KR101431067B1 - 유방암 진단용 단백질 마커 아포리포단백질 （ａ）, 이의 검출 방법 및 이에 대한 항체를 포함하는 유방암 진단키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유방암을 진단할 수 있는 단백질 마커인 아포리포단백질 (a)를 다중 반응 모니터링 방법을 통해 혈액 시료에서 검출하는 방법, 아포리포단백질 (a)에 특이적인 항체를 포함하는 유방암 진단키트, 및 항원-항체 결합반응을 이용하여 혈액 내에서 아포리포단백질 (a)를 검출하는 방법에 관한 것이다. MRM법 또는 항원-항체 결합반응을 통해 혈액 시료에서 본 발명의 유방암 진단용 단백질 마커인 아포리포단백질 (a)를 검출하는 방법 및 진단 키트는 진단의 민감도 및 정확도가 높을 뿐만 아니라 환자의 혈액을 이용하여 매우 간편하게 유방암을 진단할 수 있어 유방암의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.　

Description

유방암 진단용 단백질 마커 아포리포단백질 （ａ）, 이의 검출 방법 및 이에 대한 항체를 포함하는 유방암 진단키트{PROTEIN MARKER APOLIPOPROTEIN (a) FOR BREAST CANCER DIAGNOSIS, METHOD OF DETECTING THE SAME, AND DIAGNOSIS KIT FOR BREAST CANCER USING ANTIBODY AGAINST THE SAME}

본 발명은 유방암 진단에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 혈액에서 유방암 발병 유무를 선택적으로 진단할 수 있는 단백질 마커로서의 아포리포단백질 (a) 및 이의 검출 방법, 및 이를 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 유방암 진단키트에 관한 것이다.

유방암의 원인에 대해 명확하게 밝혀진 것은 없지만, 여성 호르몬, 가족력, 과거력, 출산력, 식생활 습관 등의 다양한 인자들이 거론되고 있다. 2005년 통계청의 조사에 의하면, 한국 여성의 유방암 발생은 최근 급격히 증가하여 1998년 자궁경부암을 추월한 이래 2001년 발생한 한국 여성암 환자의 16.1%를 차지하면서 위암을 제치고 여성암 1위가 되었다. 특히, 2002년에는 2001년에 비해 유방암(11.1%)이 가장 급증한 암으로 나타나 저출산, 짧은 수유기간, 이른 초경, 늦은 폐경 등 생리적으로 왕성한 신체적 변화를 겪는 시기의 여성들에서는 여성호르몬의 자극을 받는 횟수의 급격한 증가로 인한 유선조직의 민감도 증가, 식생활의 서구화, 생활환경의 오염 등의 이유로 유방암 발생이 급격하게 증가하고 있다.

이러한 유방암의 발생빈도 및 유방암으로 인한 사망률의 증가는 현재의 서구화 실태로 보아 앞으로도 상당기간 지속될 것으로 예상된다. 유방암은 암세포의 성장으로 인한 주변 조직의 침범 또는 림프절 전이 등의 증상을 초래하는 것이 보통이지만, 대부분이 아무런 증상 없이도 자가검진으로 진단될 수 있다. 따라서, 유방암으로 인한 사망률을 줄이기 위해서는 유방암을 효과적으로 조기에 진단하는 것이 매우 중요하다(Tuli et al., Breast J. 12: 343-348, 2006).

유방암을 진단하기 위해서 여러 가지 방법이 복합적으로 사용되고 있는데, 현재까지는 유방암 환자의 70%가 자가진단에 의해서 내원하고 있다. 그러나, 이러한 자가진단 방법은 악성종양과 양성혹을 구분하는 것이 매우 어렵다는 단점이 있다. 그 밖에, 유방암의 진단방법으로 X-선 유방촬영법, 초음파검사법, 세침흡입세포검사법, 자기공명촬영법 등이 있는데, 최종적으로는 조직검사를 통해 확인하는 것이 중요하다. X-선 유방촬영법은 X-선으로 유방을 찍어 검사하는 방법으로 혹이 양성인지 악성인지를 감별하는데 우수할 뿐만 아니라, 숨어 있는 혹을 발견하는 방법으로서 자가진단으로 혹이 만져지기 이전에 초기의 유방암을 진단하는데 가장 효과적인 방법이다. 그러나, 유방촬영법은 젊은 여성같이 유선이 많이 발달되어 있다거나 유방이 작고 섬유질이 많은 우리나라 여성에게서는 진단율이 떨어지는 단점이 있으며, 자주 찍으면 오히려 유방암이 유발될 수도 있다는 논란이 있다. 이러한 유방촬영법의 대안으로 초음파검사법이 사용되고 있는데, 초음파검사법은 물혹과 단단한 혹을 구별하는데 효과적이긴 하지만, 악성종양과 양성혹을 감별하는 능력은 떨어진다.

이러한 기존 진단방법의 단점을 보완하기 위한 방법으로 환자의 혈액에서 종양 표지자(marker)의 농도를 측정하여 유방암을 진단하려는 시도가 있었다(Clinton et al., Biomed Sci . Instrum. 39: 408-414, 2003; Rui et al., Proteomics. 3: 433-439, 2003; Soletormos et al., 48: 229-255, 2001). 그러나, 이러한 종양 표지자들의 진단적 또는 예후 인자로서의 가치가 연구되고는 있지만, 아직까지 제한적으로 사용되고 있을 뿐으로 공식적으로 권장되고 있는 유방암 표지자는 없는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 유방암 환자의 혈액에서 특이적으로 양이 변하는 마커 단백질을 유방암의 진단에 이용하는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 서열번호 1로 제시되는 아포리포단백질 (a)가 정상인에 비하여 유방암 환자의 혈액에서 특이적으로 그 양이 증가하여 존재한다는 사실을 발견하였고, 이러한 아포리포단백질 (a)를 효율적으로 추적하기 위해 다중 반응 모니터링 방법으로 아포리포단백질 (a)를 대표할 수 있는 서열번호 2로 제시되는 펩티드의 발현 정도를 모니터링하여 유방암을 간편하게 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 혈액내에 존재하는 아포리포단백질 (a)의 유방암 발병 여부에 따른 변화양상을 이용하여 간편하게 유방암을 확인할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유방암 진단용 단백질 마커로서 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 아포리포단백질 (a)를 제공한다.

또한, 본 발명은 삼중 사극자 질량분석기를 이용한 다중 반응 모니터링을 통해 혈액 시료에서 상기 아포리포단백질 (a)를 선택적으로 검출하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아포리포단백질 (a) 마커에 특이적인 항체를 포함하는 유방암 진단키트를 제공한다.

아울러, 본 발명은 유방암 단백질 마커로서 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 아포리포단백질 (a)에 특이적인 항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 혈액 시료에서 아포리포단백질 (a)를 검출하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 본 발명은 유방암 진단을 위한 단백질 마커로서 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 아포리포단백질 (a)을 제공한다.

