部分ペプチド濃度が健常人に比べて上昇するので、被験体におけるバイオマーカータンパク質又は部分ペプチド濃度が健常人よりも多い場合、バイオマーカータンパク質又は部分ペプチドは陽性と判断され、被験体が大腸がんに罹患していると判断することができる。サンプル中のバイオマーカータンパク質又は部分ペプチドが陽性か否かは、あらかじめSRM/MRM法で検出されたバイオマーカーペプチドのピークの面積値と内部標準である安定同位体標識ペプチドのピークの面積値の比又は抗体測定値についてカットオフ値を定めておき、該カットオフ値を基準としカットオフ値を超えた場合に、陽性であると判断することができる。
　カットオフ値は、例えば、ROC（receiver operating characteristic curve：受信者動作特性曲線）解析により定めることができる。また、ROC解析により本発明の方法による診断精度（感度及び特異性）を決定することができる。ROC解析は、試料として大腸がん患者から採取した試料と健常者から採取した試料についてバイオマーカータンパク質又は部分ペプチドを測定し、各カットオフ値での感度及び偽陽性率（１－特異性）を算出し、横軸と１－特異性とし、縦軸を感度とした座標上にプロットする。
　本発明の方法の測定結果についてROC解析により診断精度を解析した場合の、曲線下面積（AUC：area under the curve）は0.9以上と高く、感度は70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上であり、特異性は70％以上、好ましくは75％以上、さらに好ましくは80％以上である。本発明の方法により、非常に高い精度で初期の大腸がんを検出することができる。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
方法
大腸がん患者および健常者血清および大腸がん培養細胞
　大腸がん患者51名、および健常者26名の血清(千葉大医学部にて採取)を採取した。各検体血清サンプルは、解析まで-80℃に保存しておいた。
　４つの大腸がん細胞株HCT116 (ATCC; CCL-247), DLD-1 (ATCC; CCL-221), SW480 (ATCC; CCL-228) and SW620 (ATCC; CCL-227)は10％牛血清(FBS)及び抗生物質含有RPMI-1640培地(Gibco Laboratories)で培養した。
　細胞がサブコンフルエントまで増殖するまで、各細胞は5％CO2のインキュベーターで37℃に維持したで培養し、サブコンフルエントまで増殖させた。その後、これらの培養細胞は、FBS非含有培地で洗浄し、新鮮FBS非含有培地を添加した。さらにインキュベーターで48時間培養した後に、馴化上清培地を集め、EV（extracellular vesicle)を単離用のサンプルとした。
EV（extracellular vesicle：細胞外小胞)の単離
　EVの単離は、超遠心法により行った。遠心管の底にショ糖緩衝剤を敷くことで、EV回収時に低密度の夾雑物を効率よく分離することができる。超遠心前の処理として、血清100μlを300gで10分間、遠心分離し、大きな夾雑物を除去した。その後、回収した上清を、0.22μmスピンフィルタ(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)に通し、100,000gで90分間、30%のショ糖/D2O緩衝剤で遠心分離を行った。緩衝剤を回収し、さらに100,000gで70分間超遠心分離機に二度かけた後、遠心管に沈殿したEV画分を回収した。
EVからのタンパク質抽出及び消化
　タンパク質抽出及びタンパク質消化は、相間移動溶解剤（PTS：Phase transfer surfactant）プロトコール（Masuda T et al. J. Proteome Res. 7, 731-740 (2008)) により行った。EV画分タンパク質はMPEX PTS試薬キット（GL Science、日本）で溶解した後、ジチオトレイトールを終濃度5mMで加えて室温で30分間還元反応を行い、さらにヨードアセトアミドを終濃度20mMで加えてアルキル化反応を行った。
