CN110907565B - 一种加热不燃烧卷烟烟气中含羰基香味成分的测定方法 - Google Patents

一种加热不燃烧卷烟烟气中含羰基香味成分的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种加热不燃烧卷烟烟气中含羰基香味成分的测定方法，包括定性测定和/或定量测定；所述测定方法基于吉拉德试剂P衍生化的轻/重稳定同位素标记和高效液相‑电喷雾电离质谱，包括吉拉德试剂P衍生化的轻/重稳定同位素标记。本发明的方法可以显著改善质谱检测含羰基香味成分时的离子化效率低和灵敏度不足等问题。

Description

一种加热不燃烧卷烟烟气中含羰基香味成分的测定方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种对加热不燃烧卷烟烟气中含羰基香味成分进行定性和/或定量测定的方法。
背景技术
加热不燃烧卷烟，既满足了消费者对于烟气消费的需求，又减少了烟草高温燃烧产生的有害成分，大幅降低了对吸烟者的危害。因此，加热不燃烧卷烟已成为各烟草公司的研究热点。
烟草经加热(无论是否燃烧)产生的烟气，已经鉴定出的含羰基成分(醛、酮类化合物)的数量超过500种，大量重要香味成分属于此类。例如3-甲基-2-环戊烯-1-酮能产生令人愉快的、似焦糖香的感觉；一些高沸点的酮如紫罗兰酮具有明显的致香作用。因此，有必要对加热不燃烧卷烟烟气中含羰基香味成分进行定性和定量研究，为改善加热不燃烧卷烟的烟气品质打下物质基础，从而进一步使消费者获得更好的用户体验。
质谱是定性和定量研究中最常用的分析手段之一。但是在质谱分析时, 由于被测分子的离子化效率、质子亲合性、表面活性等差异的影响而产生较大误差。且质谱检测器存在稳定性较差，信号受基质影响大的缺点。为了克服上述问题，现有技术中出现了基于稳定同位素标记的醛类、酮类定性定量分析方法。
稳定同位素标记的方法借鉴于蛋白质组学的研究，它的优点在于：由于同位素之间的理化性质非常相近,可以达到近乎相同的离子化效率、质子亲合性、表面活性以及色谱行为。这样可以弥补被分析物离子化效率差异和仪器不稳定等偶然因素造成的误差。用于还原性羰基衍生化的稳定同位素标记试剂有还原胺化试剂、酰肼试剂等。余磊等合成了一对轻/重标记的苯胺试剂4-APC和4-APC-d4用于内源性醛类代谢物的定性分析：被轻/ 重标记的醛类化合物在碰撞诱导裂解电压下能产生一对中性片段(NL 87 和NL91)，因此，通过双中性丢失扫描模式用来寻找可能的目标醛类代谢物；另外，被4-APC和4-APC-d4标记的醛类化合物在质谱中同时电离，但是被分别记录，能很好地降低质谱的响应波动和基质干扰。然后再使用高分辨质谱和它们的裂解规律来实现对醛类化合物的定性(余磊，等.稳定同位素标记-双中性丢失扫描分析醛类代谢物[M].第二十届全国色谱学术报告会及仪器展览会论文集(第四分册)：232)。
Figure BDA0002279004590000021
属于酰肼试剂的吉拉德试剂衍生试剂因自身带有正电荷,衍生后使被测物质也带有永久正电荷,在质谱检测时主要形成[M]+离子,避免了其它衍生试剂在质谱检测中随机出现的[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+等多种金属加合离子峰并存的现象。吴智宇合成了含有5个氘原子取代的1-(2-肼基-2- 氧乙基)吡啶翁氯化物(氘代GP试剂)，进而提供了一种基于吉拉德试剂 P(Girard’s reagent P,GP)衍生化的d0/d5稳定同位素标记-电喷雾电离质谱相对定量分析还原性寡糖链的方法(吴智宇.基于稳定同位素标记吉拉德试剂P的还原性寡糖相对定量分析法[D].西北大学.2012)。吉拉德试剂P(GP) 与糖类物质衍生化反应原理，如下所示：
Figure BDA0002279004590000031
迄今，尚未见基于稳定同位素标记吉拉德试剂P定性定量测定加热不燃烧卷烟烟气中含羰基香味成分的报道。烟气中含羰基香味成分有几百种之多，且含量相差悬殊。这些客观情况都影响吉拉德试剂衍生化是否彻底，进而影响定性定量的结果。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种基于吉拉德试剂P(Girard’s reagentP，GP)衍生化的d0/d5稳定同位素标记-质谱联用技术对加热不燃烧卷烟烟气中含羰基香味成分进行定性定量测定的方法。本发明通过衍生化反应引入电喷雾电离源易电离基团和同位素标记基团，“轻”“重”同位素标记的衍生化产物具有相同的色谱保留时间和质谱电离环境，可以实现对烟气中含羰基香味成分的全面定性和精准定量分析。
为了实现上述技术效果，本发明采用了如下技术方案：
一种加热不燃烧卷烟烟气中含羰基香味成分的测定方法，所述测定方法基于吉拉德试剂P衍生化的轻/重稳定同位素标记和高效液相-电喷雾电离质谱，包括吉拉德试剂P衍生化的轻/重稳定同位素标记，具体操作为：