아포리포단백질 (a) (Apolipoprotein (a); LPA)는 세린 프로테이나아제의 활성을 갖고 있으며 자가단백질 분해 작용을 하기도 한다 (Salonen E.M. et al., EMBO J., 8:4035-4040, 1989). 상기 단백질은 주로 염증 반응과 관계되어 있으며, 리포다당류에 매개된 종양 괴사 인자인 TNF-α의 생성을 억제하는 것으로 알려져 있다 (Klezovitch O. et al., J Biol Chem., 276:46864-46869, 2001). 또한, 최근 복막 염증 모델에서 호중구의 유입과 사이토카인의 유리를 제한한다는 것이 보고되어 상기 단백질이 암세포의 생장에 따른 염증반응에 관계됨이 알려졌다 (Hoover-Plow J. et al., Exp Biol Med., 234:28-34, 2009).

한편, 삼중 사극자 질량분석기 (triple quadrupole mass-spectrometry)를 이용한 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM)은 특정 분석물질을 선택적으로 분리하여 검출하고 정량하여 그 농도변화를 모니터링할 수 있는 분석기술이다. MRM은 이미 작은 분자의 정량분석에 활용되어 특정 유전병을 진단하는데 쓰이고 있다. MRM 방법은 다수의 펩티드를 동시에 측정하기에 용이하며, 표준품이나 항체가 없이 정상인과 암환자 사이에서 단백질 진단 마커 후보들의 상대적 농도차를 확인할 수 있다는 장점이 있다. 또한 민감도와 선택성이 탁월하여 특히, 질량분석기를 이용한 프로테옴 분석에서 혈액 내에 있는 복잡한 단백질과 펩타이드의 분석을 위해 MRM 분석방법이 도입되고 있다 (Anderson L. et al., Mol Cell Proteomics , 5: 375-88, 2006; DeSouza, L. V. et al., Anal . Chem ., 81: 3462-70, 2009).

본 발명자들은 유방암 환자의 혈액에서 특이적으로 그 양이 증가하여 유방암의 진단에 유용하게 사용될 수 있는 진단 마커를 선발하기 위하여, 80명의 유방암 환자와 80명의 비환자 대조군으로부터 혈액 시료를 얻어 삼중 사극자 질량분석기를 이용한 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM)을 통해 정량 분석하였다. 그 결과 아포리포단백질 (a)가 비환자 대조군에 비해 유방암 환자의 혈액에서 발현량이 증가하였고, 이를 통해 유방암 환자를 효과적으로 구분해 낼 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 유방암 진단 마커로 선별된 아포리포단백질 (a)는 지금까지 유방암의 발병 및 진행을 진단할 수 있는 표지로서 사용될 수 있음이 알려지지 않았다. 따라서 아포리포단백질 (a)를 유방암의 진단 마커로 이용하는 것은 본 발명이 최초이다. 또한, 상기 마커 단백질은 혈액에서 검출이 가능하기 때문에 생검(biopsy)을 통하지 않아 환자에게 불편을 초래하지 않으면서 간편한 방법으로 유방암을 진단하는데 활용될 수 있다.

본 발명의 다른 태양에 따라, 본 발명은 삼중 사극자 질량분석기를 이용한 다중 반응 모니터링을 통해 혈액 시료에서 상기 아포리포단백질 (a)를 검출하는 방법을 제공한다.

바람직하게는, 본 방법은

1) 피검자의 혈액 시료 및 대조군 혈액 시료의 단백질을 펩티드 절편으로 만드는 단계;

2) 상기 펩티드 절편을 삼중 사극자 질량분석기에 주입하여 아포리포단백질 (a)를 대표하는 타깃 펩티드에 대해 다중 반응 모니터링을 수행하는 단계;

3) 상기 다중 반응 모니터링 결과를 내부 표준물질에 대한 비율로 표시하는 단계; 및

4) 피검자와 대조군에 대한 검출 결과를 비교하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 피검자의 혈액 시료를 채취하고, 상기 아포리포단백질 (a)를 피검자의 혈액 시료에서 MRM법으로 검출하여 비환자 대조군의 검출 결과에 비교하여 아포리포단백질 (a)의 양의 증가 여부를 확인함으로써 유방암의 발병 여부를 확인할 수 있다.

본 발명의 목적상, 타깃 단백질을 MRM 법으로 검출하기위해서는 각 단백질을 대표할 수 있는 특정 펩티드의 선정과 각 펩티드의 MRM 모니터링 타깃인 어미이온/딸이온 쌍의 선정이 선행되어야 한다. 본 발명의 아포리포단백질 (a)를 대표하는 타깃 펩티드는 서열 번호 2의 서열을 가지며, 타깃 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍은 각각 m/z 521.8과 m/z 634.3이다. 또한 타깃 단백질을 검출하기 위해 MRM법으로 모니터링하는 일부 아미노산이 안정한 동위원소로 치환된 특정 펩티드를 합성하고 MRM 분석시 내부 표준물질로 사용하면 타깃 단백질의 혈액내 절대량도 측정할 수 있어 더욱 정확한 분석 결과를 도출할 수 있다. 본 발명에 있어서 내부 표준물질은 MRM 분석시 일반적으로 사용되는 임의의 내부 표준물질이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 대장균 베타 갈락토시다아제가 사용될 수 있다. 타깃 단백질의 혈액 내 절대량을 측정하기 위해 일부 아미노산이 안정한 동위원소로 치환된 특정 펩티드를 내부 표준물질로서 합성할 경우, 동위 원소로 치환된 아미노산은 리신 (Lysine)이나 아르기닌 (Arginine)이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 합성된 펩티드는 95% 이상 순수 분리된 펩티드를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 아포리포단백질 (a)를 MRM법을 사용하여 검출하는 방법은 환자의 혈액을 이용하는 새로운 진단도구로서 민감도가 우수할 뿐만 아니라 항원 항체를 이용하는 기존의 면역 화학적 방법보다 검출하고자 하는 단백질에 대한 선택성이 매우 높고 생검을 이용하지 않고 혈액을 대상으로 간편하게 분석할 수 있어, 유방암의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 MRM법을 이용하여 아포리포단백질 (a)를 혈액 시료에서 검출하기 위한 진단 키트를 제공한다. 본 진단 키트는 MRM법을 이용하여 아포리포단백질 (a)를 검출하기 위해 필요한 아포리포단백질 (a)의 타깃 펩티드 및 타깃 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍에 대한 정보를 포함하며, 당분야에서 질량 분석에 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다.

한편, 아포리포단백질 (a)는 MRM법을 통해서 뿐만 아니라, 항원-항체 결합 반응을 통해서도 혈액 시료에서 검출될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 태양에 따라, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 아포리포단백질 (a)에 특이적인 항체를 포함하여 혈액 시료에서 아포리포단백질 (a)를 검출하기 위한 유방암 진단시약 및 유방암 진단키트를 제공한다.

아포리포단백질 (a)에 선택적으로 결합하는 항체를 제조하기 위해서는 아포리포단백질 (a)의 입수가 선행되어야 하며, 이는 서열번호 1의 아미노산 서열을 이용하여 합성하거나 유전자 재조합을 이용하여 미생물에서 생산할 수 있고, 또는 혈액으로부터 직접 분리하여 준비할 수도 있다.

본 발명의 목적상, 상기 항체는 아포리포단백질 (a)의 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함할 수 있으나, 항원과 보다 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체가 바람직하다.

다클론 항체는 당업자에 알려진 종래 방법에 따라 면역원(antigen)으로 아포리포단백질 (a) 또는 그의 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 이러한 외부 숙주로는 마우스, 랫트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 예로 들 수 있으며, 면역원은 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 근육내, 복강내 또는 피하주사 등의 방법으로 투여되어 외부 숙주를 면역화시킨다. 면역화된 외부 숙주로부터 정기적으로 혈청을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리, 정제하여 아포리포단백질 (a)에 특이적인 다클론 항체를 제조할 수 있다.