　その後、サンプルに１％(w/w)トリプシン(proteomics grade; Roche Mannheim, Germany)を加えて、37℃オーバーナイトで消化した。消化後、液量と等量の酢酸エチルと終濃度１％の三フルオロ酢酸を加えてボルテックスし、液中の界面活性剤を有機層に分離した。遠心分離後、ペプチドを含んでいる水相を回収し、Stage Tips（Rappsilber J. et al., Nat. Protoc. 2, 1896-1906 (2007)）による脱塩を行った。
液体クロマトグラフィー（LC）-質量分析計（MS/MS）及びプロテオームのデータ分析
　消化されたペプチドは、C18-SCX StageTipクロマトグラフィーカラムによって7分画した。その後、LC(UltiMate3000 Nanoflow HPLC system （Dionex、サニーヴェール、CA）)を連結した質量分析計(Q-Exactive（Thermo Scientific、ブレーメン、ドイツ）)で分析した。サンプルの質量分析器への導入は、内径75μm長さ300mmのニードルに1.9μmのC18-AQ樹脂を封入した自作の分析カラムを用いた。LCの移動相は、緩衝液A（0.1％ギ酸及び2％アセトニトリル）及びB（0.1％ギ酸及び90％アセトニトリル）から構成される。消化されたペプチドを緩衝液Aに溶解し、トラップカラム0.075 × 20 mm, Acclaim PepMap RSLC Nano-Trap Column; Thermo Scientific)にロードした。ナノLCは280nL /分で送液され、移動相は120分で5～35％Bの勾配で展開された。質量分析はFull MSスキャン(350～1800m/z、イオン積算3×106分解能70,000)およびMS/MSスキャン(Top10プリカーサーイオン、インジェクションタイム120ms、分解能35,000、MS/MSイオン選択閾値5×104カウント、分離幅3.0Da)で測定した。データファイルの解析は、MaxQuantソフトウェア（Ver 1.5.1.2）により行った。検索エンジンにはAndromeda、UniProtヒトタンパク質データベースに対して、ピークリストの検索を行った。プリカーサー質量誤差範囲は7ppm、断片イオン質量誤差範囲は0.01Daに設定した。同定タンパク質およびペプチドは、リバースデータベースに対する１％未満の偽陽性率(FDR 1%>)で判定した。
LC-SRM/MRM解析
　LC-SRM/MRM解析は以前に報告された方法により行った（Kume, H. et al., Mol. Cell. Proteomics 13, 1471-1484 (2014): Muraoka, S. et al., J. Proteome Res. 11, 4201-4210 (2012): Narumi, R. et al., J. Proteome Res. 11, 5311-5322 (2012))。消化ペプチドは0.1％のトリフルオロ酢酸（TFA）を含む2％のアセトニトリル溶液に溶解され、その後、ナノフローLC Paradigm MS2 (Michrom BioResources, Auburn, CA)を連結したトリプル四重極質量分析計 TSQ-Vantage(Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany)を用いて分析した。サンプルの質量分析器への導入は、内径75μm長さ100mmのニードルに1.9μmのC18-AQ樹脂を封入した自作の分析カラムを用いた。LCの移動相は、緩衝液A（0.1％ギ酸及び2％アセトニトリル）及びB（0.1％ギ酸及び90％アセトニトリル）から構成される。消化されたペプチドを緩衝液Aに溶解し、トラップカラム0.075 × 20 mm, Acclaim PepMap RSLC Nano-Trap Column; Thermo Scientific)にロードした。ナノLCは280nL /分で送液され、移動相は60分で5～35％Bの勾配で展開された。SRMモードでの解析は以下の条件で行った(Q1 Peak Width 0.7 FWHM, Cycle time:1 sec, Collision Gass Pressure 1.8 mTorr)。衝突エネルギーはSRMトランジションごとに最適化され、各トランジションの強度はピーク時間幅5分のスケジュールモードで測定した。
SI-ペプチドを用いた標的ペプチドの定量
