CN102539750A - 氯丙嗪残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种氯丙嗪残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒及其检测方法。本发明所述试剂盒包被有氯丙嗪抗原的酶标板，镧系元素标记羊抗兔或羊抗鼠抗体、氯丙嗪抗体等。本发明还公开了应用上述试剂盒检测氯丙嗪残留的方法。本发明提供的检测氯丙嗪的试剂盒采用间接竞争时间分辨免疫分析技术，灵敏度高、稳定性好，大大简化了操作步骤和反应时间，减少了因操作复杂引起的误差，降低了成本，非常适合大量样品的筛查，具有重要的现实意义。

Description

氯丙嗪残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种检测氯丙嗪残留的时间分辨免疫分析试剂盒及其制备方法。 

背景技术

近年来，随着社会经济的快速发展，养殖业的集约化发展，违禁添加物在畜牧业生产中的应用显著增加，由此导致的动物性食品中药物残留的问题也日益突出，诸如“瘦肉精事件”、“三聚氰胺事件”和“双汇事件”等事故频频出现。动物性食品中药物残留对消费者的健康是一大隐患，严重者可引起中毒甚至死亡。这些事件不仅对我国动物源性食品的出口造成极大损失，而且对人民身体健康造成严重影响。 

氯丙嗪(Chlorpromazine，简称CPZ)是世界上第一个抗精神病药，又名冬眠灵、阿米拉嗪，化学名称为：N，N-二甲基-2-氯-10H-吩噻嗪-10-丙胺，药用一般为其盐酸盐形式，分子式为：C₁₇H₁₉ClN₂S.HCl，分子量为355.33。其化学结构式见图1。 

目前，由于氯丙嗪的镇静、催眠特殊生物学作用，常被用作饲料添加剂。但氯丙嗪对人体具有白细胞减少、体位性低血压、肝功能障碍、皮疹、接触性皮炎等过敏性反应。震颤、静坐不能、流涎等迟发性运动障碍，对人体有毒性副作用。 

欧盟早在1997年就颁布了氯丙嗪禁止在饲料中添加的禁令(EC)NO.17/97。我国农业部、卫生部、国家药品监督管理局联合发布《禁止 在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》农业部第176、235号公告(2002年)也明确指出：严禁氯丙嗪在动物饲料和饮水中添加，允许治疗剂量，但在动物性食品中不得检出。免疫学分析技术以其灵敏、特异、快速、简便的优点在药物残留检测领域已被广泛应用，比起理化检验方法有很多优势。 

目前，对畜禽产品中氯丙嗪残留的检测主要采用理化检验方法。然而理化检验方法存在复杂、繁琐、检测通量小、需要专业人员和专业技能、检测成本昂贵等缺陷，不能实现大批量样品的快速检测分析。因此，有必要研制更加简单快捷方便的检测方法。免疫学分析技术以其灵敏、特异、快速、简便的优点在药物残留检测领域已被广泛应用。 

时间分辨免疫分析(TRFIA)的基本原理是其采用了特殊的镧系金属即三价稀土离子(Eu³⁺、Tb³⁺、Dy³⁺、Sm³⁺)及螯合剂(代替荧光物质、同位素或酶)。标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，待反应体系(如抗原抗体反应、核酸探针反应、生物素亲和素反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等)发生后，用时间分辨分析仪测定最后产物中的荧光强度，根据荧光值的强弱，判断体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。 

时间分辨免疫分析检测方法在国外已被广泛应用于临床检测，近年在许多新领域得到应用，如免疫组织化学、微阵列，并可用于双标记、三标记和四标记等多标记免疫分析。荧光免疫检测方法作为一项具有广阔发展潜力的新兴生物学技术，已经给标记免疫学带来一场革命。本发明对免疫检测技术进一步应用于食品中兽药残留的快速检测提供一种新途径。 

但目前尚无采用时间分辨免疫分析法检测氯丙嗪的相关技术报道，更没有一种适合进行氯丙嗪时间分辨免疫分析检测的试剂盒，以便于实现高灵敏度、操作简单的大批量快速检测。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种高灵敏度、操作简单，能大批量快速检测的氯丙嗪残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒及其检测方法。 

本发明的检测试剂盒的技术方案是这样的： 

一种检测氯丙嗪残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒，其特征在于：包括包被有氯丙嗪抗原的酶标板、氯丙嗪抗体、镧系元素标记羊抗兔抗体或镧系元素标记羊抗鼠抗体、氯丙嗪标准溶液、增强液、浓缩洗涤液及样品稀释浓缩液，其中 

所述氯丙嗪抗原通过碳二亚胺法、或活泼酯法、或混合酸酐法由氯丙嗪与载体蛋白偶联得到； 

所述氯丙嗪抗体为单克隆抗体、或者兔多克隆抗体、或者基因工程抗体； 

所述镧系元素为Eu³⁺、或者Tb³⁺、或者Dy³⁺、或者Sm³⁺； 

所述氯丙嗪标准溶液为以浓度为1000μg/L的氯丙嗪标准品配成的浓度梯度为8.1μg/L、2.7μg/L、0.9μg/L、0.3μg/L、0.1μg/L、0μg/L的氯丙嗪标准品工作液； 