取一份待标记的样品溶液，与催化剂充分混匀后，加入1-(2-肼基-2- 氧乙基)吡啶翁溴化物或1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁氯化物(吉拉德P试剂，GP)，30～60℃下振荡0.5～6小时，反应结束后用缓慢氮气流吹干，然后加入50％(v/v)甲醇水溶液复溶至与所述待标记的样品溶液相同的体积，即得到“轻”同位素标记的样品溶液；另取一份待标记的样品溶液，用d5- 氘代-1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁溴化物或d5-氘代-1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁氯化物，重复上述操作，得到“重”同位素标记的样品溶液；所述催化剂为有机酸，在整个反应体系的体积百分比浓度为0.5～10％；
液相色谱条件为：
固定相：C18键合硅胶，粒径5μm；
流动相：流动相A为0.1(v/v)％甲酸的水溶液和流动相B为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序如下：
0→5min，5％流动相B，余量为流动相A；5→20min，5％→50％流动相B，余量为流动相A；20→45min，50％→95％流动相B，余量为流动相A；45→50min，95％流动相B，余量为流动相A；50→51min，95％→5％流动相B，余量为流动相A；51→60min，5％流动相B，余量为流动相A；
流速：0.2mL/min；
进样量：10μL；
柱温：40℃；
质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源；
电喷雾电压：5500V，气帘气10psi，雾化气11psi，碰撞气6psi。
优选地，所述催化剂为冰醋酸。
更优选地，冰醋酸在整个反应体系的体积百分比浓度为5％。
优选地，1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁溴化物或1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁氯化物的用量为0.04～4nmol；更优选为2～3nmol。
优选地，反应条件为40℃下振荡2小时。
优选地，所述液相色谱的色谱柱规格为150×2.0mm。
本发明所述测定方法包括定性鉴别，具体步骤如下：
I.烟气提取液的制备：将加热不燃烧烟弹的一端插入加热装置中，并将烟弹滤嘴端插入含有剑桥滤片的捕集器上；打开烟草加热开关对烟弹进行加热至350±10℃，在加热的同时中进行抽吸，抽吸时间2～3秒；相同条件下连续抽吸3支，捕集烟气的总粒相物；将捕集有总粒相物的滤片置于容器中，加入10-50mL甲醇进行超声或振荡提取，即得，提取液即为所述待标记的样品溶液，备用；
II.供试品溶液的制备：取步骤I得到的所述烟气提取液均分为两份，按照前述吉拉德试剂P衍生化的轻/重稳定同位素标记所述步骤得到“轻”同位素标记的样品溶液和“重”同位素标记的样品溶液，将两种样品溶液等体积比混合，得到所述供试品；
III.供试品溶液的测定：取步骤II制备得到的所述供试品溶液注入液相色谱-串联质谱仪，质谱扫描模式为中性丢失扫描，扫描80和85Da的两个特定中性丢失片段；根据“轻”、“重”同位素标记的含羰基化合物的质荷比相差5Da、色谱保留时间一致、质谱信号强度比接近于1的特点，确定可能的含羰基化合物，然后再使用高分辨质谱对含羰基化合物进行定性鉴别。
优选地，所述步骤I中，超声的功率为400～700W，振荡的速率为 100～300转/分钟；提取时间为20-30min。
本发明所述测定方法还包括定量测定，包括如下步骤：
A.标准溶液的制备：准确称取标准品用甲醇配制成1.0mg/mL的溶液，均分为两份，按照前述吉拉德试剂P衍生化的轻/重稳定同位素标记所述步骤得到“轻”同位素标记的标准品溶液S轻标和“重”同位素标记的标准品溶液S重标，将S轻标进行稀释，然后分别加入S重标作为内标，混合均匀，得到一系列不同浓度的标准溶液，其中内标的浓度为S重标浓度的十分之一；
B.烟气提取液的制备：将加热不燃烧烟弹的一端插入加热装置中，并将烟弹滤嘴端插入含有剑桥滤片的捕集器上；打开烟草加热开关对烟弹进行加热至350±10℃，在加热的同时中进行抽吸，抽吸时间2～3秒；相同条件下连续抽吸3支，捕集烟气的总粒相物；将捕集有总粒相物的滤片置于容器中，加入10～50mL甲醇进行超声或振荡提取，提取结束后用甲醇补齐重量，即得，备用；
C.供试品溶液的制备：取步骤B得到的所述烟气提取液均分为两份，按照前述吉拉德试剂P衍生化的轻/重稳定同位素标记所述步骤得到“轻”同位素标记的样品溶液S轻样和“重”同位素标记的样品溶液S重样，将两种样品溶液按照体积比S轻样：S重样＝9:1混合，得到所述供试品；
D.标准曲线的建立：精密吸取步骤A制备得到的一系列不同浓度的标准溶液各10μL注入液相色谱-串联质谱仪，质谱扫描模式为多反应监测扫描，扫描[M-79]+子离子；
由“轻”同位素标记的标准品峰面积和相应的内标峰面积之比为纵坐标，“轻”同位素标记的标准品的浓度为横坐标绘制标准曲线，求出各标准曲线的斜率a和截距b；
E.测定
精密吸取步骤B制备得到的所述供试品溶液10μL注入液相色谱-串联质谱仪，在步骤C相同的色谱和质谱条件下，将“轻”同位素标记的含羰基化合物的峰面积和“重”同位素标记的含羰基化合物峰面积之比代入公式1中，计算出测试含羰基化合物在加热不燃烧卷烟中的平均每支含量；
Figure BDA0002279004590000051
其中，m为被测含羰基化合物的平均每支含量，ng/支，
x为“轻”同位素标记的含羰基化合物的峰面积和“重”同位素标记的含羰基化合物峰面积之比，