　SRMによる標的ペプチドの定量は、内部標準として標的ペプチドと同配列のStable isotope-labeled peptide (SI-ペプチド)を各検体血清から調製したEVに混合し、SRM解析により検出された内在性ペプチド/SI-ペプチドのピークエリア比(Peak Area Ratio)により算出した。標的ペプチドと同配列のSI-ペプチドのスパイク量は事前分析を実行することによって内在性ペプチドに近くなるように調整した。
SRM解析によるピークエリア比率の統計分析
　SRM解析により算出された各検体のPeak Area Ratioより、標的ペプチドの大腸バイオマーカーとしての評価を行うため、SRMデータの統計分析を行った。統計分析には、SPSSソフトウェア（バージョン23）(SPSS Inc., Chicago, IL)を用いた。まず、それぞれの標的ペプチド単独でのバイオマーカーとしての評価を、ROC解析（ROC：Receiver Operating Characteristic）によるAUC（AUC:Area under the Curve）の値を算出して行った。さらに、複数の標的ペプチドを組み合わせた、マルチマーカーとしての評価も行った。標的ペプチドの組み合わせにはSPSSソフトウェアを用いてロジスティック回帰モデルを作成し、評価した。モデルが有効なペプチドの組み合わせに対して、同じくROC解析により算出したAUCの値により評価した。
結果
CRC関連バイオマーカー候補タンパク質の探索
　図１に、本件のバイオマーカー候補探索の戦略を示す。CRCバイオマーカー候補タンパク質のリストを、医学と生物学文献のPubMed Databaseから得た。検索式として、「cancer」AND 「colorectal」AND 「expression」を用いて、2003年から2014年のデータベース上の文献検索を行い、大腸癌関連の687のタンパク質についてCRCバイオマーカー候補としてリスト化した。候補タンパク質の選択は以下の（１）～（４）の基準により行った。
（１）ヒトCRC組織又は血液におけるタンパク質発現を、ウエスタンブロット、ELISA又は免疫組織化学によって確認している。
（２）標的タンパク質ががんにおいて発現上昇していることが確認されている。(発現が上昇するタンパク質は発現が減少するタンパク質よりも検出が容易であるため、バイオマーカーに適している）。
（３）がんの発現及び進行に関連する標的タンパク質の分子機能が、RNAiまたは分子の過剰発現によって実験的に確認されている。
（４）大規模な分析（例えばomics分析）で特定されただけのタンパク質は、除外した。
　さらに、本発明者らは、以前臨床検体の標的プロテオミクスによって、44のCRCバイオマーカー候補タンパク質を特定していた（Kume, H. et al., Mol. Cell. Proteomics 13, 1471-1484 (2014))。これらの44のタンパク質は上記のバイオマーカー候補と合わせ、重複するタンパク質を除いた、合計725のタンパク質を、CRCバイオマーカー候補として選択した。
ショットガン・プロテオミクス解析によるEV含有バイオマーカー候補の選択
　選択されたバイオマーカー候補タンパク質の中から、EVに存在するタンパク質を選択するために、血清および培養細胞上清から調製したEVを用いて、ショットガン・プロテオミクス解析によりEVタンパク質の定性解析を行った。ショットガン・プロテオミクスのワークフローを図２aに示す。
　血清と細胞上清からのEVの調製は超遠心法によって行った。血清EVは、健常者、転移のない癌患者、転移のある癌患者それぞれ8人より採取した。培養細胞上清は、4つのCRC細胞（HCT116、DLD-1、SW480、SW620）から採取した。抽出したタンパク質は相関移動溶解剤（PTS）法を用いることによって消化した後、C-18 Stage SCX Tipカラムにより分画した（Masuda, T et al., J. Proteome Res. 7, 731-740 (2008); Adachi, J. et al. Anal. Chem. 88, 7899-7903 (2016))。分画サンプルをLC-MS/MSで分析し、マスコット・データベース検索により、それぞれ702（血清EV）および4749の（細胞上清EV）タンパク質を同定した。これらのEV同定タンパク質とバイオマーカー候補タンパク質の比較により、356のタンパク質が、EVタンパク質含有のバイオマーカー候補であると同定された（図２b）。
