CN108931603A - 一种基于稳定同位素标记质谱联用技术检测血浆中羧酸类代谢物的方法 - Google Patents

一种基于稳定同位素标记质谱联用技术检测血浆中羧酸类代谢物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于稳定同位素标记质谱联用技术检测血浆中羧酸类代谢物的方法，本方法通过对差异标记的血浆样品的信号识别，改善了质谱检测羧酸类代谢物时离子化效率低和灵敏度不足的问题，实现了样品中含羧基化合物的非靶向分析，还可用于稳定的相对定量。

Description

一种基于稳定同位素标记质谱联用技术检测血浆中羧酸类代 谢物的方法
技术领域
本发明涉及化学检验技术领域，具体涉及一种基于稳定同位素标记质谱联用技术检测血浆中羧酸类代谢物的方法。
背景技术
羧酸类代谢物构成了大量生物学上有意义的分子，包括小分子有机酸、脂肪酸、氨基酸、小分子肽等，已被证明以痕量水平参与了能量代谢、肠道菌代谢、胰岛素分泌和炎症反应等生理病理学过程，在调控各种生理功能中起着重要作用。因此，开发对羧酸类代谢物高灵敏度和高准确性的检测方法在生化研究和疾病诊断方面具有重要的意义。
目前对血浆中羧酸类代谢物的分离分析方法大多数是靶向的，即在有标准品的前提下对部分已知的感兴趣的羧酸类代谢物或某个代谢通路上的羧酸类代谢物进行准确定性定量分析。但获得全面性的代谢通路和总代谢物信息，在某种程度上被认为比单一代谢物实现非常低的检测限更重要。然而，目前针对血浆中羧酸类代谢物的全分析方法研究还较少。
质谱是一种高灵敏度和特异性的检测方法。羧酸类化合物通常在质谱负离子模式下检测，但检测灵敏度通常较低；由于羧基的低气相质子亲和力，羧酸类代谢物在正离子模式下常表现出较低的响应，同时用于分离羧酸的流动相(酸化以促进反相色谱的保留)不总与电喷雾电离-质谱相容；由于羧基间氢键的相互作用，羧酸类代谢物具有相对低的蒸气压，无法直接进入气相色谱-电子轰击-质谱中分析。此外，即使在相同的色谱条件下，质谱的信号响应容易波动，离子化效率易发生变化。因此，常在质谱分析前向样本中加入内标以矫正质谱信号的变化，但该方法仍有一些限制：代谢物可能不与内标共洗脱，引起定量的不准确；生物样本中的代谢物在结构和含量上的差异，使得内标的加入量难以确定；难以获取所有内标物等。因此，开发一种灵敏度高、定量准确且能对血浆中羧酸类代谢物进行全分析的方法显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于稳定同位素标记质谱联用技术检测血浆中羧酸类代谢物的方法，本方法通过对差异标记的血浆样品的信号识别，改善了质谱检测羧酸类代谢物时离子化效率低和灵敏度不足的问题，实现了样品中含羧基化合物的非靶向分析，还可用于稳定的相对定量。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
首先，本发明提供一种基于稳定同位素标记质谱联用技术检测血浆中羧酸类代谢物的方法，所述方法包含以下步骤：
(1)血浆样品溶液的制备：血浆中加入提取溶液进行提取，涡旋混匀后离心取上层有机相，于氮气下吹干，复溶于乙腈中作为样品溶液备用；
(2)样品溶液的同位素标记：取步骤(1)中的样品溶液与催化剂和激活剂充分混匀后，加入“轻”同位素衍生化试剂进行反应，反应完成后，反应体系置于-20℃条件下冷冻10min即终止反应，用缓慢氮气流吹干，所得固体样品复溶于乙腈/水(50/50，v/v)中，即得到“轻”同位素标记的衍生化产物；将“轻”同位素衍生化试剂换为“重”同位素衍生化试剂重复上述操作，得到“重”同位素标记的衍生化产物；将“轻”“重”衍生化产物等比例混合均匀，即得待测液；
(3)羧酸类代谢物的非靶向代谢组学分析：取步骤(2)中的待测液进行液相色谱-双中性丢失扫描-质谱检测，基于“轻”“重”衍生化产物的质荷比差异，扫描选定的中性丢失片段，结合保留时间与质谱信号强度进行筛选，找出潜在的羧酸类代谢物。
优选地，所述提取溶液包含提取剂和/或0.5％的甲酸；
优选地，所述提取剂选自乙酸乙酯、乙腈、甲苯、氯仿和正己烷中的一种或多种，优选为乙酸乙酯；
优选地，所述提取剂与0.5％的甲酸的体积比为30：1；
