KR101819939B1 - 유방암 진단용 단백질 마커 베타-투 마이크로글로불린 및 이를 검출하는 방법 - Google Patents

유방암 진단용 단백질 마커 베타-투 마이크로글로불린 및 이를 검출하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 질량분석법을 이용한 다중 반응 모니터링을 통해 혈액 시료에서 베타-투 마이크로글로불린을 선택적으로 검출하는 방법 및 유방암 진단 키트에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 베타-투 마이크로글로불린 단백질 마커를 선택적으로 인지하는 항체를 포함하는 유방암 진단용 조성물 및 키트 및 검체에서 항원-항체 결합반응을 통해 베타-투 마이크로글로불린 단백질 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

유방암 진단용 단백질 마커 베타-투 마이크로글로불린 및 이를 검출하는 방법{PROTEIN MARKER BETA-2 MICROGLOBULIN FOR BREAST CANCER DIAGNOSIS AND METHOD FOR DETECTING THE SAME}
본 발명은 유방암 진단에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 혈액에서 유방암 발병 유무를 선택적으로 진단할 수 있는 단백질 마커로서의 베타-투 마이크로글로불린(Beta-2 microglobulin) 및 이를 검출하는 방법 및 유방암 진단키트에 관한 것이다.
현재 유방암의 발병 원인으로 여성 호르몬, 가족력, 과거력, 출산력, 식생활 습관 등의 다양한 인자들이 거론되고 있지만 아직까지 명확하게 규명된 것은 없다. 한국 여성의 유방암 발생은 계속 증가하고 있으며, 유방암의 발생빈도 및 유방암으로 인한 사망률의 증가는 현재의 서구화 실태로 보아 앞으로도 상당기간 지속될 것으로 예상된다. 유방암은 암세포의 성장으로 인한 주변 조직의 침범 또는 림프절 전이 등의 증상을 초래하는 것이 보통이지만, 대부분이 아무런 증상 없이도 자가검진으로 진단될 수 있다. 따라서, 유방암으로 인한 사망률을 줄이기 위해서는 유방암을 효과적으로 조기에 진단하는 것이 매우 중요하다(Tuli R. et al., Breast J., 12: 343-348, 2006).
유방암을 진단하기 위해서 여러 가지 방법이 복합적으로 사용되고 있는데, 현재까지는 유방암 환자의 70%가 자가진단에 의해서 내원하고 있다. 그러나, 이러한 자가진단 방법은 악성종양과 양성 혹을 구분하는 것이 매우 어렵다는 단점이 있다. 그 밖에, 유방암의 진단방법으로 X-선 유방촬영법, 초음파검사법, 세침흡입세포검사법, 자기공명촬영법 등이 있는데, 최종적으로는 조직검사를 통해 확인하는 것이 중요하다. X-선 유방촬영법은 X-선으로 유방을 찍어 검사하는 방법으로 혹이 양성인지 악성인지를 감별하는데 우수할 뿐만 아니라, 숨어 있는 혹을 발견하는 방법으로서 자가진단으로 혹이 만져지기 이전에 초기의 유방암을 진단하는데 가장 효과적인 방법이다. 그러나, 유방촬영법은 젊은 여성같이 유선이 많이 발달되어 있다거나 유방이 작고 섬유질이 많은 우리나라 여성에게서는 진단율이 떨어지는 단점이 있으며, 자주 찍으면 오히려 유방암이 유발될 수도 있다는 논란이 있다. 이러한 유방촬영법의 대안으로 초음파검사법이 사용되고 있는데, 초음파검사법은 물혹과 단단한 혹을 구별하는데 효과적이긴 하지만, 악성종양과 양성 혹을 감별하는 능력은 떨어진다.
이러한 기존 진단방법의 단점을 보완하기 위한 방법으로 환자의 혈액에서 종양 마커의 농도를 측정하여 유방암을 진단하려는 시도가 있었으며(Clinton SR. et al., Biomed. Sci. Instrum., 39: 408-414, 2003; Rui Z. et al., Proteomics, 3: 433-439, 2003), 대한민국 공개특허 제10-2011-0077635호는 유방암 환자의 혈액에서 특이적으로 그 양이 증가하거나 감소하여 존재하는 VCL, GC 및 WDR1의 자가항체를 검출하여 유방암을 진단하는 방법을 개시하고 있다.
