WO2006098464A1 - 前立腺がんの診断方法 - Google Patents

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WO2006098464A1
WO2006098464A1 PCT/JP2006/305480 JP2006305480W WO2006098464A1 WO 2006098464 A1 WO2006098464 A1 WO 2006098464A1 JP 2006305480 W JP2006305480 W JP 2006305480W WO 2006098464 A1 WO2006098464 A1 WO 2006098464A1
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body fluid
prostate cancer
assay
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PCT/JP2006/305480
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Kazutake Tsujikawa
Hiroshi Yamamoto
Noboru Konishi
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Link Genomics, Inc.
Osaka University
Pca Intermed, Inc
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing prostate cancer, and more particularly to a method for diagnosing prostate cancer using PCA-1 in a body fluid (eg, blood, urine) sample of a subject as a marker, and a kit for the same.
  • a body fluid eg, blood, urine
  • Prostate cancer is a cancer that frequently accounts for about 20% of male cancer deaths in the West, and its frequency is increasing in Japan with the westernization of the diet and an aging society. In cancer in the urology field, it is the most common cancer in Japan, and early detection of affected individuals has important medical significance.
  • PSA prostate-specific antigen
  • Blood PSA measurement is a test that can detect the presence of prostate cancer sensitively, and also has the advantage that it can be predicted to stage because the PSA level also increases as the cancer progresses.
  • PSA levels often increase with benign prostatic hyperplasia and prostatitis, and PSA levels may be normal in the early stages of prostate cancer, resulting in a false negative diagnosis . Therefore, for a definitive diagnosis of prostate cancer, the tissue of the prostate is further collected by fine needle aspiration biopsy, rectal or perineal needle biopsy, and examined under a microscope. There must be.
  • the present invention provides the following P C A-1 in the body fluid sample of the subject. ⁇ Providing a method, detection kit, and diagnostic agent for detecting 1 gene, PCA-1mRNA, or anti-PCA-1 autoantibodies as a prostate cancer marker.
  • a method for detecting and determining or quantifying PCA-1 in a body fluid sample derived from a subject as a prostate cancer marker (1) A method for detecting and determining or quantifying PCA-1 in a body fluid sample derived from a subject as a prostate cancer marker.
  • the step of detecting and / or quantifying comprises detecting and / or quantifying the binding between PCA-1 and anti-PCA-1 antibody using a labeled anti-PCA-1 antibody.
  • the method described in (6) comprises detecting and / or quantifying the binding between PCA-1 and anti-PCA-1 antibody using a labeled anti-PCA-1 antibody.
  • a diagnostic agent for prostate cancer for detecting and / or quantifying PCA-1 in a body fluid sample derived from a subject, which contains an anti-PCA-1 antibody, as a prostate cancer marker.
  • (1 1) Contains a polynucleotide consisting of a base sequence that can be hybridized under the conditions of stringent hybridisation to the base sequence of PCA-1 gene, PCA-1 ni RNA, or a fragment thereof.
  • a diagnostic agent for prostate cancer for detecting and / or quantifying PCA-1 gene, PCA-1 mRNA, or a fragment thereof in a body fluid sample derived from a subject as a prostate cancer marker.
  • Polynucleotide that consists of a base sequence that can be hybridized under stringent hybridization conditions to the base sequence of one gene, PCA-1 mRNA, or a fragment thereof.
  • (2 4) The method according to any one of (2 1) to (2 3), wherein the anti-P C A-1 autoantibody is detected and / or quantified using a P C A-1 antigen.
  • the detection and Z or quantifying step detects and binds to the binding of PCA-1 to the anti-PCA-1 autoantibody using a labeled antibody against the anti-PCA-1 autoantibody.
  • (2 8) The method according to any one of (2 1) to (2 7) for use in diagnosis of prostate cancer.
  • a kit for detecting and / or quantifying anti-PC A-1 autoantibodies in a body fluid sample derived from a subject containing PCA-1 antigen as a prostate cancer marker (9) A kit for detecting and / or quantifying anti-PC A-1 autoantibodies in a body fluid sample derived from a subject containing PCA-1 antigen as a prostate cancer marker.
  • a diagnostic agent for prostate cancer for detecting and Z or quantifying anti-PCA-1 autoantibodies as a prostate cancer marker in a body fluid sample derived from a subject containing the PCA-1 antigen.
  • the present invention provides for the first time a method of using PCA-1 as a prostate cancer marker in a body fluid (eg, blood, urine) sample of a subject.
  • the present invention can provide an accurate method for diagnosing prostate cancer that can be diagnosed by a single test. If necessary, it can be combined with existing prostate cancer diagnosis methods to enable more reliable diagnosis of prostate cancer. Since the present invention can adopt a non-invasive or low-invasive measurement form using a body fluid sample, a rapid and simple method for diagnosing prostate cancer is less burdensome for both patients and doctors. Can be provided.
  • the present invention is useful not only for the diagnosis of prostate cancer, but also for prognostic evaluation, identification of subjects with cancer predisposition, and observation of patients undergoing treatment for cancer. Brief Description of Drawings
  • FIG. 3 is a diagram showing an elution profile of a blood sample derived from a subject having a stagnation.
  • Figure 2 shows (A), (B) insi 1 ico tryptic peptide fragment of PCA-1 and a molecule with the mass of the cleavage peptide that can be generated from the peptide is selectively selected using an LC-MS mass spectrometer.
  • C (C), (D) For comparison, a molecule having the mass of an insi 1 ico lysine-degraded peptide fragment of PSA and a cleavage peptide that can be produced from the peptide.
  • FIG. 5 is a diagram showing an elution profile when sam is selectively monitored with an LC-MS mass spectrometer.
  • FIG. 3 shows the amino acid sequence determined by MS MS analysis for the PCA_1 peak observed in Fig. 2- (A) with a retention time of around 68 minutes.
  • FIG. 4 shows the amino acid sequence determined by MS MS analysis of PCA-1 peak observed in Fig. 2 (B) with a retention time of 62 minutes.
  • FIG. 5 is a diagram showing amino acid sequences determined by MSMS analysis for the pSA peak observed in FIGS. 2 (C) and (D) at a retention time of 64 minutes for comparison.
  • - Figure 6 shows, as a comparative example of the experiment shown in Figure 2, a blood sample from a healthy subject that had been pretreated and treated with trypsin. It is a figure which shows the elution profile at the time of monitoring.
  • Figure 7 is a photograph showing the results of Western blot analysis showing the presence of PCA-1 in urine samples from prostate cancer patients.
  • the present inventors have developed a new analysis method using a mass spectrometer as a method for rapidly analyzing the presence and amount of a target polypeptide in blood, and using this, a blood sample is developed. An attempt was made to detect PCA-1 in it. As a result, the presence of PCA-1 in blood samples from prostate cancer patients, and It was confirmed that PCA-1 was not substantially detected in blood samples from healthy subjects.
  • the present invention is based on such new findings and demonstrates for the first time that PCA-1 can be used as a prostate cancer marker in a body fluid sample such as blood.
  • the present inventors have found that PCA-1 can be detected in urine samples of prostate cancer patients, and that PCA-1 is only slightly detected or substantially detected in urine samples from healthy subjects. It was confirmed that it was not detected.
  • the present invention also demonstrates for the first time that PCA-1 can be used as a prostate cancer marker even in a body fluid sample such as urine.
  • the present invention provides a method for detecting and / or quantifying PCA-1 in a body fluid sample derived from a subject as a prostate cancer marker.
  • the method of the present invention can be applied to prostate cancer diagnosis or prognosis evaluation.
  • the present invention also provides a method for detecting and / or quantifying anti-PCA-1 autoantibodies in a body fluid sample derived from a subject as a prostate cancer marker. That is, the present invention is applicable to the diagnosis of prostate cancer or prognostic evaluation, and the like; to provide a method of detecting and / or quantifying anti PCA- 1 autoantibody in a body fluid expression for.
  • the present invention provides a method for detecting a prostate cancer marker in a body fluid sample derived from a subject using an anti-PCA-1 antibody.
  • Detectable polynucleotides include, for example, recombinant DNA containing the PCA-1 gene or fragment thereof, PCA-1 mRNA, alternatively spliced variant PCA-1 mRNA, and PCA-1 polynucleotide. RNA molecules are included.
  • a method for detecting PCA-1 mRNA in a body fluid sample comprises generating cDNA from a sample by reverse transcription using at least one primer, and so on. And amplifying PCA-1 polynucleotide as a sense and antisense primer to amplify the PCA-1 cDNA contained therein, and amplified PCA-1 c Detecting the presence of DNA.
  • the method for detecting PCA-1 gene in a body fluid sample comprises first isolating genomic DNA from the body fluid sample, and isolating the isolated genomic DNA in PCA-1 Amplifying using the PCA-1 polynucleotide as a sense and antisense primer to amplify the gene and detecting the presence of the amplified PCA-1 gene.
  • P CA-1 or “P CA-1 protein” means a human P CA— whose gene is specified by Gen Bank Accession No. AB 04 2 0 2 9 P CA— 1 protein amino acid sequence is identified by the publicly accessible protein database Accession No. NP— 6 3 1 9 1 7 (SEQ ID NO: 2).
  • PCA-1 in a body fluid sample is In the embodiment used as a cancer marker, “PCA-1” is not limited to the full-length protein of PC A-1, but is a degradation product of PCA-1 or a fragment of PCA-1 by a protease in a body fluid sample, or these The derivatives of are also included.
  • derivative includes mutations, substitutions, deletions and / or additions of one or several (eg, six) amino acid residues in the amino acid sequence of the PCA-1 protein or fragment thereof.
  • P CA— It includes peptides or polypeptides having the same antigen specificity as the protein. Typical examples of derivatives include: ⁇ ⁇ 1 There is sequence change due to polymorphism, splicing, etc.
  • anti-PCA-1 antibody used in an embodiment in which PCA-1 in a body fluid sample is used as a prostate cancer marker includes PCA-1 and degradation of PCA-1 by protease.
  • the length of these protease degradation products or fragments is not limited as long as it can be recognized as an antigen specific to the anti-PCA-1 antibody, but is preferably 6 amino acids or more, more preferably 8 Amino acids or more, more preferably 10 amino acids or more (for example, amino acid sequence: RRAPEPRVIDREG '(SEQ ID NO: 3 4) or a fragment containing a partial sequence thereof).
  • these degradation products or fragments may be any part of the PCA-1 protein, but more preferably contain a part corresponding to the capetop corresponding to the PCA-1 protein.
  • “Derivative” refers to mutations, substitutions, deletions of one or several amino acid residues in the amino acid sequence of PCA-1 protein or its protease degradation product or fragment (for example, 6). And / or additions, including peptides or polypeptides having substantially the same antigen specificity as the PCA-1 protein.
  • PCA-1 PCA-1 protein
  • PCA-1 antigen used in the embodiment where anti-PCA-1 autoantibodies in body fluid samples are used as a prostate cancer marker.
  • PCA-1 protein PCA-1 protein
  • PCA-1 antigen used in the embodiment where anti-PCA-1 autoantibodies in body fluid samples are used as a prostate cancer marker.
  • a fragment containing PCE-1 protein epitopes, or fragments that can be recognized by anti-PCA-1 antibodies as epitopes, and derivatives thereof are also included.
  • the length of the fragment is not limited as long as it can be recognized as an antigen specific to the anti-PCA-1 antibody, but is preferably 6 amino acids or more, more preferably 8 amino acids or more, and further Preferably it is 10 amino acids or more.
  • These degradation products or fragments are also PCA—:!
  • “derivative” includes mutation, substitution, deletion and Z or addition of one or several (for example, six) amino acid residues in the amino acid sequence of PCA-1 protein or a fragment thereof.
  • PCA contains a peptide or polypeptide that has the same antigenic specificity as a protein.
  • an antibody “specifically binds” to certain proteins or degradation products or fragments refers to the identification of these proteins or degradation products or fragments rather than their affinity for other amino acid sequences. It binds with substantially high affinity to the amino acid sequence.
  • substantially high affinity means high affinity that allows the specific amino acid sequence to be detected separately from other amino acid sequences by a desired measuring apparatus.
  • prostate cancer marker is derived from normal prostate tissue in a subject's body fluid (eg, blood, urine, lymph, saliva, 'sweat, semen, etc.) or cells or tissues. Or a molecule that is selectively upregulated in prostate cancer cells or tissues, and the presence of the molecule in the body fluid or cell or tissue of the subject indicates the presence of prostate cancer. Indicates what is indicated or suggested.
  • the “body fluid sample” includes body fluid samples such as blood, urine, lymph fluid, saliva, sweat, and semen derived from a subject.
  • body fluid samples such as blood, urine, lymph fluid, saliva, sweat, and semen derived from a subject.
  • a preferable example of the body fluid sample used in the present invention is blood or urine, particularly preferably.
  • a blood sample is blood or urine, particularly preferably.
  • blood sample refers to a blood sample obtained from a subject, but is not limited to whole blood, and excluding blood component fractions such as serum and plasma, or further albumin, immunoglopurin, etc. It also includes blood component fractions or blood products.
  • prostate cancer is a concept that broadly encompasses cancers that have occurred in the prostate, as well as adenocarcinoma that has developed in the prostate, squamous cell carcinoma, transitional cell carcinoma, neuroendocrine. This includes cancer and undifferentiated cancer.
  • prostate cancer is a glandular cancer that has developed in the prostate.
  • the “subject” refers to a human from which a body fluid sample to be examined using the method of the present invention is widely collected, and is mainly a male human, more specifically. This includes: male male subjects for health checkups, prostate cancer subjective symptoms (eg residual urine sensation), palpation (prostatic lumps, etc.), serum PSA concentration tests (high PSA concentrations, etc.) ) Etc. include male humans suspected of developing prostate cancer. -
  • the anti-PCA-1 antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • antibody generally includes any antibody fragment or derivative, particularly a fragment or derivative of said monoclonal or polyclonal antibody that exhibits substantially the same antigenic specificity.
  • the latter includes antibody fragments (F ab, F ab ', etc. 2, CDR), humanized antibodies, multifunctional antibodies, and single chain antibodies (S c F v).
  • the antibodies used in the present invention are produced by conventional methods, including immunizing animals and collecting serum (polyclonal) or spleen cells (for the production of hybridomas by fusion with appropriate cell lines). be able to.