所述增强液包括β-二酮体、三辛基氧化磷、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、冰醋酸和pH值为2.0～3.2的邻苯二甲酸氢钾； 

所述浓缩洗涤液包括0.5～1.5％的吐温20的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液pH值为7.4，浓度为0.1mol/L； 

所述样品稀释浓缩液为pH值为7.4～8.0、0.1～0.25mol/L的Tris-HCl。 

所述酶标板为96孔酶标板，包被有氯丙嗪包被抗原，并封闭微孔表面未吸附位点；封闭微孔的封闭液为溶于PBS的脱脂奶粉溶液。 

本发明的氯丙嗪残留检测方法的技术方案是这样的： 

一种利用上述试剂盒进行检测氯丙嗪残留的检测方法，其特点在于包括如下方法步骤： 

(1)样品前处理：采集检测样本为尿液样本、或者饲料样本、或者组织样本；各种样本前处理方式如下： 

(a)尿液样本处理：清澈尿液样品可以直接进行检测分析，不用前处理；若尿液样本呈浑浊状，则采用2000r/min的离心设备离心5min过滤，得到用清澈尿液样品； 

(b)饲料样本处理：将饲料样本粉碎，称取2g置于50mL试管中，加入12mL的浓度为10％的氨化甲醇，然后充分混匀振荡1～2min，再加入9mL的乙酸乙酯，并振荡20min，用5000r/min的离心设备离心10min过滤，接着，取有机相500μL于另一试管中，用氮气吹干，加入样品稀释浓缩液500μL稀释后直接检测； 

(c)组织样本处理：所述组织样本为动物肌肉、或者动物肝脏、或者动物肾脏；将组织样本破碎和均质化，然后称取2g置于可密封的试管中，加入10mL的纯甲醇，并涡旋混匀5min，接着用10000r/min的离心设备离心5min、或者用3000r/min的离心设备离心20min后，取上清，待沉淀再加入10mL的纯甲醇，接着用10000r/min的离心设备离心5min、或者用3000r/min的离心设备离心20min后，取上清，经两次混匀离心上清后，取出10mL，用氮气吹干，取1mL的样品稀释浓缩液重新充分溶解后，得到检测用的组织样本。 

(2)检测与分析： 

(a)将权利要求1所述的试剂盒从冷藏环境中取出，置于20～24℃环境中平衡不少于30min，将酶标板条固定，做平行实验，按顺序编号； 

(b)在标准品孔加入50μL标准溶液，样品孔加入50μL待测样品，然后 每孔加入50μL氯丙嗪单克隆抗体工作液，混匀；振荡反应； 

(c)步骤(b)所述振荡反应后洗板，拍干，每孔加入100μL铕标二抗工作液，振荡反应； 

(d)步骤(c)所述振荡反应后洗板，拍干，每孔加入200μL增强液，混匀，避光室温轻拍振荡； 

(e)用TRFIA检测仪测定各孔荧光值； 

(f)根据标准溶液荧光值与浓度半对数做标准曲线，根据标准曲线与样品溶液荧光值计算样品浓度。 

本发明的有益效果： 

本发明采用镧系元素作标记物，DTTA为螯合剂，建立了对氯丙嗪的定量分析方法，此法操作流程短、简单、快速，精密度和准确度均较好，样品前处理简单，尤其是采用铕(Eu³⁺)作标记物，DTTA为螯合剂，效果好，成本低。 

浓缩洗涤液为含0.5～1.5％吐温20的磷酸盐缓冲液(pH7.4，0.1mol/L)，为正常使用浓度的15～25倍；所述样品稀释浓缩液为pH7.4～8.0、0.1～0.25mol/L的磷酸盐缓冲液，为正常使用浓度的5～15倍。以便于减少体积，方便在试剂盒中配备。 

本发明采用密封保存的方式保证所述酶标板的空白板的荧光值低于1000，保证没有稀土元素的污染。 

本发明使用酸性增强液，使铕离子(Eu³⁺)从螯合物中解离下来，游离的Eu³⁺在三辛基氧化膦协同下，重新与β-二酮体形成一种新的能够高效率地接受激发光的螯合物。在激发光激发下，铕离子获能，经过电子跃迁并返回基态，便可发射出极强的荧光信号，在时间分辨免疫(TRFIA)分析仪上读出其荧光值，其灵敏度可达16×10^-18mol Eu³⁺。 

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明： 

附图说明

图1为现有氯丙嗪的化学结构式。 

图2为本发明的氯丙嗪半抗原的合成化学结构式。 

图3为本发明的氯丙嗪时间分辨免疫检测方法的标准曲线图。 

具体实施方式

实施例一： 

一种检测氯丙嗪残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒，包括包被了氯丙嗪抗原的酶标板、氯丙嗪抗体、镧系元素标记羊抗兔或羊抗鼠抗体(二抗)；所述镧系元素包括Eu³⁺、Tb³⁺、Dy³⁺、Sm³⁺等稀土元素。 