그러나, 이러한 종양 마커들의 진단적 또는 예후 인자로서의 가치가 연구되고는 있지만, 아직까지 제한적으로 사용되고 있을 뿐으로 공식적으로 권장되고 있는 유방암 마커는 없는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 유방암 환자로부터 얻어진 생물학적 검체 시료 내에서 특이하게 변화하는 단백질을 발굴하고 이를 유방암의 조기 진단에 이용하는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 베타-투 마이크로글로불린 단백질이 정상인에 비하여 유방암 환자의 혈액에서 특이적으로 그 양이 감소하여 존재하며 이를 다중 반응 모니터링 또는 항원-항체 반응을 이용하여 검출함으로써 유방암 진단이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허 제10-2011-0077635호
Clinton SR. et al., Biomed. Sci. Instrum., 39: 408-414, 2003 Rui Z. et al., Proteomics, 3: 433-439, 2003
본 발명의 목적은 유방암 진단용 단백질 마커, 이를 이용하여 간편하게 유방암을 진단할 수 있는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유방암 진단용 단백질 마커로서 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 베타-투 마이크로글로불린을 제공한다.
또한, 본 발명은 질량분석법을 이용한 다중 반응 모니터링을 통해 혈액 시료에서 베타-투 마이크로글로불린을 선택적으로 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 질량분석법을 이용한 다중 반응 모니터링을 통해 혈액 시료에서 베타-투 마이크로글로불린을 검출하기 위한 유방암 진단키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 베타-투 마이크로글로불린을 특이적으로 인지하는 항체를 포함하는 유방암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 검체에서 항원-항체 결합반응을 통해 베타-투 마이크로글로불린을 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 베타-투 마이크로글로불린에 특이적으로 결합하는 항체가 고형 기질에 집적된 바이오칩을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 실시형태는 유방암 진단을 위한 단백질 마커로서 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 베타-투 마이크로글로불린에 관한 것이다.
베타-투 마이크로글로불린(BETA-2 MICROGLOBULIN)은 B2M 이라고도 불리며, 거의 대부분의 척추 동물의 면역작용에서 중요한 역할을 담당하는 단백질이다. B2M 단백질의 크기는 약 13KD 으로서 최초 발견 이래 전구B림프모세포백혈병(B-cell leukemia), 림프종(lymphomas), 다발성 골수종(multiple Myeloma)을 진단하기 위한 단백질 마커로서 여겨져 왔다. B2M 단백질은 암의 진행과정 및 초기의 생화학적 재발(BCR)을 관찰할 수 있는 유용한 표지자로서 알려져 있는데, 특히 단세포군감마글로불린병증의 진단에 탁월하다. (T. Malati, Indian journal of Clinical Biochemistry., 22:17-31, 2007)
한편, 질량분석법 (mass-spectrometry)을 이용한 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM)은 특정 분석물질을 선택적으로 분리하여 검출하고 정량하여 그 농도변화를 모니터링할 수 있는 분석기술이다. MRM은 생체 시료 중에 존재하는 미량의 바이오마커와 같은 물질을 정량적으로 정확하게 다중 측정할 수 있는 방법으로 제1 질량필터 (Q1)를 이용하여 이온화원에서 생성된 이온 단편들 중 어미이온을 선택적으로 충돌관으로 전달한다. 이어 충돌관에 도달한 어미이온은 내부 충돌기체와 충돌하여, 쪼개져 딸이온을 생성하여 제2 질량 필터 (Q2)로 보내지고, 여기서 특징적인 이온만이 검출부로 전달된다. 이런 방식으로 목적하는 성분의 정보만을 검출할 수 있는 선택성 및 민감도가 높은 분석방법이다. MRM은 작은 분자의 정량분석에 활용되어 특정 유전병을 진단하는데 쓰이고 있다. MRM 방법은 다수의 펩티드를 동시에 측정하기에 용이하며, 항체가 없이 정상인과 암환자 사이에서 단백질 진단 마커 후보들의 상대적 농도차를 확인할 수 있다는 장점이 있다. 또한 민감도와 선택성이 탁월하여 특히, 질량분석기를 이용한 프로테옴 분석에서 혈액 내에 있는 복잡한 단백질과 펩타이드의 분석을 위해 MRM 분석방법이 도입되고 있다 (Anderson L. et al., Mol CellProteomics, 5: 375-88, 2006; DeSouza, L. V. et al., Anal. Chem., 81: 3462-70, 2009).
본 발명자들은 유방암 환자의 혈액에서 특이적으로 그 양이 감소하여 유방암의 진단에 유용하게 사용될 수 있는 진단 마커를 선발하기 위하여, 40명의 유방암 환자와 20명의 비환자 대조군으로부터 혈액 시료를 얻어 삼중 사극자 질량분석기를 이용한 다중 반응 모니터링을 통해 정량 분석하였다. 그 결과, 베타-투 마이크로글로불린이 비환자 대조군에 비해 유방암 환자의 혈액에서 발현량이 감소하였고, 이를 통해 유방암 환자를 효과적으로 구분해 낼 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 유방암 진단 마커로 선별된 베타-투 마이크로글로불린은 지금까지 유방암의 발병 및 진행을 진단할 수 있는 표지로서 사용될 수 있음이 알려지지 않았으며, 본 발명에 의해 최초로 유방암의 진단 마커로 확인되었다. 또한, 상기 마커 단백질은 혈액에서 검출이 가능하기 때문에 생검(biopsy)을 통하지 않아 환자에게 불편을 초래하지 않으면서 간편한 방법으로 유방암을 진단하는데 활용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는 질량분석법을 이용한 다중 반응 모니터링을 통해 혈액 시료에서 베타-투 마이크로글로불린을 선택적으로 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시형태에 있어서, 다중 반응 모니터링은 삼중사극자 질량분석기를 이용할 수 있다.
