KR102473130B1

KR102473130B1 - 유방암 조기 진단용 바이오마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102473130B1
Application number: KR1020210002577A
Authority: KR
Inventors: 이준우; 문병인
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2021-01-08
Filing date: 2021-01-08
Publication date: 2022-11-30
Also published as: KR20220100293A

Abstract

본 발명은 유방암 조기 진단을 위한 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 혈청 내 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 N-당화 반응이 초기 유방암 마커임을 최초로 확인함에 따라, 혈청 내 AGP의 당화 반응을 렉틴을 이용하여 검출함으로써 유방암 초기 단계를 진단하는 방법으로, 상기 진단방법은 초기 유방암에 대한 우수한 특이도와 민감도로 나타내는 것이 확인됨에 따라, 유방암 환자의 조기 진단에 활용하여 유방암 초기 환자의 치료 효율 향상 및 유방암으로 인한 사망률 감소에 기여할 수 있다.

Description

유방암 조기 진단용 바이오마커 및 이의 용도{Biomarkers for Diagnosis Early Stage Breast Cancer and Uses Thereof}

본 발명은 유방암 조기 진단용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 혈청 내 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 N-당쇄를 포함하는 유방암 조기 진단용 바이오마커 및 이의 용도를 제공한다.

유방암은 전 세계적으로 두 번째로 빈번하게 발생하는 암이며, 여성암 중 가장 높은 발병 비율을 차지한다. 유방암은 여성암의 25%를 차지하는 암이다. 유방암의 원인은 유전적인 요인 및 후천적인 요인(환경적인 요소)가 있을 것으로 추정되나 정확한 원인은 아직까지 규명되지 않고 있다. 한편 여성호르몬인 에스트로겐이 유방암의 주요 원인으로 작용할 것이라 지목되고 있다. 2012년 통계에 따르면 168만 명의 유방암환자가 발생하였고 52만 명이 유방암으로 사망하였다. 유방암 환자의 5년 생존율은 암 발견당시 유방암의 중증도와 높은 연관이 있다. 0기 및 1기 유방암의 경우 5년 생존율은 98%에 이르고 2기의 경우 5년 생존율은 85%정도이다. 그러나 3기 환자의 경우 5년 생존율이 60%로 크게 감소하고 4기 환자의 경우 5년 생존율이 20%에 불과하다.

따라서, 유방암을 조기에 검출 하는 것은 환자의 치료 효율 및 생존율과 밀접한 연관을 가지고 있어 그 중요도가 높은 것으로 인식되고 있다.

유방촬영술(mammography)은 유방암을 진단하는데 가장 보편적으로 사용되고 있는 방법이다. 유방촬영술의 도입은 유방암으로 인한 사망을 15-25% 감소시킨 것으로 조사되었다. 그러나 유방촬영술의 경우 밀도가 높은 유방조직에서 진단의 정확도가 감소한다는 단점을 가진다. 특히, 유방촬영술(Mammography)이 무증상 여성에 대한 유방암 진단을 위해 사용되는 경우 엑스선을 이용한 촬영 결과물이 2차원 영상이므로 관심영역의 병변이 정상조직과 겹치게 되어 유방암 조기 진단의 중요한 요소인 유방 종괴(mass)의 검출이 힘든 문제점이 있었다.

또한, 유방 조직과 암에 대한 엑스선 흡수율 차이가 매우 작기 때문에 선별 능력이 낮아 유방 위양성(false positive) 또는 유방 위음성(false negative)이 발생할 확률이 높으며, 실제로 의료진단현장에서 유방 위양성(false positive) 진단이 30%에 달하고 있는 실정이다.

특히, 유방암이 있는데도 불구하고 정상 혹은 양성으로 판독하는 유방 위음성의 경우 유방암을 간과하여 늦게 진단하는 오류를 범하게 하므로 환자의 건강을 위협함과 동시에 의료사고에 따른 법적 문제를 일으키는 주원인이 되고 있다.

따라서, 유방암 진단에 있어서 위양성과 위음성의 확률을 줄여 불필요한 재촬영과 생검 등의 추가적인 검사가 필요하지 않도록 높은 정확성을 갖는 조기 유방암 진단 방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.

이를 위해 여러 연구들을 통해 유방암 환자의 선별을 위한 혈액마커로서 CEA(Carcinoembryonic antigen), CA15-3 및 순환 사이토케라틴 단편(TPA, TPS 및 CYFRA 21-1) 등이 제시되었으나 이들 마커들은 충분한 수준의 검출 민감도와 특이도를 제공하지 못하고 있는 실정이다.

유방암 환자 혈청의 글리코실화 프로파일을 분석할 때 시알화, 푸코실화 및 만노실화와 관련된 가지 구조의 주요 변화가 관찰되어 글리코실화의 변화가 림프절로의 전이 및 확장과 관련이 있음을 시사한다.