所述氯丙嗪抗原是碳二亚胺法(EDC)、活泼酯法(DCC、NHS)、混合酸酐法(氯甲酸异丁酯)将氯丙嗪半抗原与载体蛋白进行偶联得到的。所述载体蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)等载体蛋白。 

本发明提供了所述氯丙嗪半抗原的制备方法，是将氯丙嗪溶于乙酸酐，冰浴下滴入新鲜制备的硝酸乙酰酯，反应得到CPZ-NO₂，然后在钯碳催化剂的催化下氢气还原得到所述氯丙嗪半抗原。 

优选地，上述方法通过以下步骤来实现： 

(1)按投料摩尔比为1∶2将氯丙嗪、硝酸乙酰酯分别溶于乙酸酐； 

(2)将硝酸乙酰酯溶液缓慢滴入氯丙嗪溶液中，冰浴反应完毕后将产物用冰的饱和氢氧化钠溶液调节pH值至8，析出产物即为氯丙嗪的硝化物；所述冰浴反应时间优选1小时； 

(3)取步骤(2)制备得到的氯丙嗪的硝化物溶于无水乙醇中，加入的 钯碳催化剂在氢气还原下得到目的产物。 

将含有2个碳的羧基间隔臂的半抗原用于免疫原的制备，将含有4个碳的羧基间隔臂的半抗原用于包被原的制备，免疫原与包被原通过柱层析进行纯化，纯度经SDS-PAGE电泳鉴定。本发明免疫原与包被原采用不同的半抗原结构将更有利于提高检测的灵敏度。 

所述氯丙嗪抗体包括单克隆抗体、兔多克隆抗体。 

单克隆抗体的制备： 

动物免疫：以含有2个碳的羧基间隔臂的半抗原与载体蛋白偶联物为免疫原对Balb/c小鼠进行间隔免疫，间接免疫分析检测并得到血液里含有氯丙嗪特异性抗体的小鼠脾脏。 

细胞融合与克隆：取产生特异性抗体的Balb/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP20融合，采用间接竞争时间分辨免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法或显微克隆法对阳性孔进行克隆化，得到并建立产单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 

细胞冻存和复苏：取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。 

单克隆抗体的制备与纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油，7～14天后腹腔注射杂交瘤细胞，7～10天后采集腹水。经辛酸-饱和硫酸胺法或亲和层析法进行腹水纯化，纯度经SDS-PAGE电泳鉴定，小瓶分装，-20℃保存。 

氯丙嗪兔多克隆抗体的制备 

采用新西兰大白兔作为免疫动物，以氯丙嗪与载体蛋白偶联物为免疫原 对新西兰大白兔进行免疫，多次免疫后测定血清抗体效价，心脏采血，经硫酸胺分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。 

所述镧系元素标记羊抗兔或羊抗鼠抗体的制备，以Eu³⁺标羊抗兔为例，取溶解于0.05mol/L PBS pH7.0的5mg/mL羊抗鼠IgG 1mL，经PD-10柱转换缓冲盐条件，洗脱液为50mmol/L pH 9.6 NaCO₃-NaHCO₃缓冲液。收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量(1.46A₂₈₀-0.74A₂₆₀)，用上述洗脱液稀释羊抗鼠至2mg/mL。取500μL稀释后的羊抗鼠IgG加入含0.2mg的Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙酸烯三胺四乙酸(Eu³⁺-DTTA)的棕色小瓶中，置于28℃恒温烘箱中反应48h，反应液用50mmol/L Tris-HCl pH 7.8缓冲液平衡的Sepharose CL-6B(1×30cm)层析，测定每管的荧光计数值，检测稀释后的第一个计数峰，稀释后备用。 

标记率＝标记个数/IgG分子数 

为了方便现场操作和批量检测，所述试剂盒还可以包括氯丙嗪标准溶液、增强液、浓缩洗涤液、样品稀释浓缩液。 

优选地，还可以包括盒体、包被缓冲液、洗涤缓冲液、封闭液和盖板膜。 

所述氯丙嗪标准溶液是浓度为1000μg/L的氯丙嗪(CPZ)标准品贮备液，使用前再配成浓度梯度为8μg/L、4μg/L、2μg/L、1μg/L、0.5μg/L、0μg/L的氯丙嗪(CPZ)标准品贮备液。 

所述增强液包括β-二酮体、三辛基氧化磷(TOPO)、Triton X-100、冰醋酸和邻苯二甲酸氢钾(pH值为2.0～3.2)；将6mL冰醋酸用0.1mol/L的邻苯二甲酸氢钾调pH值至3.2，加入15μmolβ-二酮体(β-NTA)，50μmol三辛基氧化膦，1mL Triton X-100，加三蒸水定容至1L。 

所述浓缩洗液包括0.5～1.5％(体积比浓度)。吐温20的磷酸盐缓冲液(pH 值7.4，0.1mol/L)，为常规使用浓度的15～25倍。 

所述浓缩稀释液pH值7.4～8.0、0.1～0.25mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，为常规使用浓度的5～15倍。 