  • the class of the antibody is not particularly limited, and includes antibodies having any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE.
  • it is I g G or I g M, and considering the ease of purification, etc. More preferably, it is IgG.
  • Methods for producing monoclonal antibodies from different species include, for example, Har 1 ow et al., Ri arlowand Lane, ed .H Ant ant bodies: alaboratorymanual .C old S one pring H arbor L abatory, Old S pring H arbor, N. Y p. 1 3 9-2 8 2. 1 9 8 8) or 1: 0 11 1 6 1: et al (1: 0 11 1 6 3: joy 1 ⁇ 1 1 5 1 11 Nature. 2 5 6 (5 5 1 7): 4 9 5 2 7, 1 9 7 5).
  • This method involves immunizing an animal with an antigen, then collecting spleen cells and then fusing them with immortalized cells such as myeloma cells.
  • the resulting hybridoma produces a monoclonal antibody that can be selected by limiting dilution to isolate individual clones.
  • Antibodies may also be used in combination immunizations such as those disclosed by Ward et al. (Ward, Gussow et al. Nature. 3 4 1 (6 2 4 2): 5 4 4—6, 1 9 8 9). It can be created by selecting one globulin library. .
  • the Fab or Fab, 2 fragment can be prepared by digestion with a protease (eg, pepsin or papain) by a conventional method.
  • a protease eg, pepsin or papain
  • Human antibodies include, for example, Riechmann et al. (Riech.mann J Mo 1 Biol. Oct 5; 2 0 3 (3): 8 2 5-8, 1 9.8 8), and J ones et al. J ones et al ature 3 2 1: 5 2 2-5 2 5, 1 9 8 6).
  • Chimeric antibodies include, for example, “Experimental Medicine (Special Issue), V ol. 1. 6, No. 1 0, 1 9 8 8”, Japanese Patent Publication No. 3-7 3 2 8
  • Human antibodies include, for example, “Nature Genetics, Vol. 15, p. 1 4 6—1 5 6, 1 9 9 7”, “Nature Genetics, V o 1.7, p. ⁇ 1 3-2 1, 1 9 94 '', JP 4-5 0 4 3 6 5 publication, international application publication WO 9 4-2 5 5 8 5 publication, etc., ⁇ Nikkei Science, June issue, Pp. 40 to 50, 1 995 ”,“ Nature, V o 1. 3 6 8, p. 8 5 6— 8 5 9, 1 9 9 4 ”, special table 6-5 Each can be manufactured by referring to 0 0 2 3 3 and the like.
  • an immunoassay useful in the practice of the present invention, a bodily fluid sample from a subject is brought into contact with an anti-PCA-1 antibody, and then the PCA_1 and anti-PCA-1 antibody in the bodily fluid sample are contacted. An exemption-infestation complex is detected.
  • the condition of the present invention is not limited to a measuring system using a technique such as Uesutanburo' method, a for example, a radio I Takeno assay I (RIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Sandi Tsuchi immunoassay, fluorescence immunoassay (FIA), time-resolved fluoroimmunoassay (TR FIA), enzyme immunoassay (EIA), luminescence immunoassay (LIA), electrochemical photoimmunoassay (ECLIA) ), Latex agglutination method, immunoprecipitation assay, precipitation reaction method, gel diffusion precipitation reaction method, immunodiffusion assay method, agglutinin assay method, complement binding assay method, immunoradiometric assay method, fluorescence immunoassay method Methods, protein A immunoassays, etc.
  • a radio I Takeno assay I RIA
  • enzyme-linked immunosorbent assay ELISA
  • the anti-PCA-1 antibody is usually labeled, and examples of the type of label include fluorescent group, luminescent group, free radical group, particle, pacteriophage, cell, metal, enzyme Coenzymes, radioisotopes and the like.
  • agents other than antibodies, such as polypeptides that specifically bind to PCA-1 protein can be used to measure the level of PCA-1 protein expression.
  • Immunoassays to detect the expression of PCA-1 are typically obtained from a bodily fluid sample taken from a subject suspected of having prostate cancer or at risk for prostate cancer. Contacting with an anti-PCA-1 antibody under conditions that produce single antibody binding, and then measuring the amount of immunospecific binding by the antibody. In certain embodiments, for example, the binding of such antibodies can be used to detect the presence and Z or increased expression of PCA-1 protein. In this case, detection of increased PCA-1 protein expression is an indicator of disease state. If necessary, the level of PCA-1 protein in the body fluid sample may be compared to the level of healthy individuals without prostate cancer.
  • a body fluid sample such as a serum sample is contacted with a solid support or carrier such as nitrocellulose for the purpose of immobilizing all of the proteins present in the sample.
  • the support is then washed with buffer and subsequently treated with detectably labeled anti-PCA-1 antibody.
  • the solid support is then washed twice with buffer to remove unbound antibody.
  • the amount of bound antibody on the solid support is measured according to well-known methods. Appropriate detection conditions for each measurement can be appropriately determined by one skilled in the art using routine test methods.
  • the antibody is conjugated to an enzyme, such as that used in the enzyme immunoassay (EIA) [V oiler, A. "Enzyme-Like Immunosorbent A ssay” (ELISA), 1 9 7 8, Diagnostic Horizons, 2: 1 ⁇ 7, Microbiological A ssociates Q uarterly P ublication , W alkersvi 1 le, MD; V oi 1 er, A. J. CI i n. Pathol., 3 1: 5 0 7-5 2 0, 1 9 7 8: B tier, J. E. by M eth. Enzymol., 7 3: 4 8 2-5 2 3, 1 9 8 1].
  • EIA enzyme immunoassay
  • the enzyme that binds to the antibody is reacted with a suitable substrate, preferably a chromogenic substrate, in such a way that, for example, spectrophotometric measurement produces a chemical molecule that can be detected by fluorescence measurement with visible means.
  • a suitable substrate preferably a chromogenic substrate
  • Enzymes that can be used to attach a detectable label to the antibody include, but are not limited to, peroxidases and alkaline phosphatases. This detection can also be achieved by a colorimetric method using a chromogenic substrate for the enzyme.
  • Detection of anti-PCA-1 antibody can also be performed using various other methods.
  • PCA-1 protein expression can be detected by use of radioimmunoassay (RIA) [eg, the principle of radioimmunoassay by We intrsub, B., 7th training course on radioligand assay technology (see Principles of R adioi mm unoassays, S eventh ⁇ raining C s es R e n igand A ssay T echniques), T he Endocrine S ociety, 1 9 8 March ].
  • Radioisotopes can be detected by the use of means such as a gamma counter or a scintillation counter, or by autoradiography.
  • the antibody can also be labeled with a fluorescent compound.
  • fluorescent labeling compounds are fluorescein isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin and fluorescamine.
  • the antibody PCA-1 antibody can be labeled using a bioluminescent compound. The presence of a bioluminescent protein is measured by detecting the presence of fluorescence. Important bioluminescent compounds for this labeling purpose are noreciferin, luciferase and iequorin.
  • the PCA-1 protein in the body fluid sample Expression levels can be analyzed by two-dimensional electrophoresis.
  • Two-dimensional gel electrophoresis is known to those skilled in the art.
  • a body fluid sample such as a serum sample is loaded onto an isoelectric focusing electrophoresis gel that separates proteins based on charge in the first step.
  • Numerous first stage gel specimens can be used, including gel strips for separation based on immobilized gradients or tubular gels for separation based on carrier ampholytes.
  • the protein is transferred onto a second stage gel, then equilibrated and then separated using SDS-PAGE, which separates the proteins based on their molecular weight.
  • SDS-PAGE SDS-PAGE
  • Anti-PCA one for detecting autoantibodies
  • the present invention provides a method for detecting and Z or quantifying an anti-PCA-1 autoantibody in a body fluid sample of a subject as a prostate cancer marker. This method of the present invention can be used for diagnosis of prostate cancer. In addition, monitoring of anti-PCA_1 autoantibody levels can predict the progression of prostate cancer.
  • Detection of anti-PCA-1 autoantibodies in body fluid samples from subjects can be performed by any of a number of methods, but typical methods include immunoassays, such as Western blotting, Radioimmunoassay, E ISA, sandwich immunoassay, fluorescence immunoassay (FIA), time-resolved fluorescence immunoassay (TR FIA), enzyme immunoassay (EIA), luminescence immunoassay (LIA), electricity Chemiluminescence immunoassay (ECLIA), latitudus agglutination, immunoprecipitation assay, sedimentation reaction, gel diffusion sedimentation reaction, immunodiffusion assay, agglutinin assay, complement binding assay, immunoradiometric assay And Protein A epidemic test method.
  • immunoassays such as Western blotting, Radioimmunoassay, E ISA, sandwich immunoassay, fluorescence immunoassay (FIA), time-resolved fluorescence immunoa
  • Such an immunoassay can be implemented in various ways.
  • one method for performing such an assay involves the solid phase of PCA-1 protein, tethering on a support, and 'detection of anti-PC A-1 antibodies specific thereto.
  • the PCA-1 protein used in the assay of the present invention can be prepared by recombinant DNA techniques well known in the art.
  • DNA encoding the PCA-1 protein can be introduced into an appropriate expression vector by a gene recombination technique to express the PCA-1 protein on a large scale.
  • PCA-1 protein can be purified from natural sources.
  • the prostate using protein separation techniques well known in the art Purify from cancer cells.
  • purification techniques include, but are not limited to, molecular sieve chromatography and z or ion exchange chromatography.
  • a microtiter plate is advantageously used as a solid support for PCA-1 protein.
  • the above-mentioned assay for detecting PCA-1 or the assay for detecting anti-PCA-1 autoantibodies according to the present invention is a new one that can be used alone for prostate cancer diagnosis and Z or prognostic evaluation.
  • the present invention is not limited to such a form, and the accuracy of diagnosis can be further improved, for example, by using it in combination with another method for diagnosing prostate cancer.
  • Other methods for diagnosing prostate cancer include palpation screening, PSA testing, pathological examination using prostate cancer biopsy specimens (pathological T stage), Grayson cancer score, ultrasonography, Examples include MR I, CT, and bone scintigraphy.
  • the present invention also provides, in one embodiment, prostate cancer for detecting and Z or quantifying PCA-1 protein or a fragment thereof in a body fluid sample of a subject containing an anti-PCA-1 antibody as a prostate cancer marker.
  • a diagnostic agent for prostate cancer for detecting and / or quantifying 1 gene, PCA-1 mRNA, or a fragment thereof as a prostate cancer marker is provided.
  • the present invention provides a method for detecting and / or quantifying anti-PCA-1 autoantibodies in a body fluid sample of a subject containing PCA-1 or a fragment thereof as a first adenocarcinoma marker.
  • a diagnostic agent for prostate cancer Provide a diagnostic agent for prostate cancer.
  • the diagnostic agent of the present invention is an analogy in a body fluid sample (eg, blood, urine) of a subject.
  • a body fluid sample eg, blood, urine
  • it contains components for detecting PCA-1 protein, PCA-1 gene, or anti-PCA-1 autoantibodies.
  • PCA_1 protein or fragment thereof in a subject's body fluid sample is detected and determined or quantified by ELISA, such components may be levels of PCA-1 in body fluid samples such as blood and urine.
  • Consists of antibodies directed to a PCA-1 protein epitope that can be used to detect and Z or quantify.
  • the antibody may be labeled with radioactivity, fluorescence, colorimetry, or an enzyme label so that it can be detected by itself.
  • PCA-1 gene, PCA-1 mRNA, or a fragment thereof in a body fluid sample of a subject is detected and Z or quantified by hybridization with a probe
  • such components are:
  • PCA-1 gene, PCA-1 mRNA, or a fragment thereof in a body fluid sample of a subject is detected and Z or quantified by hybridization with a probe.
  • probes or primers designed based on the base sequence of the A-1 gene.
  • Such a probe or primer can be obtained by designing any number of suitable (sense or antisense) probes or primers from the nucleotide sequence of the PCA-1 gene shown in SEQ ID NO: 1.
  • diagnosis using such a diagnostic agent includes, for example, (a) a body fluid sample derived from a subject, and?
  • a polynucleotide consisting of a base sequence that can hybridize under stringent hybridization conditions to the base sequence of one gene, PCA-1mRNA, or a fragment thereof, and ( b) performing a method comprising the step of detecting or quantifying the hybridization between the polynucleotide in the sample and PCA-1 gene, PCA-1 mRNA, or a fragment thereof. Is done by.
  • P in a biological sample derived from a subject is used.
  • the DNA (or fragment thereof) or mRNA (or fragment thereof) of CA-1 gene is detected and / or quantified using the above probe.
  • the length of the base sequence used as a probe is, for example, 12 bases or more, 15 bases or more, 18 bases or more, 21 bases or more, 24 bases or more, 27 bases or more, 30 bases or more, or longer It can be a polynucleotide fragment of length.
  • Hybridization can be performed by a known method or a method similar thereto, for example, molecular cloning (Mo 1 e c u 1 a r C I o n
  • the “stringent condition” may be a low stringent condition, a medium stringent condition, or a high stringent condition.
  • Low stringent conditions are, for example, 5 X SSC, 5X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 32 ° C.
  • Medium stringent conditions are, for example, 5XSSC, 5X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 42. C condition.
  • “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5XSSC, 5X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 50 ° C. Under these conditions, it can be expected that DNA having high homology can be efficiently obtained as the temperature is increased. However, there are several factors that can affect the stringency of hybridization, such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration. A similar stringency can be achieved by selecting the appropriate elements.
  • PCA-1 gene PCA-1 mRNA, or a base sequence that can be hybridized under stringent hybridization conditions to the base sequence of the fragment
  • PC It also includes a base sequence (antisense DNA) complementary to the base sequence of A-1 mRNA or a fragment thereof.
  • Methods of hybridization of probes and nucleic acids are known to those skilled in the art, such as International Publication No. 8 9Z0 6 6 98, EP—A 0 20 O 3 62, US Pat. Nos. 2, 9 1-5, 0 8 2, EP_A 0 0 6 3 8 7 9, EP—A 0 1 7 3 2 5 1, EP—A 0 1 2 8 0 1 8.
  • a target sequence is prepared using a known method using a specific probe or primer for the PCA-1 gene, PCA-1 mRNA, or a fragment thereof. Can be detected or quantified.
