CN114487198B - 一种磷酸化肽的相对定量方法 - Google Patents
一种磷酸化肽的相对定量方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114487198B CN114487198B CN202210102232.2A CN202210102232A CN114487198B CN 114487198 B CN114487198 B CN 114487198B CN 202210102232 A CN202210102232 A CN 202210102232A CN 114487198 B CN114487198 B CN 114487198B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- dimethylamine
- mass
- sample
- light
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
- G01N30/08—Preparation using an enricher
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明属于生物分子检测技术领域,具体涉及一种磷酸化肽的相对定量方法。本方法使用二甲胺、氘代二甲胺作为标记试剂,可标记多肽中的C端以及天冬氨酸R基团、谷氨酸R基团,二甲胺或氘代二甲胺与多肽中的衍生位点——羧基发生反应,在生成酰胺键的同时使其带上标记。将轻重标记的样品混合,经TiO2富集后,通过液相色谱‑质谱联用检测,以提取离子色谱峰的峰面积数值为依据,即可分析同一条多肽在两组样品间的相对量差异。该标记定量方法不仅不干扰磷酸化肽的检测,还可增强TiO2对磷酸化肽的富集特异性。
Description
技术领域
本发明属于生物分子检测技术领域,具体涉及一种磷酸化肽的相对定量方法。
背景技术
作为生命活动的主要执行者,蛋白质经常呈现多样化的翻译后修饰,尤以磷酸化修饰最为普遍。通过激酶“写入”磷酸基和磷酸酶“擦除”磷酸基,可改变蛋白质的三维结构以实现其活性的调控。生物体内的蛋白质磷酸化过程是短暂且处于动态变化中的,通过定量分析掌握这些变化,将有助于洞悉生命活动中信号传导及功能的实现机制。由此,蛋白质磷酸化的相关研究已由早期的定性分析逐步发展到定量分析。
蛋白质翻译后修饰的定量分析一般是基于“自下而上”(bottom-up)的质谱方法,大体可分为3类:无标记定量技术(label free)、代谢标记技术(metabolic labeling)、化学标记技术(chemical labeling)。
无标记定量技术不使用任何标签,通过比较质谱峰强度以分析不同来源样品中同一蛋白质的相对丰度差异。以SILAC(stable isotope labelling by amino acids incellculture)为代表的代谢标记技术一般是在细胞培养阶段用轻重型同位素标记的氨基酸分别培养细胞,经数代后将标记的蛋白质混合处理。在比较氨基酸序列相同且拥有不同同位素标记的多肽的相对丰度后,得到各种蛋白质在不同处理过程中的表达量差异。化学标记是一种将蛋白质或多肽提取后再标记其特定氨基酸的技术,主要分为2类:轻重同位素标记法、同整质量标签标记法。常见的轻重同位素标记试剂有ICAT(isotope-coded affinitytag)、甲醛等。ICAT用于标记半胱氨酸,甲醛则标记多肽N端与赖氨酸。将轻重型同位素标记的样品混合处理,通过质谱分析比较不同样品中同一蛋白质的相对丰度差异。以iTRAQ(isobaric tagsfor relative and absolute quantitation)、TMT(tandem mass tag)技术为代表的同整质量标签标记,是使用一组拥有同整质量的试剂分别标记不同的样品,将样品混合后可在二级质谱谱图中观察各报告基团的相对丰度,进而比较不同样品中同一蛋白质的表达量差异。
虽然上述三类方法均可用于磷酸化肽的相对定量分析,然而,各方法都存在一些缺陷,并不非常适合此类多肽。例如,磷酸化肽具有质谱电离强度低、易丢失磷酸基团等特点,导致采用无标记定量技术时误差较大,难以得到有统计学意义的定量信息;SILAC主要适用于体外培养细胞,而对生物模型的标记成本太高,也难以应对组织、体液等样品;ICAT技术只能标记半胱氨酸,而磷酸化肽经常不含此氨基酸;单个甲醛标记位点可在轻重标记间产生4Da的差异,此差异偏小,可能存在因衍生位点过少而导致轻重标记多肽的同位素峰重叠等问题;同整质量标签试剂的优势在于可同时标记多个样品,但价格昂贵。