酶标板是96孔酶标板，采用聚苯乙烯微孔板，该微孔板包被有浓度为100μg/L氯丙嗪包被抗原，并封闭微孔表面未吸附位点；以封闭液室温封闭，所述封闭液包括溶于PBS的脱脂奶粉溶液(5g脱脂奶粉：100mL PBS)。以稀释液稀释至终浓度3％(体积比浓度)的小牛血清3mL(灭活)。 

本发明主要试剂以工作液的形式提供，节省操作时间，试剂盒的制备方法如下： 

(1)包被了氯丙嗪抗原的酶标板的制备方法：将CPZ-OVA以包被缓冲液稀释为100μg/L，向酶标板微孔中加入抗原100μL，放入4℃冰箱中包被过夜，室温平衡后洗板两次，以脱脂奶粉封闭液(250μL)37℃封闭1h，洗板三次，用无尘吸水纸上拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。固定氯丙嗪抗原载体为以下物质中的一种，例如聚苯乙烯、硝酸纤维素、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、交联葡萄糖、玻璃、硅橡胶或琼脂糖凝胶等。 

(2)CPZ抗体稀释液的制备方法：将CPZ单克隆抗体用辛酸-硫酸铵法纯化后，用PBS稀释成1mg/mL分装备用。 

(3)Eu³⁺标羊抗鼠：用含0.2％的pH 7.85Tris-HCl稀释200倍。 

(4)氯丙嗪标准溶液的配制：以浓度为1000μg/L的CPZ作为贮备液，使用前再配成浓度梯度为0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1μg/L的CPZ标准品工作液。 

(5)增强液的配制：6mL冰醋酸用0.1mol/L的邻苯二甲酸氢钾调pH值至3.2，加入15μmol β-二酮体(β-NTA)，50μmol三辛基氧化膦(TOPO)，1 mL Triton X-100，加三蒸水定容至1L。 

(6)包被缓冲液的配制：取Na₂CO₃ 0.375g，NaHCO₃ 0.732g，NaCl 2.250g，NaN₃ 0.100g，加蒸馏水至250mL，得0.1mol/L碳酸盐缓冲液。 

(7)洗涤缓冲液(PBST)的配制：取KH₂PO₄ 0.4g，Na₂HPO₄·12H₂O 5.8g，NaCl 16.0g，KCl 0.4g，Tween-20 1.0mL，加蒸馏水至2000mL。 

(8)封闭液：1)脱脂奶粉5g溶于100mL PBS；2)小牛血清3mL(灭活)，以稀释液稀释至终浓度3％。 

(9)稀释液(50mmol/L Tris-HCl，pH 7.85)：取Tris-base 6.4g，NaCl 9.0g，NaN₃ 0.4g，以浓HCl(12M)调整其pH值为7.85，加蒸馏水定容至1L。 

实施例二： 

本发明同时提供了检测氯丙嗪残留的方法，包括以下步骤： 

(1)样品前处理； 

a.尿液样本处理 

清澈尿液样品可以直接进行检测分析。若尿样呈浑浊状，2000r/min离心5min或过滤，用上清液检测。 

b.饲料样本处理 

将饲料粉碎，称取2g置于50mL试管中，加入12mL10％氨化甲醇(pH值为9～10的氨水溶液9份+甲醇1份)，充分混匀振荡1～2min。加入9mL乙酸乙酯，振荡20min。5000r/min(4000g)离心10min。取有机相500μL于另一试管中，用氮气吹干。加入样品稀释液500μL稀释后直接检测。稀释倍数10应在结果计算中考虑。 

c.组织(肌肉、肝脏、肾脏等)样本处理 

将组织破碎，用超声仪或类似仪器将组织均质化，称取2g均质化后的组 织样本置于可密封的试管中，加10mL纯甲醇，涡旋混匀5min。10000r/min离心5min或3000r/min离心20min，取上清。沉淀中再加入10mL纯甲醇，涡旋混匀后离心(方法同前)，取上清。混匀两次离心上清，取出10mL用氮气吹干。取1mL样品稀释液重新充分溶解后用于检测(注意：溶解后请立即进行分析检测)。稀释倍数为1。 

(2)利用本发明试剂盒对标准溶液和样品进行检测。 

(3)根据标准曲线与样品溶液荧光值计算样品浓度。 

应用所述试剂盒进行检测具体包括以下步骤： 

(1)将试剂盒从冷藏环境中取出，置于20～24℃环境中平衡不少于30min，将酶标板条固定，做两个平行实验，按顺序编号。 

(2)在标准品孔加入50μL标准溶液，样品孔加入50μL待测样品，然后每孔加入50μL氯丙嗪单克隆抗体工作液，混匀；振荡反应45min。 

(3)待反应后洗板六次，并在吸水纸上拍干，以保证完全除去孔中的液体。每孔加入100μL铕标二抗工作液，振荡反应45min。 

(4)待反应后洗板六次，并在吸水纸上拍干，以保证完全除去孔中的液体。每孔加入200μL增强液，混匀，避光室温轻拍振荡5min。 

(5)用时间分辨免疫分析(TRFIA)检测仪测定各孔荧光值。 

(6)根据标准溶液荧光值与浓度半对数做标准曲线，根据标准曲线与样品溶液荧光值计算样品浓度。 

检测结果处理与分析： 

以所获标准样品吸光值的平均值计算百分荧光值，以百分荧光值为纵坐标，氯丙嗪标准溶液浓度的半对数为横坐标绘制标准曲线，求出直线方程。用同样的方法计算样品溶液的百分荧光值，根据方程式求出对应样品的氯丙 嗪浓度。所述百分荧光值的计算式为： 