优选地，步骤(2)中，所述催化剂为有机碱，优选为三乙胺；
优选地，所述催化剂的浓度为1～20μmol/mL，优选为2～10μmol/mL，更优选为2～5μmol/mL，最优选为2μmol/mL；
优选地，步骤(2)中，所述激活剂为2-氯-1-甲基碘化吡啶鎓；
优选地，所述激活剂的浓度为30～240μmol/mL，优选为120～240μmol/mL，更优选为120μmol/mL；
优选地，步骤(2)中，所述的“轻”同位素衍生化试剂为N,N-二甲基乙二胺；
优选地，步骤(2)中，所述的“重”同位素衍生化试剂为d4-N,N-二甲基乙二胺；
优选地，步骤(2)中，所述“轻”或“重”同位素衍生化试剂的浓度为10～80μmol/mL，优选为40～80μmol/mL，最优选为60μmol/mL；其中，所述“轻”或“重”同位素衍生化试剂的浓度可以相同也可以不同；
优选地，步骤(2)中，所述激活剂与“轻”或“重”同位素衍生化试剂的摩尔比为1：0.5-4，优选为1：0.5-1，更优选为1：1；
优选地，步骤(2)中，所述催化剂、激活剂与“轻”或“重”衍生化试剂的体积比为1-2.5：1：0.5-1；优选为1：1：2；
优选地，步骤(2)中，所取用的样品溶液与“轻”或“重”衍生化试剂的体积比为10-13：1，优选为10：1；
优选地，步骤(2)中，加入“轻”同位素衍生化试剂进行反应或加入“重”同位素衍生化试剂进行反应的衍生化反应的条件为在20～60℃，优选50～60℃下振荡0.5～3小时优选1.5～3小时，优选为50℃下振荡2小时；
优选地，步骤(3)中，所述液相色谱条件为：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×100mm,1.7μm,Waters)；柱温30℃；流动相A为含0.1％(v/v)甲酸的水，流动相B为含0.1％(v/v)甲酸的乙腈，梯度洗脱，流速为200μL/min，进样体积为5μL；
优选地，所述梯度洗脱程序为：0-10min 5％-50％B，10-25min 50％-62％B，25-35min 62％-80％B，35-40min 80％-100％B，40-40.5min 100％-5％B，40.5-55min 5％B；
优选地，步骤(3)中，所述双中性丢失扫描-质谱检测的条件为：双中性丢失扫描，离子源为电喷雾离子源(+)；离子源参数为：电喷雾电压5000V，气帘气35psi，雾化气70psi，辅助加热气70psi，温度600℃，碰撞气6psi；
优选地，步骤(3)中，在洗脱开始的0-2min将六通阀切换至废液，并在洗脱至55min时切回六通阀，使流动相进入质谱；
优选地，步骤(3)中，所述“轻”“重”衍生化产物的质荷比差异为4Da；
优选地，步骤(3)中，所述特定的中性丢失片段分别为45Da和49Da的片段；
优选地，步骤(3)中，所述筛选依据为质荷比相差4Da的“轻”“重”衍生化产物的保留时间相差0.05min以内、峰强度比接近于1，优选两者峰强度偏差在5％以内；
优选地，所述方法还可以进一步包括步骤(4)羧酸类代谢物的定性分析：取步骤(2)中的待测液进行液相色谱-高分辨质谱分析，获得潜在羧酸类代谢物的精确分子量、二级质谱信息及相应的分子式，在代谢数据库中检索，寻找化合物的信息；
优选地，所述高分辨质谱条件为：质谱仪：Bruker micrOTOF-QⅡ四极杆飞行时间质谱；离子源：电喷雾离子源(+)；扫描模式：Auto MS/MS；扫描范围：m/z 150-800；离子源参数：毛细管电压3500V；雾化气1.5bar；干燥气6L/min；干燥温度180℃；
优选地，步骤(4)中，所述的代谢数据库为人类代谢组数据库HMDB；
优选地，所述羧酸类代谢物选自表1中所示269种羧酸类代谢物中的任一种或多种，优选为表2中所示103种羧酸类代谢物中的任一种或多种，更优选为选自癸二酸、3-羟基月桂酸、苯丙酸、己酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸中的一种或多种。