发明内容
针对上述现有技术中存在的不足,本发明的目的在于建立一种具有广谱性且操作简单、价格低廉的磷酸化肽的相对定量方法。该方法使用二甲胺、氘代二甲胺作为标记试剂,可标记多肽中的C端以及天冬氨酸R基团、谷氨酸R基团,属于化学标记技术中的“轻重同位素标记法”。二甲胺或氘代二甲胺与多肽中的衍生位点——羧基发生反应,在生成酰胺键的同时使其带上标记。将轻重标记的样品混合,通过质谱检测即可分析同一条多肽在两组样品间的相对量差异。
为了实现上述目的,本发明采取的技术方案如下:
一种磷酸化肽的相对定量方法,包括以下步骤:
(1)对待测生物样品进行前处理,得到多肽样品;
进一步,所述生物样品为组织、体液、蛋白质样品等;以体液或蛋白质样品为例,前处理步骤包括:酶解,脱盐,干燥;以组织样品为例,前处理步骤包括:裂解,超滤,酶解,脱盐,干燥;
(2)向多肽样品中加入轻或重同位素标记试剂进行标记,所述轻同位素标记试剂为二甲胺盐酸盐(CH3)2NH·HCl,所述重同位素标记试剂为氘代二甲胺盐酸盐(CD3)2NH·HCl;将轻、重同位素标记的多肽衍生产物按一定质量比混合,得到混合多肽样品;
(3)用TiO2磁性纳米颗粒特异性富集混合多肽样品中磷酸化肽;
(4)通过液相色谱-质谱联用检测经TiO2富集后样品,以提取离子色谱峰的峰面积数值为依据,比较序列相同的磷酸化肽在两组样品间的相对量差异。
进一步,所述步骤(2):将干燥的多肽被溶于0.5-1.0mol/L二甲胺盐酸盐或氘代二甲胺盐酸盐与0.5mol/L N-甲基吗啡啉的混合溶液中,再加入30-50mmol/L六氟磷酸(7-氮杂苯并三唑-1-氧基)三吡咯烷磷,其中溶剂为二甲基亚砜,常温且黑暗处放置0.6-1.2h完成标记;将质量比例确定的轻、重同位素标记的多肽衍生产物用80v/v%乙腈稀释后,随后混合。
进一步,所述步骤(3):将混合液加入到2-8mg/mL TiO2磁性颗粒悬浮液中震荡1-2h;用含0.1v/v%三氟乙酸的30v/v%丙酮和含0.1v/v%三氟乙酸的50v/v%乙腈分别清洗磁珠;用含5wt%NH4OH的20v/v%乙腈洗脱样品,回收洗脱液并真空干燥。
进一步,所述步骤(4):液相色谱包括下列条件:
流动相A:乙腈/甲酸/水=20/1/980,v/v/v;流动相B:乙腈/甲酸/水=980/1/20,v/v/v;流动相的梯度洗脱程序如下:0min,5%B;2min,5%B;30min,38%B;38min,90%B;43min,90%B;45min,5%B;60min,5%B;色谱柱为C18,3.0μm,0.3mm×150mm。
进一步,步骤(2)中轻标记试剂或重标记试剂的加入量以待测生物样品中蛋白质质量计,当待测生物样品中蛋白质的质量不超过200μg时,加入轻标记试剂或重标记试剂的量为0.02–0.04mmol;当待测生物样品中蛋白质的质量超过200μg时,加入轻或重标记试剂的用量等比例增加。
进一步,步骤(3)中TiO2磁性纳米颗粒的加入量以待富集多肽等同于原始蛋白质质量计,质量为待富集的原始蛋白质质量的2-6倍。
具体的,以蛋白质样品为例,一种磷酸化肽的相对定量方法,包括以下步骤:
S1.蛋白质的酶解:确定待测生物样品(含磷酸化蛋白质的样品溶液)中蛋白质的质量(也称为原始蛋白质质量),将样品经过变性、还原和烷基化过程处理;在经蛋白酶酶解后,加入甲酸以酸化溶液。
S2.肽段脱盐:用超纯水、80%乙腈(含0.1%三氟乙酸)清洗C18(十八烷基硅烷键合硅胶)固相萃取小柱;用0.1%三氟乙酸平衡C18小柱;将S1所得溶液加载到平衡好的小柱中;用0.1%三氟乙酸清洗小柱;用50%乙腈(含0.1%三氟乙酸)将多肽从小柱上洗脱;回收洗脱液并真空干燥。
S3.二甲胺衍生:干燥的多肽被溶于0.5-1.0mol/L二甲胺盐酸盐或氘代二甲胺盐酸盐与0.5mol/LN-甲基吗啡啉的混合溶液中(溶剂为二甲基亚砜),再加入30-50mmol/L六氟磷酸(7-氮杂苯并三唑-1-氧基)三吡咯烷磷(7-azabenzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate,PyAOP)溶液(溶剂为二甲基亚砜);常温且黑暗处放置0.6-1.2h完成标记;在含有二甲胺的反应液中的多肽被轻标记,而在含有氘代二甲胺的反应液中的多肽被重标记。