百分荧光值(％)＝(B/B₀)×100 

其中，B为标准溶液或样品的平均荧光值，B₀为0μg/L标准溶液的平均荧光值。 

检测结果的分析还可以利用计算机专业软件进行计算与分析，对氯丙嗪线性检测范围为0.1～8.1μg/L，检测限可达到0.01μg/L，整个检测过程需2h就可以完成。 

下面列举一些具体实例来对本发明作进一步地说明： 

下述实例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。 

实例1： 

半抗原合成和鉴定 

氯丙嗪半抗原的合成如图2所示。 

(1)称取319mg(1mmol)氯丙嗪溶于5mL乙酸酐中，冰浴中搅拌溶解充分； 

(2)取新鲜制备的硝酸乙酰酯4mmol溶于1mL乙酸酐缓慢滴入步骤(1)所述溶液中，冰浴反应3小时，反应完毕后将产物用冰的饱和氢氧化钠溶液调节pH值至8，析出产物即为氯丙嗪的硝化物，产率为53％； 

(3)取上述氯丙嗪的硝化物溶于20mL乙醇中，加入10％的钯碳催化剂在氢气还原下得到目的产物。 

实例2： 

人工抗原的合成和鉴定 

1、氯丙嗪抗原的合成 

戊二醛法偶连蛋白： 

(1)称取35mg氯丙嗪半抗原和68mg BSA一起溶于10mL磷酸盐缓冲液(PBS)溶液中，室温搅拌均匀； 

(2)将40μL戊二醛逐滴滴入步骤(1)所述混合溶液中，滴加完毕后室温搅拌反应3小时； 

(3)将经步骤(2)反应后的溶液装于透析袋，4℃用PBS溶液透析72小时，期间换透析液6次，即得到目的产物，分装后于-20℃保存。 

上述方法中也可以采用人血清蛋白质、血蓝蛋白或卵清蛋白，参照本实施例方法氯丙嗪包被抗原制备方法同上，只是所用载体蛋白不同。 

2、人工抗原的鉴定 

取氯丙嗪半抗原、载体蛋白BSA和氯丙嗪抗原分别进行紫外(200nm-400nm)扫描鉴定，比较三者的最高吸光值，鉴定半抗原与载体蛋白是否发生偶联，发现氯丙嗪抗原的吸光值与氯丙嗪半抗原和BSA明显不同，说明半抗原已经与BSA成功偶联制得氯丙嗪抗原。经计算，氯丙嗪半抗原与BSA的结合摩尔比为24∶1。 

实例3： 

抗体的制备 

(1)单克隆抗体的制备： 

动物免疫程序：采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以氯丙嗪半抗原与牛血清白蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为60μg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，腹腔注射，间隔3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞。 

细胞融合与克隆化：取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按4∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争时间分辨免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用显微克隆法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 

细胞冻存和复苏：取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成5×10⁶个/mL的细胞悬液，分装于冻存管，在-70℃超低温冰箱中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。 

单克隆抗体的制备与纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注射杂交瘤细胞5×10⁶个/只，14天后采集腹水。用免疫层析法进行腹水纯化，小瓶分装，-20℃保存。 

(2)氯丙嗪兔多克隆抗体的制备 

采用新西兰大白兔作为免疫动物，以氯丙嗪与载体蛋白偶联物为免疫原对新西兰大白兔进行免疫，首次免疫以100μL抗原和100μL完全佐剂充分乳化后免疫，第二、三、四次免疫以100μL抗原和100μL不完全佐剂充分乳化免疫，后测定血清抗体效价和抑制，心脏采血，经硫酸胺分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。 

实例4： 

Eu³⁺标记羊抗鼠的制备和纯化 

取溶解于0.05mol/L PBS pH7.4的5mg/mL羊抗鼠IgG 1ml，经PD-10柱转换缓冲盐条件，洗脱液为50mmol/L pH 9.6NaCO₃-NaHCO₃缓冲液。收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量(1.46A₂₈₀-0.74A₂₆₀)，用上述洗脱液稀释羊抗鼠至2mg/mL。取500μL稀释后的羊抗鼠IgG加入含0.2mg的Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄 基]-二乙酸烯三胺四乙酸(Eu³⁺-DTTA)的棕色小瓶中，置于28℃恒温烘箱中反应48h，反应液用50mmol/L Tris-HCl pH 7.8缓冲液平衡的Sepharose CL-6B(1×30cm)层析，测定每管的荧光计数值，检测稀释后的第一个计数峰，稀释后备用。 