本发明采用一对结构相同但存在同位素差异的衍生化试剂，在本发明的条件下与血浆中的目标分析物进行衍生，之后将衍生化产物等比例混合后进行液相色谱-双中性丢失扫描-质谱分析，扫描45Da和49Da的中性丢失片段，羧酸类代谢物的衍生化产物具有相同的色谱保留行为和质谱离子化能力，因此具有相同的保留时间和质谱响应强度，且具有固定的质荷比差(4Da)。因此，本发明的方法不仅能够校正基质效应，提高分析的准确度和精确度，改善质谱检测羧酸类代谢物时离子化效率低和灵敏度不足的问题，而且实现了对未知羧酸类代谢物全分析，同时还克服了商品化同位素内标价格昂贵、种类有限、获取困难的问题。此外，本发明无需借助高分辨质谱即可进行非靶向代谢组学的分析。
附图说明
图1为N,N-二甲基乙二胺和d4-N,N-二甲基乙二胺的结构式；
图2为血浆分析得到的中性丢失为45和49Da的总离子流图；
图3为不同三乙胺浓度下7种羧酸类代谢物的衍生化效果；
图4为不同激活剂与衍生化试剂的用量比下7种羧酸类代谢物的衍生化效果；
图5为不同衍生化试剂用量对血浆中加入的7种羧酸类代谢物的衍生化效果；
图6为不同温度下7种羧酸类代谢物的衍生化效果；
图7为不同时间下7种羧酸类代谢物的衍生化效果；
图8为“轻”“重”同位素标记产物的二级质谱图，其中(A)癸二酸衍生物；(B)d4-癸二酸衍生物；(C)3-羟基月桂酸衍生物；(D)d4-3-羟基月桂酸衍生物；(E)苯丙酸衍生物；(F)d4-苯丙酸衍生物；(G)己酸衍生物；(H)d4-己酸衍生物；(I)肉豆蔻酸衍生物；(J)d4-肉豆蔻酸衍生物；(K)棕榈酸衍生物；(L)d4-棕榈酸衍生物；(M)油酸衍生物；(N)d4-油酸衍生物；
图9为7种羧酸类代谢物经N,N-二甲基乙二胺衍生化后的稳定性评价。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步阐述。应当理解，本发明给出的实施例仅用于说明本发明，并不用于限制本发明的范围。
下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实验器材与试剂
2-氯-1-甲基碘化吡啶鎓：东京化成工业(TCI上海)株式会社(上海，中国)；
N,N-二甲基乙二胺：东京化成工业(TCI上海)株式会社(上海，中国)；
d4-N,N-二甲基乙二胺：中国科学院上海有机化学研究所(上海，中国)；
实验所用仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪(包括G1367D自动进样器、G1312B二元溶剂泵、G1316B柱温箱)；AB SCIEX 5500三重四级杆串联质谱仪；以及Analyst 1.5.1Software数据采集与处理软件。
实施例1
一种基于稳定同位素标记质谱联用技术检测血浆中羧酸类代谢物的方法，所述方法如下：
(1)血浆样品溶液的制备：100μL血浆中加入300μL乙酸乙酯和10μL 0.5％甲酸。涡旋混合后，以12000rpm在4℃下离心5min，萃取，收集乙酸乙酯层。萃取步骤重复三次，将三次所得乙酸乙酯层合并，于氮气吹干，复溶于乙腈中作为样品溶液备用。
(2)样品溶液的同位素标记：取步骤(1)中的样品溶液200μL，加入10μL 2μmol/mL三乙胺和10μL 120μmol/mL 2-氯-1-甲基碘化吡啶鎓充分混匀后，加入20μL 60μmol/mL N,N-二甲基乙二胺，在50℃下振荡2小时。反应结束后，将反应体系置于-20℃条件下冷冻10min即终止反应，用缓慢氮气流吹干，所得固体样品复溶于乙腈/水(50/50，v/v)中，即得到“轻”同位素标记的衍生化产物；将N,N-二甲基乙二胺换为d4-N,N-二甲基乙二胺重复上述操作，得到“重”同位素标记的衍生化产物；将“轻”“重”衍生化产物等比例混合均匀，即得待测液。
(3)羧酸类代谢物的非靶向代谢组学分析：取步骤(2)中的待测液进行液相色谱-双中性丢失扫描-质谱分析，N,N-二甲基乙二胺衍生化产物丢失质量为45的中性片段N-二甲胺并产生[M+H-45]+，d4-N,N-二甲基乙二胺衍生化产物丢失质量为49的中性片段生成[M+H-49]+，扫描45Da和49Da的中性丢失片段，得到中性丢失为45Da和49Da的总离子流图，监测4Da质荷比差异，结合保留时间(保留时间相差0.05min以内)与质谱信号强度(峰强度偏差在5％以内)筛选羧酸类代谢物，对血浆中羧酸类代谢物进行全定性分析，结果共发现269个羧酸类代谢物。