S4.TiO2磁性纳米颗粒富集磷酸化肽:标记后的样品被80%乙腈(含0.1%三氟乙酸)稀释;分别取多肽(对应的原始蛋白质)质量比例确定的轻、重标记样品,随后混合;将混合液加入到2-8mg/mLTiO2磁性颗粒悬浮液中震荡1-2h;用30%丙酮(含0.1%三氟乙酸)和50%乙腈(含0.1%三氟乙酸)分别清洗磁珠;用20%乙腈(含5wt%NH4OH)洗脱样品,回收洗脱液并真空干燥。
S5.磷酸化肽的相对定量:S4所得富集后样品被溶解于含1%甲酸的水溶液中;通过液相色谱-质谱联用仪完成检测;分别计算带有轻重标记且序列相同的磷酸化肽的理论m/z;依据理论m/z从谱图中提取相应的离子色谱峰(m/z误差为±0.01Da);以数据处理软件得到的色谱峰峰面积数值为依据,比较同一磷酸化肽在两组样品间的相对量差异。
作对替代方案,一种磷酸化肽的相对定量方法,包括以下步骤:
S1.蛋白质的酶解:确定待测生物样品(含磷酸化蛋白质的样品溶液)中蛋白质的质量(也称为原始蛋白质质量),将样品经过变性、还原和烷基化过程处理;在经蛋白酶酶解后,加入甲酸以酸化溶液。
S2.肽段脱盐:用超纯水、80%乙腈(含0.1%三氟乙酸)清洗C18(十八烷基硅烷键合硅胶)固相萃取小柱;用0.1%三氟乙酸平衡C18小柱;将S1所得溶液加载到平衡好的小柱中;用0.1%三氟乙酸清洗小柱;用50%乙腈(含0.1%三氟乙酸)将多肽从小柱上洗脱;回收洗脱液并真空干燥。
S3.TiO2磁性纳米颗粒富集磷酸化肽:脱盐后的样品被溶解于80%乙腈(含0.1%三氟乙酸)中;将样品液加入到TiO2磁性颗粒悬浮液中震荡1-2h;用80%乙腈(含0.1%三氟乙酸)清洗磁珠;用20%乙腈(含5wt%NH4OH)洗脱样品,回收洗脱液并真空干燥。
S4.二甲胺衍生:干燥的多肽被溶于0.5-1.0mol/L二甲胺盐酸盐或氘代二甲胺盐酸盐与0.5mol/LN-甲基吗啡啉的混合溶液中(溶剂为二甲基亚砜),再加入30-50mmol/LPyAOP溶液(溶剂为二甲基亚砜);常温且黑暗处放置0.6-1.2h完成标记;在含有二甲胺的反应液中的多肽被轻标记,而在含有氘代二甲胺的反应液中的多肽被重标记。
S5.二次脱盐:将轻重标记的样品混合后用0.1%三氟乙酸稀释;用超纯水、80%乙腈(含0.1%三氟乙酸)清洗C18固相萃取小柱;用30%丙酮(含0.1%三氟乙酸)平衡C18小柱;将样品混合液加载到平衡好的小柱中;再用30%丙酮(含0.1%三氟乙酸)清洗小柱;用50%乙腈(含0.1%三氟乙酸)将多肽从小柱上洗脱;回收洗脱液并真空干燥。
S6.磷酸化肽的相对定量:S5所得样品被溶解于含1%甲酸的水溶液中;通过液相色谱-质谱联用仪完成检测;分别计算带有轻重标记且序列相同的磷酸化肽的理论m/z;依据理论m/z从谱图中提取相应的离子色谱峰(m/z误差为±0.01Da);以数据处理软件得到的色谱峰峰面积数值为依据,比较同一磷酸化肽在两组样品间的相对量差异。
优选地,当待测生物样品中蛋白质的质量不超过200μg时,加入轻标记试剂或重标记试剂的量为0.02–0.04mmol;当待测生物样品中蛋白质的质量超过200μg时,加入轻/重标记试剂的用量等比例增加。
优选地,S4步骤中加入TiO2磁性纳米颗粒的质量以待富集的多肽等同于原始蛋白质质量计,为待富集的原始蛋白质质量的2-6倍。
本发明涉及的溶液百分数,未作特别说明的,均是指体积分数。
与现有技术相比,本发明具有的优点及有益效果为:
两组样品中的磷酸化肽,其羧基因被衍生而分别带上轻重同位素标记,由此可通过质谱分析同一条多肽在不同样品间的相对量差异;该方法适合组织、体液、蛋白质样品等;反应基团与天冬氨酸R基、谷氨酸R基和多肽C端相连,可用于标记所有蛋白酶酶解后产生的多肽;轻重同位素标记的同一条多肽的分子量相差6Da的整数倍,可有效地避免在质谱检测时可能出现的轻重标记多肽的质谱峰重叠风险;二甲胺与氘代二甲胺价廉易得。
该标记定量方法不仅不干扰磷酸化肽的检测,还可增强TiO2对磷酸化肽的富集特异性,原因在于:TiO2主要与多肽中的负电荷基团产生相互作用,而在二甲胺标记之后,多肽中的羧基被中性化,使得非磷酸化肽的负电性基团消失,仅磷酸化肽存在显著负电性,由此提高了TiO2与多肽之间相互作用的特异性。
附图说明
图1是二甲胺/氘代二甲胺标记天冬氨酸与谷氨酸的原理图。
图2是不同摩尔比的磷酸化肽VPQLEIVPNpSAEER被轻重试剂标记的一级质谱图。其中:A、B、C、D、E分别对应磷酸化肽的理论摩尔比5:1、2:1、1:1、1:2、1:5。