단클론 항체는 당업자에 알려진 융합(fusion)에 의한 불멸화된 세포주 생성방법(Kohler G. et al., Nature, 256: 495-497, 1975)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법을 간략히 설명하면, 먼저 순수한 아포리포단백질 (a) 또는 그의 단편으로 마우스를 면역시키거나, 이의 펩티드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 마우스에 면역시킨다. 면역이 된 마우스로부터 분리한 항체-생산 B 임파구를 인간 또는 마우스의 골수종세포와 융합하여 불멸화된 하이브리도마 세포를 생성한다. 이어, 효소면역분석법(ELISA; Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)으로 하이브리도마 세포의 단클론 항체의 생성 여부를 조사하여 양성 클론을 선발하고 이를 배양한 후 항체를 분리, 정제하거나 쥐의 복강에 주입한 후 복수를 채취하여 아포리포단백질 (a)에 특이적인 단클론 항체를 제조할 수 있다.

본 발명의 아포리포단백질 (a)의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 유방암 진단키트에는 아포리포단백질 (a)를 선택적으로 인지하는 항체뿐만 아니라 당분야에서 면역학적 분석에 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 유방암 진단키트는 아포리포단백질 (a)에 특이적인 항체; 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 이차항체 접합체(conjugate); 상기 표지체와 발색 반응할 발색기질 용액; 세척액; 및 효소반응 정지용액을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 유방암 진단키트는 아포리포단백질 (a) 표준 항원을 포함하는 양성 대조군과 상기 항원이 주입되지 않은 동물의 항혈청을 포함하는 음성 대조군을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 유방암 진단키트는 항원-항체 결합반응을 통하여 항체 단백질에 대한 항원을 정량 또는 정성적으로 분석함으로써 유방암을 진단할 수 있으며, 상기 항원-항체 결합반응은 통상의 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immnohistochemical staining), 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 등의 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 검체 및 대조군을 표면에 코팅시킨 96-웰 마이크로타이터 플레이트 등을 이용하여 재조합 단클론 항체 단백질과 반응하는 ELISA를 수행하도록 상기 진단키트를 제공할 수 있다.

항원-항체 결합반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(Well plate), 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있다.

이차항체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(폴리 L-라이신-플루오르세인 아이소티오시아네이트), RITC(로다민-B-아이소티오시아네이트) 등의 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye) 등의 표지체가 사용될 수 있다.

발색을 유도하기 위한 발색기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB(3,3',5,5'-테트라메틸 베지딘), ABTS[2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)], OPD(o-페닐렌다이아민) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색기질은 완충용액(0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 이차항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고, 이 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 상기 아포리포단백질 (a) 항원의 존재 유무를 검출한다.

세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액, 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20으로 구성된 완충용액(PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 이차항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 첨가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 황산용액(H₂SO₄)이 바람직하게 사용될 수 있다.

아울러, 본 발명의 또 다른 태양은 유방암 단백질 마커로서 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 아포리포단백질 (a)에 특이적인 항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 혈액 시료에서 아포리포단백질 (a)를 검출하는 방법을 제공한다.

상기 검출방법은 혈액내 단백질을 고정화시키거나 전기영동(SDS-PAGE)으로 분리시킨 후 PVDF 막으로 전이시키고 아포리포단백질 (a)를 선택적으로 인지하는 항체와 접촉시켜 항원-항체 결합반응을 통해 아포리포단백질 (a)의 존재를 간접적으로 확인하는 것을 포함한다. 상기 항원-항체 결합반응으로는 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(RIA), 샌드위치 측정, 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법, 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 등을 예로 들 수 있다. 시료로서는 혈청, 혈장 또는 혈액을 사용할 수 있고, 혈장이 가장 바람직하다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 검출방법은,

1) 피검자의 혈액 시료 및 대조군 혈액 시료의 단백질을 고정체에 코팅하거나 고정시키는 단계;

2) 상기 고정체에 아포리포단백질 (a)에 특이적인 항체를 첨가하여 항원-항체 결합반응을 수행하는 단계;

3) 상기 항원-항체 결합반응을 통해 생성된 항원-항체 결합반응물을 이차항체 접합체(conjugate) 및 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및

4) 피검자 혈액 시료와 대조군 혈액 시료에 대한 검출 결과를 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 검출방법을 구체적으로 설명하면, 먼저 혈액 시료로부터 혈장단백질을 분자량에 따라 분리한다. 아포리포단백질 (a)는 분자량이 501 kDa이므로 8 % 폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 전기영동을 수행하고, 이로부터 분리된 단백질들을 PVDF 막과 같은 고정체로 전이시켜 고정한다. 이어, 고정된 단백질 항원에 아포리포단백질 (a)에 특이적인 항체를 가하여 항원-항체 결합반응을 수행한다. 혈액 시료에 아포리포단백질 (a)가 존재한다면, 상기 단백질이 고정된 막에 아포리포단백질 (a) 특이적인 항체가 가해졌을 때 항원-항체 결합반응이 일어나게 된다. 아포리포단백질 (a)와 이에 대한 항체의 결합 정도를 측정하기 위해서, 아포리포단백질 (a) 항체에 친화성을 갖는 이차항체, 예컨대 항-인간 IgG-HRP와 결합시키는 단계를 수행하는데, 이차항체에 접합된 HRP(horseradish peroxidase)가 기질인 ECL(enhanced chemiluminescence)과 반응하여 발색반응을 일으키는지의 여부와 그 정도를 대조군과 비교함으로써 혈액 시료내 유방암 진단 마커인 아포리포단백질 (a)의 존재 여부 및 대조군에 비교한 그 양의 증가 여부를 검출하게 된다.