其中，所述的液相色谱条件为：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×100mm,1.7μm,Waters)；柱温30℃；流动相A为含0.1％(v/v)甲酸的水，流动相B为含0.1％(v/v)甲酸的乙腈；流速为200μL/min，进样体积为5μL。
流动相梯度为：0-10min 5％-50％B，10-25min 50％-62％B，25-35min 62％-80％B，35-40min 80％-100％B，40-40.5min 100％-5％B，40.5-55min 5％B。
其中，所述质谱条件为：离子源为电喷雾离子源(+)；离子源参数为：电喷雾电压5000V，气帘气35psi，雾化气70psi，辅助加热气70psi，温度600℃，碰撞气6psi。
在洗脱开始的0-2min将六通阀切换至废液，并在洗脱至55min时切回六通阀，使流动相进入质谱。
(4)羧酸类代谢物的定性分析：取步骤(2)的待测液进行液相色谱-高分辨质谱分析，进一步获得羧酸类代谢物的精确分子量、二级质谱信息及相应的分子式；将所得分子式在HMDB(http://www.hmdb.ca/metabolites)代谢数据库中检索，寻找化合物的信息。通过高分辨质谱分析获得138个羧酸类化合物的精确分子量，其中通过代谢数据库搜索获得103个可能的化合物信息，结果如表2所示(表1和表2中的编号为对应关系)。
其中，所述高分辨质谱条件为：质谱仪：Bruker micrOTOF-QⅡ四极杆飞行时间质谱；离子源：电喷雾离子源(+)；扫描模式：Auto MS/MS；扫描范围：m/z 150-800；离子源参数：毛细管电压3500V；雾化气1.5bar；干燥气6L/min；干燥温度180℃。
表1.筛选得到的269个羧酸类代谢物
表2.筛选得到103个潜在羧酸类代谢物的化合物信息
注：由于表中的化合物信息来源于人类代谢组数据库HMDB，为保证数据的准确性，我们直接将检索到的化合物名称以英文状态呈现在表中，虽然未提供中译名，但由于表中提供了化合物的HMDB ID和/或CAS号，化合物是清楚而确定的。
实施例2
1、提取溶剂的筛选
该项下所使用的血浆如无特别说明，均与实施例1中所用血浆为相同来源。
根据实施例1的方法，分别以乙酸乙酯(即实施例1)、乙腈、甲苯、氯仿和正己烷作为提取剂分析血浆中潜在的羧酸类代谢物，由于使用乙腈提取时不易产生分层，我们在使用乙腈测试时，同时加入了过量的氯化钠来促使溶剂分层。
实验结果表明，乙酸乙酯、乙腈、甲苯、氯仿和正己烷均能从血浆中提取到羧酸类代谢物，但是能够提取得到的羧酸类代谢物的数量存在差异，经检测各种提取剂分别提取到的羧酸类代谢物的数量如表3所示：
表3.不同提取剂提取到的羧酸类代谢物数量
提取剂 羧酸类代谢物数量(个)
乙酸乙酯 269
乙腈 251
甲苯 231
氯仿 154
正己烷 146
如表3所示，当乙酸乙酯作为人体血浆中的羧酸类代谢物的提取溶剂时，能更好地获得血浆羧酸代谢组的全貌，相对更完整准确的完成血浆羧酸类代谢物的分析。
2、衍生化反应条件筛选
为了获得选择性强、效率高的衍生化条件，我们分别以影响衍生化效果的催化剂用量、激活剂用量、衍生化反应温度、衍生化试剂用量以及反应时间条件为变量，分析其对血浆中潜在的羧酸类代谢物分析结果的影响。
(1)催化剂浓度
与实施例1方法相同，取用实施例1中步骤(1)的样品溶液，以三乙胺的浓度为变量对羧酸类代谢物进行分析。
实验表明，当三乙胺的浓度在1～20μmol/mL的范围内时均能筛选得到血浆内的羧酸类代谢物，但是能够得到的羧酸类代谢物的数量存在差异，经检测三乙胺采用不同浓度时分别得到的羧酸类代谢物的数量如表4所示：
表4.不同三乙胺浓度下羧酸类代谢物的检测数量
三乙胺浓度(μmol/mL) 羧酸类代谢物数量(个)
1 202
2 269
5 259
10 231
20 198
如表4所示，当三乙胺的浓度为2～5μmol/mL尤其为2μmol/mL时能更好地获得血浆羧酸代谢组的全貌，相对更完整准确的完成血浆羧酸类代谢物的分析。