  • known methods for example, Southern hybridization, Northern hybridization, RT_PCR method, PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, 8 74 4-7 9 9 (1 9 8 9)), Proceedingsofthe N atlona 1 A cademyor Sciences of United Sofates of Am erica, No. 8 6th, 2 7 6 6-2 7 7 0 (1 9 8 9)), FISH Method, DNA chip or array C GH method can be used. Quantitative detection can be performed by quantitative RT-PCR ; (3) Diagnostic agent using PCA-1 antigen
  • such components can be in the form of at least one, preferably several different PCA-1 antigens or their epitopes bound to a solid support.
  • a means for detecting anti-PCA-1 autoantibodies that bind to the target antigen is, for example, an antibody directed to the constant region of an anti-PCA-1 autoantibody (for example, a rabbit anti-anti-Ig G antibody) and is labeled so that it can be detected by itself. Detected (eg, radioactivity, fluorescence, colorimetric, or enzyme labeling) or labeled secondary antibody (eg, goat anti-rabbit antibody). This These diagnostic agents are used to detect prostate cancer markers by the immunological techniques described above.
  • the present invention also provides a kit for detecting and Z or quantifying PCA-1 protein or a fragment thereof in a body fluid sample of a subject containing an anti-PCA-1 antibody as a prostate cancer marker.
  • This kit is used to detect prostate cancer markers by the immunological techniques described above.
  • the present invention contains a base sequence that can be hybridized under hybridization conditions that are stringent to the base sequence of the PCA-1 gene, PCA-1 mRNA, or a fragment thereof. It also provides a kit for detecting and / or quantifying PCA-1 gene, PCA-1 mRNA, or fragments thereof in body fluid samples from subjects as prostate cancer markers. This kit is used to detect a prostate cancer marker by the hybridization method described above.
  • kits for This kit is used to detect prostate cancer markers by the immunological techniques described above.
  • the kit of the first embodiment contains a component for detecting and Z or quantifying PCA-1 antigen in a body fluid sample from a subject.
  • a component for detecting and Z or quantifying PCA-1 antigen in a body fluid sample from a subject For example, if PCA-1 protein is detected and / or quantified by ELISA, such components can detect and / or quantify the level of PCA-1 in body fluid samples such as blood and urine.
  • PCA can be used to make up antibodies directed against a single protein epitope.
  • the antibody may be labeled with radioactivity, fluorescence, colorimetry, or an enzyme label so that it can be detected by itself.
  • the kit contains a labeled secondary antibody. Moyo-Ryo.
  • the kit of the second aspect detects and / or detects PCA-1 gene or a fragment thereof, or a transcription product (mRNA) or a fragment thereof of a body fluid sample from a subject.
  • the component to quantify is contained.
  • Such components include, for example, a polynucleotide composed of a nucleotide sequence that can hybridize under stringent hybridization conditions to the nucleotide sequence of PCA-1 gene, PCA-ImRNA, or a fragment thereof.
  • the kit of the present invention may contain the above-mentioned polynucleotide immobilized on a DNA chip.
  • the kit according to the third embodiment contains components necessary for detecting and / or quantifying anti-PCA-1 autoantibodies in a body fluid sample from a subject.
  • such components can contain at least one, preferably several different PCA-1 antigens bound to the solid support, or their different It consists of a target antigen in the form of an epitope, and a means for detecting anti-PCA-1 autoantibodies that bind to the target antigen.
  • detection means are, for example, antibodies directed against the constant region of anti-PCA-1 autoantibodies (eg, rabbit anti-human IgG antibody) and are labeled so that they can be detected by themselves.
  • the kit of the present invention comprises an anti-PCA-1 antibody,? ⁇ ⁇ 1 gene, PCA— Polynucleotide consisting of a base sequence that can hybridize to the base sequence of 1 mRNA, or a fragment thereof under a stringent hybridization condition, PCA-1 antigen or anti-PCA— 1 Containers and labels may be included in addition to antibodies against autoantibodies.
  • the label on or with the container may indicate that the drug is used to detect prostate cancer markers. It may also contain other items such as instructions for use, labeled secondary antibodies, etc.
  • Serum derived from prostate cancer patients was prepared by allowing blood immediately after collection to stand at room temperature for 40 minutes, and then removing blood cell components by centrifugation. Specimen sample (serum) 1 2.5 1 is pre-treated with 100 mM ammonium hydrogen carbonate. 1) Bly Sepharose 6 Fast F low Biosciences) 5 0 1. Mix gently and let stand.After 5 minutes, 1. Mini column (Wizard Mini'columns, P in 5 ml microtube) romega) to Blue S epharose 6 F ast
  • the volume of the fraction obtained from these operations was about 65 ⁇ l.
  • a mass spectrometer coupled with HP L C that ionizes components in a sample separated by HPLC and measures the mass thereof was used.
  • a mass spectrometer (LC / MS) HCT plu 5 (Blue Car 'Daltonics) was used at a capillary voltage of 1.2 kV to 1.5 kV.
  • the sample subjected to the trypsin treatment as described above was set in the sample holder of the LC force ram of the mass spectrometer, and measurement was started.
  • Figure 1 shows the elution profile of a blood sample from a subject with prostate cancer monitored by the LC-MS mass spectrometer.
  • the vertical axis of the graph corresponds to the ion intensity, and the horizontal axis corresponds to the retention time.
  • the present inventors have specially selected PCA-1.
  • the mass of a tryptic peptide fragment was calculated based on its amino acid sequence, and an attempt was made to selectively monitor peptide fragments having that specific mass.
  • Table 1 shows the tryptic peptide fragment of PCA-1 obtained by insilico calculation (peptide mass> 600), expected mass, and expected divalent ion mass-to-charge ratio ( mZ z), and the position of each peptide fragment in the PCA-1 amino acid sequence.
  • a peptide having a known amino acid sequence can be selected from a mixture of peptides having many different masses, the mass of the amino acid sequence and the cleavage peptide that can be generated from the peptide.
  • mass and ⁇ i.e. it should be possible to detect with a mass predicted from the amino acid sequence of tryptic peptide fragments of the P CA- 1, the mass of the cleavage base peptide predicted from the base peptide Can be used to determine whether a molecule with a unique sequence for PCA-1 is present in a blood sample from a prostate cancer patient.
  • HSQP WQ VLVASR SEQ ID NO: 2 9 in Table 1
  • cleavage ions such as y 5 and y 6 above are based on the method shown in the following chemical formula.
  • FIG. 4 shows the MSMS data analysis for the single peak observed in Figure 2B (marked with an arrow in the figure). As shown in Figure 4, in this case, proper sequencing was not possible.
  • Figure 5 shows, for comparison, MSMS data for the peak near retention time of 64 minutes observed in Figures 2C and D.
  • strong signals are observed at y3, y4, y5, y6, y7, y8, y9, yl0, yll, etc., and the width between these signals is Since the mass was estimated from the size, the amino acid residue corresponding to the mass was estimated.
  • FIG. 6 shows a sample of a molecule having a specific mass under the same measurement conditions as in the experiment shown in FIG.
  • the elution profile file is shown when monitoring is performed. As shown, no specific high intensity peak was observed. This is the PCA predicted in the blood sample of healthy subjects.
  • a trypsin-degrading peptide fragment and a molecule with a mass corresponding to the mass of the PSA tryptic peptide fragment were developed by the present inventors. It may be present in such a small amount that it cannot be detected by the detection method using an LC-MS mass spectrometer.
  • PCA-1 can be used as a prostate cancer marker in the blood as well as PSAA. Furthermore, this result strongly suggests that the PCA-1 protein itself can be a self-antigen in prostate cancer patients. Thus, one skilled in the art can appreciate that autoantibodies against PCA-1 can also be used as a marker for prostate cancer in the blood.
  • PVDF polyvinylidenefluoride
  • Figure 7 shows the results. As shown, a prominent single band was detected in urine samples from prostate cancer patients detected by anti-PCA-1 antibody. Based on the analysis using the marker, the position coincided with the estimated molecular weight of PCA-1 protein. On the other hand, in one healthy subject's urine, although weak in one case, a band was found at the same position as the band detected in the urine specimen of prostate cancer patients, but the other case was below the detection limit.