a和b为标准曲线的斜率和截距，
V为提取液的体积，mL，
n为测试的加热不燃烧卷烟数量，支。
优选地，所述标准品选自3-羟基-2-丁酮、3-甲基-2-环戊烯-1-酮、2,3- 丁二酮、苯甲醛、己醛、4-庚酮、庚醛、壬醛和紫罗兰酮中的一种或多种。
更优选地，所述标准品选自3-羟基-2-丁酮、3-甲基-2-环戊烯-1-酮、 2,3-丁二酮、苯甲醛、己醛、4-庚酮、庚醛、壬醛和紫罗兰酮的全部。
优选地，所述步骤A中，所述标准品各自独立地制备所述标准溶液，或者准确称量后的所述标准品混合后制备所述标准溶液。
上述定量测定方法中，吉拉德试剂P衍生化的各标准品多反应监测扫描参数，包括母离子、定量/定性子离子和相应的碰撞能等参数，见表1 所示。其中[M-79]+子离子(即衍生化物丢失吡啶的碎片)用于定量，另一个子离子用于定性。
表1 9种含羰基标准品衍生后的多反应监测参数
Figure BDA0002279004590000061
本发明还提供所述的测定方法在定性和定量测定卷烟烟气中含羰基香味成分中的应用，所述卷烟选自加热不燃烧卷烟或加热燃烧卷烟。
本发明说明书中，如无特殊说明，所述“样品溶液”是指含有含羰基香味成分，且所述含羰基香味成分还未被GP衍生化的溶液，包括标准品的甲醇溶液、烟气捕集和提取后得到的烟气提取液。
本发明利用一对轻重同位素标记吉拉德试剂P(GP)高选择性地与加热不燃烧卷烟烟气提取液中的含羰基香味成分进行反应，然后基于液相色谱-串联质谱进行定性和定量测定。以1-(2-肼基-2-氧代乙基)吡啶-1-溴化物为例，含羰基香味成分与GP和d5-GP的反应如下所示：
Figure BDA0002279004590000071
d5-GP标记的含羰基香味成分与GP标记的含羰基香味成分的质荷比相差5Da、色谱保留时间一致。在定性测定中，“轻”、“重”同位素标记的含羰基化合物的量相同，因此两者的质谱信号强度比接近于1。所有的含羰基化合物经过GP/d5-GP衍生化处理后均形成了带正电荷的腙，且都产生来源于衍生化试剂吡啶环的碎片离子m/z 80.1和m/z 85.1。利用上述特点，根据中性丢失为80Da和85Da的总离子流图即可确定烟气中可能的含羰基化合物，然后再使用高分辨质谱对含羰基化合物进行定性鉴别。在定量测定时，d5-GP标记的含羰基香味成分(目标分析物)作为内标，可以校正基质效应和离子抑制/增强作用所引起的质谱信号波动，从而减小定量偏差。同时基于上述质谱裂解规律，将分子离子(母离子)失去吡啶基的碎片离子[M-79]+用于定量。另外，因为GP结构中含有的季铵盐基团极易电离，所以经过GP标记后，含羰基香味成分的灵敏度有了很大提高，显著改善了质谱检测含羰基化合物时的离子化效率低和灵敏度不足等问题。
显然，本发明上述对于烟气中含羰基香味成分的定性和/或定量测定方法，不仅可以应用于加热不燃烧卷烟烟气的测定，同样可以用于普通卷烟(即加热燃烧卷烟)烟气的测定。
附图说明
以下结合附图，对本发明作进一步的说明。
图1示出的是研究例1中得到的吉拉德试剂P(GP)标记后的9种含羰基香味成分的质谱裂解图，其中：1A是GP标记的3-羟基-2-丁酮的质谱图， 1B是GP标记的3-甲基-2-环戊烯-1-酮的质谱图，1C是GP标记的2,3-丁二酮的质谱图，1D是GP标记的苯甲醛的质谱图，1E是GP标记的己醛的质谱图，1F是GP标记的4-庚酮的质谱图，1G是GP标记的庚醛的质谱图，1H是GP标记的壬醛的质谱图，1I是GP标记的紫罗兰酮的质谱图。
图2示出的是冰醋酸用量对吉拉德试剂P(GP)衍生化反应的影响，横坐标是冰醋酸占反应体系的体积百分比，纵坐标是GP标记的标准品与内标峰面积的比值。
图3示出的是吉拉德试剂P(GP)用量对吉拉德试剂P衍生化反应的影响，横坐标是GP与含羰基化合物的摩尔比，纵坐标是GP标记的标准品与内标峰面积的比值。
图4示出的是温度对吉拉德试剂P(GP)衍生化反应的影响，横坐标是温度，纵坐标是GP标记的标准品与内标峰面积的比值。
图5示出的是反应时间对吉拉德试剂P(GP)衍生化反应的影响，横坐标是反应时间，纵坐标是GP标记的标准品与内标峰面积的比值。
图6示出的是吉拉德试剂P衍生化对测定目标化合物质谱检测灵敏度的影响，其中6A示出的是衍生化前标准品溶液的总离子流色谱图，6B示出的是衍生化后标准品溶液的总离子色谱图。
图7示出的是吉拉德P试剂(GP)标记的含羰基化合物的稳定性，横坐标是测定时间点，纵坐标是GP标记的含羰基化合物的峰面积积分值。
图8示出的是加热不燃烧卷烟A烟气提取液在吉拉德试剂P标记后的总离子流色谱图，其中上图是中性丢失80Da扫描得到的总离子流色谱图，下图是中性丢失85Da扫描得到的总离子色谱图。
图9示出的是加热不燃烧卷烟A烟气提取液在吉拉德试剂P标记后，质谱多反应监测扫描模式(扫描[M-79]+)下得到的色谱图。
图10示出的是加热不燃烧卷烟B烟气提取液在吉拉德试剂P标记后的总离子流色谱图，其中上图是中性丢失80Da扫描得到的总离子流色谱图，下图是中性丢失85Da扫描得到的总离子色谱图。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。其中，部分试剂和仪器购买情况如下：
高效液相-串联质谱仪：Agilent 1100(美国安捷伦公司)配API 4000三重四极杆质谱仪(美国AB公司)，色谱柱：Shim-pack VP-ODS(2.0mm×150 mm,5μm)；