구체적인 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 다중 반응 모니터링을 통해 혈액 시료에서 베타-투 마이크로글로불린을 선택적으로 검출하는 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:
1) 피검자의 혈액 시료 및 대조군 혈액 시료의 단백질을 펩티드 절편으로 만드는 단계;
2) 상기 펩티드 절편을 삼중 사극자 질량분석기에 주입하여 베타-투 마이크로글로불린을 대표하는 타깃 펩티드에 대해 다중 반응 모니터링을 수행하는 단계;
3) 상기 다중 반응 모니터링 결과를 내부 표준물질에 대한 비율로 표시하는 단계; 및
4) 피검자와 대조군에 대한 검출 결과를 비교하는 단계.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 피검자의 혈액 시료를 채취하고, 상기 베타-투 마이크로글로불린을 피검자의 혈액 시료에서 다중 반응 모니터링법으로 검출하여 비환자 대조군의 검출 결과에 비교하여 베타-투 마이크로글로불린의 양의 감소 여부를 확인함으로써 유방암의 발병 여부를 확인할 수 있다.
본 발명의 목적상, 타깃 단백질을 MRM 법으로 검출하기 위해서는 각 단백질을 대표할 수 있는 특정 펩티드의 선정과 각 펩티드의 MRM 모니터링 타깃인 어미이온/딸이온 쌍의 선정이 선행되어야 한다. 본 발명의 베타-투 마이크로글로불린을 대표하는 타깃 펩티드는 서열 번호 2의 서열을 가지며, 타깃 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍은 각각 m/z 383.751과 m/z 468.526이다. 또한 타깃 단백질을 검출하기 위해 MRM법으로 모니터링하는 일부 아미노산이 안정한 동위원소로 치환된 특정 펩티드를 합성하고 MRM 분석시 내부 표준물질로 사용함으로써 타깃 단백질의 혈액내 절대량을 측정할 수 있어서 더욱 정확한 분석 결과를 도출할 수 있다. 타깃 단백질의 혈액 내 절대량을 측정하기 위해 일부 아미노산이 안정한 동위원소로 치환된 특정 펩티드를 내부 표준물질로서 합성할 경우, 동위 원소로 치환된 아미노산은 리신 (Lysine)이나 아르기닌 (Arginine)이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 합성된 펩티드는 95% 이상 순수 분리된 펩티드를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 베타-투 마이크로글로불린을 MRM법을 사용하여 검출하는 방법은 환자의 혈액을 이용하는 새로운 진단도구로서 민감도가 우수할 뿐만 아니라 항원 항체를 이용하는 기존의 면역 화학적 방법보다 검출하고자 하는 단백질에 대한 선택성이 매우 높고 생검을 이용하지 않고 혈액을 대상으로 간편하게 분석할 수 있어, 유방암의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는 질량분석법을 이용한 다중 반응 모니터링을 통해 혈액 시료에서 베타-투 마이크로글로불린을 검출하기 위한 유방암 진단키트에 관한 것이다.
본 발명의 진단 키트는 MRM법을 이용하여 혈액 시료에서 베타-투 마이크로글로불린을 검출하기 위해 필요한 베타-투 마이크로글로불린의 타깃 펩티드 및 타깃 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍에 대한 정보가 개시된 설명서를 포함할 수 있으며, 당 분야에서 질량 분석에 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는 베타-투 마이크로글로불린에 특이적인 항체를 포함하여 혈액 시료에서 베타-투 마이크로글로불린을 검출하기 위한 유방암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 유방암 진단키트에 관한 것이다.
상술한 바와 같이, 베타-투 마이크로글로불린은 정상인에 비하여 유방암 환자에서 그 발현양이 감소되므로, 베타-투 마이크로글로불린에 특이적인 항체를 포함하는 조성물 또는 이를 포함하는 진단키트를 이용하여 혈액 시료의 베타-투 마이크로글로불린 양을 확인함으로써 유방암의 진단이 가능하다.