한편, 아포리포단백질 (a)에 특이적인 항체를 생물학적 마이크로칩(biological microchip) 상에 고정시킨 후 대상자로부터 분리된 혈액 시료와 반응시켜 상기 항체 단백질에 대한 항원을 검출할 수 있는 생물학적 마이크로칩 및 자동화된 미세배열 시스템(microarray system)을 이용하면, 한 번의 분석으로 대량의 시료를 분석할 수 있는 장점이 있다. 따라서, 본 발명은 아포리포단백질 (a)에 특이적으로 결합하는 항체가 고형 기질에 집적된 바이오칩을 제공한다. 바이오칩의 고형 기질의 예로는 플라스틱, 유리, 금속, 실리콘 등을 들 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 유방암 진단용 마커 단백질인 아포리포단백질 (a)를 혈액 시료에서 MRM법을 통해 검출하는 방법은 환자의 혈액을 이용하는 새로운 진단도구로서 민감도가 우수할 뿐만 아니라 항원 항체를 이용하는 기존의 면역 화학적 방법보다 검출하고자 하는 단백질에 대한 선택성이 매우 높고 생검을 이용하지 않고 혈액을 대상으로 간편하게 분석할 수 있어, 유방암의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있는 한편, 아포리포단백질 (a)의 항체를 이용한 유방암 진단키트 및 진단 방법 또한 비교적 채취가 용이한 혈액을 시료로 하기 때문에 생검을 대상으로 하는 기존의 유방암 진단방법과는 달리 환자에게 부담을 주지 않고 매우 간편하게 유방암을 진단할 수 있을 뿐만 아니라 진단의 정확도 및 민감도가 높아 유방암의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 서열번호 1로 제시된 아포리포단백질 (a)의 트립틱 펩티드중 하나인 서열번호 2의 펩티드를 삼중사극자 질량분석기를 이용한 다중반응 모니터링 법으로 정량 분석한 MRM 크로마토그램을 나타낸 도이다.
도　2a 및 2b는 아포리포단백질 (a) 마커 단백질을 80명의 유방암 환자와 80명의 비 환자 대조군에 대해 다중반응 모니터링 법으로 측정한 항원의 농도 (내부표준물질로 사용한 대장균 베타-갈락토시다아제에 대한 비율)를 나타낸 도이다.
a: 상자도표; 및,
b: ROC 곡선.
도　3a 및 3b는 아포리포단백질 (a) 마커 단백질을 37명의 1기 유방암 환자와 80명의 비 환자 대조군에 대해 다중반응 모니터링 법으로 측정한 항원의 농도 (내부표준물질로 사용한 대장균 베타-갈락토시다아제에 대한 비율)를 나타낸 도이다.
a: 상자도표; 및,
b: ROC 곡선.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 다중 반응 모니터링 (Multiple Reaction Monitoring; MRM)법을 이용한 유방암 진단을 위한 아포리포단백질 (a)의 검출

본 발명자들은 상기 서열번호 1에 제시된 아포리포단백질 (a)가 혈액에서 유방암의 선택적 진단을 위한 마커로서 사용될 수 있는지를 확인하기 위하여 다음과 같이 삼중 사극자 질량분석기를 이용한 다중 반응 모니터링법을 통해 정량분석하는 방법을 사용하였다 (Anderson L. et al., Mol Cell Proteomics, 5: 375-88, 2006). MRM이란 질량분석기를 이용한 정량에 주로 사용되는 방법으로 관심 있는 어미이온으로부터 생성된 특정 딸이온을 관찰하여 정보를 얻는 방법이다. 예를 들어 m/z 1000을 갖는 여러 개의 어미이온 중 단 한 개의 이온만이 m/z 500의 딸이온을 갖는다면 이러한 이온을 추적하기 위해 m/z 1000을 갖는 어미이온을 선택하여 단편화 시키고 m/z 500의 딸이온을 조사하는 것이 MRM이다.

1.1 시료의 준비

아포리포단백질 (a)의 유방암 진단 효율성을 확인하기 위해 유방암 환자 80명과 비 환자 대조군 80명으로부터 얻은 혈액 시료에서의 단백질 발현 정도를 확인하고, 통계 처리하여 아포리포단백질 (a)의 유방암 진단 효율을 확인하였다. 160 명으로부터 얻은 혈액으로부터 각각 200 ㎍의 단백질 시료를 준비하였다. 준비된 각 시료에 10 mM의 디티오트레이톨(Dithiothreitol)을 처리하여 1 시간 반응시켜, 단백질을 펩티드 절편으로 만드는 과정을 방해할 수 있는 단백질내 아미노산중 시스틴의 씨올 (thiol-)잔기간의 결합을 끊어 주었다. 이렇게 끊어준 씨올 결합은 60 mM의 이오도아세트아미드(iodoacetamide)를 처리한 후 빛이 들어오지 않는 곳에서 1시간 동안 반응시켜 씨올 잔기간의 재결합을 막아 주었다. 준비된 단백질 시료에 전체 단백질 200 ㎍의 1/50에 해당하는 양인 4 ㎍의 트립신 20 ㎕ (Promega, USA)을 첨가하고 37℃에서 16시간 동안 처리하여 다수의 펩티드 절편으로 분리하였다. 이렇게 얻은 펩티드 절편은 C18 cartridge를 이용하여 염을 제거함으로써 질량 분석을 위한 최종 시료로 준비하였다.

1.2 삼중 사극자 질량분석기를 이용한 다중 반응 모니터링 수행

MRM 분석을 위해서는 특정 단백질을 대표할 수 있는 펩티드의 선정과 그 펩티드로부터 단편화를 통해 생성된 딸이온, 즉 타깃 펩티드를 효과적으로 모니터링 할 수 있는 어미이온과 딸이온의 쌍을 먼저 선정해야 한다. 서열번호 1로 제시된 아포리포단백질 (a)의 어미이온과 딸이온 쌍을 선정하기위해 혈액 시료를 바로 텐덤 질량 분석하여 아포리포단백질 (a)를 동정하였다. 이 텐덤 질량분석 스펙트럼으로부터 아포리포단백질 (a)를 대표할 수 있는 서열번호 2의 펩티드를 선정하였고, 이 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍을 선정하여 표 1에 제시하였다.

타깃단백질	타깃펩티드	MRM transition (m/z)		MRM ratio (cancer/normal)
		어미이온	딸이온	유방암	1기 유방암
아포리포단백질 (a)	GTYSTTVTGR	521.8	634.3	1.35	2.01
대장균 베타-갈락토시다아제	GDFQFNISR	542.3	636.3	내부표준물질

실시예 1-1에서 준비된 최종 시료를 역상 수지 크로마토그래피에 걸어 혈장 펩티드 절편을 분리하였고, 삼중 사극자 질량분석기(기기: 5500 Qtrap, AB Sciex, USA)를 사용해 각 펩티드의 MRM 스펙트럼을 얻었다. 이때, 역상 수지 크로마토그래피는 HALO^TM C18 컬럼 (Eksigent, USA) 컬럼으로 45분간 5%~40%의 아세토니트릴 농도 구배를 이용하여 실시하였다. MultiQuant^TM 컴퓨터 정량 분석 프로그램 (AB Sciex, USA)으로 타깃 펩티드의 MRM 크로마토그램의 피크 면적을 계산하여 정량 정보를 확인하였다 (도 1). 이때 각 타깃 펩티드의 정량값은 내부 표준물질로 넣어준 대장균 베타-갈락토시다아제 (표 1)의 MRM 크로마토그램의 피크 면적에 대한 비율로 표시하였다. 각 펩티드의 MRM 크로마토그램 면적비를 구함으로써 유방암 환자와 비 환자 대조군 사이에 단백질 발현량의 차이를 확인할 수 있었다.

상기 방법으로 측정된 아포리포단백질 (a)의 농도를 그래프로 도시하였다. 구체적으로, 서열번호 1로 제시된 아포리포단백질 (a)를 80명의 유방암 환자와 80명의 비 환자 대조군에 대해 정량 분석하여 도 2a에서 나타난 바와 같이 상자도표로 도시한 결과, 상기 마커 단백질이 비환자 대조군에 비해 유방암 환자군에서 1.35배 증가함을 확인하였다. 이를 도 2b에서 나타난 바와 같이 수용자-조작 특성(ROC) 그래프로 도시한 결과, 상기 마커 단백질의 AUC(area under the curve)는 0.64로 나타났다. 또한, 80%의 특이도에서 37.5%의 민감도를 보여 상기 분석이 기존의 유방암 표지 마커에 비해 높은 민감성과 정확성을 갖추고 있음을 알 수 있었다.