吉拉德试剂P：1-(2-肼基-2-氧代乙基)吡啶-1-溴化物(以下简称“GP”)，纯度≥99％(TLC)，Avanti Polar Lipids Inc，批号640007P-250MG-A-010；
重同位素标记吉拉德试剂P：d5-1-(2-肼基-2-氧代乙基)吡啶-1-溴化物 (以下简称“d5-GP”)，纯度≥99％(TLC)，Avanti Polar Lipids Inc，批号640008P-10MG-A-010；
3-羟基-2-丁酮：纯度≥99.4％，Sigma-aldrich，批号LRAB8474：
3-甲基-2-环戊烯-1-酮：纯度≥99.4％，Sigma-aldrich，批号BCBW3345；
2,3-丁二酮：纯度≥97.0％，Sigma-aldrich，批号BCBW1565：
苯甲醛：纯度≥99.5％，Sigma-aldrich，批号STBH4561；
己醛：纯度≥95.0％，Sigma-aldrich，批号BCBX5241；
4-庚酮：纯度≥99.8％，Sigma-aldrich，批号BCBW5075；
庚醛：纯度≥97.0％，Sigma-aldrich，批号BCBS5647V；
壬醛：纯度≥99.5％，Sigma-aldrich，批号LRAB7582；
紫罗兰酮：纯度≥96.0％，Sigma-aldrich，批号BCBV5428。
研究例1GP衍生化反应条件的优化
本发明建立的对于烟气中含羰基香味成分的定性和/或定量测定方法基于GP和含羰基化合物生成腙的衍生化反应。因此反应进行得是否彻底关系到检测结果的准确性。本研究例以标准品为研究对象，对催化剂(冰醋酸)用量、GP用量、反应温度、反应时间等因素进行了考察和优化。
1.试剂
1.1标准品储备溶液的制备
精密称取3-羟基-2-丁酮、3-甲基-2-环戊烯-1-酮、2,3-丁二酮、苯甲醛、己醛、4-庚酮、庚醛、壬醛和紫罗兰酮，置于同一容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，使各标准品的浓度为：3-羟基-2-丁酮0.95mg/mL、3-甲基-2-环戊烯-1-酮1.05mg/mL、2,3-丁二酮1.17mg/mL、苯甲醛0.95mg/mL、己醛 1.21mg/mL、4-庚酮1.11mg/mL、庚醛0.92mg/mL、壬醛0.92mg/mL和紫罗兰酮0.98mg/mL。
1.2 GP和d5-GP溶液的制备
精密称取GP用甲醇溶解配制成浓度为0.696mg/mL的溶液；精密称取 d5-GP，用甲醇溶解配制成浓度为0.711mg/mL的溶液。以上两种溶液均在 -20℃下保存,使用前将温度恢复至室温。
2.色谱条件
固定相：C18键合硅胶，粒径5μm；
流动相：流动相A为0.1(v/v)％甲酸的水溶液和流动相B为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序如下：
0→5min，5％流动相B，余量为流动相A；5→20min，5％→50％流动相B，余量为流动相A；20→45min，50％→95％流动相B，余量为流动相A；45→50min，95％流动相B，余量为流动相A；50→51min，95％→5％流动相B，余量为流动相A；51→60min，5％流动相B，余量为流动相A；
流速：0.2mL/min；
进样量：10μL；
柱温：40℃。
3.质谱条件：
离子源：电喷雾离子源；
电喷雾电压：5500V，气帘气10psi，雾化气11psi，碰撞气6psi。
4.轻/重稳定同位素标记的GP衍生化反应
取标准品储备溶液0.8mL，均分为两份作为待标记的样品溶液；其中一份与冰醋酸充分混匀后，加入GP溶液，30～60℃下振荡0.5～6小时，反应结束后用缓慢氮气流吹干，然后加入50％(v/v)甲醇水溶液复溶至与所述待标记的样品溶液相同的体积，即得到“轻”同位素标记的样品溶液；另取一份待标记的样品溶液，用d5-GP，重复上述操作，得到“重”同位素标记的样品溶液。
5.GP衍生化产物多反应监测参数
在优选GP衍生化反应条件之前，先考察了GP标记后的含羰基香味成分的质谱二级碎裂行为。如图1所示，所有的9种含羰基化合物经过 GP衍生化处理后均形成了带正电荷的腙，且都产生来源于衍生化试剂吡啶环的碎片离子m/z 80.1。因此，GP能够标记9种含羰基的香味成分。同时根据各衍生物的碎裂行为优化了衍生化产物多反应监测时的母离子、子离子和碰撞能等参数，结果如表1所示。
6.GP衍生化反应条件的优化
6.1冰醋酸用量的优选
按照“4.”项下进行GP和d5-GP衍生化反应，其中每份待标记的样品溶液中加入GP(400μL)或d5-GP(200μL)，40℃下振荡约3.0小时 (1,500rpm)，冰醋酸用量为整个反应体系体积的0％、0.5％、1％、2％、5％和10％。反应后得到的“轻”同位素标记的样品溶液和“重”同位素标记的样品溶液按照体积比12.5:1的比例混合，得到供试品溶液。精密吸取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，选定[M-79]+子离子进行多反应监测模式质谱扫描，对得到的“轻”/“重”稳定同位素标记的标准品的色谱峰进行积分，计算两者的峰面积比值。结果见图2。
