CN115950969B - 一种血清中游离前列腺特异抗原的定值方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血清中游离前列腺特异抗原的定值方法，包括以下步骤：(1)空白血清的选择；(2)前列腺特异抗原(PSA)纯品物质的选择；(3)血清样品制备；(4)血清中游离前列腺特异抗原的纯化富集；(5)酶切；(6)高标、低标溶液的配制；(7)前列腺特异抗原定量分析。该方法无需考虑蛋白质提取率、酶切效率、仪器稳定性等因素，在样品中添加等量的内标——标记肽段，可以消除以上误差，计算得到血清样品中游离PSA的浓度。本方法通过肽段对蛋白进行定值，其数值可靠、可溯源至SI单位，并且添加原料是天然PSA，因此无需考虑其结构的差异。
Description
技术领域
本发明涉及检疫检测技术领域，特别是涉及蛋白含量的分析、测试、诊断监测、检验、检测、计量等领域，具体涉及一种血清中游离前列腺特异抗原的定值方法。
背景技术
前列腺特异抗原(PSA)是由237个氨基酸多肽主链和单糖侧链组成的，主体肽链分子量约为26kDa的蛋白。PSA是精液中最主要的蛋白质之一，在精液中含量高达0.5-3mg/ml，但在健康人体血清中含量极低。健康状态下，血清PSA浓度低是由于前列腺有完整的组织屏障导致PSA不能进入血液循环。当前列腺发生病变，甚至存在肿瘤会破坏前列腺组织屏障，血液PSA水平会大幅升高。在血液循环中，PSA以游离PSA和复合PSA两种形式存在。
临床中血清PSA水平主要使用PSA试剂盒进行免疫分析检测，但是在临床检测结果中发现，各种商业PSA试剂盒测定的血清PSA浓度值存在不可忽视的差异，这种情况归因于PSA存在形式的多样性。不同厂家生产的试剂盒中使用不同抗体，而不同抗体针识别不同形式PSA的抗原表位，导致临床测量结果不一致。因此，PSA的标准物质及其参考测量方法的开发有助于研制检测结果稳定可靠的人血清PSA检测试剂盒。大批量应用于临床检测，可以提高前列腺癌临床诊断正确率并对治疗结束后患者恢复情况进行有效评估。
英国国家生物制品检定所(NIBSC)研制出第二代游离PSA标准物质17/102，材料为人源，来自8个不同国家的10个实验室采用临床常规分析方法对候选标准物质进行联合定值，每安瓿瓶含0.53μg游离PSA。但此定值方法基于免疫分析，无法溯源到SI单位。
欧洲标准局(ERM)研制出了游离PSA标准物质BCR 613，材料为人源，五家单位通过对氨基酸的定量分析，准确测定PSA浓度，使定量结果可溯源至SI单位。氨基酸水解法相对比较成熟，其分析测定的干扰较小，但是对样品的纯度要求较高，杂质亦或是样品降解都会对其产生很大的影响，不适用于血清样品。
发明内容
针对现有技术中的上述问题，本发明提供了一种血清中游离前列腺特异抗原的定值方法。可以高效、简便、可靠的血清中游离前列腺特异抗原进行定值，为其他血清样品中蛋白质的定值提供参考。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：
一种血清中游离前列腺特异抗原的定值方法，包括以下步骤：
(1)空白血清的选择：医院检验科抽取健康志愿者血液，血液通过血液离心机进行离心分离获得血清，使用罗氏电化学发光试剂盒和生化分析仪对血清进行免疫分析，并选择前列腺特异抗原含量为0-0.5ng/mL的血清作为空白血清。
(2)前列腺特异抗原纯品物质的选择：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相、和飞行时间质谱，对前列腺特异抗原进行定性分析，为后续在血清中添加选择原料。
聚丙烯酰胺凝胶电泳具体为，在PSA溶液中加入适量溴酚蓝混匀，90℃加热5min；泳道中加入Marker和样品，电压调到80V；之后将胶块用考马斯亮蓝染色，20min后用洗脱液反复洗脱，直至能看到条带。