더불어, 상기 아포리포단백질 (a)를 37명의 1기 유방암 환자와 80명의 비 환자 대조군간의 발현량을 비교한 결과, 도 3a에서 상자도표로 도시한 바와 같이 상기 마커 단백질이 비환자 대조군에 비해 1기 유방암 환자군에서 2.01배 증가함을 확인하였다. 이를 도 3b에서 나타난 바와 같이 수용자-조작 특성(ROC) 그래프로 도시한 결과, 상기 마커 단백질의 AUC(area under the curve)는 0.73으로 나타났다. 또한, 80%의 특이도에서 51.35%의 민감도를 보여 상기 분석이 초기 유방암 환자의 진단에 매우 효과적임을 알 수 있었다.

참고로, ROC 그래프는 관찰된 데이터의 전 범위에 걸친 판정 역치를 연속적으로 변화시켜 수득되는 모든 감수성/특이성 쌍의 그래프로 주로 시험의 정확도를 나타낸다(Zweig et al ., Clin . Chem. 39:561-577, 1993).

<110> Biomedieng Co., Ltd. <120> PROTEIN MARKER APOLIPOPROTEIN (a) FOR BREAST CANCER DIAGNOSIS, METHOD OF DETECTING THE SAME, AND DIAGNOSIS KIT FOR BREAST CANCER USING ANTIBODY AGAINST THE SAME <130> SDP50347 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4548 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu His Lys Glu Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Lys Ser 1 5 10 15 Ala Ala Pro Glu Gln Ser His Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp 20 25 30 Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Tyr Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr 35 40 45 Cys Gln Ala Trp Ser Ser Met Thr Pro His Gln His Asn Arg Thr Thr 50 55 60 Glu Asn Tyr Pro Asn Ala Gly Leu Ile Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro 65 70 75 80 Asp Ala Val Ala Ala Pro Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Pro Gly Val Arg 85 90 95 Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Thr Gln Cys Ser Asp Ala Glu Gly Thr Ala 100 105 110 Val Ala Pro Pro Thr Val Thr Pro Val Pro Ser Leu Glu Ala Pro Ser 115 120 125 Glu Gln Ala Pro Thr Glu Gln Arg Pro Gly Val Gln Glu Cys Tyr His 130 135 140 Gly Asn Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Tyr Ser Thr Thr Val Thr Gly 145 150 155 160 Arg Thr Cys Gln Ala Trp Ser Ser Met Thr Pro His Ser His Ser Arg 165 170 175 Thr Pro Glu Tyr Tyr Pro Asn Ala Gly Leu Ile Met Asn Tyr Cys Arg 180 185 190 Asn Pro Asp Ala Val Ala Ala Pro Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Pro Gly 195 200 205 Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Thr Gln Cys Ser Asp Ala Glu Gly 210 215 220 Thr Ala Val Ala Pro Pro Thr Val Thr Pro Val Pro Ser Leu Glu Ala 225 230 235 240 Pro Ser Glu Gln Ala Pro Thr Glu Gln Arg Pro Gly Val Gln Glu Cys 245 250 255 Tyr His Gly Asn Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Tyr Ser Thr Thr Val 260 265 270 Thr Gly Arg Thr Cys Gln Ala Trp Ser Ser Met Thr Pro His Ser His 275 280 285 Ser Arg Thr Pro Glu Tyr Tyr Pro Asn Ala Gly Leu Ile Met Asn Tyr 290 295 300 Cys Arg Asn Pro Asp Ala Val Ala Ala Pro Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp 305 310 315 320 Pro Gly Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Thr Gln Cys Ser Asp Ala 325 330 335 Glu Gly Thr Ala Val Ala Pro Pro Thr Val Thr Pro Val Pro Ser Leu 340 345 350 Glu Ala Pro Ser Glu Gln Ala Pro Thr Glu Gln Arg Pro Gly Val Gln 355 360 365 Glu Cys Tyr His Gly Asn Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Tyr Ser Thr 370 375 380 Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln Ala Trp Ser Ser Met Thr Pro His 385 390 395 400 Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Tyr Tyr Pro Asn Ala Gly Leu Ile Met 405 410 415 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Val Ala Ala Pro Tyr Cys Tyr Thr 420 425 430 Arg Asp Pro Gly Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Thr Gln Cys Ser 435 440 445 Asp Ala Glu Gly Thr Ala Val Ala Pro Pro Thr Val Thr Pro Val Pro 450 455 460 Ser Leu Glu Ala Pro Ser Glu Gln Ala Pro Thr Glu Gln Arg Pro Gly 465 470 475 480 Val Gln Glu Cys Tyr His Gly Asn Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Tyr 485 490 495 Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln Ala Trp Ser Ser Met Thr 500 505 510 Pro His Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Tyr Tyr Pro Asn Ala Gly Leu 515 520 525 Ile Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Val Ala Ala Pro Tyr Cys 530 535 540 Tyr Thr Arg Asp Pro Gly Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Thr Gln 545 550 555 560 Cys Ser Asp Ala Glu Gly Thr Ala Val Ala Pro Pro Thr Val Thr Pro 565 570 575 Val Pro Ser Leu Glu Ala Pro Ser Glu Gln Ala Pro Thr Glu Gln Arg 580 585 590 Pro Gly Val Gln Glu Cys Tyr His Gly Asn Gly Gln Ser Tyr Arg Gly 595 600 605 Thr Tyr Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln Ala Trp Ser Ser 610 615 620 Met Thr Pro His Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Tyr Tyr Pro Asn Ala 625 630 635 640 Gly Leu Ile Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Val Ala Ala Pro 645 650 655 Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Pro Gly Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu 660 665 670 Thr Gln Cys Ser Asp Ala Glu Gly Thr Ala Val Ala Pro Pro Thr Val 675 680 685 Thr Pro Val Pro Ser Leu Glu Ala Pro Ser Glu Gln Ala Pro Thr Glu 690 695 700 Gln Arg Pro Gly Val Gln Glu Cys Tyr His Gly Asn Gly Gln Ser Tyr 705 710 715 720 Arg Gly Thr Tyr Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln Ala Trp 725 730 735 Ser Ser Met Thr Pro His Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Tyr Tyr Pro 740 745 750 Asn Ala Gly Leu Ile Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Val Ala 755 760 765 Ala Pro Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Pro Gly Val Arg Trp Glu Tyr Cys 770 775 780 Asn Leu Thr Gln Cys Ser Asp Ala Glu Gly Thr Ala Val Ala Pro Pro 785 790 795 800 Thr Val Thr Pro Val Pro Ser Leu Glu Ala Pro Ser Glu Gln Ala Pro 805 810 815 Thr Glu Gln Arg Pro Gly Val Gln Glu Cys Tyr His Gly Asn Gly Gln 820 825 830 Ser Tyr Arg Gly Thr Tyr Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln 835 840 845 Ala Trp Ser Ser Met Thr Pro His Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Tyr 850 855 860 Tyr Pro Asn Ala Gly Leu Ile Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala 865 870 875 880 Val Ala Ala Pro Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Pro Gly Val Arg Trp Glu 885 890 895 Tyr Cys Asn Leu Thr Gln Cys Ser Asp Ala Glu Gly Thr Ala Val Ala 900 905 910 Pro Pro Thr Val Thr Pro Val Pro Ser Leu Glu Ala Pro Ser Glu Gln 915 920 925 Ala Pro Thr Glu Gln Arg Pro Gly Val Gln Glu Cys Tyr His Gly Asn 930 935 940 Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Tyr Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr 945 950 955 960 Cys Gln Ala Trp Ser Ser Met Thr Pro His Ser His Ser Arg Thr Pro 965 970 975 Glu Tyr Tyr Pro Asn Ala Gly Leu Ile Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro 980 985 990 Asp Ala Val Ala Ala Pro Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Pro Gly Val Arg 995 1000 1005 Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Thr Gln Cys Ser Asp Ala Glu Gly Thr Ala 1010 1015 1020 Val Ala Pro Pro Thr Val Thr Pro Val Pro Ser Leu Glu Ala Pro Ser 1025 1030 1035 1040 Glu Gln Ala Pro Thr Glu Gln Arg Pro Gly Val Gln Glu Cys Tyr His 1045 1050 1055 Gly Asn Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Tyr Ser Thr Thr Val Thr Gly 1060 1065 1070 Arg Thr Cys Gln Ala Trp Ser Ser Met Thr Pro His Ser His Ser Arg 1075 1080 1085 Thr Pro Glu Tyr Tyr Pro Asn Ala Gly Leu Ile Met Asn Tyr Cys Arg 1090 1095 1100 Asn Pro Asp Ala Val Ala Ala Pro Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Pro Gly 1105 1110 1115 1120 Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Thr Gln Cys Ser Asp Ala Glu Gly 1125 1130 1135 Thr Ala Val Ala Pro Pro Thr Val Thr Pro Val Pro Ser Leu Glu Ala 1140 1145 1150 Pro Ser Glu Gln Ala Pro Thr Glu Gln Arg Pro Gly Val Gln Glu Cys 1155 1160 1165 Tyr His Gly Asn Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Tyr Ser Thr Thr Val 1170 1175 1180 Thr Gly Arg Thr Cys Gln Ala Trp Ser Ser Met Thr Pro His Ser His 1185 1190 1195 1200 Ser Arg Thr Pro Glu Tyr Tyr Pro Asn Ala Gly Leu Ile Met Asn Tyr 1205 1210 1215 Cys Arg Asn Pro Asp Ala Val Ala Ala Pro Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp 1220 1225 1230 Pro Gly Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Thr Gln Cys Ser Asp Ala 1235 1240 1245 Glu Gly Thr Ala Val Ala Pro