从图2可以看出，随着在整体反应体系中冰乙酸含量增加至5％(v/v)，标准品与内标峰面积的比值达到最大，且继续增加冰乙酸含量该比值没有显著变化。因此，衍生化反应中，冰乙酸的用量优选为整体反应体系体积的5％(v/v)。
6.2 GP用量的优选
按照“4.”项下进行GP衍生化反应，其中每份待标记的样品溶液中冰醋酸用量为整个反应体系体积的0.5％，加入不同量的GP，使GP与待标记的含羰基化合物的摩尔比分别为10:1、50:1、100:1、200:1、500:1和 1000:1，40℃下振荡约3小时(1,500rpm)。反应后得到“轻”同位素标记的样品溶液。
按照“4.”项下进行d5-GP衍生化反应，其中每份待标记的样品溶液加入d5-GP200μL，冰醋酸用量为整个反应体系体积的0.5％，40℃下振荡约3小时(1,500rpm)，得到“重”同位素标记的样品溶液。
将“轻”、“重”同位素标记的样品溶液按照体积比12.5:1的比例混合，得到供试品溶液。精密吸取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，选定 [M-79]+子离子进行多反应监测模式质谱扫描，对得到的“轻”/“重”稳定同位素标记的标准品的色谱峰进行积分，计算两者的峰面积比值。结果见图3。
图3示出，当GP与含羰基化合物的摩尔比为500:1时，分析物与内标峰面积的比值达到最大值，且继续增加GP用量其比值没有显著变化。因此，衍生化反应时，GP与含羰基化合物的摩尔比优选大于等于500:1。
6.3反应温度的优选
按照“4.”项下进行GP和d5-GP衍生化反应，其中每份待标记的样品溶液中GP与待标记的含羰基化合物的摩尔比为500:1，冰醋酸用量为整个反应体系体积的0.5％，不同温度下(30℃、40℃、50℃和60℃)振荡约3小时(1,500rpm)。反应后得到“轻”同位素标记的样品溶液。
按照“4.”项下进行d5-GP衍生化反应，其中每份待标记的样品溶液入d5-GP200μL，冰醋酸用量为整个反应体系体积的0.5％，40℃下振荡约 3小时(1,500rpm)，得到“重”同位素标记的样品溶液。
将“轻”、“重”同位素标记的样品溶液按照体积比8.75:1的比例混合，得到供试品溶液。精密吸取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，选定 [M-79]+子离子进行多反应监测模式质谱扫描，对得到的“轻”/“重”稳定同位素标记的标准品的色谱峰进行积分，计算两者的峰面积比值。结果见图4。
图4示出，在考察的范围内，反应温度对分析物与内标峰面积的比值影响不大。但是前期实验证明，在40℃下衍生化反应能够更快达到平衡。为了保证实验的一致性和可比性，因此将反应温度固定为40℃。
6.4反应时间的优选
按照“4.”项下进行GP和d5-GP衍生化反应，其中每份待标记的样品溶液中GP与待标记的含羰基化合物的摩尔比为500:1，冰醋酸用量为整个反应体系体积的0.5％，40℃振荡0.5小时、1小时、2小时、3小时、4 小时和6小时。反应后得到“轻”同位素标记的样品溶液。
按照“4.”项下进行d5-GP衍生化反应，其中每份待标记的样品溶液入d5-GP200μL，冰醋酸用量为整个反应体系体积的0.5％，40℃下振荡约 3小时(1,500rpm)，得到“重”同位素标记的样品溶液。
将“轻”、“重”同位素标记的样品溶液按照体积比8.75:1的比例混合，得到供试品溶液。精密吸取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，选定 [M-79]+子离子进行多反应监测模式质谱扫描，对得到的“轻”/“重”稳定同位素标记的标准品的色谱峰进行积分，计算两者的峰面积比值。结果见图5。
图5示出，当衍生化反应从0.5小时增加到2小时，分析物与内标峰面积的比值增加较显著，此后继续增加反应时间峰面积比值增加不明显。因此，衍生化反应的时间优选为2小时。
7.衍生化对测定目标化合物质谱检测灵敏度的影响
按照优选出的反应条件，按照“4.”项下进行GP和d5-GP衍生化反应，其中每份待标记的样品溶液中GP与待标记的含羰基化合物的摩尔比为500:1，冰醋酸用量为整个反应体系体积的0.5％，40℃振荡2小时。反应后得到“轻”同位素标记的样品溶液。
分别精密吸取标准品储备溶液和反应后得到的“轻”同位素标记的样品溶液10μL，注入液相色谱仪，在各自最佳的质谱条件下进行检测。结果见图6。
图6A示出，衍生化反应之前，7种化合物(3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二酮、苯甲醛、己醛、4-庚酮、庚醛和壬醛)由于离子化效率很低，在较高浓度下(10ppm左右)仍未检测到相应的质谱信号，只有3-甲基-2-环戊烯-1-酮(图中标记为2号峰)和紫罗兰酮(图中标记为9号峰)能够检测到相应的质谱信号。图6B则示出，经过GP衍生后，即使较低浓度的羰基物(0.1ppm左右)，仍能检测到所有9种含羰基化合物的质谱信号。以3-甲基-2-环戊烯-1-酮(图中标记为2号峰)和紫罗兰酮(图中标记为9 号峰)为例，衍生化后灵敏度分别提高了36和27倍。对其它衍生化之前没有质谱信号的7种化合物，灵敏度提高的倍数更大。
研究例2本发明建立的检测方法的方法学考察