液相色谱法具体为，将PSA样品进质谱，查看质谱图中是否有杂峰；色谱柱为：Vydac214TP C4(5μm，4.6×250mm)；流动相A：水(0.1％甲酸)，流动相B：乙腈(0.1％甲酸)；流速0.2mL/min。
飞行时间质谱法具体为，以饱和芥子酸溶液作为基质，吸取10μL溶液与10μL饱和芥子酸溶液于离心管中混合均匀，吸取混合液1μL滴于MTP 384靶板上，吹干后将靶板放入仪器仓中进行蛋白质分子量测定。实验采用正极性分析，检测质量范围设置为10000-40000Da，脉冲离子提取时间为450ns，离子源1、离子源2电压分别为25kV、23.3kV，使用flexanalysis分析软件进行数据处理。
(3)血清样品制备：在500μL空白血清中加入一定量的PSA，制备成为血清样品。
(4)血清中游离前列腺特异抗原的纯化富集：将磁珠活化，加过量抗体孵育过夜，制备磁珠抗体复合物，磁珠-抗体溶液为在10mg/mL；取血清样品于离心管中，加入50μL的磁珠抗体复合物，室温旋转孵育1h，使血清中的前列腺特异抗原结合到磁珠抗体上，去上清；用100μL 5％乙酸溶液水溶液将磁珠上结合的前列腺特异抗原洗脱下来，室温旋转孵育2分钟；用磁珠分离器吸附磁珠，收集洗脱下来的溶液，-20℃保存使用。
(5)酶切肽段HR、FR、LK：将洗脱液真空干燥后，加入10μL的去离子水复溶；90℃加热10分钟对蛋白质进行变性；恢复常温后，加入80μL碳酸氢铵溶液调节PH，按比例加入一定量的胰蛋白酶溶液，并加入等量的标记肽段溶液，于37℃进行酶切反应；加入甲酸终止反应；得到酶切肽段HR、FR、LK；其中，肽段HR的序列为HSQPWQVLVASR，肽段FR的序列为FLRPGDDSSHDLMLLR，肽段LK的序列为LSEPAELTDAVK，如SEQ ID NO:1-3所示；
(6)高标、低标溶液的配制：配制的高标低标溶液中特征肽段与标记特征肽段质量比约为0.8和1.2，且特征肽段浓度与PSA溶液酶解后理论特征肽段浓度一致。
(7)前列腺特异抗原定量分析：将酶切好的样品和高低标溶液进质谱，通过肽段的浓度推算出前列腺特异抗原的浓度，而肽段的浓度根据液质分析MRM模式谱图的峰面积表示；选用3条肽段计算前列腺特异抗原浓度，以三者平均值定值；
根据肽段HR、FR、LK浓度计算血清中PSA浓度，计算公式如下：
式中，I为肽段，MPSA为PSA相对分子质量26072.12，M为肽段相对分子质量，mIS为加入内标质量，单位μg；IH为高标中肽段与内标质量之比，IL为低标中肽段与内标质量之比，RH为高标中肽段或与内标峰面积之比，RL为低标中肽段与内标峰面积之比，m为PSA溶液质量，单位g；CHR，CFR和CLK分别为由三条肽段计算得到的肽段浓度，CPSA为血清中PSA的浓度。
同现有技术相比，本发明的突出效果在于：
(1)本发明方法将前列腺特异抗原的单克隆抗体结合到磁珠上，通过免疫吸附的方式提取纯化血清中的前列腺特异抗原，经胰蛋白酶酶切后，用液相色谱串联质谱的方法(LC-MS/MS)对其进行定量分析。
(2)本发明方法无需考虑蛋白质提取率、酶切效率、仪器稳定性等因素。在样品中添加等量的内标——标记肽段，可以消除以上误差，计算得到血清样品中游离PSA的浓度。通过肽段对蛋白进行定值，其数值可靠、可溯源至SI单位，并且添加原料是天然PSA，因此无需考虑其结构的差异。
(3)本发明方法是一种高效、简便、可靠的测量方法，可为其他血清样品中蛋白质的定值提供参考。
(4)本发明方法通过同位素稀释质谱法准确定量血清中游离PSA，为人血清游离PSA标准物质的研制和参考测量程序的开发提供了新思路。
下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的血清中游离前列腺特异抗原的定值方法作进一步说明。
附图说明
图1为SDS-PAGE电泳图；
图2为PSA液相色谱图；
图3为PSA的MALDI-TOF图；
图4为抗体溶液用量对富集效率影响；
图5为胰蛋白酶与蛋白质的比值曲线；