  • PCA-1 was only slightly detected or not substantially detected in healthy human urine specimens, but was significantly detected in urine specimens from prostate cancer patients. This result indicates that PCA-1 can be used as a urinary prostate cancer marker.
  • the present invention is useful as a prostate cancer marker capable of accurately, quickly and easily diagnosing prostate cancer and reducing the burden on both patients and doctors.

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Abstract

本発明は、被験者の体液試料中のＰＣＡ−１を前立腺がんマーカーとして検出および／または定量する方法を提供する。本発明はまた、被験者の体液試料中の抗ＰＣＡ−１自己抗体を前立腺がんマーカーとして検出および／または定量する方法を提供する。本発明は、前立腺がんの診断をより簡易、迅速、安価にする。

Description

明細書 前立腺がんの診断方法 技術分野
本発明は、 前立腺がんの診断方法に関し、 特に、 被験者の体液 （例え ば、 血液、 尿） 試料中の P C A— 1をマーカーと して前立腺がんを診断 する方法およびそのためのキッ 卜に関する。 背景技術
前立腺がんは、 欧米では男性がん死亡者の約 2 0 %を占める頻度の高 いがんであり、 日本でも食事の欧米化および高齢化社会に伴い、 その頻 度は増加傾向にある。 泌尿器科領域におけるがんでは、 日本においても 最も多いがんであり、 罹患者の早期発見は医学上重要な意義がある。 現在、 前立腺がんの診断には、 前立腺特異抗原 （P S A ) が一般的に 使用されており、 抗原抗体反応を用いた血液成分中の P S A検出キッ ト が多数市販されている。 血中 P S A測定は、 鋭敏に前立腺がんの存在を 検出できる検査であり、 また、 がんの進行とともに P S A値も上昇する ため、 病期までも予測できるなどの利点がある。
しかしながら、 血中 P S A値は前立腺肥大症や前立腺炎でも上昇する ことがしばしばあり、 また前立腺がんの初期段階では P S A値は正常で ある場合もあるため、 偽陰性の診断を生じるという問題がある。 したが つて、 前立腺がんの確定診断のためには、 さらに、 穿刺吸引生検法や経 直腸または経会陰的針生検にて前立腺の組織を採取し、 顕微鏡で検査す る組織診断をしなければならない。
一方、 がんにおいて発現が亢進しているタンパク質のどれが抗原性で あり または体液中で濃度増加することがあるかについて予測できる知見 はほとんどない。 前立腺がんの細胞または組織において発現が亢進して いる遺伝子およびタンパク質は極めて多数存在するが、 これらの極多数 TJP2006/305480 の増幅遺伝子またはタンパク質の全てが前立腺がんの診断マーカーと し て利用可能であるわけではない。 例えば、 現在、 I n V i t r o g e n 社から前立腺がんで発現している多数の c D N Aが販売されているが、 これらの遺伝子の前立腺がん患者における動態は全く未知である。なお、 P CA— 1 ( p r o s t a t e c a n c e r a n t i g e n— 1 ) が前立腺がん細胞または組織において発現が亢進している遺伝子と して 同定されたという報告がある （第 1 2 3回日本薬学会年会要旨集 4、 p 1 5、 2 0 0 3年）。 発明の開示
現状では、 前立腺がんの診断は、 患者および医師にとって負担が大き く、 労力と時間がかかるものである。 そこで、 前立腺がんの診断をより 簡易、 迅速、 かつ患者および医師の負担を少なくするための新たな方法 が求められている。 特に、 体液 (例えば、 血液、 尿） 試料を用いて迅速、 確実な診断を可能にするための、 あらたな前立腺がんマーカーの開発が 望まれている。
上記のような従来の課題を解决するために、本発明は、以下のような、 被験者の体液試料中の P C A— 1、 ？ 〇 ー 1遺伝子、 P C A— l m R N A、 または抗 P C A— 1 自己抗体を前立腺がんマ一カーと して検出 する方法および検出用キッ ト、 ならびに診断剤を提供する。
( 1 ) 被験者由来の体液試料中の P C A— 1を前立腺がんマーカ一と し て検出およびノまたは定量する方法。
( 2 ) 前記体液試料が、 全血、 血清、 または血漿である、 （ 1 ) に記載の 方法。
( 3) 前記体液試料が、 尿である、 （ 1 ) に記載の方法。
(4 ) 質量分析装置を用いて、 P C A— 1 を検出および/または定量す る、 （ 1 ) 〜 （ 3 ) のいずれかに記載の方法。
( 5 ) 抗 P C A— 1抗体を用いて、 P C A— 1を検出およびノまたは定 量する、 （ 1 ) 〜 （ 3 ) のいずれかに記載の方法。 TJP2006/305480
( 6 ) 前記体液試料と抗 P C A— 1抗体とを接触させる工程、 および 前記体液試料中の P CA— 1 と前記抗 P CA— 1抗体との結合を検出 および/または定量する工程
を包含する、 （ 5) に記載の方法。
( 7 ) 前記検出および/または定量する工程が、 標識された抗 P C A— 1抗体を用いて、 P CA— 1 と抗 P C A— 1抗体との結合を検出および /または定量することを包含する、 （ 6 ) に記載の方法。
( 8 ) ウェスタンブロ ッ ト法、 ラジオィ ムノアッセィ （ R I A )、 酵素結 合免疫吸着検定法 （E L I S A)、 サン ドィツチ免疫測定法、 蛍光免疫測 定法 （F I A)、 時間分解蛍光免疫測定法 （TR F I A)、 酵素免疫測定 法 （E I A)、 発光免疫測定法 （L I A)、 電気化学発光免疫測定法 （E C L I A)、 ラテックス凝集法、 免疫沈降アツセィ、 沈降素反応法、 ゲル 拡散沈降素反応法、 免疫拡散検定法、 凝集素検定法、 補体結合検定法、 免疫放射分析検定法、 蛍光免疫検定法、 およびプロテイ ン A免疫検定法 からなる群から選択される免疫測定法に従う、 （ 5 ) 〜 （ 7 ) のいずれか に記載の方法。
( 9 ) 前立腺がんの診断に用いるための、 （ 1 ) 〜 （ 8 ) のいずれかに記 载の方法。 '
( 1 0 ) 抗 P C A— 1抗体を含有する、 被験者由来の体液試料中の P C A— 1 を前立腺がんマーカ一と して検出および Zまたは定量するための、 前立腺がん診断剤。
( 1 1 ) P C A— 1遺伝子、 P C A— 1 ni R N A、 またはその断片の 塩基配列にス ト リ ンジェン トなハィブリ ダイゼーシヨ ン条件下でハィブ リ ダイズ可能な塩基配列からなるポリ ヌク レオチ ドを含有する、 被験者 由来の体液試料中の P C A— 1遺伝子、 P CA— l mR NA、 または その断片を前立腺がんマ一カーと して検出および/または定量するため の、 前立腺がん診断剤。
( 1 2 ) 前記体液試料が、 全血、 血清、 または血漿である、 （ 1 0 ) また は （ 1 1 ) に記載の診断剤。 ( 1 3 ) 前記体液試料が、 尿である、 （ 1 0 ) または （ 1 1 ) に記載の診 断剤。
( 1 4 ) 抗 P C A— 1抗体を含有する、 被験者由来の体液試料中の P C A— 1 を前立腺がんマ一カーと して検出および/または定量するための キッ ト。
( 1 5 ) 標識された抗 P C A— 1抗体をさらに含有する、 （ 1 4) に記載 のキッ ト。
( 1 6 ) ウェスタンプロ ッ ト法、 ラジオィムノアッセィ （ R I A )、 酵素 結合免疫吸着検定法 （E L I S A)、 サン ドイ ッチ免疫測定法、 蛍光免疫 測定法 （ F I A)、 時間分解蛍光免疫測定法 （T R F I A)、 酵素免疫測 定法 （E I A)、 発光免疫測定法 （L I A)、 電気化学発光免疫測定法 （E C L I A)、 ラテックス凝集法、 免疫沈降アツセィ、 沈降素反応法、 ゲル 拡散沈降素反応法、 免疫拡散検定法、 凝集素検定法、 捕体結合検定法、 免疫放射分析検定法、 蛍光免疫検定法、 およびプロテイ ン A免疫検定法 からなる群から選択される免疫測定法に従って前記検出および または 定量を行うための、 （ 1 4 ) または （ 1 5 ) に記載のキッ ト。
( 1 7 ) ?じ ー 1遺伝子、 P CA— 1 mRNA、 またはその断片の 塩基配列にス ト リ ンジヱン トなハイブリダィゼーショ ン条件下でハイブ リ ダイズ可能な塩基配列からなるポリヌク レオチドを含有する、 被験者 由来の体液試料中の P C A _ 1遺伝子、 P CA— l mRNA、 または その断片を前立腺がんマーカーと して検出および/または定量するため のキッ ト。
( 1 8 ) 前記体液試料が、 全血、 血清、 または血漿である、 （ 1 4 ) 〜 （ 1 7 ) のいずれかに記載のキッ ト。
( 1 9 ) 前記体液試料が、 尿である、 （ 1 4 ) 〜 （ 1 7 ) のいずれかに記 載のキッ 卜。
( 2 0 ) 前立腺がんの診断に用いるための、 （ 1 4) 〜 （ 1 9 ) のいずれ かに記載のキッ ト。
( 2 1 ) 被験者由来の体液試料中の抗 P C A— 1 自己抗体を前立腺がん マーカーと して検出および./または定量する方法。
( 2 2 ) 前記体液試料が、 全血、 血清、 または血漿である、 （ 2 1 ) に記 載の方法。
( 2 3 ) 前記体液試料が、 尿である、 （ 2 1 ) に記載の方法。
( 2 4) P C A— 1抗原を用いて、 前記抗 P C A— 1 自己抗体を検出お よび/または定量する、 （ 2 1 ) 〜 （ 2 3) のいずれかに記載の方法。
( 2 5 ) 前記体液試料と P C A— 1抗原とを接触させる工程、 および 前記体液試料中の抗 P C A— 1 自己抗体と P C A— 1抗原との結合を 検出および Zまたは定量する工程
を包含する、 （ 2 4 ) に記載の方法。
( 2 6 ) 前記検出および Zまたは定量する工程が、 抗 P CA— 1 自己抗 体に対する標識された抗体を用いて、 P CA— 1 と抗 P CA— 1 自己抗 体との結合を検出および Zまたは定量することを包含する、 （ 2 5 ) に記 載の方法。
( 2 7 ) ウェスタンブロ ッ ト法、 ラジオィムノ アッセィ （ R I A )、 酵素 結合免疫吸着検定法 （E L I S A)、 サン ドィ ツチ免疫測定法、 蛍光免疫 測定法 （F I A)、 時間分解蛍光免疫測定法 （T R F I A)、 酵素免疫測 定法 （E I A)、 発光免疫測定法 （L I A)、 電気化学発光免疫測定法 （E C L I A)、 ラテックス凝集法、 免疫沈降アツセィ、 沈降素反応法、 ゲル 拡散沈降素反応法、 免疫拡散検定法、 凝集素検定法、 補体結合検定法、 免疫放射分析検定法、 蛍光免疫検定法、 およびプロテイン A免疫検定法 からなる群から選択される免疫測定法に従う、 （ 2 1 ) 〜 （ 2 6 ) のいず れかに記載の方法。
( 2 8 ) 前立腺がんの診断に用いるための、 （ 2 1 ) 〜 （2 7 ) のいずれ かに記載の方法。
( 2 9 ) P C A— 1抗原を含有する、 被験者由来の体液試料中の抗 P C A— 1 自己抗体を前立腺がんマ一カーとして検出および/または定量す るためのキッ ト。
( 3 0) 抗 P CA— 1 自己抗体に対する標識された抗体をさらに含み、 当該抗体を、 前記 P C A— 1抗原と前記抗 P C A— 1自己抗体との結合 を検出および/または定量するために利用する、（ 2 9)に記載のキッ ト。 ( 3 1 ) ウェスタンブロ ッ ト法、 ラジオィムノアッセィ （R I A)、 酵素 結合免疫吸着検定法 （E L I S A)、 サンドィツチ免疫測定法、 蛍光免疫 測定法 （F I A)、 時間分解蛍光免疫測定法 （TR F I A)、 酵素免疫測 定法 （E I A)、発光免疫測定法 （L I A)、 電気化学発光免疫測定法 （E C L I A)、 ラテックス凝集法、 免疫沈降アツセィ、 沈降素反応法、 ゲル 拡 m沈降素反応法、 免疫拡散検定法、 凝集素検定法、 補体結合検定法、 免疫放射分析検定法、 蛍光免疫検定法、 お びプロテイン A免疫検定法 — からなる群から選択される免疫測定法に従って前記検出および/または · 定量を行うための、 （ 2 9 ) または （3 0 ) に記載のキッ ト。
( 3 2) 前立腺がんの診断に用いるための、 （ 2 9 ) 〜 （ 3 1 ) のいずれ かに記載のキッ ト。 ―
( 3 3 ) P C A— 1抗原を含有する、 被験者由来の体液試料中の抗 P C A— 1 自己抗体を前立腺がんマーカーとして検出および Zまたは定量す るための、 前立腺がん診断剤。
本発明により、 P C A— 1を被験者の体液 （例えば、 血液、 尿） 試料 中の前立腺がんマーカーと して利用する方法が初めて提供される。 本発 明は、 単独の検査によつて前立腺がんの診断が可能な正確な前立腺がん 診断方法を提供し得る。 また、 必要に応じて既存の前立腺がんの診断方 法と組み合わせることにより、 より確実な前立腺がんの診断を可能にす る。 本発明は、 体液試料を用いて非浸襲的または浸襲性の程度の低い測 定形態を採り得るため、 患者および医者の両方にとって負担が少なく、 迅速かつ簡易な前立腺がんの診断方法を提供し得る。 本発明は、 前立腺 がんの診断のみならず、 予後評価、 がんの疾病素質を有する被験者の同 定、 およびがんの治療を受けている患者の観察のために有用である。 図面の簡単な説明
図 1は、 L C一 M S質量分析装置によりモニタリングし 前立腺がん を有する被験者由来の血液試料の溶出プロファイルを示—す図である。 図 2は、 （ A ) , (B) P C A— 1の i n s i 1 i c o トリプシン分解 ぺプチド断片及び当該ぺプチドから生じ得る開裂ぺプチドの質量を有す る分子を L C一 MS質量分析装置で選択的にモニタリングした場合、 な らぴに （C), (D) 比較のために、 P S Aの i n s i 1 i c o リプ シン分解ぺプチド断片及び当該ぺプチドから生-じ得る開裂ぺプチドの質 量を有する分子を L C— MS質量分析装置で選択的にモニタリングした 場合の、 溶出プロファイルを示す図である。
図 3は、 図 2— (A) で保持時間 6 8分付近に観察された P C A_ 1 ピ ークに対する MS MS解析によって決定されたアミノ酸配列を示す図で ある。 ' 図 4は、 図 2 (B) で保持時間 6 2分付近に観察された P C A— 1 ピ ークに対する MS MS解析によって決定されたアミノ酸配列を示す図で ある。
図 5は、 比較のために、 図 2 (C) 及び （D) で保持時間 6 4分付近 に観察された p S Aピークに対する MSMS解析によって決定されたァ ミノ酸配列を示す図である。 - 図 6は、 図 2に示す実験の比較例として、 前処理およびトリプシン処 理を施した健常者由来の血液試料について、 図 2に示す実験と同様の設 定で特定の質量を有する分子のモニタ リングを行った場合の溶出プロフ アイルを示す図である。
図 7は、 前立腺がん患者由来の尿試料中の P C A— 1の存在を示すゥ エスタンブロッ ト分析の結果を示す写真である。 発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、 血液中の標的ポリぺプチドの存在とその量を迅速に解 析するための手法として、 質量分析装置を用いた新たな解析手法.を開発 し、 これを用いて血液試料中の P C A— 1の検出を試みた。 その結果、 前立腺がん患者由来の血液試料中に P C A— 1が存在すること、 および 健常者由来の血液試料中では P C A— 1が実質的に検出されないことを 確認した。 本発明は、 このような新たな知見に基づく ものであり、 P C A— 1が血液のような体液試料中の前立腺がんマーカーとして使用し得 ることを初めて実証するものである。 - さらに本発明者らは、 前立腺がん患者の尿試料中においても P C A— 1が検出され得ること、 および健常者由来の尿試料中では P C A— 1が わずかに検出されるのみかまたは実質的に検出されないことを確認した。 このように、 本発明はまた、 P C A— 1が尿のような体液試料中におい ても前立腺がんマーカーとして使用し得ることを初めて実証するもので ある。
したがって、 本発明は、 1つの態様において、 被験者由来の体液試料 中の P C A— 1を前立腺がんマーカーと して検出および/または定量す る方法を提供する。 本発明の方法は、 前立腺がんの診断または予後評価 等に適用し得る。
本発明はまた、 別の態様において、 被験者由来の体液試料中の抗 P C A— 1自己抗体を前立腺がんマーカーと して検出および/または定量す る方法を提供する。 すなわち、 本発明は、 前立腺がんの診断または予後 評価等に適用する ;ための抗 P C A— 1 自己抗体の体液中発現を検出およ び/または定量する方法を提供する。
(体液中の P C A— 1または抗 P C A _ 1自己抗体の検出および/ま たは定量） _
被験者から採取された血液または尿のような体液試料中の P C A - 1 タンパク質の検出には、 多くの方法があり、 そのいずれかを用いて検出 を行うことが可能である。 上記のような質量分析装置を用いた検出法の ほかに、 例えば、 P C A— 1タンパク質が P C A— 1タンパク質に特異 的に結合する抗体 （抗 P C A— 1抗体） によって検出される免疫測定法 が使用され得る。 本発明に有用な抗体は、 P C A— 1タンパク質または その断片の存在を定量的にまたは定性的に検出するために使用され得る。 したがって、 1つの態様において、 本発明は、 抗 P CA— 1抗体を用い て、 被験者由来の体液試料中の前立腺がんマーカーを検出する方法を提 供する。
また、 被験者から採取された血液または尿'のような体液試料中の P C A— 1ポリヌクレオチドの検出には、 多くの方法があり、 そのいずれか を用いて検出を行うことが可能である。 検出可能なポリヌクレオチドに は、例えば、 P C A— 1遺伝子またはその断片、 P CA— 1 mRNA、 選択的スプライス変異型の P C A— 1 mRNA、 および P CA— 1ポ リヌク レオチドを含む組換え DN Aまたは RN A分子が含まれる。
P CA— 1ポリヌクレオチドの增幅および/またはその存在の検出を 行うための数多くの方法が当該分野で周知であり、 本発明のこの局面の 実施において使用し得る。 例えば、 1つの態様において、 体液試料中の P CA— 1 mR N Aを検出するための方法は、 少なく とも 1つのプラ イマ一を使用する逆転写によって試料から c D N Aを作製する工程、 そ のようにして作製した c D N Aをその中の P C A— 1 c DNAを増幅 するために P CA— 1ポリヌク レオチドをセンスおよびアンチセンスプ ライマーと して用いて増幅する工程、 ならびに増幅された P C A- 1 c D N Aの存在を検出する工程を包含する。さらに、別の態様において、 体液試料中の P C A— 1遺伝子を検出するための方法は、 体液試料から ゲノム D NAをまず単離する工程、 単離されたゲノム D NAをその中の P C A— 1遺伝子を増幅するために P CA— 1ポリヌクレオチドをセン スおよびアンチセンスプライマーとして使用して増幅する工程、 ならび に増幅された P C A— 1遺伝子の存在を検出する工程を含む。