베타-투 마이크로글로불린에 선택적으로 결합하는 항체를 제조하기 위해서는 베타-투 마이크로글로불린의 입수가 선행되어야 하며, 이는 서열번호 1의 아미노산 서열을 이용하여 합성하거나 유전자 재조합을 이용하여 미생물에서 생산할 수 있고, 또는 혈액으로부터 직접 분리하여 준비할 수도 있다.
본 발명의 목적상, 상기 항체는 베타-투 마이크로글로불린의 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함할 수 있으나, 항원과 보다 특이적으로 결합할 수 있는 단클론항체가 바람직하다.
다클론 항체는 당업계에 알려진 종래 방법에 따라 면역원(antigen)으로 베타-투 마이크로글로불린 또는 그의 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 이러한 외부 숙주로는 마우스, 랫트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 예로 들 수 있으며, 면역원은 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 근육내, 복강내 또는 피하주사 등의 방법으로 투여되어 외부 숙주를 면역화시킨다. 면역화된 외부 숙주로부터 정기적으로 혈청을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리, 정제하여 베타-투 마이크로글로불린에 특이적인 다클론 항체를 제조할 수 있다.
단클론 항체는 당업계에 알려진 융합(fusion)에 의한 불멸화된 세포주 생성방법(Kohler G. et al., Nature, 256: 495-497, 1975)을 이용하여 제조될 수 있다.상기 방법을 간략히 설명하면, 먼저 순수한 베타-투 마이크로글로불린 또는 그의 단편으로 마우스를 면역시키거나, 이의 펩티드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 마우스에 면역시킨다. 면역이 된 마우스로부터 분리한 항체-생산 B 임파구를 인간 또는 마우스의 골수종세포와 융합하여 불멸화된 하이브리도마 세포를 생성한다. 이어, 효소면역분석법(ELISA; Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)으로 하이브리도마 세포의 단클론 항체의 생성 여부를 조사하여 양성 클론을 선발하고 이를 배양한 후 항체를 분리, 정제하거나 쥐의 복강에 주입한 후 복수를 채취하여 베타-투 마이크로글로불린에 특이적인 단클론 항체를 제조할 수 있다.
본 발명의 베타-투 마이크로글로불린의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 유방암 진단키트에는 베타-투 마이크로글로불린을 선택적으로 인지하는 항체를 포함하는 조성물 뿐만 아니라, 당분야에서 면역학적 분석에 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 유방암 진단키트는 베타-투 마이크로글로불린에 특이적인 항체; 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 이차항체 접합체(conjugate); 상기 표지체와 발색 반응할 발색기질 용액; 세척액; 및 효소반응정지용액을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 유방암 진단키트는 베타-투 마이크로글로불린 표준 항원을 포함하는 양성 대조군과 상기 항원이 주입되지 않은 동물의 항혈청을 포함하는 음성 대조군을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 유방암 진단키트는 항원-항체 결합반응을 통하여 항체 단백질에 대한 항원을 정량 또는 정성적으로 분석함으로써 유방암을 진단할 수 있으며, 상기항원-항체 결합반응은 통상의 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immnohistochemical staining), 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 등의 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 검체 및 대조군을 표면에 코팅시킨 96-웰 마이크로타이터 플레이트 등을 이용하여 재조합 단클론 항체 단백질과 반응하는 ELISA를 수행하도록 상기 진단키트를 제공 할 수 있다.
항원-항체 결합반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(Well plate), 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있다.
이차항체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(폴리 L-라이신-플루오르세인 아이소티오시아네이트), RITC(로다민-B-아이소티오시아네이트) 등의 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye) 등의 표지체가 사용될 수 있다.
발색을 유도하기 위한 발색기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는것이 바람직하며, TMB(3,3',5,5'-테트라메틸 베지딘), ABTS[2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)], OPD(o-페닐렌다이아민) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색기질은 완충용액(0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 이차항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해분해되어 발색 침적체를 생성하고, 이 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 상기 베타-투 마이크로글로불린 단백질 항원의 존재 유무를 검출한다.
세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액, 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20으로 구성된 완충용액(PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 이차항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 첨가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 황산용액(H2SO4)이 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는 베타-투 마이크로글로불린에 특이적인 항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 혈액 시료에서 베타-투 마이크로글로불린을 검출하는 방법에 관한 것이다.
상기 검출방법은 혈액내 단백질을 고정화시키거나 전기영동(SDS-PAGE)으로 분리시킨 후 PVDF 막으로 전이시키고 베타-투 마이크로글로불린을 선택적으로 인지하는 항체와 접촉시켜 항원-항체 결합반응을 통해 베타-투 마이크로글로불린의 존재를 간접적으로 확인하는 것을 포함한다. 상기 항원-항체 결합반응으로는 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(RIA), 샌드위치 측정, 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법, 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 등을 예로 들 수 있다. 시료로서는 혈청, 혈장 또는 혈액을 사용할 수 있고, 혈장이 가장 바람직하다.