图6为3条肽段在6个不同酶切时间段的未标记肽段与标记肽段响应强度比值曲线。
具体实施方式
试剂：
乙腈购自德国Merck公司产品；
超纯水由Millipore纯水系统纯化；
乙酸购自美国Sigma-Aldirich公司；
甲酸购自美国Fisher Scientific公司；
胰蛋白酶购自美国Promega公司；
磁珠购自Invitrogen公司，为含有羧酸键的环氧树脂磁珠；
HR、FR、LK、L-HR、L-FR、L-LK由南京金斯瑞生物科技有限公司合成(使用MALDI-TOF-MS对酶切后的PSA进行分析，选择质谱响应高、能够分开的三条肽段HR、FR、LK，L-HR、L-FR、L-LK为这三条肽段的同位素标记肽段，L-HR、L-FR和L-LK的序列分别为HSQPWQVLVASR*，FLRPGDDSSHDLMLLR*，LSEPAELTDAVK*)。
人血清样品由北京航天总医院制备。
仪器：
液相色谱质谱联用仪：Agilent 6410三重四级杆质谱，美国安捷伦公司；
移液器：德国Eppendorf Research公司；
天平：ME235S型，最小分度值0.01mg，德国Satorius公司；
天平：XP26型，最小分度值0.001mg，瑞典Mettler Toledo公司；
生化分析仪：日立7180。
一种血清中游离前列腺特异抗原的定值方法，包括以下步骤：
(1)空白血清的选择
医院检验科抽取一位健康志愿者的血液，血液通过血液离心机进行离心分离获得血清，使用罗氏电化学发光试剂盒和生化分析仪对血清进行免疫分析，检测其PSA浓度为0.36ng/mL，浓度极低，确定其为空白血清。
(2)前列腺特异抗原纯品物质的选择
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相和飞行时间质谱，对前列腺特异抗原进行定性分析，选取纯度高，实际分子量与理论一致的纯品蛋白作为后续制备血清样品的添加原料。
具体为：在PSA溶液中加入适量溴酚蓝混匀，90℃加热5min；泳道中加入Marker和样品，电压调到80V；之后将胶块用考马斯亮蓝染色，20min后用洗脱液反复洗脱，直至能看到条带。如图1所示，经过成像分析得到PSA样品中主成分的纯度为90.6％，分子量为24.8kDa，杂质蛋白质分子量为31.2kDa。是由于PSA会发生糖基化类的蛋白质修饰，使PSA结合SDS的能力发生变化，导致分子量测定出现偏差。并且由于SDS-PAGE实验中使用上样缓冲液破坏蛋白质结构，还原二硫键，导致测定结果显示蛋白质变性后的亚基(肽链)的分子量，也会导致测定样品纯度偏低。
将PSA样品进液相色谱质谱，查看质谱图中是否有杂峰；色谱柱为：Vydac 214TPC4(5μm，4.6×250mm)；流动相A：水(0.1％甲酸)，流动相B：乙腈(0.1％甲酸)；流速0.2mL/min；如图2所示，没有明显的杂质峰，说明样品纯度比较高，峰面积积分后得到纯度为99.76％。
飞行时间质谱法中，以饱和芥子酸溶液作为基质，吸取10μL溶液和10μL饱和芥子酸溶液于离心管中混合均匀，吸取混合液1μL滴于MTP 384靶板上，吹干后将靶板放入仪器仓中进行蛋白质分子量测定。实验采用正极性分析，检测质量范围设置为10000-40000Da，脉冲离子提取时间为50ns，离子源1、离子源2电压分别为25kV、23.3kV，使用flexanalysis分析软件进行数据处理。图3显示两个主要的质谱峰分别为带+1电荷和+2电荷的PSA质谱峰，表明PSA的相对分子质量为28273.01Da，与理论值26072.13Da存在差异。PSA原料的实际相对分子质量与理论相对分子质量相差2200.88Da，分析该差异是由于位于PSA氨基酸序列第45位的天冬酰胺发生糖基化反应而连接碳水化合物导致相对分子质量增加2-3kDa，但碳水化合物的存在并不会影响特征肽段检测。
(3)制备血清样品
在500μL空白血清中加入341.22ng的PSA，制备成为血清样品。