Pro Thr Val Thr Pro Val Pro Ser Leu 1250 1255 1260 Glu Ala Pro Ser Glu Gln Ala Pro Thr Glu Gln Arg Pro Gly Val Gln 1265 1270 1275 1280 Glu Cys Tyr His Gly Asn Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Tyr Ser Thr 1285 1290 1295 Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln Ala Trp Ser Ser Met Thr Pro His 1300 1305 1310 Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Tyr Tyr Pro Asn Ala Gly Leu Ile Met 1315 1320 1325 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Val Ala Ala Pro Tyr Cys Tyr Thr 1330 1335 1340 Arg Asp Pro Gly Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Thr Gln Cys Ser 1345 1350 1355 1360 Asp Ala Glu Gly Thr Ala Val Ala Pro Pro Thr Val Thr Pro Val Pro 1365 1370 1375 Ser Leu Glu Ala Pro Ser Glu Gln Ala Pro Thr Glu Gln Arg Pro Gly 1380 1385 1390 Val Gln Glu Cys Tyr His Gly Asn Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Tyr 1395 1400 1405 Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln Ala Trp Ser Ser Met Thr 1410 1415 1420 Pro His Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Tyr Tyr Pro Asn Ala Gly Leu 1425 1430 1435 1440 Ile Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Val Ala Ala Pro Tyr Cys 1445 1450 1455 Tyr Thr Arg Asp Pro Gly Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Thr Gln 1460 1465 1470 Cys Ser Asp Ala Glu Gly Thr Ala Val Ala Pro Pro Thr Val Thr Pro 1475 1480 1485 Val Pro Ser Leu Glu Ala Pro Ser Glu Gln Ala Pro Thr Glu Gln Arg 1490 1495 1500 Pro Gly Val Gln Glu Cys Tyr His Gly Asn Gly Gln Ser Tyr Arg Gly 1505 1510 1515 1520 Thr Tyr Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln Ala Trp Ser Ser 1525 1530 1535 Met Thr Pro His Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Tyr Tyr Pro Asn Ala 1540 1545 1550 Gly Leu Ile Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Val Ala Ala Pro 1555 1560 1565 Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Pro Gly Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu 1570 1575 1580 Thr Gln 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Arg Pro Gly Val Gln 2180 2185 2190 Glu Cys Tyr His Gly Asn Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Tyr Ser Thr 2195 2200 2205 Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln Ala Trp Ser Ser Met Thr Pro His 2210 2215 2220 Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Tyr Tyr Pro Asn Ala Gly Leu Ile Met 2225 2230 2235 2240 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Val Ala Ala Pro Tyr Cys Tyr Thr 2245 2250 2255 Arg Asp Pro Gly Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Thr Gln Cys Ser 2260 2265 2270 Asp Ala Glu Gly Thr Ala Val Ala Pro Pro Thr Val Thr Pro Val Pro 2275 2280 2285 Ser Leu Glu Ala Pro Ser Glu Gln Ala Pro Thr Glu Gln Arg Pro Gly 2290 2295 2300 Val Gln Glu Cys Tyr His Gly Asn Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Tyr 2305 2310 2315 2320 Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln Ala Trp Ser Ser Met Thr 2325 2330 2335 Pro His Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Tyr Tyr Pro Asn Ala Gly Leu 2340 2345 2350 Ile Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Val Ala Ala Pro Tyr Cys 2355 2360 2365 Tyr Thr Arg Asp Pro Gly Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Thr Gln 2370 2375 2380 Cys Ser Asp Ala Glu Gly Thr Ala Val Ala Pro Pro Thr Val Thr Pro 2385 2390 2395 2400 Val Pro Ser Leu Glu Ala Pro Ser Glu Gln Ala Pro Thr Glu Gln Arg 2405 2410 2415 Pro Gly Val Gln Glu Cys Tyr His Gly Asn Gly Gln Ser Tyr Arg Gly 2420 2425 2430 Thr Tyr Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln Ala Trp Ser Ser 2435 2440 2445 Met Thr Pro His Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Tyr Tyr Pro Asn Ala 2450 2455 2460 Gly Leu Ile Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Val Ala Ala Pro 2465 2470 2475 2480 Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Pro Gly Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu 2485 2490 2495 Thr Gln Cys Ser Asp Ala Glu Gly Thr Ala Val Ala Pro Pro Thr Val 2500 2505 2510 Thr Pro Val Pro Ser Leu Glu Ala Pro Ser Glu Gln Ala Pro Thr Glu 2515 2520 2525 Gln Arg Pro Gly Val Gln Glu Cys Tyr His Gly Asn Gly Gln Ser Tyr 2530 2535 2540 Arg Gly Thr Tyr Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln Ala Trp 2545 2550 2555 2560 Ser Ser Met Thr Pro His Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Tyr Tyr Pro 2565 2570 2575 Asn Ala Gly Leu Ile Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Val Ala 2580 2585 2590 Ala Pro Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Pro Gly Val Arg Trp Glu Tyr Cys 2595 2600 2605 Asn Leu Thr Gln Cys Ser Asp Ala Glu Gly Thr Ala Val Ala Pro Pro 2610 2615 2620 Thr Val Thr Pro Val Pro Ser Leu Glu Ala Pro Ser Glu Gln Ala Pro 2625 2630 2635 2640 Thr Glu Gln Arg Pro Gly Val Gln Glu Cys Tyr His Gly Asn Gly Gln 2645 2650 2655 Ser Tyr Arg Gly Thr Tyr Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln 2660 2665 2670 Ala Trp Ser Ser Met Thr Pro His Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Tyr 2675 2680 2685 Tyr Pro Asn Ala Gly Leu Ile Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala 2690 2695 2700 Val Ala Ala Pro Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Pro Gly Val Arg Trp Glu 2705 2710 2715 2720 Tyr Cys Asn Leu Thr Gln Cys Ser Asp Ala Glu Gly Thr Ala Val Ala 2725 2730 2735 Pro Pro Thr Val Thr Pro Val Pro Ser Leu Glu Ala Pro Ser Glu Gln 2740 2745 2750 Ala Pro Thr Glu Gln Arg Pro Gly Val Gln Glu Cys Tyr His Gly Asn 2755 2760 2765 Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Tyr Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr 2770 2775 2780 Cys Gln Ala Trp Ser Ser Met Thr Pro His Ser His Ser Arg Thr Pro 2785 2790 2795 2800 Glu Tyr Tyr Pro Asn Ala Gly Leu Ile Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro 2805 2810 2815 Asp Ala Val Ala Ala Pro Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Pro Gly Val Arg 2820 2825 2830 Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Thr Gln Cys Ser Asp Ala Glu Gly Thr Ala 2835 2840 2845 Val Ala Pro Pro Thr Val Thr Pro Val Pro Ser Leu Glu Ala Pro Ser 2850 2855 2860 Glu Gln Ala Pro Thr Glu Gln Arg Pro Gly Val Gln Glu Cys Tyr His 2865 2870 2875 2880 Gly Asn Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Tyr Ser Thr Thr Val Thr Gly 2885 2890 2895 Arg Thr Cys Gln Ala Trp Ser Ser Met Thr Pro His Ser His Ser Arg 2900 2905 2910 Thr Pro Glu Tyr Tyr Pro Asn Ala Gly Leu Ile Met Asn Tyr Cys Arg 2915 2920 2925 Asn Pro Asp Ala Val Ala Ala Pro Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Pro Gly 2930 2935 2940 Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Thr Gln Cys Ser Asp Ala Glu Gly 2945 2950 2955 2960 Thr Ala Val Ala Pro Pro Thr Val Thr Pro Val Pro Ser Leu Glu Ala 2965 2970 2975 Pro Ser Glu Gln Ala Pro Thr Glu Gln Arg Pro Gly Val Gln Glu Cys 2980 2985 2990 Tyr His Gly Asn Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Tyr Ser Thr Thr Val 2995 3000 3005 Thr Gly Arg Thr Cys Gln Ala Trp Ser Ser Met Thr Pro His Ser His 3010 3015 3020 Ser Arg Thr Pro Glu Tyr Tyr Pro Asn Ala Gly Leu Ile Met Asn Tyr 3025 3030 3035 3040 Cys Arg Asn Pro Asp Ala Val Ala Ala Pro Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp 3045 3050 3055 Pro Gly Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Thr Gln Cys Ser Asp Ala 3060 3065 3070 Glu Gly Thr Ala Val Ala Pro Pro Thr Val Thr Pro Val Pro Ser Leu 3075 3080 3085 Glu Ala Pro Ser Glu Gln Ala Pro Thr Glu Gln Arg Pro Gly Val Gln 3090 3095 3100 Glu Cys Tyr His Gly Asn Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Tyr Ser Thr 3105 3110 3115 3120 Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln Ala Trp Ser Ser Met Thr Pro His 3125 3130 3135 Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Tyr Tyr Pro Asn Ala Gly Leu Ile Met 3140 3145 3150 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Val Ala Ala Pro Tyr Cys Tyr Thr 3155 3160 3165 Arg Asp Pro Gly Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Thr Gln Cys Ser 