精密称取3-羟基-2-丁酮、3-甲基-2-环戊烯-1-酮、2,3-丁二酮、苯甲醛、己醛、4-庚酮、庚醛、壬醛和紫罗兰酮，置于同一容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，使各标准品的浓度为：3-羟基-2-丁酮5.029mg/mL、3-甲基-2-环戊烯-1-酮1.986mg/mL、2,3-丁二酮0.474mg/mL、苯甲醛0.522mg/mL、己醛0.512mg/mL、4-庚酮5.011mg/mL、庚醛0.285mg/mL、壬醛0.11mg/mL 和紫罗兰酮0.138mg/mL，得到的混合标准品溶液作为储备液，用于以下各项研究。
1.稳定性
衍生化产物的稳定性会直接影响检测方法的重现性及准确度，本研究以标准品的GP衍生物为对象，考察GP标记含羰基化合物的稳定性。
取混合标准品溶液，以优化的GP衍生反应条件，制备了GP标记的衍生化产物，在4℃环境下保存，并分别在第0、6、12和24小时进行测定，对峰面积进行积分。结果见图7所示。
图7示出，衍生化产物在4℃环境下保存24小时是稳定的，其峰面积没有显著的变化，能保证本方法在对含羰基化合物进行准确定量时的重复性。
2.线性范围、检出限和定量限
取混合标准品溶液依次稀释1000、2500、5000、10000、25000、50000 和100000，得到系列标准溶液。
以优化的GP衍生反应条件，制备得到“轻”同位素GP标记的系列标准品溶液S轻标。以优化的GP衍生化反应条件，将未稀释的混合标准品溶液和d5-GP反应，得到“重”同位素d5-GP标记的标准品溶液S重标，将 S重标作为内标分别加入系列S轻标，混合均匀，得到系列不同浓度的标准溶液，其中内标的浓度为GP标记的S轻标系列中最高浓度的五分之一。精密吸取所述系列不同浓度的标准溶液各10μL注入液相色谱-串联质谱仪，在最优的质谱条件下进行多反应监测扫描，以标准品和内标的峰面积之比对标准品浓度作工作曲线，分别以3倍和10倍信噪比计算检出限和定量限，结果见表2。
表2本发明方法中9种含羰基香味成分的线性范围、工作曲线、检出限和定量限
Figure BDA0002279004590000131
Figure BDA0002279004590000141
3.精密度和准确度
3.1低、中、高浓度供试品溶液的制备
取混合标准品溶液稀释为表2所示的线性范围最低值的2、10和40 倍，得到低、中、高浓度三份混合标准品溶液，用于日内精密度和准确度考察；其中各标准品的浓度如表3所示。
表3精密度和准确度考察用供试品溶液浓度
Figure BDA0002279004590000142
以优化的GP衍生反应条件，按照研究例1“4.”项下步骤制备了GP“轻”同位素标记和“重”同位素标记的衍生化产物溶液，将两种溶液按照“轻”：“重”＝9:1的体积比混合，精密吸取10μL注入液相色谱仪，按照最佳的质谱条件进行扫描，计算各目标分析物的浓度，并与实际浓度相比，得到回收率。每种浓度的测试品溶液平行操作5次。结果见表4。
连续3天，每天平行制备所述低、中、高浓度的样品溶液各五份(浓度具体见表3)，然后进行衍生和测定来评价日间精密度，结果见表4。
表4 9种含羰基香味成分在不同浓度下的准确度和精密度
Figure BDA0002279004590000143
Figure BDA0002279004590000151
表4数据示出，9种含羰基化合物在不同浓度下的日内及日间相对标准偏差分别小于8.5％和10.0％，说明方法具有较好的重现性。不同浓度下 9种含羰基化合物的回收率介于90.3-112.6％之间，说明方法的准确性良好。
总之，通过研究例2证明，本发明建立的定量测定方法稳定，准确度和精密度好。
在研究例1和研究例2的基础上建立了本发明的加热不燃烧卷烟烟气中含羰基化合物的检测方法，具体包括：
1.吉拉德试剂P衍生化的轻/重稳定同位素标记，具体操作为：
取一份待标记的样品溶液，与冰醋酸充分混匀，加入1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁溴化物或1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁氯化物(吉拉德P试剂， GP)，30～60℃下振荡0.5～6小时，优选为40℃下振荡2小时；反应结束后用缓慢氮气流吹干，然后加入50％(v/v)甲醇水溶液复溶至与所述待标记的样品溶液相同的体积，即得到“轻”同位素标记的样品溶液；另取一份待标记的样品溶液，用d5-氘代-1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁溴化物或d5-氘代-1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁氯化物(d5-GP)，重复上述操作，得到“重”同位素标记的样品溶液；其中，冰醋酸在整个反应体系的体积百分比浓度为0.5～10％，优选0.5％；1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁溴化物或1-(2-肼基-2- 氧乙基)吡啶翁氯化物的用量为0.04～4nmol；更优选为2～3nmol；
液相色谱条件为：
固定相：C18键合硅胶，粒径5μm；
流动相：流动相A为0.1(v/v)％甲酸的水溶液和流动相B为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序如下：