本明細書中、 「P CA— 1」 または 「P CA— 1タンパク質」 とは、 そ の遺伝子が G e n B a n k A c c e s s i o n N o . AB 04 2 0 2 9で特定されるヒ ト P CA— 1タンパク質のことをいい、 P CA— 1 タンパク質のアミノ酸配列は、 公にアクセス可能なタンパク質データべ ースの A c c e s s i o n N o . N P— 6 3 1 9 1 7 (配列番号： 2 ) で特定される。 また、 本明細書中、 体液試料中の P C A— 1を前立腺が んマーカーとして使用する態様で 「P CA— 1」 という場合には、 P C A- 1の全長タンパク質に限らず、 体液試料中のプロテアーゼによる P C A— 1の分解産物もしくは P C A— 1の断片、 またはこれらの誘導体 をも含むものとする。 ここで、 「誘導体」 とは'、 P C A— 1タンパク質ま たはその断片のアミノ酸配列において 1または数個 （例えば、 6個） の アミノ酸残基の変異、 置換、 欠失および/または付加を含み、 実質的に P CA—：！タンパク質と同じ抗原特異性を有するぺプチドまたはポリぺ プチドを含むものとする。 誘導体の典型的な例には、 ？〇 ー 1多型、 スプライシングなどによる配列変化がある。
本明細書中、 体液試料中の P C A— 1を前立腺がんマーカーとして使 用する態様で使用する 「抗 P C A— 1抗体」 には、 P CA— 1、 ならび にプロテアーゼによる P CA— 1の分解産.物もしくは P CA— 1の断片、 またはこれらの誘導体に特異的に結合する抗体が含まれるものとする。 これらのプロテアーゼ分解産物または断片の長さとしては、 抗 P CA— 1抗体に特異的な抗原と して認識され得る長さであれば制限はないが、 好ましくは 6アミノ酸以上、 より好ましくは 8アミノ酸以上、 さらに好 ましくは 1 0アミノ酸以上である 〈例えば、 アミノ酸配列 ： RR AP E P RV I DR E G' (配列番号 3 4) またはその部分配列を含む断片）。 ま た、 これらの分解産物または断片は、 P C A— 1タンパク質の任意の部 分であり得るが、 P CA— 1タンパク質のェピトープに対応するカ ェ ピトープに対応する部分を含んでいることがより好ましい。 また、 「誘導 体」 とは、 P C A— 1タンパク質またはそのプロテアーゼ分解産物もし くは断片のアミノ酸配列において、 1または数個 (例えば、 6個） のァ ミノ酸残基の変異、 置換、 欠失および または付加を含み、 実質的に P CA— 1タンパク質と同じ抗原特異性を有するぺプチドまたはポリぺプ チドを含むものとする。
本明細書中、 体液試料中の抗 P C A— 1 自己抗体を前立腺がんマーカ 一として使用する態様で使用する 「P CA_ 1」、 「P CA— 1タンパク 質」 または「P C A— 1抗原」 には、 P C A— 1タンパク質のみならず、 P C A— 1タンパク質のェピトープを含むかまたはェピトープとして抗 P C A - 1抗体に認識され得る断片、 およびこれらの誘導体をも含むも のとする。 ここで、 断片の長さとしては、 抗 P C A— 1抗体に特異的な 抗原として認識され得る長さであれば制限はないが、 好ましくは 6アミ ノ酸以上、 より好ましくは 8アミノ酸以上、 さらに好ましくは 1 0アミ ノ酸以上である。 また、 これらの分解産物または断片は、 P C A— ：！ タ ンパク質の任意の部分であり得るが、 P C A— 1タンパク質のェピトー プに対応するか、 ェピトープに対応する部分を含んでいることがより好 ましい。 また、 「誘導体」 とは、 P C A— 1タンパク質またはその断片の アミノ酸配列において 1または数個 （例えば、 6個） のアミノ酸残基の 変異、 置換、 欠失および Zまたは付加を含み、 実質的に P C A— 1タン パク質と同じ抗原特異性を有するぺプチドまたはポリぺプチドを含むも のとする。
本明細書中、 抗体があるタンパク質または分解産物または断片に 「特 異的に結合する」 とは、 その抗体が他のアミノ酸配列に対するその親和 性よりも、 これらのタンパク質または分解産物または断片の特定のアミ ノ酸配列に対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。 ここ で、 「実質的に高い親和性」 とは、 所望の測定装置によって、 その特定の ァミノ酸配列を他のアミノ酸配列から区別して検出することが可能なほ どに高い親和性を意味する。
本明細書中、 「前立腺がんマーカー」 とは、 被験者の体液 （例えば、 血 液、 尿、 リンパ液、 唾液、' 汗、 精液等） または細胞もしくは組織中にお ける、 正常前立腺組織に由来していないか、 あるいは前立腺がん細胞ま たは組織において選択的に発現の亢進している分子のことをいい、 被験 者の体液または細胞もしくは組織中における当該分子の存在が前立腺が んの存在を示すかまたは示唆するものをいう。
本明細書中、 「体液試料」 には、 被験者由来の血液、 尿、 リ ンパ液、 唾 液、 汗、 精液等の体液試料が含まれるものとする。 本発明において使用 される体液試料の好ましい例は、 血液または尿であり、 特に好ましくは 血液試料である。
本明細書中、「血液試料」とは、被験者から得られた血液試料を指すが、 全血に限定されず、 血清、 血漿等の血液成分分画、 もしくはさらにアル ブミン、 ィムノグロプリン等を除いた血液成分分画または血液製剤等を も含むものとする。
本明細書中、 「前立腺がん」 とは、 前立腺において発生したがんを広く 包含する概念であり、 前立腺に発生した腺がんのみならず、 扁平上皮が ん、 移行上皮がん、 神経内分泌がん、 未分化がん等をも包含する。 好ま しくは、 前立腺がんは、 前立腺に発生した腺がんである。
本明細書中、 「被験者」 とは、 広く本発明の方法を用いた検査の対象と なる体液試料を採取されるヒ トをさすが、 主と して、 男性ヒ トであり、 より具体的には、 健康診断等の被験男性ヒ ト、 あるいは前立腺がんの自 覚症状 （例えば、 残尿感）、 触診検査 （前立腺のしこ り等）、 血清中等の P S A濃度検査 （高値の P S A濃度等） 等により、 前立腺がんを発症し ていることが疑われる男性ヒ トなどが含まれる。 -
(抗体） - 本発明においで使用する抗 P C A— 1抗体は、 ポリクローナル抗体で あってもよいし、 モノ ク ローナル抗体であってもよい。 さらに、 「抗体」 とは一般に、 任意の抗体断片または誘導体、 特に、 実質的に同じ抗原特 異性を示す前記モノクローナルまたはポリクローナル抗体の断片または 誘導体を含む。 後者は、 抗体断片 （F a b、 F a b ' 2、 C D Rなど）、 ヒ ト化抗体、 多機能抗体、 単鎖抗体 （S c F v ) などを含む。 本発明に 使用する抗体は、 動物を免疫化し、 血清 （ポリクローナル） または脾臓 細胞を回収すること （適切な細胞系との融合によるハイプリ ドーマの作 製のため） を含む、 従来の方法により作製することができる。
抗体のクラスは、 特に限定されず、 I g G、 I g M、 I g A、 I g D、 または I g E等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。 好 ましくは、 I g Gまたは I g Mであり、 精製の容易性等を考慮すると、 よ り好ましくは I g Gである。
マウス、 げっ歯類、 霊長類、 ゥマ、 ブタ、 ゥサギ、 家禽などを含む種々 の種に由来するポリ ク ローナル抗体の作製法は、 例えば V a i t u k a i t i s ら (V a i t u k a i t i s、 R o'D b i n s ら、 J C l i n — E n d o c r i n o l M e t a b . 3 3 (6) : 9 8 8 - 9 1 , 1 9 7 1 ) に見いだすことができる。 抗原をァ-ジュバン ト （例えばフロ イ ン トのアジュバント） と合わせ、 動物に、 典型的には皮下注射により • 投与する。 繰り返し注射してもよい。 血液試料を回収し、 免疫グロプリ ンまたは血清を単離する。 · "
異なる種からモノ ク ローナル抗体を作製する方法は、 例えば H a r 1 o wら 、 ri a r l o w a n d L a n e 、 e d .ハ A n t ι b o d i e s : a l a b o r a t o r y m a n u a l . C o l d S 一 p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y, C o l d S p r i n g H a r b o r , N. Y p . 1 3 9 - 2 8 2. 1 9 8 8) または1： 0 11 1 6 1： ら （1： 0 11 1 6 3：ぉょび1^ 1 1 5 セ 6 ：1 11 N a t u r e . 2 5 6 ( 5 5 1 7) : 4 9 5二 7， 1 9 7 5) に見—いだす — 'ことができる。 この方法は、 動物を抗原で免疫化し、 その後、 脾臓細胞 を回収し、 これをその後、 骨髄腫細胞などの不死化細胞と融合すること を含む。 得られたハイプリ ドーマはモノ ク ローナル抗体を生じ、 限界希 釈により選択して個々のクローンを単離することができる。抗体はまた、 例えば W a r d ら （Wa r d、 G u s s o wら N a t u r e . 3 4 1 ( 6 2 4 2) : 5 4 4— 6 , 1 9 8 9 ) に開示されているようなコンビ ナト リアル免疫グロブリ ンライブラリ一の選択により作製することがで さる。 .
F a bまたは F a b， 2断片は、 従来の方法によるプロ アーゼ . (例 えば、 ペプシンまたはパパイン） を用いた消化により作製することがで きる。 ヒ ト-ィ匕抗体は、 例えば R i e c h m a n nら （ R i e c h .m a n n J Mo 1 B i o l . O c t 5 ; 2 0 3 ( 3 ) : 8 2 5 - 8, 1 9.8 8 )、 および J o n e s ら （ J o n e s ら N a t u r e 3 2 1 ： 5 2 2 - 5 2 5 , 1 9 8 6 ) に記载のような方法の 1つにより調製 することができる。
また、 キメラ抗体は、 例えば、 「実験医学 （臨時増刊号）、 V o l . 1. 6， N o . 1 0 , 1 9 8 8」、 特公平 3— 7 3 2 8 0号公報等を、 ヒ ト化 抗体は、例えば、 「N a t u r e G e n e t i c s , V o l . 1 5， p . 1 4 6— 1 5 6 , 1 9 9 7」、 「 N a t u r e G e n e t i c s , V o 1 . 7 , p . 1 3 - 2 1 , 1 9 9 4」、 特表平 4 - 5 0 4 3 6 5号公報、 国際出願公開 WO 9 4 - 2 5 5 8 5号公報等、「日経サイエンス、 6月号、 第 4 0〜第 5 0頁、 1 9 9 5年」、 「N a t u r e , V o 1 . 3 6 8 , p . 8 5 6— 8 5 9， 1 9 9 4」、 特表平 6— 5 0 0 2 3 3号公報等を参考に それぞれ製造す—ることができる。
(免疫ァッセィ）
1. P CA— 1検出のためのアツセィ
'本発明め実施に有用な免疫測定法の 1つの態様では、 被験者由来の体 液試料と抗 P C A— 1抗体とを接触させ、 次いで、 体液試料中の P C A _ 1 と抗 P C A— 1抗体との免—疫複合体が検出される。
本発明の上記態 ;様の免疫ァッセィには、 ゥエスタンブロッ ト法のよう な手法を用いた測定システムに限らず、 例えば、 ラジオィムノアッセィ (R I A)、 酵素結合免疫吸着検定法 （E L I S A)、 サンドィ ツチ免疫 測定法、 蛍光免疫測定法 （F I A)、 時間分解蛍光免疫測定法 （TR F I A)、 酵素免疫測定法 （E I A)、 発光免疫測定法 （L I A)、 電気化学発 光免疫測定法 （E C L I A)、 ラ—テックス凝集法、 免疫沈降アツセィ、 沈 降素反応法、 ゲル拡散沈降素反応法、 免疫拡散検定法、 凝集素検定法、 補体結合検定法、 免疫放射分析検定法、 蛍光免疫検定法、 プロテイン A 免疫検定法等が使用され得る。 このような手法では、 通常、 抗 P CA— 1抗体は標識されており、 標識の種類と しては、 例えば、 蛍光基 発光 基、 フリーラジカル基、 粒子、 パクテリオファージ、 細胞、 金属、 酵素、 補酵素、 ラジオアイソ トープなどが挙げられる。 さらに、 例えば、 P C A— 1タンパク質に特異的に結合するポリぺプ チドのような抗体以外の薬剤が P C A— 1タンパク質発現のレベルを測 定するために使用され得る。
P C A— 1の発現を検出するための免疫測定は、 代表的には、 前立腺 がんを有すると疑われるか、 前立腺がんの危険性を有する被験体から採 取した体液試料を、 特異的抗原一抗体結合を生じさせる条件下で抗 P C A— 1抗体と接触させ、 次いで、 抗体による免疫特異的結合量を測定す ることを包含する。 特定の態様において、 例えば、 このような抗体の結 合 ¾r使用して、 P C A— 1タンパク質の存在および Zまたは増大した発 現が検出される。 この場合、 増大した P C A— 1 タンパク質発現の検出 が疾病状態の指標となる。 必要に応じて、 体液試料中の P C A— 1 タン パク質のレベルを、 前立腺がんを有しない健常者のレベルと比較しても よい。
上記免疫測 法の 1つの態様では、 血清試料などの体液試料を、 試料 中に存在する全—部のタンパク質を固定する目的で、 ニトロセルロースな どの固相支持体または担体と接触させる。 次いで、 この支持体を緩衝液 で洗浄し、続いて検出可能に標識した抗 P C A~- 1抗体により 理する。 次いで、この固相支持体を緩衝液 2回洗浄し、未結合抗体を除去する。 固相支持体上の結合した抗体の量を、 周知の方法に従って測定する。 各 測定に適する検出条件は、 慣用的な試験方法を使用して当業者により適 宜決定され得る。
抗 P C A— 1抗体を検出可能に標識する方法の 1つにおいて、 当該抗 体を、 酵素、 例えば、 酵素ィムノアッセィ （E I A) に使用されるもの のような酵素に結合させる [V o i l e r , A. による 「酵素標識した 免疫吸着アツセィ」 （"T h e E n z y m e L i n k e d I mm u n o s o r b e n t A s s a y) (E L I S A) , 1 9 7 8 , D i a g n o s t i c H o r i z o n s , 2 : 1 ~ 7 , M i c r o b i o l o g i c a l A s s o c i a t e s Q u a r t e r l y P u b l i c a t i o n, W a l k e r s v i 1 l e . MD ; V o i 1 e r , A . による J . C I i n. P a t h o l ., 3 1 : 5 0 7〜 5 2 0， 1 9 7 8 : B u t i e r , J . E. による M e t h . E n z y m o l ., 7 3 : 4 8 2〜5 2 3 , 1 9 8 1 ]。 抗体に結合する酵素を、 例えば分光光度測定に より、 可視手段による蛍光測定により検出することができる化学分子が 生成されるような方法で、 適当な基質、 好ましくは色素原性基質と反応 させる。 抗体に検出可能な標識を付けるために使用することができる酵 素は、ペルォキシダーゼおよびアル力リ性ホスファターゼを包含する力 これらに限定されない。 この検出はまた、 酵素に対する色素原性基質を 用いる比色法により達成することができる。
抗 P C A— 1抗体の検出はまた、 その他の種々の方法を用いて行うこ とができる。 一例として、 抗体または抗体断片を放射性物質で標識する ことによって、 放射線ィムノアッセィ （R I A) の使用により P C A— 1タンパク質発現を検出することができる [例えば、 We i n t r s u b , B. による放射線免疫検定の原理、 ラジオリガンド検定技術に関す る第 7回 ト レーニング コース （P r i n c i p l e s o f R a d i o i mm u n o a s s a y s , S e v e n t h Γ r a i n i n g C o u r s e o n R a d i o l i g a n d A s s a y T e c h n i q u e s ), T h e E n d o c r i n e S o c i e t y , 1 9 8 6年 3月参照]。 放射性同位元素は、 ガンマカウンターまたはシンチレ一 シヨ ンカウンターのよ うな手段の使用により、 もしくはオートラジオグ ラフィにより検出することができる。
抗体はまた、 蛍光化合物により標識することができる。 最も慣用の蛍 光標識化合物の中には、 フルォレセインイソチオシァネート、 ローダミ ン、 フィコエリ トリンおよびフルォレスカミンがある。 同様に、 生体発 光性化合物を用いて、 抗体 P C A— 1抗体を標識することもできる。 生 体発光性タンパク質の存在は、 蛍光の存在を検出することによって測定 される。 この標識目的に重要な生体発光性化合物は、 ノレシフェリ ン、 ル シフェラーゼおよびイエクオリ ンである。
本発明の特定の態様において、 体液試料中の P C A— 1タンパク質の 発現水準は、 二次元電気泳動法により分析することができる。 二次元ゲ ル電気泳動法は、 当業者に公知である。 血清試料などの体液試料を、 第 一段階で電荷に基づいてタンパク質を分離する等電点焦点化分離用電気 泳動用ゲル上に装填する。 不動化した勾配に基づく分離用のゲルス トリ ップまたは担体両性電解質に基づく分離用の管状ゲルを包含する多数の 第一段階ゲル標本を使用することができる。 第-一次分離後、 タンパク質 を第二段階ゲル上に移し、 次いで平衡化し、 次いでタンパク質をその分 子量に基づいて分離する S D S— PAGEを用いて分離する。 異なる被 験者から採取した血清試料を比較する場合、 複数のゲルを各血清試料か ら調製する。
分離後、 この第二段階ゲルからウェスタンブロティ ッング法に慣用の 膜上にタンパク質を移す。 ウェスタンブロティッング法および引き続く タンパク質の可視化はまた、 当業者に周知である [S a mb r o o kら による 「分子クローニング。 実験指針」 （Mo l e c u l a r C l o n i n g . A l a b o r a t o r y m a n u a l )， 第 2fe、 第 3卷、 1 9 8 9， C o I d S p r i n g H a r b o r ]。標準的方法を用い ることができ、 またはこの方法を特定の種類のタンパク質、 例えば高度 に塩基性または酸性、 もしくは脂質可溶性などの種類のタンパク質の同 定にかかわり当該技術で知られているように修正することもできる [例 えば、 A u s u b e 1 らによる 「分子生物学における現在の方法」 （C u r r e n t P r o t o c o l s i n M o l e c u l a r B i o l o g y), G r e e n P u b l i s h i n g A s s o c i a t e s a n d W i l e y I n t e r s c i e n c e , N. Y. 参照]。 P C A— 1タンパク質に結合する抗体を、 ウェスタンプロッティング分析法 におけるよう.なインキュベーショ ン工程に用いる。 第一の抗体に対して 特異性の第二の抗体をウェスタンプロッティング分析法で使用し、 第一 抗体と反応するタンパク質を可視化する。 .