본 발명의 일 실시형태에 의하면, 상기 검출방법은,
1) 피검자의 혈액 시료 및 대조군 혈액 시료의 단백질을 고정체에 코팅하거나 고정시키는 단계;
2) 상기 고정체에 베타-투 마이크로글로불린에 특이적인 항체를 첨가하여 항원-항체 결합반응을 수행하는 단계;
3) 상기 항원-항체 결합반응을 통해 생성된 항원-항체 결합반응물을 이차항체 접합체(conjugate) 및 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및
4) 피검자 혈액 시료와 대조군 혈액 시료에 대한 검출 결과를 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 검출방법을 구체적으로 설명하면, 먼저 혈액 시료로부터 혈장단백질을 분자량에 따라 분리한다. 베타-투 마이크로글로불린은 분자량이 13 kDa이므로 18% 폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 전기영동을 수행하고, 이로부터 분리된 단백질들을 PVDF 막과 같은 고정체로 전이시켜 고정한다. 이어, 고정된 단백질 항원에 베타-투 마이크로글로불린에 특이적인 항체를 가하여 항원-항체 결합반응을 수행한다. 혈액 시료에 베타-투 마이크로글로불린이 존재한다면, 상기 단백질이 고정된 막에 베타-투 마이크로글로불린 특이적인 항체가 가해졌을 때 항원-항체 결합반응이 일어나게 된다. 베타-투 마이크로글로불린과 이에 대한 항체의 결합 정도를 측정하기 위해서, 베타-투 마이크로글로불린 항체에 친화성을 갖는 이차항체, 예컨대 항-인간 IgG-HRP와 결합시키는 단계를 수행하는데, 이차항체에 접합된 HRP(horseradish peroxidase)가 기질인 ECL(enhanced chemiluminescence)과 반응하여 발색반응을 일으키는지의 여부와 그정도를 대조군과 비교함으로써 혈액 시료내 유방암 진단 마커인 베타-투 마이크로글로불린의 존재 여부 및 대조군에 비교한 그 양의 감소 여부를 검출하게 되며, 이를 통해 유방암의 진단이 가능하다.
본 발명의 다른 실시형태는 베타-투 마이크로글로불린에 특이적으로 결합하는 항체가 고형 기질에 집적된 바이오칩에 관한 것이다.
베타-투 마이크로글로불린에 특이적인 항체를 생물학적 마이크로칩(biological microchip) 상에 고정시킨 후 대상자로부터 분리된 혈액 시료와 반응시켜 상기 항체 단백질에 대한 항원을 검출할 수 있는 생물학적 마이크로칩 및 자동화된 미세배열 시스템(microarray system)을 이용하면, 한 번의 분석으로 대량의 시료를 분석할 수 있다. 바이오칩의 고형 기질의 예로는 플라스틱, 유리, 금속, 실리콘 등을 들 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 유방암 진단용 마커 단백질인 베타-투 마이크로글로불린을 혈액 시료에서 MRM법을 통해 검출하는 방법은 환자의 혈액을 이용하는 새로운 진단도구로서 민감도가 우수할 뿐만 아니라 항원 항체를 이용하는 기존의 면역 화학적 방법보다 검출하고자 하는 단백질에 대한 선택성이 매우 높고 생검을 이용하지 않고 혈액을 대상으로 간편하게 분석할 수 있어, 유방암의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있는 한편, 베타-투 마이크로글로불린의 항체를 이용한 유방암 진단키트 및 진단 방법 또한 비교적 채취가 용이한 혈액을 시료로 하기 때문에 생검을 대상으로 하는 기존의 유방암 진단방법과는 달리 환자에게 부담을 주지 않고 매우 간편하게 유방암을 진단할 수 있을 뿐만 아니라 진단의 정확도 및 민감도가 높아 유방암의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 검출된 베타-투 마이크로글로불린의 트립틱 펩티드들 중 하나인 서열번호: 2의 펩티드가 무거운 동위원소의 리신으로 표지된 것에 대한 탠덤질량분석(tandem mass spectrometry) 스펙트럼 결과를 나타낸 것이고,
도 2는 베타-투 마이크로글로불린의 트립틱 펩티드 중 하나인 서열번호 2의 펩티드를 삼중사극자 질량분석기를 이용한 다중반응 모니터링 법으로 정량 분석한 MRM 크로마토그램을 나타낸 도이다.
도 3a 및 3b 는 베타-투 마이크로글로불린 마커 단백질을 40명의 유방암 환자와 20명의 비 환자 대조군에 대해 다중반응 모니터링 법으로 측정한 항원의 농도를 나타낸 도이다.
a: 상자도표; 및,
b: ROC 곡선.