3170 3175 3180 Asp Ala Glu Gly Thr Ala Val Ala Pro Pro Thr Val Thr Pro Val Pro 3185 3190 3195 3200 Ser Leu Glu Ala Pro Ser Glu Gln Ala Pro Thr Glu Gln Arg Pro Gly 3205 3210 3215 Val Gln Glu Cys Tyr His Gly Asn Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Tyr 3220 3225 3230 Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln Ala Trp Ser Ser Met Thr 3235 3240 3245 Pro His Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Tyr Tyr Pro Asn Ala Gly Leu 3250 3255 3260 Ile Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Val Ala Ala Pro Tyr Cys 3265 3270 3275 3280 Tyr Thr Arg Asp Pro Gly Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Thr Gln 3285 3290 3295 Cys Ser Asp Ala Glu Gly Thr Ala Val Ala Pro Pro Thr Val Thr Pro 3300 3305 3310 Val Pro Ser Leu Glu Ala Pro Ser Glu Gln Ala Pro Thr Glu Gln Arg 3315 3320 3325 Pro Gly Val Gln Glu Cys Tyr His Gly Asn Gly Gln Ser Tyr Arg Gly 3330 3335 3340 Thr Tyr Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln Ala Trp Ser Ser 3345 3350 3355 3360 Met Thr Pro His Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Tyr Tyr Pro Asn Ala 3365 3370 3375 Gly Leu Ile Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Pro Val Ala Ala Pro 3380 3385 3390 Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu 3395 3400 3405 Thr Gln Cys Ser Asp Ala Glu Gly Thr Ala Val Ala Pro Pro Thr Ile 3410 3415 3420 Thr Pro Ile Pro Ser Leu Glu Ala Pro Ser Glu Gln Ala Pro Thr Glu 3425 3430 3435 3440 Gln Arg Pro Gly Val Gln Glu Cys Tyr His Gly Asn Gly Gln Ser Tyr 3445 3450 3455 Gln Gly Thr Tyr Phe Ile Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln Ala Trp 3460 3465 3470 Ser Ser Met Thr Pro His Ser His Ser Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Pro 3475 3480 3485 Asn Ala Gly Leu Ile Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Pro Val Ala 3490 3495 3500 Ala Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr Cys 3505 3510 3515 3520 Asn Leu Thr Arg Cys Ser Asp Ala Glu Trp Thr Ala Phe Val Pro Pro 3525 3530 3535 Asn Val Ile Leu Ala Pro Ser Leu Glu Ala Phe Phe Glu Gln Ala Leu 3540 3545 3550 Thr Glu Glu Thr Pro Gly Val Gln Asp Cys Tyr Tyr His Tyr Gly Gln 3555 3560 3565 Ser Tyr Arg Gly Thr Tyr Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln 3570 3575 3580 Ala Trp Ser Ser Met Thr Pro His Gln His Ser Arg Thr Pro Glu Asn 3585 3590 3595 3600 Tyr Pro Asn Ala Gly Leu Thr Arg Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala 3605 3610 3615 Glu Ile Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Met Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu 3620 3625 3630 Tyr Cys Asn Leu Thr Gln Cys Leu Val Thr Glu Ser Ser Val Leu Ala 3635 3640 3645 Thr Leu Thr Val Val Pro Asp Pro Ser Thr Glu Ala Ser Ser Glu Glu 3650 3655 3660 Ala Pro Thr Glu Gln Ser Pro Gly Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp 3665 3670 3675 3680 Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Ser Phe Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr 3685 3690 3695 Cys Gln Ser Trp Ser Ser Met Thr Pro His Trp His Gln Arg Thr Thr 3700 3705 3710 Glu Tyr Tyr Pro Asn Gly Gly Leu Thr Arg Asn Tyr Cys Arg Asn Pro 3715 3720 3725 Asp Ala Glu Ile Ser Pro Trp Cys Tyr Thr Met Asp Pro Asn Val Arg 3730 3735 3740 Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Thr Gln Cys Pro Val Thr Glu Ser Ser Val 3745 3750 3755 3760 Leu Ala Thr Ser Thr Ala Val Ser Glu Gln Ala Pro Thr Glu Gln Ser 3765 3770 3775 Pro Thr Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser Tyr Arg Gly 3780 3785 3790 Ser Phe Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln Ser Trp Ser Ser 3795 3800 3805 Met Thr Pro His Trp His Gln Arg Thr Thr Glu Tyr Tyr Pro Asn Gly 3810 3815 3820 Gly Leu Thr Arg Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Glu Ile Arg Pro 3825 3830 3835 3840 Trp Cys Tyr Thr Met Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu 3845 3850 3855 Thr Gln Cys Pro Val Met Glu Ser Thr Leu Leu Thr Thr Pro Thr Val 3860 3865 3870 Val Pro Val Pro Ser Thr Glu Leu Pro Ser Glu Glu Ala Pro Thr Glu 3875 3880 3885 Asn Ser Thr Gly Val Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asp Gly Gln Ser Tyr 3890 3895 3900 Arg Gly Thr Leu Ser Thr Thr Ile Thr Gly Arg Thr Cys Gln Ser Trp 3905 3910 3915 3920 Ser Ser Met Thr Pro His Trp His Arg Arg Ile Pro Leu Tyr Tyr Pro 3925 3930 3935 Asn Ala Gly Leu Thr Arg Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Glu Ile 3940 3945 3950 Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Met Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr Cys 3955 3960 3965 Asn Leu Thr Arg Cys Pro Val Thr Glu Ser Ser Val Leu Thr Thr Pro 3970 3975 3980 Thr Val Ala Pro Val Pro Ser Thr Glu Ala Pro Ser Glu Gln Ala Pro 3985 3990 3995 4000 Pro Glu Lys Ser Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Arg 4005 4010 4015 Ser Tyr Arg Gly Ile Ser Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln 4020 4025 4030 Ser Trp Ser Ser Met Ile Pro His Trp His Gln Arg Thr Pro Glu Asn 4035 4040 4045 Tyr Pro Asn Ala Gly Leu Thr Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ser 4050 4055 4060 Gly Lys Gln Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Cys Val Arg Trp Glu 4065 4070 4075 4080 Tyr Cys Asn Leu Thr Gln Cys Ser Glu Thr Glu Ser Gly Val Leu Glu 4085 4090 4095 Thr Pro Thr Val Val Pro Val Pro Ser Met Glu Ala His Ser Glu Ala 4100 4105 4110 Ala Pro Thr Glu Gln Thr Pro Val Val Arg Gln Cys Tyr His Gly Asn 4115 4120 4125 Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Phe Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr 4130 4135 4140 Cys Gln Ser Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Arg Thr Pro 4145 4150 4155 4160 Glu Asn Tyr Pro Asn Asp Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro 4165 4170 4175 Asp Ala Asp Thr Gly Pro Trp Cys Phe Thr Met Asp Pro Ser Ile Arg 4180 4185 4190 Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Thr Arg Cys Ser Asp Thr Glu Gly Thr Val 4195 4200 4205 Val Ala Pro Pro Thr Val Ile Gln Val Pro Ser Leu Gly Pro Pro Ser 4210 4215 4220 Glu Gln Asp Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Lys 4225 4230 4235 4240 Ala Thr Thr Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Glu Trp Ala Ala Gln Glu 4245 4250 4255 Pro His Arg His Ser Thr Phe Ile Pro Gly Thr Asn Lys Trp Ala Gly 4260 4265 4270 Leu Glu Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ile Asn Gly Pro 4275 4280 4285 Trp Cys Tyr Thr Met Asn Pro Arg Lys Leu Phe Asp Tyr Cys Asp Ile 4290 4295 4300 Pro Leu Cys Ala Ser Ser Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu 4305 4310 4315 4320 Pro Lys Lys Cys Pro Gly Ser Ile Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro 4325 4330 4335 His Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Lys His 4340 4345 4350 Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala 4355 4360 4365 His Cys Leu Lys Lys Ser Ser Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu 4370 4375 4380 Gly Ala His Gln Glu Val Asn Leu Glu Ser His Val Gln Glu Ile Glu 4385 4390 4395 4400 Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu Pro Thr Gln Ala Asp Ile Ala Leu Leu 4405 4410 4415 Lys Leu Ser Arg Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Met Pro Ala Cys 4420 4425 4430 Leu Pro Ser Pro Asp Tyr Met Val Thr Ala Arg Thr Glu Cys Tyr Ile 4435 4440 4445 Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Thr Gly Leu Leu Lys 4450 4455 4460 Glu Ala Gln Leu Leu Val Ile Glu Asn Glu Val Cys Asn His Tyr Lys 4465 4470 4475 4480 Tyr Ile Cys Ala Glu His Leu Ala Arg Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly 4485 4490 4495 Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu 4500 4505 4510 Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro 4515 4520 4525 Gly Val Tyr Ala Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu Gly Met 4530 4535 4540 Met Arg Asn Asn 4545 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Thr Tyr Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 3 Gly Asp Phe Gln Phe Asn Ile Ser Arg 1 5