标记率＝标记个数/IgG分子数 

实例5： 

时间分辨免疫分析试剂盒组分的配制 

(1)浓缩洗涤缓冲液的配制：含0.5～1.5％吐温20的磷酸盐缓冲液(pH7.4，0.1mol/L)，为正常使用浓度的15～25倍。 

(2)样品稀释浓缩液的配制：pH7.4～8.0、0.1～0.25mol/L、含有的磷酸盐缓冲液，为正常使用浓度的5～15倍。 

(3)封闭液的配制：脱脂奶粉1.0～5.0g溶于100mL蒸馏水。 

(4)增强液的配制：6mL冰醋酸用0.1mol/L的邻苯二甲酸氢钾调pH值至3.2，加入15μmol β-二酮体(β-NTA)，50μmol三辛基氧化膦(TOPO)，1mL Triton X-100，加三蒸水定容至1L。 

(5)酶标板微孔板的包被：包被抗原用pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液(含1～2g碳酸钠和2～4g碳酸氢钠，双蒸水1L)稀释成0.1～5μg/mL，在酶标板的每孔加100μL，37℃包被1h后4℃下包被过夜，倾去包被液，用PBST洗涤3次，拍干，然后在每孔中加入200μL1.0～5.0％脱脂奶粉，放入37℃温箱中1h后用PBST洗涤3次，干燥后封入铝箔袋中4℃保存。 

(6)氯丙嗪标准溶液的配制：准确称取氯丙嗪标样8.1mg，溶于0.1L缓冲液中，然后用缓冲液稀释分别配制8.1μg/L、2.7μg/L、0.9μg/L、0.3μg/L、0.1μg/L氯丙嗪溶液，另外缓冲液配制0μg/L对照样，4℃保存。 

(7)试剂分装：各种试剂按要求配制，测定合格后无菌分装氯丙嗪抗体工作液7mL/瓶，氯丙嗪标准样品1mL/瓶，二抗工作液10mL/瓶，增强液20mL/瓶，浓缩洗液50mL/瓶，浓缩样品稀释液50mL/瓶。分装后贴标签，注明批号和有效期，4℃保存。 

(8)试剂盒的组装：分别将可拆卸包被好包被抗原的微孔板1块，氯丙嗪抗体工作液、二抗工作液、增强液、浓缩洗液、氯丙嗪标准溶液、浓缩样品稀释液各1瓶，氯丙嗪标准溶液6瓶，使用说明书1份置试剂盒内指定位置。试剂盒检验合格后封装，4℃保存。 

实例6： 

检测氯丙嗪的时间分辨免疫分析试剂盒的组建 

组建检测氯丙嗪的时间分辨免疫分析试剂盒，包括包被了氯丙嗪抗原的酶标板、氯丙嗪抗体、镧系元素标记羊抗兔或羊抗鼠抗体，其他工作液可以在检验室配备。 

如果为了大批量快速的检测样品中氯丙嗪，组建的检测氯丙嗪的时间分辨免疫分析试剂盒包括下述组分： 

(1)包被氯丙嗪抗原的酶标板，96孔； 

酶标板是96孔酶标板，采用聚苯乙烯微孔板，该微孔板包被有浓度为100μg/L抗氯丙嗪抗原，并封闭微孔表面未吸附位点；所述封闭指以浓度为5％脱脂奶粉的PBS(以重量比)封闭液室温封闭。 

(2)氯丙嗪抗体工作液，7mL/瓶；浓度为2mg/mL； 

(3)铕标二抗工作液，10mL/瓶；浓度为0.4mg/mL； 

(4)氯丙嗪标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L，1mL/瓶； 

(5)增强液，7mL/瓶； 

(6)浓缩洗涤液，50mL/瓶； 

(7)浓缩样品稀释液，50mL/瓶； 

(8)使用说明书，1份； 

(9)盖板膜，2张； 

(10)自封袋(含干燥剂)，1个。 

本发明的检测氯丙嗪残留的荧光免疫分析试剂盒的制备方法包括以下步骤： 

(1)包被了氯丙嗪抗原的酶标板的制备方法：将CPZ-OVA以包被缓冲液稀释为100μg/L，向酶标板微孔中加入抗原100μL，放入4℃冰箱中包被过夜，室温平衡后洗板两次，以脱脂奶粉封闭液(250μL)37℃封闭1h，洗板三次，用无尘吸水纸上拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。固定氯丙嗪抗原载体为以下物质中的一种，例如聚苯乙烯、硝酸纤维素、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、交联葡萄糖、玻璃、硅橡胶或琼脂糖凝胶等。 

(2)CPZ抗体稀释液的制备方法：将CPZ单克隆抗体用辛酸-硫酸铵法纯化后，用PBS稀释成1mg/mL分装备用。 

(3)Eu³⁺标羊抗鼠：用含0.2％的pH 7.85 Tris-HCl稀释200倍。 

(4)氯丙嗪标准溶液的配制：以浓度为1000μg/L的CPZ作为贮备液，使用前再配成浓度梯度为0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1μg/L的CPZ标准品工作液。 

(5)增强液的配制：6mL冰醋酸用0.1mol/L的邻苯二甲酸氢钾调pH值至3.2，加入15μmol β-二酮体(β-NTA)，50μmol三辛基氧化膦(TOPO)，1mL Triton X-100，加三蒸水定容至1L。 