EV中に同定されたバイオマーカー候補タンパク質からのSRMターゲットペプチドの選択
　候補タンパク質がバイオマーカーとして有効か検証するため、CRC患者血清から採取したEV分画のSRM解析を行った。SRM候補ペプチドは、ショットガン・プロテオミクスで特定されたペプチドから選択した。候補ペプチド選択の基準として、以下の（１）～（３）を用いた。
（１）同定されたタンパク質はタンパク質に固有のペプチド配列であり、複数ある場合はショットガン解析において強度の高い標的を選択した。
（２）トリプシンによる切断ミスや、SRM解析に適さないアミノ酸修飾（例えば、酸化されたメチオニン等）を有するペプチドは除外した。
（３）長すぎるペプチド（> 20アミノ酸）は、安定同位体標識ペプチド（SI-ペプチド）を合成することが困難であるため、標的ペプチドから除外した。
　これらの基準を満たすペプチドは、すべての同定されたペプチドの中で3316ペプチド（346のタンパク質）存在した。
　次に、これらの候補からSRM標的ペプチドを選ぶために、非がんコントロールの健常者(N)プール血清（n=26）、転移のないがん患者(C)のプール血清（n=26）、転移のあるがん患者(Cm)のプール血清（n=25）から調製したEV分画を用いてSRM分析を行った。ショットガン解析の結果から、ペプチドあたりに3つまたは4つのトランジション（プリカーサーイオンとプロダクトイオンの対）を選択した。SRM解析はそれぞれのプールごとに３回繰り返し測定し、ペプチドピーク面積はSkylineソフトウェアを用いて定量化した。ピーク面積がプールサンプル（N対CまたはC対Cm）の間で2倍以上有意（p<0.01）に増加した標的ペプチドをマーカー候補ペプチドとして選択した。二つ以上の候補ペプチドが検出されたタンパク質については、SRM解析でのピーク強度が高い2つのペプチドを選択した。これらの基準を考慮して、71のペプチド（46のタンパク質）を、バイオマーカ候補の標的ペプチドとして選択した（図３）。
血清EV画分における標的ペプチドのSRMによる定量
　個々の患者の血清から調製したEV画分中の37バイオマーカー候補ペプチドについて、SRMによる定量解析を行った。個々のEV画分は、3つの群の患者血清（健常者(N); n=26、転移なしがん患者(C); n=26、転移ありがん患者(Cm); n=25）のグループから調製した。各検体には等量のSI-peptideを内部標準として加え、内在性の標的ペプチドに対するピーク面積比をSkylineソフトウェアを用いて算出した。それぞれの標的ペプチドについて、N,C,およびCmのグループ間での定量値の比較をt検定により行ったところ、NとCまたはCとCmの間で有意な定量値の増加が見られた（p <0.05）(図４及び図５－１、５－２、５－３、５－４、５－５及び５－６)。
 標的ペプチドの統計分析によるバイオマーカーとしての評価
　バイオマーカーの候補ペプチドの評価をするために、37ペプチドについてROC（Receiver Operating Characteristic、受信者動作特性）分析を行った。各候補ペプチドについて、NとCとの間およびCとCmとの間の区別を評価した。4つのペプチド（3つのタンパク質）は非常に感度が高いタンパク質（AUC＞0.9、図６－１a,b）であった。そして、22のペプチドはNとCを識別するために十分に感度が高かった（0.7-0.9AUC、図７－１、７－２、７－３、７－４、７－５及び７－６）。一方、11のペプチドはCとCm（図６－２c,d）を識別するために十分に感度が高かった。
　次に、候補ペプチドを組合せてマルチマーカーとしてより高い感度が得られるかどうかを、ロジスティック回帰分析により調べた。ペプチドの有意な組み合わせについては、SPSSソフトウェアを用いて評価した。2つ以上のペプチドによるロジスティック分析の結果は、マルチマーカーのROC曲線のAUCにより評価した。候補ペプチドの14の組合せについてはAUCはマーカー単独の値よりも増加し（図８－１及び８－２）、特に8つの組合せについてはAUCが0.9<であった（図９）。最も高いAUC (0.97)は、3つのペプチド（トランスフェリン受容体タンパク1、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンおよびアンジオポエチン－１）の組合せによって得られた。これらの結果は、複数のマーカーの組み合わせが大腸がんの診断の精度を改善するのに有効であることを示唆している。