(2)衍生化试剂浓度
与实施例1方法相同，取用实施例1中步骤(1)的样品溶液，以衍生化试剂(N,N-二甲基乙二胺和d4-N,N-二甲基乙二胺)的浓度为变量对羧酸类代谢物进行分析。
实验表明，当衍生化试剂的浓度在10-80μmol/mL的范围内时均能筛选得到血浆内的羧酸类代谢物，但是能够得到的羧酸类代谢物的数量存在差异，经检测衍生化试剂使用不同浓度时分别得到的羧酸类代谢物的数量如表5所示：
表5.不同衍生化试剂浓度下羧酸类代谢物的检测数量
衍生化试剂浓度(μmol/mL) 羧酸类代谢物数量(个)
10 121
20 174
40 221
60 269
80 272
当衍生化试剂的浓度为60-80μmol/mL时羧酸类代谢物的数量达到平台，能更好地获得血浆中羧酸代谢组的全貌，相对更完整准确的完成血浆羧酸类代谢物的分析；由于衍生化试剂过量可能影响羧酸类代谢物的分析，因此综合考虑选择60μmol/mL作为血浆样品衍生化试剂的浓度。
(3)激活剂的浓度
与实施例1方法相同，取用实施例1中步骤(1)的样品溶液，以激活剂(2-氯-1-甲基碘化吡啶鎓)的浓度为变量对羧酸类代谢物进行分析。
实验表明，当激活剂的浓度在30-240μmol/mL的范围内时均能筛选得到血浆内的羧酸类代谢物，但是能够得到的羧酸类代谢物的数量存在差异，经检测激活剂使用不同浓度时分别得到的羧酸类代谢物的数量如表6所示：
表6.不同激活剂浓度下羧酸类代谢物的检测数量
激活剂浓度(μmol/mL) 羧酸类代谢物数量(个)
30 142
40 172
60 214
120 269
240 249
结果表明，当激活剂的浓度为120-240μmol/mL尤其为120μmol/mL时能更好地获得血浆中羧酸代谢组的全貌，相对更完整准确的完成血浆羧酸类代谢物的分析。
(4)衍生化反应温度
与实施例1方法相同，以衍生化反应温度(20、40、45、50和60℃)为变量进行衍生化反应，对羧酸类代谢物进行分析。
实验表明，当衍生化反应温度在20-60℃的范围内时均能筛选得到血浆内的羧酸类代谢物，但是能够得到的羧酸类代谢物的数量存在差异，经检测当衍生化反应温度不同时分别得到的羧酸类代谢物的数量如表7所示：
表7.不同衍生化反应温度下羧酸类代谢物的检测数量
衍生化试剂反应温度(℃) 羧酸类代谢物数量(个)
20 196
30 232
40 242
50 269
60 266
结果表明，当衍生化反应温度为50-60℃尤其为50℃时能更好地获得血浆羧酸代谢组的全貌，相对更完整准确的完成血浆羧酸类代谢物的分析。
(5)衍生化反应时间
与实施例1方法相同，以衍生化反应时间(0.5、1、1.5、2和3h)进行衍生化反应，对羧酸类代谢物进行分析。
实验表明，当衍生化反应时间在0.5-3小时的范围内时均能筛选得到血浆内的羧酸类代谢物，但是能够得到的羧酸类代谢物的数量存在差异，经检测当衍生化反应时间不同时分别得到的羧酸类代谢物的数量如表8所示：
表8.不同衍生化反应时间下羧酸类代谢物的检测数量
衍生化试剂反应时间(h) 羧酸类代谢物数量(个)
0.5 214
1 231
1.5 259
2 269
3 269
结果表明，当衍生化反应时间为2h时能更好地获得血浆羧酸代谢组的全貌，相对更完整准确的完成血浆羧酸类代谢物的分析。
实施例3
我们以七种不同类型的羧酸类代谢物(癸二酸、3-羟基月桂酸、苯丙酸、己酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸)为模型化合物加入到与实施例1相同来源的血浆中，并按照实施例1的方法进行了验证；结果除实施例1中筛选得到的269种羧酸类代谢物以外，此次加入的羧酸类代谢物也均作为潜在化合物被分析出来。
此外，我们利用上述已知的七种羧酸类代谢物(癸二酸、3-羟基月桂酸、苯丙酸、己酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸)验证了本发明的实验条件，具体过程如下所示：
(1)关于催化剂浓度