(4)血清中游离前列腺特异抗原的纯化富集
将PSA抗体偶联至M-270环氧树脂微珠表面，利用抗体与抗原的亲和结合将血清中的PSA结合到磁珠抗体偶联物上，结合生成的PSA-磁珠抗体偶联物被磁铁吸附于管壁，移除血清进而从血清中分离PSA。然后添加洗脱液将PSA从磁珠抗体偶联物上洗脱从而分离血清中的PSA。
具体为：将磁珠活化，加入过量抗体，制备磁珠抗体复合物，磁珠抗体复合物浓度为10mg/mL；取血清样品于500μL的离心管中；加入50μL磁珠抗体复合物，室温旋转孵育1h，保证PSA抗体与血清中全部PSA结合充分，去上清(通过电化学发光免疫分析试剂盒考察剩余血清中PSA浓度计算免疫提取效率)；用100μL的5％乙酸水溶液将磁珠上结合的前列腺特异抗原洗脱下来，室温旋转孵育2分钟；用磁珠分离器吸附磁珠，收集洗脱下来的溶液，-20℃保存使用。
磁珠富集效率考察：在步骤(4)中，用磁珠抗体复合物提取血清中的PSA，收集弃去的血清，用生化分析仪检测其PSA浓度，得到磁珠提取效率。结果如图4所示，当磁珠-抗体溶液用量为50μL时，即磁珠-抗体溶液与血清体积比为1:10时，基本认为血清中PSA完全被分离提取，富集效率可达95.53％，基本富集完全。
(5)酶切肽段HR、FR、LK：
对洗脱下的蛋白真空干燥后复溶，90℃加热变性，加入碳酸氢铵调整体系pH至7.8-8.5。按照胰蛋白酶与PSA质量比1:70加入相应的胰蛋白酶，并加入等量的标记肽段溶液，于37℃孵育10h。加入甲酸终止反应，得到酶切肽段HR、FR、LK。
在PSA溶液中分别加入与PSA溶液中蛋白质质量比为1:5、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90和1:100的胰蛋白酶，酶解后加入固定质量标记特征肽段，LC-MS/MS检测特征肽段与标记特征肽段峰面积比，考察PSA酶解是否完全，从而确定最佳胰蛋白酶添加量由图5分析可知，当胰蛋白酶添加量与PSA质量比低于1:70时，特征肽段HR、FR和LK与标记特征肽段峰面积比均未达到最大值，表明PSA未被胰蛋白酶完全酶解，胰蛋白酶添加量不足，而胰蛋白酶添加量与PSA质量比为1:70时，肽段HR、FR和LK与标记特征肽段峰面积比达到最大值，继续增加胰蛋白酶比例，酶解效果略有下降，表明PSA被过度酶解而产生了肽段损失。因此确定胰蛋白酶添加量为PSA质量的1/70。
在PSA溶液中加入固定量胰蛋白酶后，分别酶解4、8、9、10、14和16小时，酶解不同时间的PSA溶液中加入固定质量标记特征肽段，LC-MS/MS检测特征肽段与标记特征肽段峰面积比，考察PSA酶解是否完全，从而确定最佳酶解时间。由图6分析可知，PSA溶液酶解4-8小时内，随着酶解时间增加，特征肽段HR、FR和LK与标记特征肽段峰面积比呈现稳定上升趋势，表明酶解时间不足，PSA未被完全酶解，而当酶解时间达到10小时后，肽段HR、FR和LK与标记特征肽段峰面积之比均达到平稳，在酶解时间更长后也没有明显增加。因此PSA溶液酶解时间确定为10小时。
(6)高标、低标溶液的配制：
配制的高标低标溶液中特征肽段与标记特征肽段质量比约为0.8和1.2，且特征肽段浓度与PSA溶液酶解后理论特征肽段浓度一致。
(7)前列腺特异抗原定量分析：
将酶切好的样品和高低标溶液进质谱，通过肽段的浓度推算出前列腺特异抗原的浓度，而肽段的浓度根据液质分析MRM模式谱图的峰面积表示；选用3条肽段计算前列腺特异抗原浓度，以3者平均值定值；
根据肽段HR、FR、LK浓度计算血清中PSA浓度，计算公式如下：
式中，I是肽段，MPSA是PSA相对分子质量(26072.12)，M是肽段相对分子质量，mIS是加入内标质量(μg)，IH是高标中肽段与内标质量之比，IL是低标中肽段与内标质量之比，RH是高标中肽段或与内标峰面积之比，RL是低标中肽段与内标峰面积之比，m是PSA溶液质量(g)。CHR，CFR和CLK分别是由三条肽段计算得到的肽段浓度，CPSA是血清中PSA的浓度。