한편, AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)는 산성(pKa = 2.6)이고, 물에 잘 용해되는 인간 혈장의 당단백질로, 인간 혈장에서 가장 많이 글리코실화된 단백질 중 하나이며 분자량(41-43kDa)의 약 45%는 글리코실화로 구성된다. 혈장에서 AGP의 역할은 명확하지 않으나, 항염증 또는 면역 조절 활성을 갖는 것으로 알려져 있다.

AGP는 위치 15, 38, 54, 75 및 85에 5 개의 N-글리코실화 부위를 가지며, 다양한 정도의 분지(mono-, bi-, tri- and tetra-antennary glycans)를 가지고 있다. AGP의 글리코실화는 다양한 가지 구조와 다중 글리코실화 부위로 인해 높은 수준의 이질성(heterogeneity)을 보여준다.

AGP는 다양한 암에 대한 실험을 통해 암의 중증도와 유의한 상관 관계가 있는 것으로 밝혀졌으나, 혈청 AGP 수준의 변화와 유방암의 중증도의 상관 관계는 연구된 바가 없다.

대한민국공개특허 제2013-0102693호 (2013.09.23 공개)

이러한 상황하에서, 여성암 중 가장 높은 비율을 차지하는 암인 유방암은 조기 진단이 5년 생존율을 결정하는 중요한 요소이나, 아직까지 유방암 초기 환자를 높은 수준의 정확도로 검출할 수 있는 마커가 존재하지 못함에 따라, 본 발명자들은 초기 유방암을 신속하고 정확하게 조기 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 유방암 환자 혈청 내 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 글리코실화(glycosylation) 변화가 유방암 진행 단계를 모니터링하는 데 중요한 지표로 적용할 수 있음을 발견하였다. 이에, 유방암 환자 혈청 내 AGP의 글리코실화를 유방암 조기 진단용 바이오마커로 간주하고, 코팅된 항-AGP 항체를 이용하여 유방암 환자 혈청에서 AGP를 포획하고, 포획된 AGP의 N-글리코실화를 렉틴을 이용하여 검출한 경우, 유방암의 중증도에 따라, 특히, 초기 단계의 유방암 환자를 효과적으로 선별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 일 목적은, 혈청 내 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 N-당쇄를 포함하는 유방암 조기 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은, 혈청 내 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 N-당쇄를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 유방암 조기 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 혈청 내 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 N-당쇄를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 유방암 조기 진단용 키트를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 유방암 조기 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 데 있다.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 혈청 내 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 N-당쇄를 포함하는 유방암 조기 진단용 바이오마커 조성물 및 유방암 조기 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 상기 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 N-당쇄가, 양성 유방종(benign) 및 유방암(breast cancer) 병기 2 기(IIA, IIB) 및 3 기(III)에 비해, 유방암 병기 1기 (I) 환자의 혈청 내에서 수준이 감소되는 것을 최초로 발견하였다.

이에, 본 발명은, 유방암 발생시 당쇄 변화를 나타내는 단백질인 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 N-당화 반응(glycosylation)을, 렉틴을 사용하여 검출함으로써, 혈청 내 AGP의 당화 수준을 타겟으로 하여 유방암을 초기 단계와 초기 이상의 중증 단계를 구별하여, 유방암 초기를 효과적으로 진단할 수 있다는 데 특징이 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 혈청 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 N-당쇄를 검출할 수 있는 제제는 렉틴이다.

렉틴은 탄수화물에 선택적으로 결합하는 단백질로 식물, 미생물, 바이러스, 무척추동물, 척추동물 등에서 분리, 정제되어 각종 질병관련 연구의 재료로 널리 활용되고 있으며, 현재까지 약 300 여종이 보고되어 있다.

이러한 렉틴은 적혈구를 응집시켜 침강시키는 작용이 잘 알려져 있고 혈액형을 분류하기도 하며, 최근에는 암세포를 특이적으로 응집시키는 기능이 밝혀지는 등 다양한 기능을 갖는 것으로 보고되었는데 이는 렉틴이 가지고 있는 특정 구조가 당과 결합하며, 렉틴성 물질을 갖고 있는 세포와 그것에 결합하는 당을 가지고 있는 세포간의 선택적 정보교환을 가능하게 한다.

본 발명에 사용될 수 있는 렉틴은 AAL(Aleuria Aurantia Lectin), 자칼린(jacalin), MAA(Maackia Amurensis Lectin 2), SNA(Sambucus Nigra Lectin), ConA(Concanavalin A) 및 RCA I(Ricinus communis Agglutinin I)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 시알릴화(sialylation), 푸코실화(fucosylation), 갈락토실화(galactosylation) 및 만노실화(mannosylation)를 측정할 수 있는 렉틴이면 임의의 것도 사용할 수 있다.

이러한 시알릴화(sialylation), 푸코실화(fucosylation), 갈락토실화(galactosylation) 및 만노실화(mannosylation)를 측정할 수 있는 렉틴, 예컨대, AAL, 자칼린 및 MAA은 각각 fucose, mannose 및 sialic acid 결합과 반응하는 특징을 가지고 있다.