根据实施例1的方法，我们分别选取1μmol/mL、2μmol/mL、5μmol/mL、10μmol/mL、15μmol/mL和20μmol/mL作为该实验中的三乙胺的量，对羧酸类代谢物进行分析，检测结果以三乙胺浓度为横坐标，以N,N-二甲基乙二胺/d4-N,N-二甲基乙二胺衍生物峰面积为纵坐标绘制曲线，结果如图3所示。
结果分析：如图3所示，当三乙胺的浓度增加时，一元羧酸衍生物的峰面积逐渐下降，二元羧酸衍生物的峰面积逐渐增加。三乙胺浓度为1.5～2μmol/mL时已足以维持反应所需的弱碱环境。综合考虑一元酸和多元酸，选择加入的三乙胺浓度为2μmol/mL时最优，结果与实施例2一致。
(2)关于激活剂与衍生化试剂用量比
根据实施例1的方法，我们分别选取240μmol/mL、120μmol/mL、60μmol/mL、40μmol/mL和30μmol/mL作为该实验中激活剂2-氯-1-甲基碘化吡啶鎓的浓度，以保证激活剂与衍生化试剂的摩尔比分别符合2:1、1:1、1:2、1:3和1:4，对羧酸类代谢物进行分析。检测结果以激活剂2-氯-1-甲基碘化吡啶鎓与衍生化试剂N,N-二甲基乙二胺的摩尔比为横坐标，以N,N-二甲基乙二胺/d4-N,N-二甲基乙二胺衍生物峰面积为纵坐标绘制曲线，结果如图4所示。
结果分析：图4表明，当2-氯-1-甲基碘化吡啶鎓与衍生化试剂N,N-二甲基乙二胺的摩尔比为2:1和1:1时，7种羧酸衍生物的峰面积最大，但2:1时，2-氯-1-甲基碘化吡啶鎓会与N,N-二甲基乙二胺发生衍生化副反应，因此1:1为最优的2-氯-1-甲基碘化吡啶鎓与N,N-二甲基乙二胺的摩尔比，结果与实施例2一致。
(3)关于衍生化试剂浓度
根据实施例1的方法，我们分别选取10μmol/mL、20μmol/mL、30μmol/mL、40μmol/mL、50μmol/mL、60μmol/mL、70μmol/mL、80μmol/mL作为该实验中的衍生化试剂N,N-二甲基乙二胺的浓度，对羧酸类代谢物进行分析，检测结果以N,N-二甲基乙二胺浓度为横坐标，以N,N-二甲基乙二胺峰面积为纵坐标绘制曲线，结果如图5所示。
结果分析：图5表明，当衍生化试剂N,N-二甲基乙二胺的浓度在40-80μmol/mL时，7种羧酸衍生物的峰面积最大，但60μmol/mL时最优，结果与实施例2一致。
(4)关于衍生化反应温度
根据实施例1的方法，我们分别选取20、30、40、50和60℃进行衍生化反应，检测结果以衍生化反应温度为横坐标，以N,N-二甲基乙二胺/d4-N,N-二甲基乙二胺衍生物峰面积为纵坐标绘制曲线，结果如图6所示。
结果分析：反应温度为50℃时，羧酸衍生物的峰面积最大，衍生化效果最好，结果与实施例2一致。
(5)关于衍生化反应时间
根据实施例1的方法，我们分别选取0.5、1、1.5、2和3h进行衍生化反应，检测结果以衍生化反应时间为横坐标，以N,N-二甲基乙二胺/d4-N,N-二甲基乙二胺衍生物峰面积为纵坐标绘制曲线，结果如图7所示。
结果分析：反应时间为2h，7种羧酸衍生物的峰面积达到平台，即已达到反应平台期。因此2h为最优的反应时间，结果与实施例2一致。
在经验证的最优的衍生化条件下，我们针对该方法的衍生化效率以及衍生物稳定性进行了评价。
衍生化效率通过如下公式计算：衍生化效率＝1-衍生峰面积/未衍生峰面积(用衍生化试剂衍生等量的标准品)。
结果表明，一元羧酸的衍生化效率均高于96.3％(不包括己酸，未衍生的己酸在负离子模式下检测时离子化效率低，达到检出限但并未达到定量限)；癸二酸的标记效率相比一元酸较低为83.4％，但连续三天衍生化的结果比较稳定(相对标准偏差1.13％)，因此我们可以用该条件对多元酸进行衍生化，而且具有很好的二级质谱碎裂行为(如图8所示)。
衍生化后羧酸类化合物的稳定性会影响方法的准确度和重现性。为考察衍生化产物的稳定性，我们还监测了7种N,N-二甲基乙二胺羧酸衍生物在室温下48h内不同时间点的含量。N,N-二甲基乙二胺标记的羧酸类代谢物在室温条件下48h内稳定性良好(相对标准偏差＜13.0％)。其中，将棕榈酸的峰面积除以10，癸二酸的峰面积乘以100，结果如图9。
实施例4