PSA定量测试结果：
对血清样品进行亲和纯化。设3个平行实验，采用一点法进行实验。由3个平行样品测量结果计算得出特征肽段HR、FR、LK的含量，详细数据见表1。
表1LC-MS定值结果
3个血清样品之间和3种特征肽段之间测量数据无明显差异，测得通过添加法制成的血清样品PSA浓度为0.42ng/μL，RSD均低于5％，三条肽段的定量结果具有良好的重复性和精密度，结果高度一致。由此可见，本发明方法是一种高效、简便、可靠的检测方法。
综上所述：
(1)本发明选用磁珠亲和纯化的方法对血清游离PSA进行前处理。通过磁珠富集纯化，可去除PSA血清样品中的杂蛋白，对低浓度的血清样品有很好的富集作用，降低检测限，同时纯化后的蛋白，提高信噪比，提高质谱检测的准确性。因此，血清处理前后都用生化分析仪测试其浓度，磁珠提取效率达到95.53％，证明磁珠富集血清中的蛋白质是一种可靠、方便的富集纯化技术。
(2)本发明还对酶切效率进行了考察。现有技术中的实验大多采用尿素和盐酸胍对蛋白进行变性，用超滤管去除变性剂或稀释变性剂后上机检测。用超滤管去除变性剂后回收率低，对于低丰度蛋白来说质谱响应太低，数据可比性不强。稀释变性剂后上样使肽段浓度大大降低，质谱响应不高。本发明将磁珠富集后的样品离心浓缩后只加入10μL去离子水溶解，90℃加热变性后加入碳酸氢铵，在最后加入胰蛋白酶，进行酶解。通过改变变性方法，不需要去除或稀释变性剂的操作，因此终体积小，肽段浓度相对较高，这一方法的回收率达61.52％。
无论是磁珠富集效率还是胰蛋白酶的酶切效率的优化，在本发明中只是为了加强质谱的响应面积，不参与浓度计算。
(3)本发明使用LC-MS/MS方法对血清中游离前列腺特异抗原进行定值。实验原理是通过特征肽段的浓度推算出蛋白质的浓度，而肽段的浓度可以根据液质分析MRM模式谱图的峰面积表示。选用3条肽段计算PSA浓度，以3者平均值定值。在一般实验中，蛋白质的提取率、酶切效率、仪器的稳定性、实验误差等都会影响蛋白质的定量，而本发明方法在样品中添加等量的内标——标记肽段，可以消除以上误差，计算得到血清样品中游离前列腺特异抗原的浓度。通过肽段对蛋白进行定值，其数值可靠、可溯源至SI单位，并且原料是天然PSA，因此无需考虑其结构的差异。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种血清中游离前列腺特异抗原的定值方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)空白血清的选择：通过基于免疫的方法测定血清中前列腺特异抗原的浓度，并选择前列腺特异抗原含量为0-0.5ng/mL的血清作为空白血清；
(2)前列腺特异抗原纯品物质的选择：对前列腺特异抗原进行定性分析，为后续在血清中添加选择原料；
(3)血清样品制备：空白血清中添加一定量的前列腺特异抗原纯品物质；
(4)血清中游离前列腺特异抗原的纯化富集：将磁珠活化，按比例加入抗体，制备磁珠抗体复合物；在血清样品中加入一定量的磁珠抗体复合物，孵育洗涤；用乙酸水溶液将磁珠上结合的PSA洗脱下来，-20℃保存使用；所述磁珠为M-270环氧树脂微珠；
(5)酶切肽段HR、FR、LK：对洗脱下的蛋白真空干燥后复溶，90℃加热变性，加入碳酸氢铵调整体系pH；按比例加入一定量的胰蛋白酶溶液，并加入等量的标记肽段溶液，于37℃进行酶切反应；加入甲酸终止反应，得到酶切肽段HR、FR、LK；其中，肽段HR的序列为HSQPWQVLVASR，肽段FR的序列为FLRPGDDSSHDLMLLR，肽段LK的序列为LSEPAELTDAVK，如SEQID NO:1-3所示；
(6)高标、低标溶液的配制；
(7)前列腺特异抗原定量分析：将酶切好的样品和高低标溶液进质谱，通过肽段的浓度推算出前列腺特异抗原的浓度，而肽段的浓度根据液质分析MRM模式谱图的峰面积表示；选用3条肽段计算前列腺特异抗原浓度，以三者平均值定值；