0→5min，5％流动相B，余量为流动相A；5→20min，5％→50％流动相B，余量为流动相A；20→45min，50％→95％流动相B，余量为流动相A；45→50min，95％流动相B，余量为流动相A；50→51min，95％→5％流动相B，余量为流动相A；51→60min，5％流动相B，余量为流动相A；
流速：0.2mL/min；
进样量：10μL；
柱温：40℃；
质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源；
电喷雾电压：5500V，气帘气10psi，雾化气11psi，碰撞气6psi。
2.定性鉴别，具体步骤如下：
I.烟气提取液的制备：将加热不燃烧烟弹的一端插入加热装置中，并将烟弹滤嘴端插入含有剑桥滤片的捕集器上；打开烟草加热开关对烟弹进行加热至350±10℃，在加热的同时中进行抽吸，抽吸时间2～3秒；相同条件下连续抽吸3支，捕集烟气的总粒相物；将捕集有总粒相物的滤片置于容器中，加入10～50mL甲醇进行超声或振荡提取，超声的功率为400～700W，振荡的速率为100～300转/分，提取时间为20～30min，即得，提取液即为所述待标记的样品溶液，备用；
II.供试品溶液的制备：取步骤I得到的所述烟气提取液均分为两份，按照前述吉拉德试剂P衍生化的轻/重稳定同位素标记所述步骤得到“轻”同位素标记的样品溶液和“重”同位素标记的样品溶液，将两种样品溶液等体积比混合，得到所述供试品；
III.供试品溶液的测定：取步骤II制备得到的所述供试品溶液注入液相色谱-串联质谱仪，质谱扫描模式为中性丢失扫描，扫描80Da和85Da 的两个特定中性丢失片段；根据“轻”、“重”同位素标记的含羰基化合物的质荷比相差5Da、色谱保留时间一致、质谱信号强度比接近于1的特点，确定可能的含羰基化合物，然后再使用高分辨质谱对含羰基化合物进行定性鉴别。
3.定量测定，包括如下步骤：
A.标准溶液的制备：准确称取标准品用甲醇配制成1.0mg/mL的溶液，均分为两份，按照前述吉拉德试剂P衍生化的轻/重稳定同位素标记所述步骤得到“轻”同位素标记的标准品溶液S轻标和“重”同位素标记的标准品溶液S重标，将S轻标进行稀释，然后分别加入S重标作为内标，混合均匀，得到一系列不同浓度的标准溶液，其中内标的浓度为S重标浓度的十分之一；
B.烟气提取液的制备：将加热不燃烧烟弹的一端插入加热装置中，并将烟弹滤嘴端插入含有剑桥滤片的捕集器上；打开烟草加热开关对烟弹进行加热至350±10℃，在加热的同时中进行抽吸，抽吸时间2～3秒；相同条件下连续抽吸3支，捕集烟气的总粒相物；将捕集有总粒相物的滤片置于容器中，加入10～50mL甲醇进行超声或振荡提取，提取结束后用甲醇补齐重量，即得，备用；
C.供试品溶液的制备：取步骤B得到的所述烟气提取液均分为两份，按照前述吉拉德试剂P衍生化的轻/重稳定同位素标记所述步骤得到“轻”同位素标记的样品溶液S轻样和“重”同位素标记的样品溶液S重样，将两种样品溶液按照体积比S轻样：S重样＝9:1混合，得到所述供试品；
D.标准曲线的建立：精密吸取步骤A制备得到的一系列不同浓度的标准溶液各10μL注入液相色谱-串联质谱仪，质谱扫描模式为多反应监测扫描，扫描[M-79]+子离子，各化合物的母离子、子离子和碰撞能，如表 1所示；
由“轻”同位素标记的标准品峰面积和相应的内标峰面积之比为纵坐标，“轻”同位素标记的标准品的浓度为横坐标绘制标准曲线，求出各标准曲线的斜率a和截距b；
E.测定
精密吸取步骤B制备得到的所述供试品溶液10μL注入液相色谱-串联质谱仪，在步骤C相同的色谱和质谱条件下，将“轻”同位素标记的含羰基化合物的峰面积和“重”同位素标记的含羰基化合物峰面积之比代入公式1中，计算出测试含羰基化合物在加热不燃烧卷烟中的平均每支含量；
Figure BDA0002279004590000171
其中，m为被测含羰基化合物的平均每支含量，ng/支，
x为“轻”同位素标记的含羰基化合物的峰面积和“重”同位素标记的含羰基化合物峰面积之比，
a和b为标准曲线的斜率和截距，
V为提取液的体积，mL，
n为测试的加热不燃烧卷烟数量，支。
实施例1加热不燃烧卷烟A烟气中含羰基化合物的定性和定量测定
按照上述方法，对加热不燃烧卷烟A烟气中含羰基化合物进行了定性和定量测定。通过扫描两个特定的中性丢失片段(80Da和85Da)，得到总离子流色谱图，见图8。依据衍生化产物的质荷比相差5Da、衍生化产物的色谱保留时间一致、衍生化产物的质谱信号强度比接近于1，一共得到56种可能的含羰基化合物，结果见表5 。
定量测定中，建立的工作曲线见表2所示。加热不燃烧卷烟A烟气中检测到2,3-丁二酮含量为39.2ng/支，色谱图见图9。虽然也检测到3-羟基-2-丁酮，但其含量低于本发明方法的定量限，故未定量。
实施例2加热不燃烧卷烟B烟气中含羰基化合物的定性和定量测定
按照上述方法，对加热不燃烧卷烟B烟气中含羰基化合物进行了定性和定量测定。通过扫描两个特定的中性丢失片段(80Da和85Da)，得到总离子流色谱图，见图10。依据衍生化产物的质荷比相差5Da、衍生化产物的色谱保留时间一致、衍生化产物的质谱信号强度比接近于1，一共得到38种可能的含羰基化合物，结果见表5 。
定量测定中，建立的工作曲线见表2所示。加热不燃烧卷烟B烟气中检测到3-羟基-2-丁酮，但其含量低于本发明方法的定量限，故未定量。
表5 实施例1和实施例2的定性测定结果