为了更直观的了解及验证本发明的方法，我们继续采用七种不同类型的羧酸类代谢物(癸二酸、3-羟基月桂酸、苯丙酸、己酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸)为模型化合物，对本发明的方法进行了考察。其中，本发明方法的检测限和定量限分别为目标分析物信噪比为3和10时所对应的浓度，以N,N-二甲基乙二胺衍生物的浓度为横坐标，N,N-二甲基乙二胺衍生物与d4-N,N-二甲基乙二胺衍生物的峰面积比为纵坐标绘制标准曲线，结果如表9所示。
此外，我们还同时比较了相同浓度下模型化合物与现有技术相比灵敏度提高的倍数，结果如表9所示，除了二元羧酸癸二酸的灵敏度提高倍数为5倍外，其余六种分析物的灵敏度提高了63-322倍。
按实施例1的方法进行衍生化且检测条件同实施例1。
不经衍生化检测条件：液相色谱条件为：ACQUITY UPLC BEH HILIC色谱柱(2.1×100mm,1.7μm,Waters)；柱温30℃；流动相A为含10mM乙酸铵的水，流动相B为含10mM乙酸铵的乙腈；流速为300μL/min，进样体积为5μL。
流动相梯度为：0-4min 98％B，4-20min 98％-45％B，20-25min 45％B，25-30min45％-98％B，30-45min 98％B。
其中，所述质谱条件为：离子源为电喷雾离子源(-)；扫描模式：多反应监测模式，离子源参数为：电喷雾电压5000V，气帘气35psi，雾化气70psi，辅助加热气70psi，温度600℃，碰撞气6psi。
表9.本发明方法中代表性羧酸类代谢物的线性范围、工作曲线、检测限和定量限
为了考察方法的重现性和准确性，我们配制了基于低、中、高3种不同浓度N,N-二甲基乙二胺的羧酸类代谢物的标准溶液，在1天内平行测定3次来评价日内精密度，连续3天测定新制备的样品来评价日间精密度，精密度用相对标准偏差(RSD)表示。通过标准曲线方程计算不同样品中测到的浓度，并与实际浓度相比得到回收率。结果如表10所示，目标分析物在不同浓度下的日内精密度和日间精密度分别小于12.8％和15.1％，不同浓度下目标分析物的回收率介于92.9％-116.7％之间，表明该方法具有较好的重复性和准确度，可以满足血浆中羧酸类代谢物的定量分析。
表10检测7种羧酸类代谢物方法的日内日间精密度和准确度
上述实施例仅是本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
应当理解的是，本文所述发明不限于特定的方法学、实验方案或试剂，因为这些是可以变化的。本文所提供的论述和实例仅是为了描述特定的实施方案呈现而非意在限制本发明的范围，本发明的范围仅受到权利要求的限定。

Claims (8)

1.一种基于稳定同位素标记质谱联用技术检测血浆中羧酸类代谢物的方法，所述方法包含以下步骤：
(1)血浆样品溶液的制备：血浆中加入提取溶液进行提取，涡旋混匀后离心取上层有机相，于氮气下吹干，复溶于乙腈中作为样品溶液备用；
(2)样品溶液的同位素标记：取步骤(1)中的样品溶液与催化剂和激活剂充分混匀后，加入“轻”同位素衍生化试剂反应，反应体系置于-20℃条件下冷冻10min即终止反应，用缓慢氮气流吹干，所得固体样品复溶于乙腈/水(50/50，v/v)中，即得到“轻”同位素标记的衍生化产物；将“轻”同位素衍生化试剂换为“重”同位素衍生化试剂重复上述操作，得到“重”同位素标记的衍生化产物；将“轻”“重”衍生化产物等比例混合均匀，即得待测液；
(3)羧酸类代谢物的非靶向代谢组学分析：取步骤(2)中的待测液进行液相色谱-双中性丢失扫描-质谱分析，根据“轻”“重”衍生化产物的质荷比差异，扫描特定的中性丢失片段，结合保留时间与质谱信号强度进行筛选，找出潜在的羧酸类代谢物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述提取溶液包含提取剂和/或0.5％的甲酸；优选地，所述提取剂选自乙酸乙酯、乙腈、甲苯、氯仿和正己烷中的一种或多种，优选为乙酸乙酯；
优选地，所述提取剂与0.5％的甲酸的体积比为30：1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述催化剂为有机碱，优选为三乙胺；
优选地，所述催化剂的浓度为1～20μmol/mL，优选为2～10μmol/mL，更优选为2～5μmol/mL，最优选为2μmol/mL；