Claims (23)

1) 피검자의 혈액 시료 및 대조군 혈액 시료의 단백질을 펩티드 절편으로 만드는 단계;
2) 상기 펩티드 절편을 삼중 사극자 질량분석기에 주입하여 아포리포단백질 (a)를 대표하는 서열 번호 2의 서열을 가지며, 타깃 펩티드의 어미이온과 딸이온은 각각 m/z 521.8과 m/z 634.3인 타깃 펩티드에 대해 다중 반응 모니터링을 수행하는 단계;
3) 상기 다중 반응 모니터링 결과를 내부 표준물질에 대한 비율로 표시하는 단계; 및
4) 피검자와 대조군에 대한 검출 결과를 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 삼중 사극자 질량분석기를 이용한 다중 반응 모니터링(Multiple Reaction Monitoring)을 통해 혈액 시료에서 서열 번호 1의 서열을 갖는 아포리포단백질 (a)를 선택적으로 검출하는 방법.

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제1항에 있어서, 내부 표준물질로서 대장균 베타-갈락토시다아제가 사용되며 대장균 베타-갈락토시다아제를 대표하는 타깃 펩티드는 서열 번호 3의 서열을 가지며 어미이온과 딸이온은 각각 m/z 542.3과 m/z 636.3인 것을 특징으로 하는 방법.

제1항에 있어서, 시료는 혈장 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.

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상기 제1항의 검출방법을 이용하여 혈액 시료에서 아포리포단백질 (a)를 검출하기 위해 필요한 아포리포단백질 (a)의 타깃 펩티드 및 타깃 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍에 대한 정보를 포함하는 유방암 진단 키트.

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