広く使われている腫瘍マーカー(がん胎児性抗原CEA)と標的ペプチドの感度の比較
　CEAは今日、最も広く利用されている大腸がんの血中マーカーの1つである。しかし、CEAの感度は、早期のステージ患者を見つけるのに十分ではなく、ステージ２の患者に対する感度は30％程度であることが報告されている。そこで、新たに確立した37のバイオマーカー候補とCEA比較の比較を行った。各標的ペプチドのSRM定量値のカットオフ点は、CEA特異性がほぼ100％であるため、100％の特異性に設定した。検証に用いた検体グループCに対するCEAの感度は、38.8％であった。一方、37の標的ペプチドのうち17のペプチド（12のタンパク質;Annexin A3、Annexin A4、Annexin A5、Annexin A11、Tenascin-N、Transferrin受容体タンパク1、GLUT-1、マトリックス・メタロプロテイナーゼ-9、Olfactomedin-4、CD88抗原、Tripeptidyl-ペプチダーゼ1、Neutrophilゼラチナーゼ関連のlipocalin）の感度はCEAを大きく上回っていた（図１０－１、１０－２及び１０－３）。特に、Annexin A4およびA11の3つのペプチドの感度は、80%<であった（図１１）。
　本発明の方法により大腸がんを早期で検出することができる。
配列番号２３～５９　合成
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (15)

  1. 　以下の１～２２の２２個のタンパク質の少なくとも１つのタンパク質、または１～２２のタンパク質の部分ペプチドの少なくとも１つのペプチドからなる大腸がん検出のための大腸がんバイオマーカー：
    １．アネキシンA11（Annexin A11) (ANXA 11)（配列番号１）；
    ２．アネキシンA3（Annexin A3) (ANXA 3)（配列番号２）；
    ３．アネキシンA4（Annexin A4) (ANXA 4)（配列番号３）；
    ４．テネイシン-N（Tanascin-N) (TNN)（配列番号４）；
    ５．トランスフェリン受容体タンパク質１（Transferrin receptor protein 1) (TFRC)（配列番号５）；
    ６．グルコーストランスポーター１（GLUT-1）(SLC2A1)（配列番号６）；
    ７．補体成分C9（Complement component C9) (C9)（配列番号７）；
    ８．CD88抗原（CD88 antigen) (C5AR1)（配列番号８）；
    ９．78kDa グルコース制御タンパク質（78kDa glucose-regulated protein) (HSPA5)（配列番号９）；
    １０．α-1-酸性グリコプロテイン（α-1-acid glycoprotein) (ORM1)（配列番号１０）；
    １１．マトリックスメタロプロテアーゼ９（Matrix metalloproteinase-9) (MMP9)（配列番号１１）；
    １２．アンジオポエチン－１（Angiopoietin-1） (ANGPT1)（配列番号１２）；
    １３．CD67抗原（CD67 antigen) (CEACAM8)（配列番号１３）；
    １４．ムチン-5B（Mucin-5B) (MUC5B)（配列番号１４）；
    １５．アダプタータンパク質 GRB2（Adapter protein GRB2) (GRB2)（配列番号１５）；１６．アネキシンA5（Annexin A5)（ANXA 5)（配列番号１６）；
    １７．オルファクトメジン-４（Olfactomedin-4) (OLFM4)（配列番号１７）；
    １８．中性アミノ酸トランスポーターB(0)（Neutral amino acid transporter B(0))(SLC1A5)（配列番号１８）；
    １９．トリペプチジルペプチダーゼ１（Tripeptidyl-peptidase 1) (TPP1)（配列番号１９）；
    ２０．熱ショック関連70kDaタンパク質２（Heat shock-related 70kDa protein 2）(HSPA2)（配列番号２０）；