图3是不同摩尔比的磷酸化肽VPQLEIVPNpSAEER被轻重试剂标记的提取离子色谱图。其中:A、B、C、D、E分别对应磷酸化肽的理论摩尔比5:1、2:1、1:1、1:2、1:5。
图4是采用本方法得到的磷酸化肽VPQLEIVPNpSAEER的相对定量结果与理论值的差异图。
具体实施方式
以下申请人结合具体实施例和附图对本发明的技术方案进一步进行描述。
实施例1:一种磷酸化肽的相对定量方法
样品的准备(重复三次,每次均执行酶解、脱盐、衍生、富集操作)
蛋白质的酶解:取200μg牛血清酪蛋白,用120μL的8mol/L尿素溶解;加入3μL的1mol/L二硫苏糖醇溶液,反应液置于37℃条件下保持2h,使蛋白质中的二硫键被还原;加入7μL的1mol/L碘乙酰胺溶液,反应液于常温且黑暗处被静置1h;用130μL的100mmol/L碳酸氢铵溶液稀释样品,按蛋白质与酶的质量比为500:1加入胞内蛋白酶(Lys-C),于35℃预酶解4h;用700μL的50mmol/L碳酸氢铵溶液稀释样品,按蛋白质与酶的质量比25:1加入胰蛋白酶(Trypsin),于37℃酶解6h;向溶液中加入100μL纯甲酸以终止酶解反应。
多肽的脱盐:用1mL超纯水、1mL 80%乙腈(含0.1%三氟乙酸)各清洗两次C18(十八烷基硅烷键合硅胶)固相萃取小柱;使用1mL 0.1%三氟乙酸平衡C18小柱,重复一次;将酶解肽段室温下12000rpm离心5min后取上清液加载到小柱中;用1mL 0.1%三氟乙酸清洗小柱,重复一次;用1mL 50%乙腈(含0.1%三氟乙酸)将多肽从C18小柱上洗脱;回收全部洗脱液,洗脱液被真空干燥后置于-20℃冰箱保存备用。
样品的分装:将脱盐干燥后的全部样品用200μL超纯水溶解,按照如下量分装成5对(共10个),根据体积量取待分装的样品,每对样品对应的原始蛋白质理论质量比不同,分别为1/5(3.2μL:16.0μL)、1/2(6.4μL:12.8μL)、1/1(9.6μL:9.6μL)、2/1(12.8μL:6.4μL)、5/1(16.0μL:3.2μL);分装后的样品被真空干燥,后续每对样品分别被轻重同位素标记。
二甲胺衍生:干燥的肽段溶于40μL的标记溶液中,该标记溶液组成为1mol/L二甲胺盐酸盐或氘代二甲胺盐酸盐和0.5mol/L的N-甲基吗啡啉混合溶液,其中溶剂为二甲基亚砜;再加入40μL的50mmol/LPyAOP溶液(溶剂为二甲基亚砜);混匀后于常温且黑暗处放置1h。其中:二甲胺/氘代二甲胺标记天冬氨酸与谷氨酸的原理图见图1。
磷酸化肽的富集:标记后的样品均被200μL的80%乙腈(含0.1%三氟乙酸)稀释,然后将轻重同位素标记的每对样品混合在一起,共得到5个样品;每个混合样品对应的原始蛋白质总质量为19.2μg,向每个混合样品中加入20μL的5mg/mL的TiO2磁性颗粒悬浮液(厦门普睿迈格生物科技有限公司),然后震荡1h;用100μL的30%丙酮(含0.1%三氟乙酸)和100μL的50%乙腈(含0.1%三氟乙酸)各清洗磁性颗粒两次;用200μL的20%乙腈(含5wt%NH4OH)洗脱样品;回收洗脱液,洗脱液被真空干燥后置于-20℃冰箱保存备用,后续进行定量分析。
液相色谱-质谱联用分析
微流液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用仪(micro-liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry,microLC-QTOF-MS):美国SCIEX公司产品,型号为M5-TripleTOF 5600+,配有电喷雾离子源及PeakView 2.1数据处理系统。
液相条件:经TiO2富集的标记后样品用50μL的1%甲酸溶解,经过进样系统进入液相;多肽首先被富集到一个捕集柱中,然后进入分析柱(C18,3.0μm,0.3mm×150mm,Phenomenex,USA)经过60min的梯度洗脱(流动相A:乙腈/甲酸/水=20/1/980,v/v/v;流动相B:乙腈/甲酸/水=980/1/20,v/v/v);流速为6μL/min。不同肽段依次被离子化后进入质谱分析器被分析。流动相的梯度洗脱程序如下:0min,5%B;2min,5%B;30min,38%B;38min,90%B;43min,90%B;45min,5%B;60min,5%B。
质谱条件:正离子模式;离子源温度350℃;喷雾电压5500V;离子源气体GS1为16psi;离子源气体GS2为18psi;窗帘气CUR为30psi;MS质量扫描范围300~1250m/z;MS/MS质量扫描范围100~1500m/z。