본 발명의 렉틴으로서 AAL(Aleuria Aurantia Lectin)은 AGP의 푸코실화(fucosylation)된 N-당쇄에 특이적으로 결합하고; 자칼린(jacalin)은 AGP의 만노실화(mannosylation)된 N-당쇄에 특이적으로 결합하며; MAA(Maackia Amurensis Lectin 2)는 AGP의 시알릴화(sialylation)된 N-당쇄에 특이적으로 결합한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에서는 AGP의 글리코실화를 분석하기 위해 환자 혈청의 AGP를 열 페놀 추출로 정제한 후, 분리된 AGP의 3 가지 유형의 글리코실화(푸코실화, 고만노스 유형 및 시알릴화)를 효소 결합 렉틴 분석 (ELLA)을 사용하여 검출하였다. 그 결과, 푸코실화, 만노실화 및 시알릴화 수준이 BC I에서 가장 낮은 것으로 나타났다. 또한, BC I의 글리코실화 수준은 BC IIA, BC IIB 및 BC III 및 BN과 명확하게 구별되는 우수한 민감도 및 특이성을 제공하였다.

즉, 이러한 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 N-당쇄는, 양성 유방종(benign, BN) 및 유방암(breast cancer, BC) 병기 IIA, IIB 및 III에 비해, 유방암 병기 I기 환자의 혈청 내에서 수준(발현량, 반응성)이 감소된 것으로서, 혈청 내 AGP의 당화 수준의 감소가 지표로 사용될 때, BC IIA, IIB, III 및 BN과, 유방암 초기 단계인 BC I을 효과적으로 구별하는 것이 가능함을 입증한다.

따라서, ELLA를 이용한 AGP 당화(글라이코실화) 측정은 유방암 조기 진단에 유용하다.

또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 혈청 내 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 N-당쇄를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 유방암 조기 진단용 키트를 제공한다.

바람직하게는, 본 발명의 키트는 대상 피검체 유래 혈청 내 항체와 결합하는 항원이 고정된 기질, 바이오틴 표지된 렉틴 및 스트렙타비딘-결합 발색효소를 포함하는, 키트를 제공한다.

진단키트 내에서 렉틴이 시료의 당쇄 변화를 탐지하는 원리는 다음과 같다.

즉, 피검체 유래의 혈청을 키트에 가하면, 혈청 내 항체가 기질에 고정된 항원과 결합하고, 당쇄변화가 일어난 항체에 바이오틴 표지된 렉틴이 결합하게 된다. 이후, 스트렙타비딘이 결합된 발색효소 또는 형광물질 및 발색기질이 순서대로 결합함으로써 그 결과가 흡광도 또는 형광으로 나타나게 되는데, 항체와 렉틴 결합 수준이 감소된 경우 유방암, 특히 초기단계인 I기인 것으로 판정할 수 있다.

본 발명에 따른 진단키트에서, 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지로 합성된 96 웰 플레이트(96 well plate), 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 한편, 기질에 항체를 접착시키기 위해서는 기질 표면이 L-리신 중합체(poly-L-lysine), 아크릴아미드 중합체(poly-arylamine) 또는 알데하이드(aldehyde)로 처리되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 진단키트에 포함되는 렉틴은 바이오틴 표지된 렉틴으로서, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 발색효소는, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase) 및 루시페라제(luciferase)로 구성된 군으로부터 선택되고, 형광물질은 FITC(fluorescein isothiocyanate) 또는 TRITC(tetramethylrhodamine isothiocyanate)을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 유방암 조기 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

(a) 대상체로부터 획득한 혈청 시료와 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 N-당쇄를 검출할 수 있는 제제를 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 N-당쇄와 결합한 상기 제제의 수준을 측정하는 단계.

상기 (b) 단계에서의 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 N-당쇄는, 양성 유방종(benign), 유방암(breast cancer) 병기 2(IIA, IIB)기 및 3(III)기에 비해, 유방암 병기 1(I)기 환자의 혈청 내에서 수준이 감소된 경우 유방암, 특히 초기 단계인 I기인 것으로 판정할 수 있다.

상기 (a) 단계에서의 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 N-당쇄를 검출할 수 있는 제제는 렉틴이고, 상기 렉틴은 바이오틴(biotin)으로 표지될 수 있으나, 본 발명의 목적 효과를 달성할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다.