2. 抗 P C A— 1自己抗体検出のためのアツセィ 本発明は、 別の態様において、 被験者の体液試料中の抗 P C A— 1 自 己抗体を前立腺がんマーカーと して検出および Zまたは定量する方法を 提供する。 この本発明の方法は、 前立腺がんの診断に使用することがで きる。 さらに抗 P CA_ 1 自己抗体レベルのモニタリ ングによ り、 前立 腺がんの進行を予知することができる。
被験者からの体液試料中の抗 P C A— 1 自己抗体の検出は、 任意の多 くの方法で行う ことができるが、 代表的な方法には、 免疫アツセィがあ り、 例えば、 ウェスタンブロッ ト法、 ラジオイムノアツセィ、 Eし I S A、 サンドイッチ免疫測定法、 蛍光免疫測定法 （F I A)、 時間分解蛍光 免疫測定法 （TR F I A)、 酵素免疫測定法 （E I A)、 発光免疫測定法 (L I A)、電気化学発光免疫測定法（E C L I A)、 ラテツタス凝集法、 免疫沈降アツセィ、 沈降素反応法、 ゲル拡散沈降素反応法、 免疫拡散検 定法、 凝集素検定法、 補体結合検定法、 免疫放射分析検定法、 プロティ ン A 疫検定法等が挙げられる。
このよ うなィムノアッセィは、 様々な方法で実施することができる。 例えば、 このようなアツセィを実施するための 1つの方法は、 P CA— 1タンパク質の固相,支持体上への繋留、 およびそれに対して特異的な抗 P C A- 1抗体の'検出を包含する。 本発明のァッセィに用いられる P C A— 1 タンパク質は、 当該分野において周知の組換え D N A技術によつ て調製し得る。 例えば、 P C A— 1タンパク質をコードする DNAを適 当な発現ベクター中に遺伝子組換え技術により導入して、 P CA— 1タ ンパク質を大規模に発現することができる。 好ましくは、 ？〇 ー 1の 標識、 固定化または検出を容易にすることができる融合タンパク質が遣 伝子操作される （例えば、 S a mb r o o k ら、 1 9 8 9， M o l e c u 1 a r C l o n i n g :A L a b o r a t o r y Ma n u a l , C o l d S p r i n g H a r b o r P r e s s , C o l d S p r i n g H a r b o r , N. Y. に記載された技術を参照）。 別法と し て、 P C A— 1タンパク質は天然の供給源から精製することができる。 たとえば、 当該分野において周知のタンパク質分離技術を用いて前立腺 がん細胞から精製する。 このような精製技術には、 分子シーブクロマト グラフィ一および zまたはィオン交換ク ロマ トグラフィ一が包含される が、 これらに限定されない。 実際には P C A— 1タンパク質の固体支持 体としては、 マイクロタイタープレー卜が好都合に使用される。
上記本発明の P CA— 1検出のためのアツセィまたは抗 P CA— 1 自 己抗体検出のためのアツセィは、 単独で、 前立腺がんの診断および Zま たは予後評価等に使用し得る新たな方法であり得るが、 本発明はそのよ うな形態に限定されず、 例えば、 他の前立腺がんの診断方法と組み合わ せて用いることで、 診断の精度をさらに向上させることもできる。 その ような他の前立腺がんの診断方法としては、 触診検查、 P S A検査、 前 立腺がん生検試料を用いた病理検査 （病理学的 Tステージ）、 グレーソン 癌スコア、 超音波検査、 MR I 、 C T、 骨シンチ等が挙げられる。
(診断剤）
本発明はまた、 1つの態様において、 抗 P C A— 1抗体を含有する、 被験者の体液試料中の P C A— 1タンパク質またはその断片を前立腺が んマーカーとして検出および Zまたは定量するための、 前立腺がん診断 剤を提供する。 - さらに本発明は、 ？ 0 ー 1遺伝子、 P CA— 1 mRNA、 または その断片の塩基配列にス トリンジェントなハイブリダイゼーション条件 下でハイプリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有す る、 被験者の体液試料中の P C A— 1遺伝子、 P CA— 1 mRNA、 またはその断片を前立腺がんマーカーとして検出および/または定量す るための、 前立腺がん診断剤を提供する。
本発明はさらに別の態様において、 P C A— 1またはその断片を含有 する、 被験者の体液試料中の抗 P C A— 1 自己抗体を前 ¾腺がんマーカ 一と して検出および/または定量するための、 前立腺がん診断剤を提供 する。
本発明の診断剤は、 被験者の体液試料 （例えば、 血液、 尿） 中の例え ば、 P C A— 1 タンパク質、 P CA— 1遺伝子、 または抗 P C A— 1 自 己抗体を検出するための成分を含有する。
( 1 ) 抗 P C A— 1抗体を用いる診断剤 ■
例えば、 被験者の体液試料中の P CA_ 1タンパク質またはその断片 が E L I S Aで検出およびノまたは定量される場合、このよ うな成分は、 例えば、 血液や尿のような体液試料中の P C A— 1のレベルを検出およ び Zまたは定量するために使用され得る P C A— 1タンパク質のェピト ープに向けられた抗体から構成される。 抗体はそれ自体で検出可能なよ うに放射能、 蛍光、 比色、 または酵素標識で標識されていてもよい。
( 2) 核酸 （またはヌクレオチド） プローブまたはプライマーを用い る診断剤
例えば、 被検者の体液試料中の P C A— 1遺伝子、 P CA— 1 mR NA、 またはその断片がプローブとのハイブリダィゼーシヨンによって 検出および Zまたは定量される場合、 このような成分は、 例えば、 P C
A- 1遺伝子の塩基配列に基づいて設計されるプローブ又はプライマー から構成される。 このようなプローブまたはプライマーは、 配列番号 1 に示される P C A— 1遺伝子のヌクレオチド配列から、 任意の数の適し た （センスまたはアンチセンスの） プローブまたはプライマーを設計し て得ることができる。 このような診断剤を用いる診断は、 具体的には、 例えば、 （a ) 被験者由来の体液試料と、 ？〇 ー 1遺伝子、 P CA— 1 mR N A、 またはその断片の塩基配列にス トリンジェントなハイブリダ ィゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌク レオチド （プローブ） とを接触させる工程、 および （b ) 前記試料中で の前記ポリヌク レオチ ドと、 P CA— 1遺伝子、 P CA— 1 mRNA、 またはその断片とのハイプリダイゼーションを検出おょぴノまたは定量 する工程を包含する方法を実施することによって行われる。
本発明の診断剤を用いる診断方法では、 被験者由来の生体試料中の P CA— 1遺伝子のDNA (もしくはその断片） または mRNA (もしく はその断片） 等を、 上記プローブを使用して検出および/または定量す る。 プローブとして用いる塩基配列の長さは、 例えば、 1 2塩基以上、 1 5塩基以上、 1 8塩基以上、 2 1塩基以上、 2 4塩基以上、 2 7塩基 以上、 3 0塩基以上、 またはさらに長い長さのポリヌク レオチド断片で あり得る。
ハイブリダイゼーショ ンは、 公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキュラー ' クローニング （Mo 1 e c u 1 a r C I o n
1 n g T h i r d E d i t i o n, J . S a mb r o o k e t a 1 . , C o l d S p r i n g H a r b o r L a b . P r e s s .