使用pFind 3.1.5软件(http://pfind.ict.ac.cn/)从酪蛋白的蛋白酶酶解样品中共鉴定到10条磷酸化肽,如表1所示。其中,理论值通过分子量计算工具得到;实验值通过质谱分析后的一级质谱图得到,理论值与实验值的差异小于20ppm,表明测定结果较为可靠。以编号P4的多肽(VPQLEIVPNpSAEER)为例,其包含4个标记位点,轻重标记的分子量相差24Da(两电荷的情况下,m/z相差12),其不同摩尔比的轻重标记样品的一级质谱图如图2所示。以理论摩尔比为5:1的轻重标记样品为例,样品在m/z=884.995(允许误差±0.01Da)的峰面积与m/z=897.069(允许误差±0.01Da)的峰面积之比值,即为两个样品的摩尔比实际检测值(图3)。本实施例共检测了5个混合样品,其轻重标记多肽的理论摩尔比分别为5/1、2/1、1/1、1/2、1/5;相应的检测结果分别为4.96/1、1.89/1、0.94/1、0.92/2、0.96/5。检测值与理论值的差异小于10%,表明本方法具有较高的准确度。采用本方法得到的磷酸化肽VPQLEIVPNpSAEER的相对定量结果与理论值的差异图见图4。
表1从酪蛋白的蛋白酶酶解样品中鉴定的磷酸化肽
上述实施例不应以任何限制本发明,凡采用等同替换或等效转换方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种磷酸化肽的相对定量方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)对待测生物样品进行前处理,得到多肽样品;
(2)向多肽样品中加入轻或重同位素标记试剂进行标记,所述轻同位素标记试剂为二甲胺盐酸盐(CH3)2NH·HCl,所述重同位素标记试剂为氘代二甲胺盐酸盐(CD3)2NH·HCl;二甲胺或氘代二甲胺与多肽中的衍生位点羧基发生反应生成酰胺键的同时使其带上标记,在二甲胺标记之后,多肽中的羧基被中性化,使得非磷酸化肽的负电性基团消失,仅磷酸化肽存在显著负电性;
(3)将质量比例确定的轻、重同位素标记的多肽衍生产物用含0.1v/v%三氟乙酸的80v/v%乙腈稀释后,随后混合,然后用TiO2磁性纳米颗粒特异性富集混合多肽样品中磷酸化肽;
(4)通过液相色谱-质谱联用检测步骤(3)所得经TiO2富集后样品,以提取离子色谱峰的峰面积数值为依据,比较序列相同的磷酸化肽在两组样品间的相对量差异。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述生物样品为组织、体液、蛋白质样品,所述前处理步骤包括酶解、脱盐、干燥步骤。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(2):将干燥的多肽被溶于0.5-1.0mol/L二甲胺盐酸盐或氘代二甲胺盐酸盐与0.5mol/L N-甲基吗啡啉的混合溶液中,再加入30-50mmol/L六氟磷酸(7-氮杂苯并三唑-1-氧基)三吡咯烷磷,其中溶剂为二甲基亚砜,常温且黑暗处放置0.6-1.2h完成标记。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤(3):将质量比例确定的轻、重同位素标记的多肽衍生产物用含0.1v/v%三氟乙酸的80v/v%乙腈稀释后,随后混合,再将混合液加入到2-8 mg/mL TiO2磁性颗粒悬浮液中震荡1-2h;用含0.1v/v%三氟乙酸的30v/v% 丙酮和含0.1v/v%三氟乙酸的50v/v% 乙腈分别清洗磁珠;用含5wt% NH4OH 的20v/v% 乙腈洗脱样品,回收洗脱液并真空干燥。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤(4):液相色谱包括下列条件:
流动相A:乙腈/甲酸/水=20/1/980,v/v/v;流动相B:乙腈/甲酸/水=980/1/20,v/v/v;流动相的梯度洗脱程序如下:0min,5%B;2min,5%B;30 min,38%B;38 min,90%B;43 min,90%B;45 min,5%B;60min,5%B;色谱柱为C18,3.0μm,0.3 mm × 150 mm。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法,其特征在于,所述步骤(2):当待测生物样品中蛋白质的质量不超过200μg时,加入轻或重标记试剂的用量为0.02–0.04mmol;当生物样品中蛋白质的质量超过200μg时,所述轻或重标记试剂的用量等比例增加。