도 4a 및 4b는 베타-투 마이크로글로불린 마커 단백질을 20명의 1기 유방암 환자와 20명의 비 환자 대조군에 대해 다중반응 모니터링 법으로 측정한 항원의 농도를 나타낸 도이다.
a: 상자도표; 및,
b: ROC 곡선.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오직 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들에 국한되지 않는다는 것은 당업자에게 있어서 자명하다.
실시예 1: 유방암 특이적 진단 마커로서 베타-투 마이크로글로불린의 동정
본 발명자들은 유방암 환자의 혈액에서 특이적으로 그 양이 감소하여 유방암의 진단에 유용하게 사용될 수 있는 진단 마커를 선발하기 위하여, SILAC(Stable Isotope Labeling with Acmino Acids in cell culture) 세포배양방법을 사용하여 단백질을 표지하고 질량분석기로 정량분석하는 방법을 사용하였다(Ong SE. et al., Methods., 29:124-130, 2003). SILAC 정량분석을 위하여 Cambridge Isotope laboratories 사에서 공급하는 SILAC Protein Quantification Kit(카달로그 번호: 115)을 준비하였다. 이 시약은 자연에 존재하며 세포구성에 필수적인 아미노산인 리신(L-Lysine)과 알지닌(L-Arginine) 으로서, 각각의 탄소원소가 모두 가벼운 동위원소(12C) 또는 무거운 동위원소(13C)로 치환된 두 종류의 시약으로 구성된다.
상기 SILAC 세포배양법을 사용하여 유방암세포와 비암세포의 분비단백체 시료를 준비하였다. 준비된 분비단백체 시료는 각각 200 ㎍씩 준비하여 동량으로 혼합한 후 전체 단백질 400 ㎍의 1/40에 해당하는 양인 10 ㎍의 트립신을 첨가하고 37 ℃에서 16시간 동안 처리하여 다수의 펩티드 절편으로 분리하였다. 이렇게 얻은 펩티드 절편을 Agilent-3100-OFFGEL-fractionator를 사용하여 12 개의 분획으로 나누었다. 이렇게 얻은 12개의 분획을 고체상추출법 (solid phase extraction)을 통해 탈염하여 질량 분석을 위한 최종 시료를 준비하였다
상기에서 준비된 최종 시료를 역상 수지 크로마토그래피에 걸어 혈장 펩티드 절편을 분리하고 탠덤질량분석기를 사용해 각 절편의 탠덤질량분석 스펙트럼을 얻었다. 이때, 역상 수지 크로마토그래피는 내경 75 ㎛의 무수규산이 입혀진 모세관(silica coated capillary)에 매직 아쿠아 수지(magic C18 aqua resin, Microchom사)를 충진한 컬럼으로 70분간 5%~40%의 아세토니트릴 농도 구배를 이용하여 실시하였다. SEQUEST 컴퓨터 분석 프로그램(thermo scientific사)으로 펩티드 절편의 탠덤질량분석 정보를 SWISS-PROT 단백질 데이터베이스와 비교 검색하여 단백질을 동정하고, ISB 파이프라인(Institute for Systems Biology사)을 사용하여 동정된 단백질을 재확인하였으며, 이로부터 유방암세포와 비암세포 대조군 시료 사이의 양적 차이를 분석하였다(Keller A. et al., Anal. Chem., 15: 5395-5392, 2002; Nesvizhskii AI. et al., Anal. Chem., 75: 4646-4658, 2003; Han DK. et al., Nat Biotech., 19:946-951, 2001).
비암세포 대조군으로부터 얻은 분비단백체 시료내의 단백질들은 가벼운 탄소로 이루어진 리신, 알지닌 시약으로 표지되고 유방암세포군으로부터 얻은 분비단백체 시료내의 단백질들은 무거운 리신, 알지닌 시약으로 표지되기 때문에, 동일한 단백질로부터 얻은 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드들도 질량 차이를 나타낸다. 따라서, 하나의 단백질을 동정하는데 사용된 펩티드는 가벼운 탄소로 이루어진 리신, 알지닌 시약으로 표지된 펩티드일 수도 있고 무거운 탄소로 이루어진 리신, 알지닌 시약으로 표지된 펩티드일 수도 있다. 이와 같이 특정 단백질의 동정에 사용된 가벼운 탄소로 이루어진 리신, 알지닌 시약과 무거운 탄소로 이루어진 리신, 알지닌 시약으로 표지된 펩티드 각각의 크로마토그램을 추적하여 이들의 질량 피크(mass peak) 면적을 계산하고 각 펩티드의 크로마토그램 면적비를 구하면 비암세포 대조군과 유방암 세포군 사이에 단백질 발현량의 차이를 정량할 수 있다. 이러한 정량분석으로부터 비암세포 대조군에 비해 유방암 세포군에서 특이적으로 발현량이 감소한 트립틱 펩티드를 선별하였고 이 펩티드가 서열번호: 2의 아미노산 서열을 가짐을 확인하였다.