2 0 0 1 ) に記載の方法などに従って行うことができる。 また、 市販の ライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って 行う ことができる。 ここで、 「ス トリンジェントな条件」 は、 低ス ト リ ン ジヱントな条件、 中ス トリンジェントな条件及び高ス トリンジヱントな 条件のいずれでもよい。 「低ス トリンジヱントな条件」 は、 例えば、 5 X SSC、 5Xデンハルト溶液、 0.5%SDS、 50%ホルムアミ ド、 32°Cの条件で ある。 また、 「中ス トリンジェントな条件」 は、 例えば、 5XSSC、 5Xデ ンハルト溶液、 0.5%SDS、 50%ホルムアミ ド、 42。Cの条件である。 「高ス トリ ンジェントな条件」 は、 例えば、 5XSSC、 5Xデンハルト溶液、 0.5% SDS、 50%ホルムアミ ド、 50°Cの条件である。 これらの条件において、 温 度を上げるほど高い相同性を有する DN Aが効率的に得られることが期 待できる。 ただし、 ハイブリダィゼーシヨンのス トリンジエンシーに影 響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、 時間、 塩濃度など複数の要素が考えられ、 当業者であればこれら要素を 適宜選択することで同様のス トリンジエンシーを実現することが可能で ある。
なお、 本明細書中、 「P C A— 1遺伝子、 P CA— 1 mRNA、. また はその断片の塩基配列にス トリンジェントなハイブリダイゼーション条 件下でハイブリダィズ可能な塩基配列」 には、 〇八ー 1遺伝子、 P C A- 1 mRNA、 またはその断片の塩基配列に相補的な塩基配列 （ァ ンチセンス DNA) も含まれるものとする。 プローブおよび核酸のハイ プリダイゼ一ションの方法は当業者に知られており、 例えば国際公開公 報第 8 9Z0 6 6 9 8号、 E P— A 0 2 0 O 3 6 2、 米国特許第 2， 9 1 5， 0 8 2号、 E P _A 0 0 6 3 8 7 9、 E P— A 0 1 7 3 2 5 1、 E P— A 0 1 2 8 0 1 8に記載されている。 - 上記本発明の診断剤および診断方法を用いるに際しては、 P CA— 1 遺伝子、 P CA— l mRNA、 またはその断片に対する特異的プロ一 ブまたはプライマーを用いて、 公知の手法を用いて標的配列を検出また は定量することができる。 そのような公知の手法として、 例えば、 サザ ンハイブリダィゼーシヨン、 ノーザンハイブリダィゼーシヨン、 R T_ P C R法、 P C R— S S C P法 （G e n o m i c s , 第 5巻， 8 7 4〜 8 7 9頁 （ 1 9 8 9年））、 P r o c e e d i n g s o f t h e N a t l o n a 1 A c a d e m y o r S c i e n c e s o f t h e U n i t e d S t a t e s o f Am e r i c a，第 8 6卷, 2 7 6 6〜 2 7 7 0頁 （ 1 9 8 9年））、 F I S H法、 DNAチップある いはアレイ C GH法などを用いることができる。 定量的な検出は、 定量 R T— P C Rによ ;つて実施可能である。 ( 3) P C A— 1抗原を用いる診断剤
例えば、 自己抗体が E L I S Aによって検出および または定量され る場合、 このような成分は、 固相支持体に結合された少なく とも 1種、 好ましい複数種の異なる P C A— 1抗原またはそれらのェピトープの形 態における標的抗原、 および標的抗原に結合する抗 P C A— 1 自己抗体 を検出するための手段から構成される。このような検出手段は、例えば、 抗 P C A— 1 自己抗体の定常部領域に向けられた抗体 （例えば、 ゥサギ 抗ヒ ト I g G抗体） であり、 それ自体で検出可能なように標識されてい る （例えば、 放射能、 蛍光、 比色、 または酵素標識） 力 、 または標識さ れた二次抗体 （例えば、 ャギ抗一ゥサギ抗体） によって検出される。 こ の診断剤は、 上述の免疫学的手法によ り、 前立腺がんマーカーを検出す るために用レヽられる。
(キッ 卜）
本発明はまた、 1つの態様において、 抗 P CA— 1抗体を含有する、 被験者の体液試料中の P C A— 1 タンパク質またはその断片を前立腺が んマーカーと して検出および Zまたは定量するためのキッ トを提供する。 このキッ トは、 上述の免疫学的手法によ り、 前立腺がんマーカーを検出 するために用いられる。
さらに、 本発明は別の態様において、 P CA— 1遺伝子、 P CA— 1 mR N A、 またはその断片の塩基配列にス ト リ ンジヱン トなハイブリダ ィゼーショ ン条件下でハイプリ ダイズ可能な塩基配列を含有する、 被験 者由来の体液試料中の P CA— 1遺伝子、 P CA— 1 mRNA、 また はその断片を前立腺がんマーカーと して検出および/または定量するた めのキッ トをも提供する。 このキッ トは、 上述のハイブリダィゼーショ ン法により、 前立腺がんマーカーを検出するために用いられる。
さらに、 本発明はさらに別の態様において、 P CA— 1またはその断 片を含有する、 被験者の体液試料中の抗 P C A_ 1 自己抗体を前立腺が んマーカーと して検出およびノまたは定量するためのキッ トを提供する。 このキッ トは、 上述の免疫学的手法により、 前立腺がんマーカーを検出 するために用いられる。
上記第一の態様のキッ トは、 被験者からの体液試料中の P CA— 1抗 原を検出および Zまたは定量する成分を含有する。 例えば、 P CA— 1 タンパク質が E L I S Aで検出および/または定量される場合、 このよ うな成分は、 例えば、 血液や尿のよ うな体液試料中の P C A— 1のレべ ルを検出および/または定量するために使用され得る P C A— 1タンパ ク質のェピ トープに向けられた抗体から構成される。 抗体はそれ自体で 検出可能なように放射能、 蛍光、 比色、 または酵素標識で標識されてい てもよい。 別法と して、 キッ トは、 標識された二次抗体を含有していて もよレヽ。
上記第二の態様のキッ トは、 被験者からの体液試料中の P C A— 1遺 伝子も しくはその断片、 または該遺伝子の転写産物 （m R NA) も しく はその断片等を検出および/または定量する成分を含有する。 このよう な成分は、 例えば、 P C A— 1遺伝子、 P C A— l mR NA, または その断片の塩基配列にス ト リ ンジェン トなハイブリダイゼーショ ン条件 下でハイブリ ダイズ可能な塩基配列からなるポリヌク レオチ ドから構成 される。 例えば、 本発明のキッ トは、 D N Aチップ上に固定された上記 ポリ ヌ ク レオチドを含有し得る。
上記第三の態様のキッ トは、 被験者からの体液試料中の抗 P C A— 1 自己抗体を検出および/または定量するために必要な成分を含有する。 例えば、 自己抗体が E L I S Aによって検出およびノまたは定量される 場合、 このよ う な成分は、 固相支持体に結合された少なく とも 1種、 好 ましい複数種の異なる P C A— 1抗原またはそれらのェピトープの形態 における標的抗原、 および標的抗原に結合する抗 P C A— 1 自己抗体を 検出するための手段から構成される。 このよ う な検出手段は、 例えば、 抗 P C A— 1 自己抗体の定常部領域に向けられた抗体 （例えば、 ゥサギ 抗ヒ ト I g G抗体） であり、 それ自体で検出可能なように標識されてい る （例えば、 放射能、 蛍光、 比色、 または酵素標識） 力、、 または標識さ れた二次抗体 （例えば、 ャギ抗—ゥサギ抗体） によって検出される。 本発明のキッ トは、 抗 P C A— 1抗体、 ？〇 ー 1遺伝子、 P C A— 1 mR NA, またはその断片の塩基配列にス トリ ンジェン トなハイブ リ ダイゼーショ ン条件下でハイブリ ダイズ可能な塩基配列からなるボリ ヌク レオチド、 P C A— 1抗原または抗 P C A— 1 自己抗体に対する抗 体等の他に、 容器およびラベル等を含んでいてもよい。 容器上のまたは 容器に伴うラベルには、 薬剤が前立腺がんマーカーの検出に使用される ことが示されていてもよい。 また、他のアイテム、 例えば、 使用説明書、 標識二次抗体等がさらに含まれていてもよし、。
以下、 実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、 本発明の範 囲はこれらの実施例によって限定されない。 実施例
(実施例 1 ) '
(質量分析装置を用いた血中 P C A— 1の検出）
1. 試料の前処理 - (血球成分、 アルブミ ン、 I g G等の除去）
前立腺がんの罹患者由来の血清は、 採血直後の血液を室温で 4 0分間 静置させた後、 遠心分離によって血球成分を除去し調製した。 検体サン プル （血清） 1 2. 5 1 を、 予め 1 0 0 mM 炭酸水素アンモ-ゥム で平 1奐] "ィ匕し 7こ B l u e S e p h a r o s e 6 F a s t F l o w 樹月旨 (Am e r s h a m B i o s c i e n c e s社) 5 0 1に刀口 ^ て、.穏やかに混合して静置した。 5分後、 1. 5 m lのマイクロチュー ブにセッ トしたミニカラム (W i z a r d M i n i 'c o l u mn s , P r o m e g a社) に B l u e S e p h a r o s e 6 F a s t
F 1 o w樹脂と一緒に移し、 遠心分離によってアルブミ ンを分離^去し た。 - 次に、 1. 5 m' 1マイクロチューブに回収された分画を、 予め 1 0 0 mM 炭酸水素アンモニゥムで平衡化した P r o t e i n G S e p h a r o s e 4 F a s t F l o w樹月 g (Am e r s h a m B i ◦ s c i e n c e s社） 5 0 μ 1に加えて、 穏やかに混合して静置し、 上記と同様の遠心分離を行って、 I g Gを分離除去した。 ―
最終的に、 これらの操作から得られた分画の液量は 6 5 μ 1程度にな つた。
( ト リプシン処理）
上記の処理から得られた分画から 2 5 1 を取り、 2 5 μ 1 φ 1 0 0 mM炭酸水素アンモニゥムと混合し、 0. 5 μ gのトリプシンき加えて 、 3 7 °Cで一晩保温をした。 直ちに測定を行わない場合は、 これを一 8
( eで保存した。 2. 血中 P CA— 1の検出
本実施例においては、 H P L Cで分離した試料中の成分をイオン化し てその質量を計測する HP L Cと結合した質量分析装置を用いた。 具体 的には、 ィォン源として n a n o E S Iィォン源およびガラスキヤビラ リーとして P i c o T i p n e e d l e (本体内径 2 0 m、 先端内 径 1 0 ;u m) (L C P a c k i n g s社） を装備したイオントラップ型 の液体クロマ トグラフ質量分析装置 （L C/MS) である HCT p l u 5 (ブルーカー ' ダルトニクス社） を、 キヤピラリー電圧 1. 2 k V〜 1. 5 k Vで使用した。 プレカラムとして、 0. 1 %蟻酸を含有する 2 %ァセ トニ トリルで平衡化させた 0. 3 X 1 0 mmカラムを、 流速 3 0 μ LZ分で使用した。 本力ラムと して、 0. 0 7 5 X 1 5 0mmのカラ ムを 2 0 0 n LZ分の流速で使用した。 試料の溶出液と して、 溶出液 A (0. 1 %蟻酸を含有する 2 %ァセ トニト リル） および溶出液 B ( 0. 1 %蟻酸を含有する 8 0 %ァセ トニ ト リル） を、 以下のよ うな勾配に従 つて使用した ： 0Ζ0— 5ノ 0— 9 0 / 5 0 - 9 5 / 1 0 0 - 1 0 0 / 1 0 0 - 1 0 0. 1 /0 - 1 2 0 /0 (分 /Β%)。
上記質量分析装置の L C力ラムの試料ホルダに、 上記のようにト リプ シン処理した試料をセッ トして、 測定を開始した。
(結果）
図 1は、 上記 L C一 MS質量分析装置によりモニタ リ ングした前立腺 がんを有する被験者由来の血液サンプルの溶出プロファイルを示す。 グ ラフの縦軸はイオン強度、 そして横軸は保持時間に対応する。 図示され るように、 血液サンプル中にはト リプシン分解べプチド断片のピークが 多数存在している。 当該前立腺がん患者の血液試料中に P C A— 1が存 在しているとすれば、 これらのピークのいずれかは P C A— 1由来の ト リブシン分解ペプチド断片であるはずである。 . 本発明者らは、 これらのピークの中に P CA— 1に由来するペプチド 断片のピークが存在しているか否かを確認するために、 P C A— 1 に特 有のトリプシン分解ぺプチド断片の質量をそのアミノ酸配列に基づいて 算出し、 その特定の質量を有するぺプチド断片を選択的にモニタリング することを試みた。
表 1は、 i n s i l i c oでの算出により得られた P CA— 1の ト リプシン分解べプチド断片 （ぺプチド質量 6 0 0以上）、 ならびに予想さ れる質量、 予想される 2価のイオン質量電荷比 （mZ z )、 および各ぺプ チド断片の P C A— 1ァミノ酸配列中での位置を示す。
(表 1 )
The peptide masses from PCA-i
Figure imgf000028_0001
The peptide masses from PSA
Figure imgf000028_0002
上記質量分析装置では、 H P L Cから溶出されるぺプチドの質量のみ ならず、 そのぺプチドをイオン化する際に当該べプチドに過剰なェネル ギーを与えることによってそのペプチドが開裂して生じる様々な長さの 断片化ペプチド （開裂ペプチド） の質量も測定することができる。 そし
27/1 て、 これらの開裂ペプチドの質量の差を解析することによって、 ぺプチ ドを構成するァミノ酸配列を決定することができる。
一方、 この原理を利用すれば、 多数の異なる質量を有するペプチドの 混合物の中から、 アミノ酸配列の分かっている特定のペプチドを、 その ァミノ酸配列の質量および当該ぺプチドから生じ得る開裂ぺプチドの質 量とを用いて検出することができるはずである δ すなわち、 P CA— 1 のトリプシン分解ぺプチド断片のアミノ酸配列から予測される質量と、 当該べプチドから予測される開裂べプチドの質量とを用いて、 前立腺が ん患者からの血液サンプル中に P C A— 1に特有の配列を有する分子が 存在するか否かを確認することができる。
そこで、 表 1に示される P CA— 1ペプチド断片の中から、 P C Α— 1のァミノ酸位置 7 5— 8 9位のぺプチド断片 ： E GVYE I S L S P T G V S R (配列番号： 1 0) およびァミノ酸位置 1 0— 1 9位のぺプ チド断片 ： VQ G AWAA P VK (配列番号： 1 6 ) を任意に選び、 こ れらの分子のアミノ酸配列から導かれる質量 （それぞれ、 1 5 9 2. 8 0 5および 1 0 2 5. 5 6 6 ) からさらに予想される開裂ぺプチドの質 量を有する分子を選択的にモニタリングした。 図 2 Aおよび Bはその溶 出プロフアイルを示す。
図 2 Aに示されるように、 配列番号 1 0の質量から予測される 2価時 の質量電荷比 7 9 7. 4 m/ zおよび当該ペプチドから生じ得る開裂ぺ プチドの 1価時の質量電荷比 7 0 3 m/ zを選択的に捕捉するように測 定条件を設定すると、 保持時間 6 8分付近に単一の強いピーク （図中、 矢印を付した） を観察した。 これは、 P C A— 1に特有の配列を有する ペプチドが被検サンプル中に存在することを強く示唆する。 また、 図 2 Bに示されるように、 配列番号 1 6の質量から予測される 2価時の質量 電荷比 5 1 3. 8 m/ zおよび当該ぺプチドから生じ得る開裂ぺプチド の 1価時の質量電荷比 7 9 9 m/ zを選択的に捕捉するように設定する と、 保持時間 6 2分付近に単一の強いピ ク （図中、 矢印を付した） を 観察した。 これもまた、 P C A— 1に特有の配列を有するペプチドが被
28 検サンプル中に存在することを強く示唆する。
なお、 比較のために、 同じ被験者からのサンプルに対して、 P S Aに 特有のペプチド ： H S Q P WQ V L V A S R (表 1の配列番号 2 9 ) の 質量から予測される 2価時の質量電荷比 7 0 4. 3 mZ zおよび、 当該 ぺプチドから生じ得る二つの開裂ぺプチドの 1価時の質量電荷比 6 9 5 niZ zおよび 1 0 5 5 m/ zについて選択的にモニタリングした。 その 結果、 6 9 5 m/ zについては、 保持時間 5 2分、 5 9分、 および 6 4 分付近にそれぞれピークが観察された （図 2 C)。 また、 1 0 5 5 mZ z については、 保持時間 6 4分付近に単一のピークを観察した （図 2 D)。 これらから 6 4分付近のピーク （図中、 矢印を付した） が 2価時の質量 電荷比 7 0 4. 3 m/ zを持つ P S A特有のペプチド （H S Q PWQV LVA S R) であることを示し、 それが被験者からの血液サンプル中に 存在することを強く示唆する。
3. MSMSによるデータ解析
上記の結果は、 特定のアミノ酸残基の組み合わせから算出される質量 を有する分子が存在することは示すが、 特定の配列を有するぺプチドが 被検試料中に存在することを示すには、 上記の結果だけでは不十分であ る。 ；
そこで、 さらに図 2 Aで観察された単一のピーク （図中、 矢印を付し た） に対する MSMSのデータ解析を行った。 結果を図 3に示す。 示さ れるように、 y 5、 y 6、 y 7、 y 8、 y 9、 y 1 0等に強いシグナル が観察され、 また、 これらのシグナル間の幅の大きさから質量が推定さ れ、 それにより、 その質量に相当するアミノ酸残基が決定された。 その 結果、 少なく とも C末端側から P S L S I とレ、う部分配列を決定するこ とができた。 この配列は、 配列番号 1 0のペプチド断片の一部と一致し ており、 これによつて、 配列番号 1 0のペプチド断片が被検サンプル中 に存在したことが確認できた。 .