7.根据权利要求1-5任一所述的方法,其特征在于,所述步骤(3):加入TiO2磁性纳米颗粒的质量为待富集多肽等同于原始蛋白质质量的2-6倍。
8.根据权利要求1-5任一所述的方法,其特征在于,步骤(2)和步骤(3)顺序调换,多肽被标记后还需经过二次脱盐,才可以通过液相色谱-质谱完成检测。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210102232.2A CN114487198B (zh) | 2022-01-27 | 2022-01-27 | 一种磷酸化肽的相对定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210102232.2A CN114487198B (zh) | 2022-01-27 | 2022-01-27 | 一种磷酸化肽的相对定量方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114487198A CN114487198A (zh) | 2022-05-13 |
CN114487198B true CN114487198B (zh) | 2023-08-25 |
Family
ID=81476719
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210102232.2A Active CN114487198B (zh) | 2022-01-27 | 2022-01-27 | 一种磷酸化肽的相对定量方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114487198B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117964681B (zh) * | 2024-03-26 | 2024-06-04 | 吉尔生化(上海)有限公司 | 一种固相合成的全r系列多肽三氟乙酸盐的脱盐方法 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102818836A (zh) * | 2012-08-06 | 2012-12-12 | 华中师范大学 | 多位点磷酸化修饰肽段序贯分离质谱鉴定方法 |
CN105301119A (zh) * | 2014-07-15 | 2016-02-03 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 基于两端非等重标记的蛋白质氨基酸序列从头测序方法 |
CN106645437A (zh) * | 2015-10-30 | 2017-05-10 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 基于化学修饰和同位素标记多肽氨基酸序列从头测序方法 |
CN108548876A (zh) * | 2018-03-30 | 2018-09-18 | 武汉光谷创赢生物技术开发有限公司 | 一种改进的生物样本中磷酸化肽段的鉴定及定量方法 |
CN108931603A (zh) * | 2018-04-23 | 2018-12-04 | 国家烟草质量监督检验中心 | 一种基于稳定同位素标记质谱联用技术检测血浆中羧酸类代谢物的方法 |
CN112986570A (zh) * | 2019-12-02 | 2021-06-18 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 基于肽段两末端准等重双标记用于氨基酸序列测定方法 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004503780A (ja) * | 2000-06-12 | 2004-02-05 | ユニバーシティ オブ ワシントン | リンペプチドの選択的標識および単離ならびにプロテオーム分析への適用 |