상기 (b) 단계에서의 측정은 ELLA(enzyme-linked lectin assay), SDS-PAGE, 웨스턴블랏팅(Western blotting)법, ELISA(Enzymelinked immunosorbent assay), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상을 통해 실시될 수 있으며, 바람직하게는 ELLA(enzyme-linked lectin assay)이나, 본 발명의 목적 효과를 달성할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 방법은 상술한 본 발명의 유방암 조기 진단용 조성물을 이용하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명에서 혈청 내 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 N-당화 반응이 초기 유방암 마커임을 최초로 확인함에 따라, 혈청 내 AGP의 당화 반응을 렉틴을 이용하여 검출함으로써 유방암 초기 단계를 진단하는 방법으로, 상기 진단방법은 초기 유방암에 대한 우수한 특이도와 민감도로 나타내는 것이 확인됨에 따라, 유방암 환자의 조기 진단에 활용하여 유방암 초기 환자의 치료 효율 향상 및 유방암으로 인한 사망률 감소에 기여할 수 있다.

도 1은 BN 및 BCs의 혈청 AGP 수준을 확인한 결과이다.
도 2는 열 페놀 추출(hot phenol extraction)을 사용한 혈청 AGP 정제 결과를 보여준다.
도 3은 양성 유방종과 유방암 그룹(stage I, II, 및 III 포함)의 AGP N-당화 수준을 확인한 결과이다.
도 4는 양성 유방종과 유방암 그룹(stage I, II, 및 III 포함)의 AGP N-당화 수준을 확인한 결과이다.

이하, 실시예는 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실험 재료 및 방법

실험 윤리

본 실시예는 이화여자대학교 목동 병원 기관 윤리 심의위원회(한국, 서울)의 승인하에 수행되었으며 헬싱키 선언에 따라 수행되었다. 환자의 혈청 샘플은 서면 동의를 얻은 후 수집되었다.

표본 준비

한국 여성의 혈청은 2015 년 11 월부터 2017 년 1 월까지 이화여자대학교 여성 암 센터 유방암 및 갑상선암 센터에서 수집되었다: 양성(benign) 유방종(BN, n = 47) 및 유방암 1 기 (BC I, n = 48) ), IIA (BC IIA, n = 34), IIB (BC IIB, n = 12) 및 III (BC III, n = 25).

유방암 단계는 TNM(tumor-node-metastasis) 병기 결정 시스템에 의해 결정되었고 각 병기별 분류 기준은 다음과 같다:

BN(benign) 상태는 암세포를 포함하지 않는 유방 조직의 비정상적인 성장 또는 기타 변화를 가르킨다. BN은 비 침습성 유방암을 의미하며 암세포가 관찰되지 않거나 주변 조직을 침범하지 않은 단계를 의미한다.

BC(breast cancer) I는 암세포가 정상적인 주변 유방 조직을 관통하기 시작한 침습성 유방암 단계를 의미한다.

BC IIA는 유방에서 종양이 발견되지 않았으나 1 내지 3 개의 겨드랑이 림프절에서 2mm 이상의 암이 발견된 단계; 유방에서 2cm 이하의 종양이 발견되고 종양이 주변에 침범한 단계; 또는 2cm보다 크고 5cm보다 작은 종양이 유방에서 발견되나, 겨드랑이 림프절에서는 발견되지 않은 단계를 의미한다.

BC IIB는 유방에서 2cm 이상 5cm 미만의 종양이 발견되고 겨드랑이 림프절에서 0.2mm 이상 2mm 미만의 종양이 발견된 단계; 유방에서 2cm 이상 5cm 미만의 종양이 발견되고 1 내지 3 개의 겨드랑이 림프절 또는 흉골 주변에서 종양이 발견된 단계; 또는 5cm보다 큰 종양이 유방에서 발견되나, 겨드랑이 림프절에서는 발견되지 않은 단계를 의미하다.

BC III는 종양이 4 개 이상의 겨드랑이 림프절 또는 흉골 주변에서 발견되거나, 5cm 이상의 종양이 겨드랑이 림프절 또는 흉골 주변에서 발견되는 단계를 의미한다.

본 실시예에서 BN 군의 평균 연령은 40 세였고 BC I, IIA, IIB, III의 연령은 각각 51 세, 51 세, 55 세, 54 세였다.

BN 그룹의 연령대는 19-74 세였고 BC I, IIA, IIB 및 III의 연령대는 각각 29-78, 29-87, 33-83 및 36-78 세였다.

수술적 절제 전에 혈청 샘플을 수집하였다.

혈청 샘플은 12,000g에서 10 분 동안 원심분리하고, 상층액을 수집하여 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.

고온 페놀 정제 방법을 통해 혈청에서 AGP 추출

AGP는 hot phenol 추출 방법(Chan and Yu)을 사용하여 혈청에서 추출되었다. 각 혈청 샘플(20 μl)을 동일한 부피의 10mM Tris-HCl pH 7.6과 합하고 증류수에 포화된 40 μl 페놀 용액과 혼합하였다. 혼합물을 진탕하면서 70℃에서 20 분 동안 가열한 다음 얼음에서 10 분 동안 냉각시켰다. 각각의 혼합물을 12,000 rpm에서 10 분 동안 원심 분리하고 상층액을 수집하였다. 상층액을 동일한 부피의 안정화 완충액 (150mM NaCl, 25mM L-아르기닌)과 혼합하고 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.