根据肽段HR、FR、LK浓度计算血清中PSA浓度，计算公式如下：
式中，I为肽段，MPSA为PSA相对分子质量26072.12，M为肽段相对分子质量，mIS为加入内标质量，单位μg；IH为高标中肽段与内标质量之比，IL为低标中肽段与内标质量之比，RH为高标中肽段或与内标峰面积之比，RL为低标中肽段与内标峰面积之比，m为PSA溶液质量，单位g；CHR，CFR和CLK分别为由三条肽段计算得到的肽段浓度，CPSA为血清中PSA的浓度。
2.根据权利要求1所述的血清中游离前列腺特异抗原的定值方法，其特征在于：所述步骤(1)具体为，抽取健康志愿者血液，血液通过血液离心机进行离心分离获得血清，使用罗氏电化学发光试剂盒和生化分析仪对血清进行免疫分析，检测PSA浓度为0.36ng/mL，浓度极低，确定其为空白血清。
3.根据权利要求1所述的血清中游离前列腺特异抗原的定值方法，其特征在于：所述步骤(2)具体为，对纯品前列腺特异抗原进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱法和飞行时间质谱分析。
4.根据权利要求3所述的血清中游离前列腺特异抗原的定值方法，其特征在于：所述步骤(2)中的聚丙烯酰胺凝胶电泳具体为，在PSA溶液中加入适量溴酚蓝混匀，90℃加热5min；泳道中加入Marker和样品，电压调到80V；之后将胶块用考马斯亮蓝染色，20min后用洗脱液反复洗脱，直至能看到条带。
5.根据权利要求3所述的血清中游离前列腺特异抗原的定值方法，其特征在于：所述步骤(2)中的高效液相色谱法具体为，将PSA样品进色谱，查看色谱图中是否有杂峰；色谱柱为：Vydac 214TP C4，规格为5μm，4.6×250mm；流动相A：0.1％甲酸水，流动相B：含有0.1％甲酸的乙腈；流速0.2mL/min。
6.根据权利要求3所述的血清中游离前列腺特异抗原的定值方法，其特征在于：所述步骤(2)中的飞行时间质谱法具体为，以饱和芥子酸溶液作为基质，吸取10μL蛋白溶液与10μL饱和芥子酸溶液于离心管中混合均匀，吸取混合液1μL滴于MTP 384靶板上，吹干后将靶板放入仪器仓中进行蛋白质分子量测定；实验采用正极性分析，检测质量范围设置为10000-40000Da，脉冲离子提取时间为450ns，离子源1、离子源2电压分别为25kV、23.3kV，使用flexanalysis分析软件进行数据处理。
7.根据权利要求1所述的血清中游离前列腺特异抗原的定值方法，其特征在于：所述步骤(3)具体为，在500μL空白血清中加入一定量的PSA，制备成为血清样品。
8.根据权利要求1所述的血清中游离前列腺特异抗原的定值方法，其特征在于：所述步骤(4)具体为，将磁珠活化，加过量抗体孵育过夜，制备磁珠抗体复合物，磁珠-抗体溶液为在10mg/mL；取血清样品于离心管中，加入50μL的磁珠抗体复合物，室温旋转孵育1h，使血清中的前列腺特异抗原结合到磁珠抗体上，去上清；用100μL 5％乙酸溶液水溶液将磁珠上结合的前列腺特异抗原洗脱下来，室温旋转孵育2分钟；用磁珠分离器吸附磁珠，收集洗脱下来的溶液，-20℃保存使用。
9.根据权利要求1所述的血清中游离前列腺特异抗原的定值方法，其特征在于：所述步骤(5)具体为，将洗脱液真空干燥后，加入10μL的去离子水复溶；90℃加热10分钟对蛋白质进行变性；恢复常温后，加入80μL碳酸氢铵溶液调节pH，按比例加入一定量的胰蛋白酶溶液，并加入等量的标记肽段溶液，于37℃进行酶切反应；加入甲酸终止反应；得到酶切肽段HR、FR、LK。
10.根据权利要求1所述的血清中游离前列腺特异抗原的定值方法，其特征在于：所述步骤(6)具体为，配制的高标低标溶液中特征肽段与标记特征肽段质量比为0.8和1.2，且特征肽段浓度与PSA溶液酶解后理论特征肽段浓度一致。
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