(6)包被缓冲液的配制：取Na₂CO₃ 0.375g，NaHCO₃ 0.732g，NaCl 2.250g，NaN₃ 0.100g，加蒸馏水至250mL，得0.1mol/L碳酸盐缓冲液。 

(7)洗涤缓冲液(PBST)的配制：取KH₂PO₄ 0.4g，Na₂HPO₄·12H₂O 5.8g，NaCl 16.0g，KCl 0.4g，Tween-201.0mL，加蒸馏水至2000mL。 

(8)封闭液：1)脱脂奶粉5g溶于100mL PBS；2)小牛血清3mL(灭活)，以稀释液稀释至终浓度3％。 

(9)稀释液(50mmol/LTris-HCl，pH 7.85)：取Tris-base 6.4g，NaCl 9.0g，NaN₃ 0.4g，以浓HCl(12M)调整其pH值为7.85，加蒸馏水定容至1L。 

实例7： 

样品前处理 

a.尿液样本处理 

清澈尿液样品可以直接进行检测分析。若尿样呈浑浊状，2000r/min离心5min或过滤，上清液用于检测。 

b.饲料样本处理 

将饲料粉碎，称取2g置于50mL试管中，加入12mL10％氨化甲醇(pH9～10的氨水溶液9份+甲醇1份)，充分混匀振荡1～2min。加入9mL乙酸乙酯，振荡20min。5000r/min(4000g)离心10min。取有机相500μL于另一试管中，用氮气吹干。加入样品稀释液500μL稀释后直接检测。稀释倍数10应在结果计算中考虑。 

c.组织(肌肉、肝脏或肾脏等)样本处理 

将组织破碎，用超声仪或类似仪器将组织均质化，称取2g均质化后的组织样本置于可密封的试管中，加10mL纯甲醇，涡旋混匀5min。10000r/min离心5min或3000r/min离心20min，取上清。沉淀中再加入10mL纯甲醇， 涡旋混匀后离心(方法同前)，取上清。混匀两次离心上清，取出10mL用氮气吹干。取1mL样品稀释液重新充分溶解后用于检测(注意：溶解后请立即进行分析检测)。稀释倍数为1。 

实例8： 

试剂盒的检测方法 

(1)将试剂盒从冷藏环境中取出，置于20～24℃环境中平衡不少于30min，将酶标板条固定，做两个平行实验，按顺序编号。 

(2)在标准品孔加入50μL标准溶液，样品孔加入50μL待测样品，然后每孔加入50μL氯丙嗪单克隆抗体工作液，混匀；振荡反应45min。 

(3)待反应后洗板六次，并在吸水纸上拍干，以保证完全除去孔中的液体。每孔加入100μL铕标二抗工作液，振荡反应45min。 

(4)待反应后洗板六次，并在吸水纸上拍干，以保证完全除去孔中的液体。每孔加入200μL增强液，混匀，避光室温轻拍振荡5min。 

(5)用TRFIA检测仪测定各孔荧光值。 

(6)根据标准溶液荧光值与浓度半对数做标准曲线，根据标准曲线与样品溶液荧光值计算样品浓度。图3为氯丙嗪时间分辨免疫检测方法的标准曲线图。 

检测结果处理与分析： 

以所获标准样品吸光值的平均值计算百分荧光值，以百分荧光值为纵坐标，氯丙嗪标准溶液浓度的半对数为横坐标绘制标准曲线，求出直线方程，直线方程为y＝46.34-31.32x，R²＝0.9912。用同样的方法计算样品溶液的百分荧光值，根据方程式求出对应样品的氯丙嗪浓度。所述百分荧光值的计算式为： 

百分荧光值(％)＝(B/B₀)×100 

其中，B为标准溶液或样品的平均荧光值，B₀为0μg/L标准溶液的平均荧光值。 

检测结果的分析还可以利用计算机专业软件进行计算与分析，对氯丙嗪线性检测范围为0.1～8.1μg/L，检测限可达到0.01μg/L，整个检测过程需2h就可以完成。 

实例9： 

试剂盒精密度与准确度试验 

1、标准品溶液重复性试验 

从3批按照实例4(6)中的方法制备的酶标板中，各抽出20个微孔，测定0.9μg/L标准溶液的荧光值(CPS值)，重复20次，计算变异系数CV％，结果见表1。 

表1标准品溶液重复性试验 

结果表明试剂盒标准品检测的批内变异系数范围在1.8～4.5％之间，批间变异系数为9.1％。 

2、样本重复性与准确度试验 

准确度是指测得值与真值的符合程度，在免疫分析测定中，准确度常以回收率表示，精密度常以变异系数来表示。在空白猪尿、猪肝中，将氯丙嗪添加至终浓度为1μg/L(μg/kg)、5μg/L(μg/kg)，在空白饲料中，将氯丙嗪添加至终浓度为50μg/kg、100μg/kg，每个浓度各10个平行，测定3批。计算 平均值、添加回收率及批内与批间变异系数。结果见表2。 