US9835629B2 (en) * | 2012-05-18 | 2017-12-05 | Pierce Biotechnology, Inc. | Methods and reagents for biomolecule labeling, enrichment and gentle elution |
GB201322567D0 (en) * | 2013-12-19 | 2014-02-05 | Electrophoretics Ltd | Mass labels |
-
2022
- 2022-01-27 CN CN202210102232.2A patent/CN114487198B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102818836A (zh) * | 2012-08-06 | 2012-12-12 | 华中师范大学 | 多位点磷酸化修饰肽段序贯分离质谱鉴定方法 |
CN105301119A (zh) * | 2014-07-15 | 2016-02-03 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 基于两端非等重标记的蛋白质氨基酸序列从头测序方法 |
CN106645437A (zh) * | 2015-10-30 | 2017-05-10 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 基于化学修饰和同位素标记多肽氨基酸序列从头测序方法 |
CN108548876A (zh) * | 2018-03-30 | 2018-09-18 | 武汉光谷创赢生物技术开发有限公司 | 一种改进的生物样本中磷酸化肽段的鉴定及定量方法 |
CN108931603A (zh) * | 2018-04-23 | 2018-12-04 | 国家烟草质量监督检验中心 | 一种基于稳定同位素标记质谱联用技术检测血浆中羧酸类代谢物的方法 |
CN112986570A (zh) * | 2019-12-02 | 2021-06-18 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 基于肽段两末端准等重双标记用于氨基酸序列测定方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Fully automated isotopic dimethyl labeling and phosphopeptide enrichment using a microfluidic HPLC phosphochip;Ayse Nur Polat 等;Analytical and Bioanalytical Chemistry;第404卷(第8期);2507-2512 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN114487198A (zh) | 2022-05-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Griffin et al. | Toward a high-throughput approach to quantitative proteomic analysis: expression-dependent protein identification by mass spectrometry | |
Lill | Proteomic tools for quantitation by mass spectrometry | |
CN110850099B (zh) | 一种非疾病诊断目的的血清中c反应蛋白的定值方法 | |
EP1346229B1 (en) | Inverse labeling method for the rapid identification of marker/target proteins | |
EP1918714A1 (en) | Compounds and methods for double labelling of polypeptides to allow multiplexing in mass spectrometric analysis | |
AU2001273568B2 (en) | Methods and kits for sequencing polypeptides | |
AU2001273568A1 (en) | Methods and kits for sequencing polypeptides | |