SDS-PAGE 겔에서 정제된 AGP 분석

정제된 AGP의 순도를 확인하기 위해 SDS-PAGE 폴리아크릴아미드 겔을 사용하고, 분별된 AGP를은 염색으로 시각화하였다. 샘플을 인산염 완충 식염수 (PBS)를 사용하여 희석하고 환원 조건 하에서 소디윰 도데실 설페이트를 함유하는 12.5% 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동을 실시하였다. 인간 혈장 에서 얻은 상용화된 AGP(Sigma-Aldrich; Merck, U.S., cat No. G9885)를 사용하여 각 AGP의 분자량 및 순도를 평가하였다.

효소 결합 면역 흡착 분석을 사용한 혈청 AGP 적정

혈청 샘플에서 AGP의 역가는 간접 ELISA(enzyme-linked immunoassay)에 의해 결정되었다. 96-웰 면역 플레이트(Greiner bio-one)를 3 시간 동안 37℃에서 연속 희석된 혈청 샘플로 코팅하였다. 연속 희석은 PBS를 사용하여 수행되었다. 그 다음 플레이트의 각 웰당 0.1% (v/v) Tween 20을 포함하는 TBST (Tris-buffered saline/Tween 20)에 녹인 5% 소 혈청 알부민(BSA, MP Biomedicals) 300μl을 넣고 37℃에서 2 시간 동안 블록킹하였다. 래빗 항-AGP 항체(Abcam, ab118809)는 PBST에서 0.5% BSA를 사용하여 1: 5000으로 희석하고 블록킹된 플레이트에서 37℃에서 1.5 시간 동안 반응시켰다. 세척 후, 플레이트를 HRP-접합 고트 항-래빗 IgG(Bethyl, A120-101P)와 반응시켰다. 2 차 항체는 PBST에서 0.5% BSA를 사용하여 1:5000으로 희석되었다. 반응 사이에 PBS-T를 사용하여 플레이트를 3 내지 5 회 세척하였다. 발색 반응은 o-페닐렌디아민을 사용하여 현상되었으며 492 nm에서 측정되었다. 종점 역가는 대조군 웰의 OD의 2 배의 OD에서 설정되었다. 대조군은 혈청 코팅이 없는 빈 웰을 이용하였다.

ELISA를 사용하여 정제된 AGP의 적정

AGP의 역가는 공지된 방법을 변형하여 결정되었다. 정제된 AGP는 PBS를 사용하여 1:200 내지 1:51,200으로 희석하고 96-웰 면역플레이트에서 37℃에서 3 시간 동안 반응시켰다. 코팅된 웰은 PBST에서 5% BSA로 37℃에서 2 시간 동안 블록팅되었다(각 웰당 300 μl). 후속 과정은 위와 동일하다. 종점 역가는 대조군 웰의 OD의 2 배의 OD에서 설정되었다. 대조군은 AGP 샘플이 없는 빈 웰을 이용하였다.

효소 결합 렉틴 분석(enzyme-linked lectin assay, ELLA)을 사용하여 정제된 AGP의 적정

적정하기 위해 정제된 AGP를 사용하였고, 당업계에 통상적으로 이용되는 효소 결합 렉틴 분석 (ELLA)을 이용하여 역가를 결정하였다. 푸코실화(fucosylated) 또는 시알릴화(sialylated)된 AGP의 역가 또는 높은 만노스 유형 글리칸을 갖는 역가는 변형된 공지 방법에 의해 결정되었다. 샘플을 ELISA와 동일한 방식으로 코팅하여 정제된 AGP의 역가를 측정하였다. 0.1% Tween 20을 함유하는 TBST (Tris-buffered saline/Tween 20)을 사용하여 3 회 세척한 후, 웰을 1% Tween 20을 함유하는 TBS로 실온에서 2 시간 동안 블록킹하여 렉틴의 비특이적 반응을 방지하였다. 바이오틴화된 렉틴은 Vector Laboratories에서 구입하였다. 푸코실화(fucosylation)와 만노실화(mannosylation)를 검출하기 위해 각각 AAL(Aleuria Aurantia Lectin)과 자칼린(jacalin)을, 시알릴화 검출을 위해 MAA(Maackia Amurensis Lectin 2)를 적용하였다. 모든 렉틴을 TBST에서 1 ㎍/ml의 농도로 희석하고 AGP-코팅된 웰에서 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 코팅된 AGP에 결합된 렉틴은 HRP-결합 스트렙 타비딘(Thermo Fisher Scientific, 1:10,000 희석)에 의해 검출되었다. 반응 사이에 TBST를 사용하여 플레이트를 3 내지 5 회 세척하였다. 발색 반응은 상술한 바와 동일하게 현상하였다. 종점 역가는 대조군 웰의 OD의 2 배의 OD에서 설정되었다.

렉틴 반응성 AGP의 백분율 결정

렉틴-반응성 AGP의 백분율은 다음 공식에 따라 계산되었다:

ELLA에 의해 결정된 AGP의 역가(AAL-, 자칼린- 또는 MAA-반응성 AGP) x 100 / ELISA에 의해 결정된 AGP의 역가.

정제된 AGP의 역가를 계산에 적용하였다. 데이터는 백분율로 표시된다.

통계 분석

그룹 간의 차이는 Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 평가되었으며 P <0.01이 중요한 것으로 간주되었다. 그래프 패드 프리즘 버전 5.01 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)을 사용하여 AUC (Area Under the Curve) 값, P-값, 민감도, 특이도, NPV(negative predictive value) 및 PPV(positive predictive value)을 계산하였다:

민감도 및 특이도의 합을 최대화하기 위해 컷오프가 선택되었다. 특이도 = 진음성(true negatives) 수 Х 100 / 진음성 수 + 위양성(false positives) 수. 민감도 = 진양성(true positives) 수 Х 100 / 진양성 수 + 위음성(false negatives) 수.

G power 3.1 프로그램 (Franz Faul, Germany)으로 검정력을 분석하였다.

실시예 1. BN 및 BCs의 혈청 AGP 수준 분석

본 발명자들은, 유방암 환자 혈청 내 AGP의 글리코실화를 유방암 조기 진단용 바이오마커로 간주하고, 먼저, BN 및 BCs의 혈청 AGP 수준을 ELLA를 통해 분석하였다.

각 그룹에 대한 혈청 내 AGP의 양은 ELISA를 사용한 종점 적정 방법에 의해 결정되었다.

그 결과, 도 1A 및 1B 에 나타낸 바와 같이, 혈청의 AGP 역가는, BN에 비해,

BC I, BC IIA, BC IIB 및 BC III에서 증가하였으며, 또한, BC 그룹의 AGP 역가는 BN 그룹의 역가보다 높았다(도 1B).

또한, BN에서 BC I, BC IIA, BC IIB 및 BC III를 검출하기 위한 민감도, 특이성, NPV, PPV 및 AUC 값은 하기 표 1에 나타내었다.

그 결과, BN과 BC IIA에서 AGP를 검출했을 때 AGP의 민감도와 특이도는 각각 82% 및 94%로 우수하였다.

또한, BN과 BC I, BC IIB, BC III에서 AGP를 검출했을 때 민감도는 각각 98%, 100% 및 100%이고; 특이도는 40%로 나타났다. 또한, BN 형태의 BC 그룹을 검출 할 때 모든 AUC 값은 0.7 이상의 값을 나타냈다.

따라서, 혈청 AGP 수준을 측정하는 것이 양성(benign) 유방종 그룹과 비교하여 높은 민감도 및 특이도로 BCs 검출에 효과적이라는 것을 알 수 있다.

비교	민감도	특이도	NPV	PPV	AUC 값
BN vs. BC I	98%	40%	95%	62%	0.8
BN vs. BC II A	82%	94%	88%	90%	0.9
BN vs. BC II B	100%	40%	100%	30%	0.7
BN vs. BC III	100%	40%	47%	35%	0.7
BN vs, BCs	48%	94%	85%	42%	0.8

실시예 2. 열 페놀 추출(hot phenol extraction)을 사용한 혈청 AGP 정제

본 발명자들은 도 2A에 나타낸 페놀 추출법으로 AGP를 추출하였다. 혈청을 페놀과 혼합하고 70℃에서 20 분간 가열하여 혈청 내 오염 단백질 침전을 유도하였다. 원심 분리 후 침전물을 제거하고 순수한 AGP를 얻었다.

그 결과, 도 2B에 나타낸 바와 같이, 정제된 AGP는 글리코실화를 분석하기에 충분한 순도를 보여주었다.

실시예 3. AAL-반응성, 자칼린-반응성 또는 MAA-반응성 AGP의 백분율 분석

본 발명자들은 유방암 환자 혈청 내 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 글리코실화(glycosylation) 변화가 유방암 진행 단계를 모니터링하는 데 중요한 지표로 적용할 수 있음을 입증하기 위해, 렉틴을 이용하여 혈청에서 AGP에 부착된 N-글리코실화 수준에 따른 유방암 중증도를 분석하였다.

한편, AGP에는 5 개의 N-글리코실화 부위가 있다. N-글리코실화(glycosylation)에 결합하는 렉틴의 경우, AAL은 α-1,6 결합에서 N-아세틸 글루코사민에 부착된 푸코스와 결합한다. 자칼린(jacalin)은 높은 만노스(mannose) 유형 N-글리코실화에 결합한다. MAA는 α-2,3 결합에서 갈락토실화에 부착된 시알산에 결합한다.

따라서, 정제된 AGP의 글리코실화 수준은 이러한 렉틴이 결합하는 AGP의 백분율을 계산을 통해 알 수 있으므로, AAL(Aleuria Aurantia Lectin)-반응성, 자칼린(jacalin)-반응성 또는 MAA(Maackia Amurensis Lectin 2)-반응성 AGP의 백분율을 분석하였다.

렉틴 반응성 AGP의 백분율은 ELISA에 의해 결정된 총 AGP 역가 중 ELLA에 의해 결정된 렉틴 반응을 보여주는 AGP 역가가 차지하는 백분율로 표현되었다.

이들 렉틴-반응성 AGP의 비율에서 그룹 간 비교에 따른 통계적 유의성과 검정값은 표 2에 나타내었다.

그 결과, 도 3A에 나타낸 바와 같이, BC I 그룹에서 AAL 반응성(reactive) AGP의 비율은 BN 그룹보다 현저하게 낮았다. 한편, 해당 값은 BC IIA 그룹에서 크게 증가한 다음 BC IIA에서 BC III까지 지속되었다.

또한, 도 3B에 나타낸 바와 같이, 이러한 경향은 자칼린-반응성(reactive) AGP의 백분율과 유사한 수준이나 BC IIA에서 BC III로 단계가 증가함에 따라 값이 감소하였다.

또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, MAA-반응성 AGP의 비율에서도 BN I 그룹의 값은 BN 그룹의 값보다 낮은 경향을 나타냈다. 한편, MAA-반응성 AGP의 비율은 BC I에서 BC IIA, BC IIB까지 단계가 증가할수록 증가하는 경향을 보였고 BC III 그룹에서는 감소하는 경향을 보였다.

즉, 양성 유방종 및 유방암 stage I, IIA, IIB 및 III에 대한 AGP의 N-글라이코실화 수준이, 병기 I에 비해 매우 높게 나타나는 것을 확인할 수 있으며, 이러한 결과들은, 혈청 내 AGP의 글리코실화 수준에 따라 BC I 그룹이, BN, BC IIA, BC IIB 및 BC III와 구별될 수 있음을 보여준다.

따라서, 혈청 내 AGP의 글리코실화는 유방암 조기 진단 마커로서 유방암 초기 단계인 BC I을 조기에 발견할 수 있는 가능성을 제공한다.

분석 유형	해당 도면	비교 그룹	유의성(Significance)	검정값(Power value)
혈청 AGP 적정(titer)	도 1	BN vs. BC I	P < 0.001	1.0
		BN vs. BC II A	P < 0.001	1.0
		BN vs. BC II B	N/A	N/A
		BN vs. BC III	N/A	N/A
		BC I vs. BC II A	N/A	N/A
		BC I vs. BC II B	N/A	N/A
		BC I vs. BC III	N/A	N/A
		BC II A vs. BC II B	N/A	N/A
		BC II A vs. BC III	P < 0.001	1.0
		BC II B vs. BC III	N/A	N/A
AAL 반응성 AGP의 %	도 3A	BN vs. BC I	P < 0.001	1.0
		BN vs. BC II A	N/A	N/A
		BN vs. BC II B	N/A	N/A
		BN vs. BC III	N/A	N/A
		BC I vs. BC II A	P < 0.001	1.0
		BC I vs. BC II B	P < 0.001	1.0
		BC I vs. BC III	P < 0.01	0.9
		BC II A vs. BC II B	N/A	N/A
		BC II A vs. BC III	N/A	N/A
		BC II B vs. BC III	N/A	N/A
자칼린(jacalin) 반응성 AGP의 %	도 3B	BN vs. BC I	P < 0.001	1.0
		BN vs. BC II A	P < 0.01	1.0
		BN vs. BC II B	N/A	N/A
		BN vs. BC III	N/A	N/A
		BC I vs. BC II A	P < 0.001	1.0
		BC I vs. BC II B	P < 0.01	1.0
		BC I vs. BC III	N/A	N/A
		BC II A vs. BC II B	N/A	N/A
		BC II A vs. BC III	P < 0.001	1.0
		BC II B vs. BC III	N/A	N/A
MAA 반응성 AGP의 %	도 4	BN vs. BC I	N/A	N/A
		BN vs. BC II A	N/A	N/A
		BN vs. BC II B	N/A	N/A
		BN vs. BC III	N/A	N/A
		BC I vs. BC II A	P < 0.05	0.9
		BC I vs. BC II B	N/A	N/A
		BC I vs. BC III	N/A	N/A
		BC II A vs. BC II B	N/A	N/A
		BC II A vs. BC III	P < 0.05	0.3
		BC II B vs. BC III	N/A	N/A

또한, 추가적으로 BC I를 다른 그룹과 구별하기 위한 민감도, 특이성, NPV, PPV 및 AUC 값을 확인하였고, 하기 표 3에 나타내었다.

그 결과, 다른 그룹의 BC I 검출에서 AAL-반응성 AGP의 백분율을 기준으로 했을 때 특이도는 68 내지 98%이고 민감도는 64 내지 92%였다.

자칼린-반응성 AGP의 비율에 따른 특이도는 60 내지 88%, 민감도는 56 내지 82%였다.