도 1은 상기에서 유방암 세포군의 분비단백체에서 특이적으로 발현량이 감소한 것으로 확인된 서열번호: 2의 펩티드에 대한 탠덤질량분석 스펙트럼 결과를 나타낸 것으로, 이로부터 질량분석기에 의해 동정된 단백질이 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 베타-투 마이크로글로불린 단백질임을 확인하였다.
실시예 2. 다중 반응 모니터링 (Multiple Reaction Monitoring; MRM)법을 이용한 유방암 진단을 위한 베타-투 마이크로글로불린의 검출
본 발명자들은 상기 서열번호 1에 제시된 베타-투 마이크로글로불린이 혈액에서 유방암의 선택적 진단을 위한 마커로서 사용될 수 있는지를 확인하기 위하여 다음과 같이 삼중 사극자 질량분석기를 이용한 다중 반응 모니터링법을 통해 정량분석하는 방법을 사용하였다 (Anderson L. et al., Mol Cell Proteomics, 5: 375-88, 2006). MRM이란 질량분석기를 이용한 정량에 주로 사용되는 방법으로 관심 있는 어미이온으로부터 생성된 특정 딸이온을 관찰하여 정보를 얻는 방법이다. 예를 들어 m/z 1000을 갖는 여러 개의 어미이온 중 단 한 개의 이온만이 m/z 500의 딸이온을 갖는다면 이러한 이온을 추적하기 위해 m/z 1000을 갖는 어미이온을 선택하여 단편화 시키고 m/z 500의 딸이온을 조사하는 것이 MRM이다.
2.1 시료의 준비
베타-투 마이크로글로불린의 유방암 진단 효율성을 확인하기 위해 유방암 환자 40명과 비 환자 대조군 20명으로부터 얻은 혈액 시료에서의 단백질 발현 정도를 확인하고, 통계 처리하여 베타-투 마이크로글로불린의 유방암 진단 효율을 확인하였다. 60명으로부터 얻은 혈액으로부터 각각 100 ㎍의 단백질 시료를 준비하였다. 준비된 각 시료에 10 mM의 디티오트레이톨(Dithiothreitol)을 처리하여 1 시간 반응시켜, 단백질을 펩티드 절편으로 만드는 과정을 방해할 수 있는 단백질내 아미노산중 시스틴의 씨올 (thiol-)잔기간의 결합을 끊어 주었다. 이렇게 끊어준 씨올 결합은 60 mM의 이오도아세트아미드(iodoacetamide)를 처리한 후 빛이 들어오지 않는 곳에서 1시간 동안 반응시켜 씨올 잔기간의 재결합을 막아 주었다. 준비된 단백질 시료에 전체 단백질 100 ㎍의 1/50에 해당하는 양의 트립신(Promega, USA)을 각각 첨가하고 37℃에서 16시간 동안 처리하여 다수의 펩티드 절편으로 분리하였다. 이렇게 얻은 펩티드 절편은 C-18 spin column을 이용하여 염을 제거함으로써 질량 분석을 위한 최종 시료로 준비하였다.
2.2 삼중 사극자 질량분석기를 이용한 다중 반응 모니터링 수행
MRM 분석을 위해서는 특정 단백질을 대표할 수 있는 펩티드의 선정과 그 펩티드로부터 단편화를 통해 생성된 딸이온, 즉 타깃 펩티드를 효과적으로 모니터링 할 수 있는 어미이온과 딸이온의 쌍을 먼저 선정해야 한다. 서열번호 1로 제시된 베타-투 마이크로글로불린의 어미이온과 딸이온 쌍을 선정하기 위해 혈액 시료를 바로 텐덤 질량 분석하여 베타-투 마이크로글로불린을 동정하였다. 이 텐덤 질량분석 스펙트럼으로부터 베타-투 마이크로글로불린을 대표할 수 있는 서열번호 2의 펩티드를 선정하였고, 이 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍을 선정하여 표 1에 제시하였다.