表2样本重复性与准确度试验结果 

结果表明尿样、猪肝、饲料样本的添加回收率在81.2～104％之间，批内变异系数在2.1～9.8％之间，批间变异系数在8.1～17.3％之间。 

实例10： 

保存期试验 

(1)将试剂盒放置于2～8℃，分别取0、2、4、6、8、9、10、11和12个月的试剂盒，对氯丙嗪标准样品(0.1μg/L)的荧光值、50％抑制浓度、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。 

(2)将试剂盒在37℃保存的条件下放置12天，每天对氯丙嗪标准样品(0.1μg/L)的荧光值、50％抑制浓度、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。 

(3)将试剂盒在-20℃冰箱保存12天，每天对氯丙嗪标准样品(0.1μg/L)的荧光值、50％抑制浓度、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。 

从结果可看出，经过三种条件保存试验，氯丙嗪标准样品(0.1μg/L)的 荧光值下降小于5％，且CPS不低于100000；50％抑制率在0.5～1.0μg/L之间；其检测限可达到0.01μg/mL，IC₅₀可达到0.2ng/mL；添加回收率在80～110％之间；批内变异系数在3.5～6.2％之间，小于10％；批间变异系数在11.3～15.2％之间。各项指标均符合质量要求，因此，试剂盒可以在2～8℃保存12个月。 

Claims (2)

1.一种检测氯丙嗪残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒，其特征在于：包括包被有氯丙嗪抗原的酶标板、氯丙嗪抗体、镧系元素标记羊抗兔抗体或镧系元素标记羊抗鼠抗体、氯丙嗪标准溶液、增强液、浓缩洗涤液及样品稀释浓缩液，其中

所述氯丙嗪抗原通过碳二亚胺法、或活泼酯法、或混合酸酐法由氯丙嗪与载体蛋白偶联得到；

所述氯丙嗪抗体为单克隆抗体、或者兔多克隆抗体、或者基因工程抗体；

所述镧系元素为Eu³⁺、或者Tb³⁺、或者Dy³⁺、或者Sm³⁺；

所述氯丙嗪标准溶液为以浓度为1000μg/L的氯丙嗪标准品配成的浓度梯度为8.1μg/L、2.7μg/L、0.9μg/L、0.3μg/L、0.1μg/L、0μg/L的氯丙嗪标准品工作液；

所述增强液包括β-二酮体、三辛基氧化磷、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、冰醋酸和pH值为2.0～3.2的邻苯二甲酸氢钾；

所述浓缩洗涤液包括0.5～1.5％的吐温20的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液pH值为7.4，浓度为0.1mol/L；

所述样品稀释浓缩液为pH值为7.4～8.0、0.1～0.25mol/L的Tris-HCl。

所述酶标板为96孔酶标板，包被有氯丙嗪包被抗原，并封闭微孔表面未吸附位点；封闭微孔的封闭液为溶于PBS的脱脂奶粉溶液。

2.一种利用权利要求1所述试剂盒进行检测氯丙嗪残留的检测方法，其特征在于包括如下方法步骤：

(1)样品前处理：采集检测样本为尿液样本、或者饲料样本、或者组织样本；各种样本前处理方式如下：

(a)尿液样本处理：清澈尿液样品可以直接进行检测分析，不用前处理；若尿液样本呈浑浊状，则采用2000r/min的离心设备离心5min过滤，得到用清澈尿液样品；

(b)饲料样本处理：将饲料样本粉碎，称取2g置于50mL试管中，加入12mL的浓度为10％的氨化甲醇，然后充分混匀振荡1～2min，再加入9mL的乙酸乙酯，并振荡20min，用5000r/min的离心设备离心10min过滤，接着，取有机相500μL于另一试管中，用氮气吹干，加入样品稀释浓缩液500μL稀释后直接检测；

(c)组织样本处理：所述组织样本为动物肌肉、或者动物肝脏、或者动物肾脏；将组织样本破碎和均质化，然后称取2g置于可密封的试管中，加入10mL的纯甲醇，并涡旋混匀5min，接着用10000r/min的离心设备离心5min、或者用3000r/min的离心设备离心20min后，取上清，待沉淀再加入10mL的纯甲醇，接着用10000r/min的离心设备离心5min、或者用3000r/min的离心设备离心20min后，取上清，经两次混匀离心上清后，取出10mL，用氮气吹干，取1mL的样品稀释浓缩液重新充分溶解后，得到检测用的组织样本。

(2)检测与分析：

(a)将权利要求1所述的试剂盒从冷藏环境中取出，置于20～24℃环境中平衡不少于30min，将酶标板条固定，做平行实验，按顺序编号；

(b)在标准品孔加入50μL标准溶液，样品孔加入50μL待测样品，然后每孔加入50μL氯丙嗪单克隆抗体工作液，混匀；振荡反应；

(c)步骤(b)所述振荡反应后洗板，拍干，每孔加入100μL铕标二抗工作液，振荡反应；

(d)步骤(c)所述振荡反应后洗板，拍干，每孔加入200μL增强液，混匀，避光室温轻拍振荡；

(e)用TRFIA检测仪测定各孔荧光值；

(f)根据标准溶液荧光值与浓度半对数做标准曲线，根据标准曲线与样品溶液荧光值计算样品浓度。

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