Lee et al. | Highly informative proteome analysis by combining improved N‐terminal sulfonation for de novo peptide sequencing and online capillary reverse‐phase liquid chromatography/tandem mass spectrometry | |
AU2002240866A1 (en) | Inverse labeling method for the rapid identification of marker/target proteins | |
Gevaert et al. | Peptides adsorbed on reverse‐phase chromatographic beads as targets for femtomole sequencing by post‐source decay matrix assisted laser desorption ionization‐reflectron time of flight mass spectrometry (MALDI‐RETOF‐MS) | |
EP1617223A2 (en) | Serial derivatization of peptides for "de Novo" sequencing using tandem mass spectrometry | |
Regnier et al. | Multidimensional chromatography and the signature peptide approach to proteomics | |
Qian et al. | High-throughput proteomics using Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry | |
CN114487198B (zh) | 一种磷酸化肽的相对定量方法 | |
AU757356B2 (en) | Methods and kits for sequencing polypeptides | |
EP2008109A1 (en) | Method and reagent for the specific identification and quantification of one or more proteins in a sample using inductively coupled plasma-mass spectrometry | |
Shively et al. | Highlights of protein structural analysis | |
EP1521969A2 (en) | Quantitative analysis via isotopically differentitated derivatization | |
US20070015233A1 (en) | Analysis of molecules | |
EP1916526A1 (en) | Method for diagnostic and therapeutic target discovery by combining isotopic and isobaric labels | |
CN116046923B (zh) | 一种血清中降钙素原的定值方法 | |
WO2008064239A2 (en) | Imidazolidine derivative mass tags | |
KR20110121842A (ko) | 펩티드 아미노기 치환용 화합물 엔-메틸피페라진 아세트산의 동위 이성질체 및 질량 분석기를 이용한 펩티드 정량 방법 | |
Meyers et al. | Protein identification and profiling with mass spectrometry | |
Stewart et al. | The use of 18O labeling as a tool for proteomic applications |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |