CN108387661A - 一种烟草制品、主流烟气或加热不燃烧卷烟中羧酸类香味成分的检测方法 - Google Patents

一种烟草制品、主流烟气或加热不燃烧卷烟中羧酸类香味成分的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种烟草制品、主流烟气或加热不燃烧卷烟中羧酸类香味成分的检测方法，本方法通过对差异标记的烟草制品、主流烟气或加热不燃烧卷烟样品的信号识别，改善了质谱检测羧酸类香味成分时离子化效率低和灵敏度不足的问题，实现了样品中羧酸类香味成分的非靶向分析。

Description

一种烟草制品、主流烟气或加热不燃烧卷烟中羧酸类香味成 分的检测方法
技术领域
本发明涉及烟草化学检验技术领域，具体涉及一种基于稳定同位素标记质谱联用技术的烟草制品、主流烟气或加热不燃烧卷烟中羧酸类香味成分的检测方法。
背景技术
烟草的化学组成与其品质密切相关，其进而影响着烟气的香味和吃味，因此香味成分的研究一直为人们所重视。随着吸烟与健康问题的尖锐化和降低卷烟焦油技术的发展，对卷烟加香加料的要求越来越高，也对烟气香味物质研究工作提出了更高要求。羧酸类香味成分是烟气中的重要香味成分，目前烟气中已经鉴定出的羧酸类香味成分的数量超过275种，烟草中已经鉴定出的有机酸的数量超过450种。例如，烟气中2-甲基丙酸和戊酸在提高香气质、增加香气量和提高烟气劲头方面有显著作用，在提高透发性、增加烟气浓度和改善余味方面有作用，同时在掩盖杂气、提升吃味和改善细腻柔和等方面均具有较明显的效果；乙酸则会对烟气产生辛辣刺激的影响；丙烯酸和丁烯酸具有焦糖气息，能够增加烟气的丰满度；苯甲酸和苯乙酸具有柔和气息，弱甜、具有蜂蜜、花香，能够增加烟气的丰满度；芳香酸类一般可以产生优美的香味，与烤烟型香味比较协调。烟草中许多有机酸是羧酸类香味成分，直接影响着烟草及烟草制品的质量，例如甲酸、乙酸、丙酸、苯甲酸、α-甲基丁酸、β-甲基戊酸、柠檬酸、苹果酸、草酸。其中，苹果酸在香料烟和烤烟中含量较多，能增加烟气酸性，改进烟气特征，促进烟气平和；柠檬酸则能导致烤烟吃味变差；异戊酸和β-甲基戊酸具有显著的香料烟香味；甲酸、乙酸等挥发性羧酸的含量过高，则有可能使烟气对喉部产生辛辣灼热的感觉。
有研究表明，羧酸类香味成分的组成和相对含量综合影响着烟叶、烟气的品质香味情况。因此烟叶、烟气中羧酸类香味成分的剖析研究(定性和相对定量分析)具有重要的意义。然而，目前专门针对烟叶或烟气中羧酸类香味成分的剖析方法研究还较少。
目前烟叶或烟气中羧酸类香味成分的筛查方法大多数是将烟叶或烟气提取液浓缩后进行气相色谱-质谱分析。与气相色谱-质谱相比，液相色谱-电喷雾离子化-串联质谱在实际检测中有更好的重现性、更低的检测限和更快的样品分析速度。在液质联用检测中，单重四极杆质谱因为选择能力有限，仍然无法排除复杂的烟叶或烟气样品中杂质的干扰。串联质谱由于可以做二级质谱扫描，其抗干扰能力明显增强，其灵敏度也已基本满足痕量化合物检测的要求。最近几年逐渐开始普及的高分辨质谱仪具备高速的全扫描特性和获得高精度分子质量的能力，具有抗干扰能力强和单位时间内获取信息量大的优点，因此具有更强的定性能力和更自由的数据处理方式，目前其在烟叶或烟气中羧酸类香味成分分析中的应用还较少。
由于烟叶或烟气中羧酸类香味成分的提取过程中会同时将其他香味成分(如酯类和醇类化合物)一起提取出来，再加上一维气相色谱柱的分离能力和峰容量有限，因此该方法能够分析的羧酸类香味成分的数量有限，而且针对性也不强。另外，目前对烟气中羧酸类香味成分的分离筛查方法大多数有靶向的，即在有标准品的前提下对羧酸类香味成分进行准确定性分析，即无法实现羧酸类香味成分的全分析。除此以外，在负离子模式下羧酸类香味成分的离子化效率也不高，进而影响了其灵敏度。因此，开发一种灵敏度高、能对烟草制品、主流烟气以及加热不燃烧卷烟中羧酸类香味成分进行全分析的方法显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于稳定同位素标记质谱联用技术的烟草制品、主流烟气或加热不燃烧卷烟中羧酸类香味成分(含羧基的香味成分)的检测方法，本方法通过对差异标记的样品的信号进行识别，改善了质谱检测羧酸类香味成分时离子化效率低和灵敏度不足的问题，实现了样品中羧酸类香味成分的全分析，还可用于稳定的相对定量。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
首先，本发明提供一种烟草制品、主流烟气或加热不燃烧卷烟中羧酸类香味成分的检测方法，所述方法包含以下步骤：
(1)样品溶液的制备：在烟草制品、捕集有卷烟主流烟气总粒相物的滤片或捕集有加热不燃烧卷烟总粒相物的滤片中加入提取溶剂进行提取，得到的提取液以有机相滤膜过滤或离心后，作为样品溶液备用；
举例而言，烤烟烟叶、白肋烟烟叶等属于烟草制品。
(2)样品溶液的同位素标记：取步骤(1)中的样品溶液与催化剂和激活剂充分混匀后，加入“轻”同位素衍生化试剂进行反应，反应完成后，反应体系置于-20℃条件下冷冻10min即终止反应，用缓慢氮气流吹干，所得固体样品复溶于乙腈/水(50/50，v/v)中，即得到“轻”同位素标记的衍生化产物；将“轻”同位素衍生化试剂换为“重”同位素衍生化试剂重复上述操作，得到“重”同位素标记的衍生化产物；将“轻”“重”衍生化产物等比例混合均匀，即得待测液；
(3)待测液的测定：取步骤(2)中的待测液进行液相色谱-双中性丢失扫描-质谱检测，即得；
其中，在步骤(3)中，液相色谱-双中性丢失扫描-质谱检测待测液时，基于“轻”“重”衍生化产物的质荷比差异，扫描选定的中性丢失片段，结合保留时间与质谱信号强度筛选属于羧酸类香味成分的谱峰。
优选地，步骤(1)中，所述卷烟主流烟气总粒相物按照GB/T 19609-2004、ISO4387：2000规定的捕集方法获得；
优选地，步骤(1)中，所述的加热不燃烧卷烟气溶胶捕集物的捕集方法包括：将加热不燃烧烟弹的一端插入烟草加热棒中，并将烟弹滤嘴端插入含有剑桥滤片的捕集器上；打开烟草加热棒开关对烟弹进行加热，在加热过程中进行抽吸，同时捕集其总粒相物；
优选地，步骤(1)中，所述提取溶剂选自乙酸乙酯、乙腈、甲苯和环己烷中的一种或多种，优选为乙腈；优选地，步骤(1)中，所述提取溶剂的体积为10-50mL，优选为15mL；
优选地，步骤(1)中，所述提取模式为超声或振荡，提取时间为10-60min，优选超声提取30min；
优选地，步骤(1)中，所述有机相滤膜为尼龙滤膜，所述尼龙滤膜的规格为13mm×0.22μm(直径×孔径)；
优选地，步骤(2)中，所述催化剂为有机碱，优选为三乙胺；
优选地，所述催化剂的浓度为1～20μmol/mL，优选为2～10μmol/mL，更优选为2～5μmol/mL，最优选为2μmol/mL；
优选地，步骤(2)中，所述激活剂为2-氯-1-甲基碘化吡啶鎓；
优选地，步骤(2)中，所述激活剂的浓度为30～240μmol/mL，优选为120～240μmol/mL，更优选为120μmol/mL；
优选地，步骤(2)中，所述的“轻”同位素衍生化试剂为N,N-二甲基乙二胺；
优选地，步骤(2)中，所述的“重”同位素衍生化试剂为d4-N,N-二甲基乙二胺；
优选地，所述“轻”或“重”同位素衍生化试剂的浓度为10～80μmol/mL，优选为40～80μmol/mL，最优选为60μmol/mL；所述“轻”或“重”同位素衍生化试剂的浓度可以相同也可以不同；
优选地，步骤(2)中，所述激活剂与“轻”或“重”同位素衍生化试剂的摩尔比为1：0.5-4，优选为1：0.5-1，更优选为1：1；
优选地，步骤(2)中，所述催化剂、激活剂与“轻”或“重”衍生化试剂的体积比为1-2.5：1：0.5-1；优选为1：1：2；
优选地，步骤(2)中，所取用的样品溶液与“轻”或“重”衍生化试剂的体积比为10-13：1，优选为10：1；
优选地，步骤(2)中，加入“轻”同位素衍生化试剂进行反应或加入“重”同位素衍生化试剂进行反应的衍生化反应的条件为在20～60℃，优选在50～60℃下振荡0.5～3小时优选1.5～3小时，优选为在50℃下振荡2小时；
优选地，步骤(3)中，所述液相色谱条件为：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×100mm,1.7μm,Waters)；柱温30℃；流动相A为含0.1％(v/v)甲酸的水，流动相B为含0.1％(v/v)甲酸的乙腈，梯度洗脱，流速为200μL/min，进样体积为5μL；
优选地，所述梯度洗脱的程序为：0-10min 5％-50％B，10-25min 50％-62％B，25-35min 62％-80％B，35-40min 80％-100％B，40-40.5min 100％-5％B，40.5-55min 5％B；
优选地，步骤(3)中，所述双中性丢失扫描-质谱条件为：双中性丢失扫描，离子源为电喷雾离子源(+)；离子源参数为：电喷雾电压5000V，气帘气35psi，雾化气70psi，辅助加热气70psi，温度600℃，碰撞气6psi；
优选地，步骤(3)中，在洗脱开始的0-2min将六通阀切换至废液，并在洗脱至55min时切回六通阀，使流动相进入质谱；
优选地，步骤(3)中，所述“轻”“重”衍生化产物的质荷比差异为4Da；
优选地，步骤(3)中，所述选定的中性丢失片段为45Da和49Da的中性丢失片段；
优选地，步骤(3)中，所述筛选依据为质荷比相差4Da的“轻”“重”衍生化产物的保留时间相差0.05min以内、峰强度比接近于1，优选为两者峰强度偏差在5％以内。
本发明采用一对结构相同但存在同位素差异的衍生化试剂在本发明的条件下与烟草制品、主流烟气或加热不燃烧卷烟中目标分析物进行衍生，之后将衍生化产物等比例混合后进行液相色谱‐双中性丢失扫描‐质谱分析，羧酸化合物的衍生化产物具有相同的色谱保留行为和质谱离子化能力，因此具有相同的保留时间和质谱响应强度，且具有固定的质荷比差(4Da)。因此，本发明的方法不仅能够校正基质效应，提高分析的准确度和精确度，改善质谱检测羧酸类香味成分时离子化效率低和灵敏度不足的问题，而且实现了对未知羧酸类香味成分的全分析，同时还克服了商品化同位素内标价格昂贵、种类有限、获取困难的问题。
附图说明
图1为N,N-二甲基乙二胺和d4-N,N-二甲基乙二胺的结构式；
图2为实施例1中分析某烤烟烟叶得到的中性丢失为45和49Da的总离子流图；
图3为实施例2中分析某白肋烟烟叶得到的中性丢失为45和49Da的总离子流图；
图4为实施例3中分析某烤烟型卷烟主流烟气得到的中性丢失为45和49Da的总离子流图；
图5为实施例4中分析某混合烟型卷烟主流烟气得到的中性丢失为45和49Da的总离子流图；
图6为实施例5中分析某加热不燃烧卷烟A得到的中性丢失为45和49Da的总离子流图；
图7为实施例6中分析某加热不燃烧卷烟B得到的中性丢失为45和49Da的总离子流图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步阐述。应当理解，本发明给出的实施例仅用于说明本发明，并不用于限制本发明的范围。
下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实验器材与试剂
2-氯-1-甲基碘化吡啶鎓：东京化成工业(TCI上海)株式会社(上海，中国)；
N,N-二甲基乙二胺：东京化成工业(TCI上海)株式会社(上海，中国)；
d4-N,N-二甲基乙二胺：中国科学院上海有机化学研究所(上海，中国)；
有机相滤膜：尼龙滤膜，13mm×0.22μm，上海安普科学仪器公司；
实验所用仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪(包括G1367D自动进样器、G1312B二元溶剂泵、G1316B柱温箱)；AB SCIEX 5500三重四级杆串联质谱仪；以及Analyst1.5.1Software数据采集与处理软件。
实施例1
基于稳定同位素标记质谱联用技术对某烤烟烟叶中羧酸类香味成分的检测，包括如下步骤：
(1)烟叶样品溶液的制备：在烤烟烟叶中加入乙腈(每克样品加入15mL，)进行超声提取30min，提取液以有机相滤膜过滤后，作为样品溶液备用。
(2)样品溶液的同位素标记：取步骤(1)中的样品溶液200μL，加入10μL 2μmol/mL三乙胺和10μL 120μmol/mL 2-氯-1-甲基碘化吡啶鎓充分混匀后，加入20μL 60μmol/mL N,N-二甲基乙二胺，在50℃下振荡2小时。反应结束后，将反应体系置于-20℃条件下冷冻10min即终止反应，用缓慢氮气流吹干，所得固体样品复溶于乙腈/水(50/50，v/v)中，即得到“轻”同位素标记的衍生化产物；将N,N-二甲基乙二胺换为d4-N,N-二甲基乙二胺重复上述操作，得到“重”同位素标记的衍生化产物；将“轻”“重”衍生化产物等比例混合均匀，即得待测液。
(3)待测液的测定：取步骤(2)中的待测液进行液相色谱-双中性丢失扫描-质谱分析。
其中，所述的液相色谱条件为：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×100mm,1.7μm,Waters)；柱温30℃；流动相A为含0.1％(v/v)甲酸的水，流动相B为含0.1％(v/v)甲酸的乙腈；流速为200μL/min，进样体积为5μL。
流动相梯度为：0-10min 5％-50％B，10-25min 50％-62％B，25-35min 62％-80％B，35-40min 80％-100％B，40-40.5min 100％-5％B，40.5-55min 5％B。
其中，所述质谱条件为：离子源为电喷雾离子源(+)；离子源参数为：电喷雾电压5000V，气帘气35psi，雾化气70psi，辅助加热气70psi，温度600℃，碰撞气6psi。
在洗脱开始的0-2min将六通阀切换至废液，并在洗脱至55min时切回六通阀，使流动相进入质谱。
在该步骤中，N,N-二甲基乙二胺衍生化产物丢失质量为45的中性碎片N-二甲胺并产生[M+H-45]+，d4-N,N-二甲基乙二胺衍生化产物丢失质量为49的中性碎片生成[M+H-49]+，扫描45Da和49Da的中性丢失片段，得到中性丢失为45Da和49Da的总离子流图，如图2所示。监测4Da质荷比差异，结合保留时间(保留时间相差0.05min以内)与质谱信号强度(峰强度偏差在5％以内)筛选羧酸类香味成分，对烟草制品中羧酸类香味成分进行全定性分析，结果共发现93种羧酸类香味成分，结果如表1所示。
表1某烤烟烟叶中潜在的羧酸类香味成分
实施例2
采用实施例1所述方法对某白肋烟烟叶进行分析，得到如图3所示的中性丢失为45和49Da的总离子流图。通过筛选一共得到如表2所示的120种可能的羧酸类香味成分。
表2某白肋烟烟叶中潜在的羧酸类香味成分
实施例3
基于稳定同位素标记质谱联用技术对某烤烟型卷烟主流烟气中羧酸类香味成分的分析，包括如下步骤：
(1)卷烟主流烟气样品溶液的制备：卷烟按照GB/T 19609-2004，ISO 4387:2002规定的条件用直线型吸烟机每次抽吸4支后，将捕集有卷烟主流烟气总粒相物的滤片置于容器中，加入乙腈(每克样品加入15mL)进行超声提取30min，提取液以有机相滤膜过滤后，作为样品溶液备用。
(2)样品溶液的同位素标记：取步骤(1)中的样品溶液200μL，加入10μL 2μmol/mL三乙胺和10μL 120μmol/mL 2-氯-1-甲基碘化吡啶鎓充分混匀后，加入20μL 60μmol/mL N,N-二甲基乙二胺，在50℃下振荡2小时。反应结束后，将反应体系置于-20℃条件下冷冻10min即终止反应，用缓慢氮气流吹干，所得固体样品复溶于乙腈/水(50/50，v/v)中，即得到“轻”同位素标记的衍生化产物；将N,N-二甲基乙二胺换为d4-N,N-二甲基乙二胺重复上述操作，得到“重”同位素标记的衍生化产物；将“轻”“重”衍生化产物等比例混合均匀，即得待测液。
(3)待测液的测定：取步骤(2)中的待测液进行液相色谱-双中性丢失扫描-质谱分析。
其中，所述的液相色谱条件为：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×100mm,1.7μm,Waters)；柱温30℃；流动相A为含0.1％(v/v)甲酸的水，流动相B为含0.1％(v/v)甲酸的乙腈；流速为200μL/min，进样体积为5μL。
流动相梯度为：0-10min 5％-50％B，10-25min 50％-62％B，25-35min 62％-80％B，35-40min 80％-100％B，40-40.5min 100％-5％B，40.5-55min 5％B。
其中，所述质谱条件为：离子源为电喷雾离子源(+)；离子源参数为：电喷雾电压5000V，气帘气35psi，雾化气70psi，辅助加热气70psi，温度600℃，碰撞气6psi。
在洗脱开始的0-2min将六通阀切换至废液，并在洗脱至55min时切回六通阀，使流动相进入质谱。
在该步骤中，N,N-二甲基乙二胺衍生化产物丢失质量为45的中性碎片N-二甲胺并产生[M+H-45]+，d4-N,N-二甲基乙二胺衍生化产物丢失质量为49的中性碎片生成[M+H-49]+，扫描45Da和49Da的中性丢失片段，得到中性丢失为45Da和49Da的总离子流图，如图4所示，监测4Da质荷比差异，结合保留时间(保留时间相差0.05min以内)与质谱信号强度(峰强度偏差在5％以内)筛选羧酸类香味成分，对烟气中羧酸类香味成分进行全定性分析，结果共发现31种羧酸类香味成分，结果如表3所示。
表3某烤烟型卷烟主流烟气中潜在的羧酸类香味成分
实施例4
采用实施例3所述方法对某混合烟型卷烟主流烟气进行分析，得到如图5所示的中性丢失为45和49Da的总离子流图。通过筛选一共得到如表4所示的74种可能的羧酸类香味成分。
表4.某混合型卷烟主流烟气中潜在的羧酸类香味成分
实施例5
基于稳定同位素标记质谱联用技术对某加热不燃烧卷烟A中羧酸类香味成分的分析，包括如下步骤：
(1)加热不燃烧卷烟A样品溶液的制备：将加热不燃烧烟弹的一端插入烟草加热棒中，并将烟弹滤嘴端插入含有剑桥滤片的捕集器上。打开烟草加热棒开关对烟弹进行加热，在加热过程中进行抽吸，同时捕集其总粒相物，将捕集有加热不燃烧卷烟总粒相物的滤片置于容器中，加入乙腈(每克样品加入15mL)进行超声提取30min，提取液以有机相滤膜过滤后，作为样品溶液备用。
(2)样品溶液的同位素标记：取步骤(1)中的样品溶液200μL，加入10μL 2μmol/mL三乙胺和10μL 120μmol/mL 2-氯-1-甲基碘化吡啶鎓充分混匀后，加入20μL 60μmol/mL N,N-二甲基乙二胺，在50℃下振荡2小时。反应结束后，将反应体系置于-20℃条件下冷冻10min即终止反应，用缓慢氮气流吹干，所得固体样品复溶于乙腈/水(50/50，v/v)中，即得到“轻”同位素标记的衍生化产物；将N,N-二甲基乙二胺换为d4-N,N-二甲基乙二胺重复上述操作，得到“重”同位素标记的衍生化产物；将“轻”“重”衍生化产物等比例混合均匀，即得待测液。
(3)待测液的测定：取步骤(2)中的待测液进行液相色谱-双中性丢失扫描-质谱分析。
其中，所述的液相色谱条件为：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×100mm,1.7μm,Waters)；柱温30℃；流动相A为含0.1％(v/v)甲酸的水，流动相B为含0.1％(v/v)甲酸的乙腈；流速为200μL/min，进样体积为5μL。
流动相梯度为：0-10min 5％-50％B，10-25min 50％-62％B，25-35min 62％-80％B，35-40min 80％-100％B，40-40.5min 100％-5％B，40.5-55min 5％B。
其中，所述质谱条件为：离子源为电喷雾离子源(+)；离子源参数为：电喷雾电压5000V，气帘气35psi，雾化气70psi，辅助加热气70psi，温度600℃，碰撞气6psi。
在洗脱开始的0-2min将六通阀切换至废液，并在洗脱至55min时切回六通阀，使流动相进入质谱。
在该步骤中，N,N-二甲基乙二胺衍生化产物丢失质量为45的中性碎片N-二甲胺并产生[M+H-45]+，d4-N,N-二甲基乙二胺衍生化产物丢失质量为49的中性碎片生成[M+H-49]+，扫描45Da和49Da的中性丢失片段，得到中性丢失为45Da和49Da的总离子流图，如图6所示，监测4Da质荷比差异，结合保留时间(保留时间相差0.05min以内)与质谱信号强度(峰强度偏差在5％以内)筛选羧酸类香味成分，对烟气中羧酸类香味成分进行全定性分析，结果共发现105种羧酸类香味成分，结果如表5所示。
表5.加热不燃烧卷烟A中潜在的羧酸类香味成分
实施例6
采用实施例5所述方法对某加热不燃烧卷烟B进行分析，得到如图7所示的中性丢失为45和49Da的总离子流图。通过筛选一共得到如表6所示的117种可能的羧酸类香味成分。
表6.加热不燃烧卷烟B中潜在的羧酸类香味成分
实施例7
为了说明本方法对羧酸类香味成分检测时灵敏度提高的倍数，我们以七种不同类型的羧酸类香味成分(癸二酸、3-羟基月桂酸、苯丙酸、己酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸)为模型化合物，对整个方法学过程进行了考察。本发明方法的检测限和定量限为目标分析物信噪比为3和10时所对应的浓度，以N,N-二甲基乙二胺衍生物的浓度为横坐标，N,N-二甲基乙二胺衍生物与d4-N,N-二甲基乙二胺衍生物的峰面积比为纵坐标绘制标准曲线，结果如表7所示。另外，我们还比较了相同浓度下模型化合物衍生前后灵敏度提高的倍数，结果如表7所示，除了二元羧酸癸二酸的灵敏度提高倍数为5倍外，其余几种化合物灵敏度提高了63-322倍。
表7.本发明方法中代表性羧酸类香味成分的线性范围、工作曲线、检测限和定量限
为了考察方法的重现性和准确性，我们配制了基于低、中、高3种不同浓度N,N-二甲基乙二胺标记的样品，在1天内平行测定3次来评价日内精密度，连续3天测定新制备的样品来评价日间精密度，精密度用相对标准偏差(RSD)表示。通过标准曲线方程计算不同样品中测到的浓度，并与实际浓度相比得到回收率。结果如表8所示，目标分析物在不同浓度下的日内及日间精密度分别小于12.8％和15.1％，说明方法具有较好的重现性。不同浓度下目标分析物的回收率介于97.4-116.7％之间，说明方法的准确性良好，可以满足烟草制品、主流烟气或加热不燃烧卷烟中羧酸类香味成分的定量分析。
表8.本方法的精密度和准确度
实施例8
以烤烟烟叶(取自实施例1中所用烟叶，以下简称烟叶)为例，根据实施例1的方法，我们分别对提取溶剂、影响衍生化效果的衍生化反应条件进行了筛选。
1、提取溶剂的筛选
根据实施例1的方法，分别以乙腈(即实施例1)、乙酸乙酯、甲苯和环己烷作为提取溶剂分析烟叶中潜在的羧酸类香味成分。
实验结果表明，乙腈、乙酸乙酯、甲苯和环己烷均能从烟叶中提取到羧酸类香味成分，但是能够提取得到的羧酸类香味成分的数量存在差异，经检测各种提取剂分别提取到的羧酸类香味成分的数量如表9所示：
表9.不同提取溶剂的提取效果
如表9所示，当乙腈作为烟叶中的羧酸类香味成分的提取溶剂时，能更好地获得烟叶中羧酸类香味成分的全貌，相对更完整准确的完成烟叶中羧酸类香味成分的分析。
2、衍生化反应条件筛选
为了获得选择性强、效率高的衍生化条件，我们分别以影响衍生化效果的催化剂用量、激活剂用量、衍生化反应温度、衍生化试剂用量以及反应时间条件为变量，分析其对烟叶中潜在的羧酸类香味成分分析结果的影响。
(1)催化剂浓度
与实施例1方法相同，取用实施例1中步骤(1)的样品溶液，以三乙胺的浓度为变量对羧酸类香味成分进行分析。
实验表明，当三乙胺的浓度在1～20μmol/mL的范围内时均能筛选得到烟叶中的羧酸类香味成分，但是能够得到的羧酸类香味成分的数量存在差异，经检测三乙胺采用不同浓度时分别得到的羧酸类香味成分的数量如表10所示：
表10.不同三乙胺浓度下羧酸类香味成分的检测数量
三乙胺浓度(μmol/mL) 羧酸类香味成分数量(个)
1 69
2 93
5 82
10 71
20 64
如表10所示，当三乙胺的浓度为2～5μmol/mL尤其为2μmol/mL时能更好地获得烟叶中羧酸类香味成分的全貌，相对更完整准确的完成烟叶中羧酸类香味成分的分析。
(2)衍生化试剂浓度
与实施例1方法相同，取用实施例1中步骤(1)的样品溶液，以衍生化试剂(N,N-二甲基乙二胺和d4-N,N-二甲基乙二胺)的浓度为变量对羧酸类香味成分进行分析。
实验表明，当衍生化试剂的浓度在10-80μmol/mL的范围内时均能筛选得到烟叶中的羧酸类香味成分，但是能够得到的羧酸类香味成分的数量存在差异，经检测衍生化试剂使用不同浓度时分别得到的羧酸类香味成分的数量如表11所示：
表11.不同衍生化试剂浓度下羧酸类香味成分的检测数量
衍生化试剂浓度(μmol/mL) 羧酸类香味成分数量(个)
10 51
20 62
40 79
60 93
80 87
当衍生化试剂的浓度为60-80μmol/mL时羧酸类香味成分的数量达到平台，能更好地获得烟叶中羧酸类香味成分的全貌，相对更完整准确的完成烟叶中羧酸类香味成分的分析；由于衍生化试剂过量可能影响羧酸类香味成分的分析，因此综合考虑选择60μmol/mL作为烟叶中样品衍生化试剂的浓度。
(3)激活剂的浓度
与实施例1方法相同，取用实施例1中步骤(1)的样品溶液，以激活剂(2-氯-1-甲基碘化吡啶鎓)的浓度为变量对羧酸类香味成分进行分析。
实验表明，当激活剂的浓度在30-240μmol/mL的范围内时均能筛选得到烟叶中的羧酸类香味成分，但是能够得到的羧酸类香味成分的数量存在差异，经检测激活剂使用不同浓度时分别得到的羧酸类香味成分的数量如表12所示：
表12.不同激活剂浓度下羧酸类香味成分的检测数量
激活剂浓度(μmol/mL) 羧酸类香味成分数量(个)
30 60
40 69
60 79
120 93
240 87
结果表明，当激活剂的浓度为120-240μmol/mL尤其为120μmol/mL时能更好地获得烟叶中羧酸类香味成分的全貌，相对更完整准确的完成烟叶中羧酸类香味成分的分析。
(4)衍生化反应温度
与实施例1方法相同，以衍生化反应温度(20、40、45、50和60℃)为变量进行衍生化反应，对羧酸类香味成分进行分析。
实验表明，当衍生化反应温度在20-60℃的范围内时均能筛选得到烟叶中的羧酸类香味成分，但是能够得到的羧酸类香味成分的数量存在差异，经检测当衍生化反应温度不同时分别得到的羧酸类香味成分的数量如表13所示：
表13.不同衍生化反应温度下羧酸类香味成分的检测数量
衍生化试剂反应温度(℃) 羧酸类香味成分数量(个)
20 54
30 70
40 87
50 93
60 91
结果表明，当衍生化反应温度为50-60℃尤其为50℃时能更好地获得烟叶中羧酸类香味成分的全貌，相对更完整准确的完成烟叶中羧酸类香味成分的分析。
(5)衍生化反应时间
与实施例1方法相同，以衍生化反应时间(0.5、1、1.5、2和3h)进行衍生化反应，对羧酸类香味成分进行分析。
实验表明，当衍生化反应时间在0.5-3小时的范围内时均能筛选得到烟叶中的羧酸类香味成分，但是能够得到的羧酸类香味成分的数量存在差异，经检测当衍生化反应时间不同时分别得到的羧酸类香味成分的数量如表14所示：
表14.不同衍生化反应时间下羧酸类香味成分的检测数量
衍生化试剂反应时间(h) 羧酸类香味成分数量(个)
0.5 41
1 62
1.5 84
2 93
3 93
结果表明，当衍生化反应时间为2h时能更好地获得烟叶中羧酸类香味成分的全貌，相对更完整准确的完成烟叶中羧酸类香味成分的分析。
上述实施例仅是本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
应当理解的是，本文所述发明不限于特定的方法学、实验方案或试剂，因为这些是可以变化的。本文所提供的论述和实例仅是为了描述特定的实施方案呈现而非意在限制本发明的范围，本发明的范围仅受到权利要求的限定。

Claims (6)

1.一种烟草制品、主流烟气或加热不燃烧卷烟中羧酸类香味成分的检测方法，所述方法包含以下步骤：
(1)样品溶液的制备：在烟草制品、捕集有卷烟主流烟气总粒相物的滤片或捕集有加热不燃烧卷烟总粒相物的滤片中加入提取溶剂进行提取，得到的提取液以有机相滤膜过滤或离心后，作为样品溶液备用；
(2)样品溶液的同位素标记：取步骤(1)中的样品溶液与催化剂和激活剂充分混匀后，加入“轻”同位素衍生化试剂进行反应，反应完成后，反应体系置于-20℃条件下冷冻10min即终止反应，用缓慢氮气流吹干，所得固体样品复溶于乙腈/水(50/50，v/v)中，即得到“轻”同位素标记的衍生化产物；将“轻”同位素衍生化试剂换为“重”同位素衍生化试剂重复上述操作，得到“重”同位素标记的衍生化产物；将“轻”“重”衍生化产物等比例混合均匀，即得待测液；
(3)待测液的测定：取步骤(2)中的待测液进行液相色谱-双中性丢失扫描-质谱分析，即得；
其中，在步骤(3)中，液相色谱‐双中性丢失扫描‐质谱检测待测液时，基于“轻”“重”衍生化产物的质荷比差异，扫描选定的中性丢失片段，结合保留时间与质谱信号强度筛选属于羧酸类香味成分的谱峰。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述卷烟主流烟气总粒相物按照GB/T 19609-2004、ISO 4387：2000规定的捕集方法获得；
优选地，步骤(1)中，所述的加热不燃烧卷烟气溶胶捕集物的捕集方法包括：将加热不燃烧烟弹的一端插入烟草加热棒中，并将烟弹滤嘴端插入含有剑桥滤片的捕集器上；打开烟草加热棒开关对烟弹进行加热，在加热过程中进行抽吸，同时捕集其总粒相物。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述提取溶剂选自乙酸乙酯、乙腈、甲苯和环己烷中的一种或多种，优选为乙腈；
优选地，步骤(1)中，所述提取溶剂即的体积为10-50mL，优选为15mL；
优选地，步骤(1)中，所述提取模式为超声或振荡，提取时间为10-60min，优选超声提取30min；
优选地，步骤(1)中，所述有机相滤膜为尼龙滤膜，所述尼龙滤膜的规格为13mm×0.22μm。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述催化剂为有机碱，优选为三乙胺；优选地，所述催化剂的浓度为1～20μmol/mL，优选为2～10μmol/mL，更优选为2～5μmol/mL，最优选为2μmol/mL；
优选地，步骤(2)中，所述激活剂为2-氯-1-甲基碘化吡啶鎓；优选地，所述激活剂的浓度为30～240μmol/mL，优选为120～240μmol/mL，更优选为120μmol/mL；
优选地，步骤(2)中，所述的“轻”同位素衍生化试剂为N,N-二甲基乙二胺；
优选地，步骤(2)中，所述的“重”同位素衍生化试剂为d4-N,N-二甲基乙二胺；
优选地，所述“轻”或“重”同位素衍生化试剂的浓度为10～80μmol/mL，优选为40～80μmol/mL，最优选为60μmol/mL；
优选地，步骤(2)中，所述激活剂与“轻”或“重”同位素衍生化试剂的摩尔比为1：0.5-4，优选为1：0.5-1，更优选为1：1；
优选地，步骤(2)中，所述催化剂、激活剂与“轻”或“重”衍生化试剂的体积比为1-2.5：1：0.5-1；优选为1：1：2；
优选地，步骤(2)中，所取用的样品溶液与“轻”或“重”衍生化试剂的体积比为10-13：1，优选为10：1；
优选地，步骤(2)中，加入“轻”同位素衍生化试剂进行反应或加入“重”同位素衍生化试剂进行反应的衍生化反应的条件为在20～60℃，优选在50～60℃下振荡0.5～3小时优选1.5～3小时，优选为在50℃下振荡2小时。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述液相色谱条件为：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×100mm,1.7μm,Waters)；柱温30℃；流动相A为含0.1％(v/v)甲酸的水，流动相B为含0.1％(v/v)甲酸的乙腈，梯度洗脱，流速为200μL/min，进样体积为5μL；
优选地，所述梯度洗脱的程序为：0-10min5％-50％B，10-25min50％-62％B，25-35min62％-80％B，35-40min 80％-100％B，40-40.5min 100％-5％B，40.5-55min 5％B；
优选地，步骤(3)中，所述双中性丢失扫描-质谱条件为：双中性丢失扫描，离子源为电喷雾离子源(+)；离子源参数为：电喷雾电压5000V，气帘气35psi，雾化气70psi，辅助加热气70psi，温度600℃，碰撞气6psi；
优选地，步骤(3)中，在洗脱开始的0-2min将六通阀切换至废液，并在洗脱至55min时切回六通阀，使流动相进入质谱。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述“轻”“重”衍生化产物的质荷比差异为4Da；
优选地，步骤(3)中，所述选定的中性丢失片段为45Da和49Da的中性丢失片段；
优选地，步骤(3)中，所述筛选依据为质荷比相差4Da的“轻”“重”衍生化产物的保留时间相差0.05min以内、峰强度比接近于1，优选为两者峰强度偏差在5％以内。
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