타깃 단백질 타깃 단백질 MRM transition (m/z)
어미이온 딸이온
베타-투 마이크로글로불린 VEHSDLSFSK 383.751 468.526
내부표준물질 VEHSDLSFSK* 386.398 476.468
실시예 2.1에서 준비된 최종 시료를 역상 수지 크로마토그래피에 걸어 혈장 펩티드 절편을 분리하였고, 삼중 사극자 질량분석기(기기: 5500 Qtrap, AB Sciex, USA)를 사용해 각 펩티드의 MRM 스펙트럼을 얻었다. 이때, 역상 수지 크로마토그래피는 HALOTM C-18 컬럼 (Eksigent, USA) 컬럼으로 9분간 0%~10%, 그리고 5분간 10%~30%의 아세토니트릴 농도 구배를 이용하여 실시하였다. MultiQuantTM 컴퓨터 정량 분석 프로그램 (ABSciex, USA)으로 타깃 펩티드의 MRM 크로마토그램의 피크 면적을 계산하여 정량 정보를 확인하였다. 이때 각 타깃 펩티드의 정량 값은 내부 표준물질로 넣어준 동위원소 라벨된 상기 타깃 펩티드(JPT, Germany) (표 1)의 MRM 크로마토그램의 피크 면적에 대한 비율로 표시하였다. 각 펩티드의 MRM 크로마토그램 면적비를 구함으로써 유방암 환자와 비 환자 대조군 사이에 단백질 발현량의 차이를 확인할 수 있었다. 상기 방법으로 측정된 베타-투 마이크로글로불린의 농도를 그래프로 도시하였다. 구체적으로, 서열번호 1로 제시된 베타-투 마이크로글로불린을 40명의 유방암 환자와 20명의 비 환자 대조군에 대해 정량 분석하여 도 3a에서 나타난 바와 같이 상자도표로 도시한 결과, 상기 마커 단백질이 비환자 대조군에 비해 유방암 환자군에서 1.13배 감소함을 확인하였다. 이를 도 3b에서 나타난 바와 같이 수용자-조작 특성(ROC) 그래프로 도시한 결과, 상기 마커 단백질의 AUC(area under the curve)는 0.667로 나타났다. 또한, 35%의 특이도에서 91.18%의 민감도를 보였다.
더불어, 상기 베타-투 마이크로글로불린을 20명의 1기 유방암 환자와 20명의 비 환자 대조군간의 발현량을 비교한 결과, 도 4a에서 상자도표로 도시한 바와 같이 상기 마커 단백질이 비환자 대조군에 비해 1기 유방암 환자군에서 1.27배 감소함을 확인하였다. 이를 도 4b에서 나타난 바와 같이 수용자-조작 특성(ROC) 그래프로 도시한 결과, 상기 마커 단백질의 AUC(area under the curve)는 0.769로 나타났다. 또한, 70%의 특이도에서 75%의 민감도를 보여 상기 분석이 초기 유방암 환자의 진단에 매우 효과적임을 알 수 있었다.
참고로, ROC 그래프는 관찰된 데이터의 전 범위에 걸친 판정 역치를 연속적으로 변화시켜 수득되는 모든 감수성/특이성 쌍의 그래프로 주로 시험의 정확도를 나타낸다(Zweig et al., Clin. Chem. 39:561-577, 1993).
<110> Biomedieng Co., Ltd. <120> PROTEIN MARKER BETA-2 MICROGLOBULIN FOR BREAST CANCER DIAGNOSIS AND METHOD FOR DETECTING THE SAME <130> SDP50999 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg 20 25 30 His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser 35 40 45 Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu 50 55 60 Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp 85 90 95 Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile 100 105 110 Val Lys Trp Asp Arg Asp Met 115 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> tryptic peptide <400> 2 Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys 1 5 10

Claims (13)

1) 피검자의 혈액 시료 및 대조군 혈액 시료의 단백질을 펩티드 절편으로 만드는 단계;
2) 상기 펩티드 절편을 삼중 사극자 질량분석기에 주입하여 베타-투 마이크로글로불린을 대표하는 타깃 펩티드에 대해 다중 반응 모니터링을 수행하는 단계;
3) 상기 다중 반응 모니터링 결과를 내부 표준물질에 대한 비율로 표시하는 단계; 및
4) 피검자와 대조군에 대한 검출 결과를 비교하는 단계를 포함하며,
상기 베타-투 마이크로글로불린을 대표하는 타깃 펩티드는 서열 번호 2의 서열을 가지며, 상기 타깃 펩티드의 어미이온과 딸이온은 각각 m/z 383.751과 m/z 468.526인, 질량분석법을 이용한 다중 반응 모니터링(Multiple Reaction Monitoring)을 통해 유방암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 혈액 시료에서 베타-투 마이크로글로불린을 선택적으로 검출하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 베타-투 마이크로글로불린은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 방법.
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제1항에 있어서, 상기 내부 표준물질로서 동위원소 라벨된 베타-투 마이크로글로불린 타깃 펩티드가 사용되며, 동위원소 라벨된 베타-투 마이크로글로불린 타깃 펩티드의 어미이온과 딸이온은 각각 m/z 386.398과 m/z 476.468인 방법.
제1항의 검출방법을 이용하여 혈액 시료에서 베타-투 마이크로글로불린을 검출하기 위해 필요한 베타-투 마이크로글로불린의 타깃 펩티드 및 타깃 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍에 대한 정보가 기재된 설명서를 포함하는 유방암 진단 키트.
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