なお、 上記 y 5、 y 6などの開裂イオンの名称は、 次の化学式に示す 方式に基づいている。
29 N末端イオン
H2N-CH COfNH CHfCOfNH CH CO NH CH-COOH
Figure imgf000032_0001
乂 3 丫 3 厶 3 X2 ^2 ¾ Xl ' 1 1
C末珊イオン 図 4は、 図 2 Bで観察された単一のピーク （図中、 矢印を付した） に 対する MSMSのデータ解析を示す。 図 4に示されるように、 この場合 には、 適切な配列決定はできなかった。
図 5は、 比較のために、 図 2 C及び Dで観察された保持時間 6 4分付 近のピークに対する MSMSデータを示す。 図 5に示されるように、 y 3、 y 4、 y 5、 y 6、 y 7、 y 8、 y 9、 y l 0、 y l l等に強レヽシ グナルが観察され、 これらのシグナル間の幅の大きさから、 質量が推定 されるため、その質量に相当するアミノ酸残基が推定された。その結果、 少なく とも C末端'側から V L VQWP Q Sという部分配列を決定するこ とができた。 これは、 配列番号 2 9のペプチド断片の一部と一致してお り、 これにより、 配列番号 2 9のペプチド断片が被検サンプル中に存在 したことが確認できた。
図 6は、 図 2に示す実験の比較例として、 前処理およびトリプシン処 理を施した健常者由来の血液試料について、 図 2に示す実験と同様の測 定条件で特定の質量を有する分子のモニタリングを行った場合の溶出プ 口ファイルを示す。 図示されるように、 特定の高強度のピークは観察さ れなかった。 これは、 健常者の血液試料中に予測される P C A」 1 トリ プシン分解べプチド断片おょぴ P S Aトリプシン分解べプチド断片の質 量に相当する質量を有する分子が、 本発明者らの開発した L C一 MS質 量分析装置による検出法では検出できないほど微量に存在するかもしく
30 は存在しないことを示す。
このように、 本発明者らの開発した、 L C一 MS質量分析装置による 血液試料中の特定配列の検出方法により、 P C A— 1が前立腺がん患者 由来の血液中に存在すること、 そして健常者の血液試料中には検出可能 には存在しないことが示された。
このことは、 P C A— 1が血中の前立腺がんマーカーと して、 P S A と同様に使用され得ることを示す。 さらに、 この結果は、 P CA— 1タ ンパク質自体が前立腺がん患者中で自己抗原になり得ること強く示唆す るものである。 それゆえ P C A— 1に対する自己抗体もまた、 血中の前 立腺がんマーカ一と して使-用し得ること も示すことを当業者は理解し得 る。
(実施例 2)
(ウェスタンブロッテイングによる尿中 P CA— 1の検出）
(手順）
尿検体 1 6 μ 1 (健常人 2検体、前立腺がん患者 2検体） を 1 2 % Ν u PAG E N o v e x B i s T r i s G e l ならびに N u PA G E N o v e - B i s — T r i s電気泳動システム （ I n v i t r o g e n社製） を用いて電気泳動した。 泳動後、 セミ ドライブ口ティン グ装置 （B i o R a d) を用いて P VD F ( p o l y v i n y l i d e n e f l u o r i d e ) 膜 （B i o R a d) に蛋白質を転写した。 P VD F膜は、 3 %ゥシ血清アルブミンーリ ン酸緩衝生理食塩水を用いて 4 °C一昼夜ブロッキングした。 T B S— T ( 2 0 mM T r i s — HC 1、 p H 8. 0、 1 3 7 mM N a C l、 0. 1 % T w e e n 2 0 ) により 3回洗浄後、 抗 P CA— 1ポリ クローナル抗体 （ 1 g / 1 ) と ともに室温で 1時間ィンキュベートし、 T B S— Tで 3回洗浄した。 抗原抗体結合を検出するために当該膜を T B S— Tで希釈した 0 ; 1 gZm l HR P (H o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e) 架橋抗ゥサギ I g G (S a n t a C r u z B i o t e c h社製） 中
31 で室温 1時間インキュベートした。 T B S一 Tにて 3回洗浄後、 E C L l u s W e s t e r n B l o t t i n g D e t e c t i o n S y s t e m 、Am e r s h a m B i o s c i e n c e子土製) を用レヽ て化学発光を惹起し、 L i g h t— C a p t 'u r e (ATT O社製） を 用いてその化学発光を検出した。
(結果）
図 7にその結果を示す。 示されるように、 前立腺がん患者の尿検体に おいて、 抗 P C A— 1抗体により検出される顕著な単一バンドが認めら れた。 マーカーを用いた解析により、 その位置は P C A— 1タンパク質 の推定分子量に一致した。 一方、 健常人の尿においては 1例で弱いなが ら前立腺がん患者の尿検体で検出されたバンドと同じ位置にバンドが認 められたが、 もう 1例は検出限界以下であった。
このよ う に、 P CA— 1は、 健常人の尿検体中ではわずかに検出され るのみかまたは実質的に検出されなかったが、 前立腺がん患者由来の尿 検体では顕著に検出された。 この結果は、 P C A— 1が尿中の前立腺が んマーカーとして使用し得ることを示す。 産業上の利用可能性
本発明は、 前立腺がんの診断を、 正確かつ迅速、 簡易に行い得、 また 患者および医師の両方の負担を軽減し得る前立腺がんマーカーとして有 用である。
32

Claims

請求の範囲
1. 被験者由来の体液試料中の P C A— 1を前立腺がんマーカーとして 検出および Zまたは定量する方法。 '
2. 前記体液試料が、 全血、 血清、 または血漿である、 請求項 1に記載 の方法。 -
3. 前記体液試料が、 尿である、 請求項 1に記載の方法。
4.質量分析装置を用いて、 P C A- 1を検出および Zまたは定量する、 請求項 1〜 3のいずれかに記載の方法。
5. 抗 P C A— 1抗体を用いて、 P C A— 1を検出および/または定量 する、 請求項 1〜 3のいずれかに記載の方法。
6. 前記体液試料と抗 P CA— 1抗体とを接触させる工程、 および 前記体液試料中の P C A— 1 と前記抗 P C A— 1抗体との結合を検出 および/または定量する工程
を包含する、 請求項 5に記載の方法。
7. 前記検出および/または定量する工程が、 標識された抗 P C A— 1 抗体を用いて、 P CA— 1 と抗 P CA— 1抗体との結合を検出および/ または定量するこ'とを包含する、 請求項 6に記載の方法。
8. ウェスタンプロット法、 ラジオイムノアツセィ （R I A)、 酵素結合 免疫吸着検定法 （E L I S A)、 サンドィツチ免疫測定法、 蛍光免疫測定 法 （F I A)、 時間分解蛍光免疫測定法 （TR F I A)、 酵素免疫測定法 (E I A)、 発光免疫測定法 （L I A)、 電気化学発光免疫測定法 （E C L I A)、 ラテックス凝集法、 免疫沈降ァッセィ、 沈降素反応法、 ゲル拡 散沈降素反応法、 免疫拡散検定法、 凝集素検定法、 補体結合検定法、 免 疫放射分析検定法、 蛍光免疫検定法、 およびプロテイン A免疫検定法か らなる群から選択される免疫測定法に従う、 請求項 5〜 7のいずれかに 記載の方法。 ·
9. 前立腺がんの診断に用いるための、 請求項 1〜 8のいずれかに記載 の方法。
33
1 0. 抗 P C A— 1抗体を含有する、 被験者由来の体液試料中の P C A 一 1を前立腺がんマーカーとして検出および/または定量するための、 前立腺がん診断剤。
1 1. P CA— 1遺伝子、 P CA— 1 mRNA、 またはその断片の塩 基配列にス トリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリ ダイズ可能な塩基配列からなるポリヌク レオチ ·Κを含有する、 被験者由 来の体液試料中の P C Α— 1遺伝子、 P CA— 1 mRNA、 またはそ の断片を前立腺がんマーカーとして検出および/または定量するための、 前立腺がん診断剤。
1 2. 前記体液試料が、 全血、 血清、 または血漿である、 請求項 1 0ま たは 1 1に記載の診断剤。
1 3. 前記体液試料が、 尿である、 請求項 1 0または 1 1に記載の診断 剤。
1 4. 抗 P C A— 1抗体を含有する、 被験者由来の体液試料中の P C A — 1を前立腺がんマーカーとして検出および/または定量するためのキ ッ 卜。
1 5. 標識された抗 P C A— 1抗体をさらに含有する、 請求項 1 4に記 載のキッ ト。 '
1 6. ゥエスタンプロッ ト法、 ラジオイムノアッセィ （R I A)、 酵素結 合免疫吸着検定法 （E L I S A)、 サンドィツチ免疫測定法、 蛍光免疫測 定法 （F I A)、 時間分解蛍光免疫測定法 （TR F I A)、 酵素免疫測定 法 （E I A)、 発光免疫測定法 （L I A)、 電気化学発光免疫測定法 （E C L I A)、 ラテックス凝集法、 免疫沈降アツセィ、 沈降素反応法、 ゲル 拡散沈降素反応法、 免疫拡散検定法、 凝集素検定法、 補体結合検定法、 免疫放射分析検定法、 蛍光免疫検定法、 およびプロテイン A免疫検定法 からなる群から選択される免疫測定法に従って前記検出おょぴ または 定量を行うための、 請求項 1 4または 1 5に記載のキッ ト。
1 7. P CA— 1遺伝子、 P CA— 1 mRNA、 またはその断片の塩 基配列にス トリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリ
34 ダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する、 被験者由 来の体液試料中の P C A— 1遺伝子、 P CA— 1 mRNA、 またはそ の断片を前立腺がんマーカーとして検出および /または定量するための キッ ト。
1 8. 前記体液試料が、 全血、 血清、 または血漿である、 請求項 1 4〜 1 7のいずれかに記載のキッ ト。 -
1 9. 前記体液試料が、 尿である、 請求項 1 4〜 1 7のいずれかに記載 のキッ ト。
2 0. 前立腺がんの診断に用いるための、 請求項 1 4〜 1 9のいずれか に記載のキッ ト。
2 1. 被験者由来の体液試料中の抗 P C A— 1 自己抗体を前立腺がんマ 一力一として検出おょぴ Zまたは定量する方法。
2 2. 前記体液試料が、 全血、 血清、 または血漿である、 請求項 2 1に 記載の方法。
2 3. 前記体液試料が、 尿である、 請求項 2 1に記載の方法。
2 4. P CA— 1抗原を用いて、 前記抗 P C A— 1自己抗体を検出およ ぴ Zまたは定量する、 請求項 2 1 ~-2 3のいずれかに記載の方法。
2 5. 前記体液試料と P C A— 1抗原とを接触させる工程、 および 前記体液試料中の抗 P C A— 1自己抗体と P C A— 1抗原との結合を 検出および/または定量する工程
を包含する、 請求項 2 4に記載の方法。
2 6. 前記検出および Zまたは定量する工程が、 抗 P CA— 1 自己抗体 に対する標識された抗体を用いて、 P CA— 1 と抗 P CA— 1 自己抗体 との結合を検出および/または定量することを包含する、 請求項 2 5に 記載の方法。
2 7. ゥエスタンプロッ ト法、 ラジオィムノアッセィ （R I A)、 酵素結 合免疫吸着検定法 （E L I S A), サンドィツチ免疫測定法、 蛍光免疫測 定法 （F I A)、 時間分解蛍光免疫測定法 （TR F I A)、 酵素免疫測定 法 （E I A)、 発光免疫測定法 （L I A)、 電気化学発光免疫測定法 （E
35 C L I A)、 ラテックス凝集法、 免疫沈降アツセィ、 沈降素反応法、 ゲル 拡散沈降素反応法、 免疫拡散検定法、 凝集素検定法、 補体結合検定法、 免疫放射分析検定法、 蛍光免疫検定法、 およびプロテイン A免疫検定法 からなる群から選択される免疫測定法に従う '、 請求項 2 1 〜 2 6のいず れかに記載の方法。
2 8. 前立腺がんの診断に用いるための、 請求項 2 1〜 2 7のいずれか に記載の方法。
2 9. P C A— 1抗原を含有する、 被験者由来の体液試料中の抗 P C A 一 1 自己抗体を前立腺がんマーカーとして検出および/または定量する ためのキッ ト。
3 0. 抗 P C A— 1 自己抗体に対する標識された抗体をさらに含み、 当 該抗体を、 前記 P C A- 1抗原と前記抗 P C A— 1 自己抗体との結合を 検出および/または定量するために利用する、 請求項 2 9に記載のキッ 卜。 '
3 1 . ウェスタンプロッ ト法、 ラジオイムノアツセィ （R I A)、 酵素結 合免疫吸着検定法 （E L I S A)、 サンドィツチ免疫測定法、 蛍光免疫測 定法 （F I A)、 時間分解蛍光免疫測定法 （T R F I A)、 酵素免疫測定 法 （E I A)、 発光免疫測定法 （L I A)、 電気化学発光免疫測定法 （E C L I A), ラテックス凝集法、 免疫沈降アツセィ、 沈降素反応法、 ゲル 拡散沈降素反応法、 免疫拡散検定法、 凝集素検定法、 補体結合検定法、 免疫放射分析検定法、 蛍光免疫検定法、 およびプロテイン A免疫検定法 からなる群から選択される免疫測定法に従って前記検出および Zまたは 定量を行うための、 請求項 2 9または請求項 3 0に記載のキッ ト。
3 2. 前立腺がんの診断に用いるための、 請求項 2 9〜 3 1のいずれか に記載のキッ ト。
36
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