    ２１．プロテアソームサブユニットαタイプ-５（Proteasome subunit alpha type-5) (PSMA5)（配列番号２１）；または
    ２２．好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（Neutrophil gelatinase-associated lipocalin) (LCN2)（配列番号２２）。
  2. 　請求項１記載の１～２２の２２個のタンパク質の２以上のタンパク質、または１～２２のタンパク質の部分ペプチドの２以上のペプチドを組合せてなる、請求項１記載の大腸がん検出のための大腸がんバイオマーカー。
  3. 　請求項１記載の１～２２のタンパク質の部分ペプチドが配列番号２３～５９で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１または２に記載の大腸がん検出のための大腸がんバイオマーカー。
  4. 　以下の１２個のタンパク質の少なくとも１つのタンパク質、または該１２個のタンパク質の部分ペプチドの少なくとも１つのペプチドからなる、請求項１記載の大腸がん検出のための大腸がんバイオマーカー：
    １．アネキシンA11（配列番号１）；
    ２．アネキシンA3（配列番号２）；
    ３．アネキシンA4（配列番号３）；
    ４．テネイシン-N（配列番号４）；
    ５．トランスフェリン受容体タンパク質１（配列番号５）；
    ６．グルコーストランスポーター１（配列番号６）；
    ８．CD88抗原（配列番号８）；
    １１．マトリックスメタロプロテアーゼ９（配列番号１１）；
    １６．アネキシンA5（配列番号１６）；
    １７．オルファクトメジン-４（配列番号１７）；
    １９．トリペプチジルペプチダーゼ１（配列番号１９）；または
    ２２．好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（配列番号２２）。
  5. 　請求項４記載の１２個のタンパク質の２以上のタンパク質、または該１２個のタンパク質の部分ペプチドの２以上のペプチドを組合せてなる、請求項４記載の大腸がん検出のための大腸がんバイオマーカー。
  6. 　請求項４記載の１２個のタンパク質の部分ペプチドが配列番号２３～３４、３７、３８、４３、４４、５３、５４、５６および５９で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項４または５に記載の大腸がん検出のための大腸がんバイオマーカー。
  7. 　アネキシンA4若しくはアネキシンA11、またはそれらの部分ペプチドからなる、請求項１記載の大腸がん検出のための大腸がんバイオマーカー。
  8. 　アネキシンA4とアネキシンA11、またはアネキシンA4の部分ペプチドとアネキシンA11の部分ペプチドを組合せてなる、請求項７記載の大腸がん検出のための大腸がんバイオマーカー。
  9. 　アネキシンA4およびアネキシンA11の部分ペプチドが配列番号２３、２４、２７および２８で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項７または８に記載の大腸がん検出のための大腸がんバイオマーカー。
  10. 　請求項１～９のいずれか１項に記載の大腸がんバイオマーカーとCEAとを組合せてなる、大腸がん検出のための大腸がんバイオマーカー。
  11. 　生体試料中の請求項１～１０のいずれか１項に記載の大腸がんバイオマーカーを測定することを含む大腸がんの検出方法。
  12. 　生体試料中の請求項１～１０のいずれか１項に記載の大腸がんバイオマーカーを測定し、該バイオマーカーが健常人と比較して高濃度で存在する場合に、大腸がんに罹患していると判断する、大腸がんの検出方法。
  13. 　生体試料が血液中の細胞外小胞(EV)である、請求項１１または１２に記載の大腸がんの検出方法。
  14. 　検出が免疫学的測定法または質量分析法により行われる、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の大腸がんの検出方法。
  15. 　生体試料中の請求項１～１０のいずれか１項に記載の大腸がんバイオマーカーに対する抗体を含む大腸がんの検出キット。
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