优选地，步骤(2)中，所述激活剂为2-氯-1-甲基碘化吡啶鎓；
优选地，所述激活剂的浓度为30～240μmol/mL，优选为120～240μmol/mL，更优选为120μmol/mL；
优选地，步骤(2)中，所述的“轻”同位素衍生化试剂为N,N-二甲基乙二胺，所述的“重”同位素衍生化试剂为d4-N,N-二甲基乙二胺；
优选地，所述“轻”或“重”同位素衍生化试剂的浓度为10～80μmol/mL，优选为40～80μmol/mL，最优选为60μmol/mL；
优选地，步骤(2)中，所述激活剂与“轻”或“重”同位素衍生化试剂的摩尔比为1：0.5-4，优选为1：0.5-1，更优选为1：1；
优选地，步骤(2)中，所述催化剂、激活剂与“轻”或“重”衍生化试剂的体积比为1-2.5：1：0.5-1；优选为1：1：2；
优选地，步骤(2)中，所取用的样品溶液与“轻”或“重”衍生化试剂的体积比为10-13：1，优选为10：1；
优选地，步骤(2)中，所述衍生化反应的条件为在20～60℃优选50～60℃下振荡0.5～3小时优选1.5～3小时，优选为50℃下振荡2小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述液相色谱条件为：ACQUITYUPLC BEH C18色谱柱(2.1×100mm,1.7μm,Waters)；柱温30℃；流动相A为含0.1％(v/v)甲酸的水，流动相B为含0.1％(v/v)甲酸的乙腈，梯度洗脱，流速为200μL/min，进样体积为5μL；
优选地，所述梯度洗脱程序为：0-10min 5％-50％B，10-25min 50％-62％B，25-35min62％-80％B，35-40min 80％-100％B，40-40.5min 100％-5％B，40.5-55min 5％B；
优选地，步骤(3)中，所述双中性丢失扫描-质谱条件为：双中性丢失扫描，离子源为电喷雾离子源(+)；离子源参数为：电喷雾电压5000V，气帘气35psi，雾化气70psi，辅助加热气70psi，温度600℃，碰撞气6psi；
优选地，步骤(3)中，在洗脱开始的0-2min将六通阀切换至废液，并在洗脱至55min时切回六通阀，使流动相进入质谱；
优选地，步骤(3)中，所述“轻”“重”衍生化产物的质荷比差异为4Da；
优选地，步骤(3)中，所述特定的中性丢失片段分别为45Da和49Da的片段；
优选地，步骤(3)中，所述筛选依据为质荷比相差4Da的“轻”“重”衍生化产物的保留时间相差0.05min以内、峰强度比接近于1，优选为两者峰强度偏差在5％以内。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还可以进一步包括步骤(4)羧酸类代谢物的定性分析：取步骤(2)中的待测液进行液相色谱-高分辨质谱分析，获得潜在羧酸类代谢物的精确分子量、二级质谱信息及相应的分子式，在代谢数据库中检索，寻找化合物的信息。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述高分辨质谱条件为：质谱仪：BrukermicrOTOF-QⅡ四极杆飞行时间质谱；离子源：电喷雾离子源(+)；扫描模式：Auto MS/MS；扫描范围：m/z 150-800；离子源参数：毛细管电压3500V；雾化气1.5bar；干燥气6L/min；干燥温度180℃。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的代谢数据库为人类代谢组数据库HMDB。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述羧酸类代谢物选自表1中所示羧酸类代谢物中的任一种或多种，优选为表2中所示羧酸类代谢物中的任一种或多种，优选为选自癸二酸、3-羟基月桂酸、苯丙酸、己酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸中的一种或多种。
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