두 분석 모두에서 AUC 값은 0.6 이상의 값을 보여 BC I를 다른 그룹과 구별하는 데 유의하다는 것을 알 수 있었다.

또한, 각 그룹의 ELISA로 계산한 렉틴 반응성 AGP 역가와 혈청 AGP 역가의 백분율이 연령대 편향에 영향을 받는지 확인하기 위해 각 그룹의 값과 각 그룹의 연령 간의 상관 관계를 분석하였고, 해당 데이터를 표 4에 나타내었다.

그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이, 각 분석 횟수와 연령간에 명확한 상관 관계가 없음을 알 수 있었다.

분석 유형	비교	민감도	특이도	PPV	NPV	AUC
AAL 반응성 AGP의 %	BC I vs. BN	77%	68%	71%	74%	0.8
	BC I vs. BC II A	65%	98%	96%	80%	0.9
	BC I vs. BC II B	92%	77%	50%	97%	0.9
	BC I vs. BC III	64%	77%	59%	80%	0.8
자클린 반응성 AGP의 %	BC I vs. BN	60%	85%	81%	68%	0.8
	BC I vs. BC II A	82%	88%	82%	88%	0.9
	BC I vs. BC II B	75%	88%	60%	93%	0.9
	BC I vs. BC III	56%	60%	42%	73%	0.6

		양성(Benign) (n=47)	Stage I (n=48)	Stage IIA (n=34)	Stage IIB (n=12)	Stage III (n=25)
나이대		19-74	29-78	29-75	33-83	36-78
평균 나이		40	51	51	55	54
Pearson, r	혈청 AGP 적정	-0.19	0.00	-0.09	0.00	0.09
	AAL 반응성 AGP의 %	0.20	-0.11	-0.13	-0.3	-0.24
	자클린 반응성 AGP의 %	0.17	-0.1669	-0.16	-0.09	0.28
	MAA 반응성 AGP의 %	0.26	-0.1	-0.15	-0.18	-0.16

결론적으로, 본 발명의 목적 대상의 혈청 내 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 N-글리코실화 수준을 분석하는 경우, 양성(benign) 유방종, 유방암 병기 IIA, IIB 및 III 그룹과 비교하여, 유방암 초기 단계인 유방암 병기 I 을 높은 민감도 및 특이도로 구별할 수 있음이 확인되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

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혈청 내 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 N-당화(glycosylation) 수준을 검출하는 제제를 유효성분으로 포함하는 유방암 병기 1기 (I) 진단용 조성물로서,
상기 N-당화는 푸코실화(fucosylation), 만노실화(mannosylation) 및 시알릴화(sialylation)이고;
상기 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 N-당화 수준은, 양성 유방종(benign), 유방암(breast cancer) 병기 2(IIA, IIB)기 및 3(III)기에 비해, 유방암 병기 1(I)기 환자의 혈청 내에서 수준이 감소되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
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제3항에 있어서,
상기 푸코실화(fucosylation)를 검출하는 제제는 AAL(Aleuria Aurantia Lectin)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제3항에 있어서,
상기 만노실화(mannosylation)를 검출하는 제제는 자칼린(jacalin)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제3항에 있어서,
상기 시알릴화(sialylation)를 검출하는 제제는 MAA(Maackia Amurensis Lectin 2)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
혈청 내 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 N-당화(glycosylation) 수준을 검출하는 제제를 유효성분으로 포함하는 유방암 병기 1기 (I) 진단용 키트로서,
상기 N-당화는 푸코실화(fucosylation), 만노실화(mannosylation) 및 시알릴화(sialylation)이고;
상기 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 N-당화 수준은, 양성 유방종(benign), 유방암(breast cancer) 병기 2(IIA, IIB)기 및 3(III)기에 비해, 유방암 병기 1(I)기 환자의 혈청 내에서 수준이 감소되는 것을 특징으로 하는, 키트.
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다음 단계를 포함하는, 유방암 병기 1기 (I) 진단을 위한 정보 제공 방법:
(a) 대상체로부터 획득한 혈청 시료와 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 N-당화(glycosylation) 수준을 검출하는 제제를 접촉시키는 단계로서,
상기 N-당화는 푸코실화(fucosylation), 만노실화(mannosylation) 및 시알릴화(sialylation)이고; 및
(b) 상기 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 N-당쇄와 결합한 상기 제제의 수준을 측정하는 단계로서,
상기 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)의 N-당화 수준이, 양성 유방종(benign), 유방암(breast cancer) 병기 2(IIA, IIB)기 및 3(III)기에 비해, 혈청 내에서 수준이 감소된 경우 유방암 병기 1(I)기 환자인 것으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 방법.
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제13항에 있어서,
상기 (b) 단계에서의 측정은 ELLA(enzyme-linked lectin assay), SDS-PAGE, 웨스턴블랏팅(Western blotting)법, ELISA(Enzymelinked immunosorbent assay), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상을 통해 실시되는 것을 특징으로 하는, 방법.