Figure BDA0002279004590000181
Figure BDA0002279004590000191
Figure BDA0002279004590000201

Claims (15)

1.一种加热不燃烧卷烟烟气中含羰基香味成分的测定方法，所述测定方法基于吉拉德试剂P衍生化的轻/重稳定同位素标记和高效液相-电喷雾电离质谱，包括吉拉德试剂P衍生化的轻/重稳定同位素标记，具体操作为：
取一份待标记的样品溶液，与催化剂充分混匀后，加入1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁溴化物或1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁氯化物，30～60℃下振荡0.5～6小时，反应结束后用缓慢氮气流吹干，然后加入50％(v/v)甲醇水溶液复溶至与所述待标记的样品溶液相同的体积，即得到“轻”同位素标记的样品溶液；另取一份待标记的样品溶液，用d5-氘代-1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁溴化物或d5-氘代-1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁氯化物，重复上述操作，得到“重”同位素标记的样品溶液；所述催化剂为有机酸，在整个反应体系的体积百分比浓度为0.5～10％；
液相色谱条件为：
固定相：C18键合硅胶，粒径5μm；
流动相：流动相A为0.1(v/v)％甲酸的水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序如下：
0→5min，5％流动相B，余量为流动相A；5→20min，5％→50％流动相B，余量为流动相A；20→45min，50％→95％流动相B，余量为流动相A；45→50min，95％流动相B，余量为流动相A；50→51min，95％→5％流动相B，余量为流动相A；51→60min，5％流动相B，余量为流动相A；
流速：0.2mL/min；
进样量：10μL；
柱温：40℃；
质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源；
电喷雾电压：5500V，气帘气10psi，雾化气11psi，碰撞气6psi。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述催化剂为冰醋酸。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，冰醋酸在整个反应体系的体积百分比浓度为5％。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁溴化物或1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁氯化物的用量为0.04～4nmol。
5.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁溴化物或1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁氯化物的用量为2～3nmol。
6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，反应条件为40℃下振荡2小时。
7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述液相色谱的色谱柱规格为150×2.0mm。
8.根据权利要求1所述测定方法，其特征在于，所述测定方法包括定性鉴别，具体步骤如下：
I.烟气提取液的制备：将加热不燃烧烟弹的一端插入加热装置中，并将烟弹滤嘴端插入含有剑桥滤片的捕集器上；打开烟草加热开关对烟弹进行加热至350±10℃，在加热的同时进行抽吸，抽吸时间2～3秒；相同条件下连续抽吸3支，捕集烟气的总粒相物；将捕集有总粒相物的滤片置于容器中，加入10～50mL甲醇进行超声或振荡提取，即得，提取液即为所述待标记的样品溶液，备用；
II.供试品溶液的制备：取步骤I得到的所述烟气提取液均分为两份，分别加入轻/重稳定同位素标记的吉拉德试剂P进行衍生化，得到“轻”同位素标记的样品溶液和“重”同位素标记的样品溶液，将两种样品溶液等体积比混合，得到所述供试品溶液；
III.供试品溶液的测定：取步骤II制备得到的所述供试品溶液注入液相色谱-串联质谱仪，质谱扫描模式为中性丢失扫描，扫描80和85Da的两个特定中性丢失片段；根据“轻”、“重”同位素标记的含羰基化合物的质荷比相差5Da、色谱保留时间一致、质谱信号强度比接近于1的特点，确定可能的含羰基化合物，然后再使用高分辨质谱对含羰基化合物进行定性鉴别。
9.根据权利要求8所述测定方法，其特征在于，所述步骤I中，超声的功率为400～700W，振荡的速率为100～300转/分钟；提取时间为20～30min。
10.根据权利要求1或8所述的测定方法，其特征在于，所述测定方法还包括定量测定，包括如下步骤：
A.标准溶液的制备：准确称取标准品用甲醇配制成1.0mg/mL的溶液，均分为两份，分别加入轻/重稳定同位素标记的吉拉德试剂P进行衍生化，得到“轻”同位素标记的标准品溶液S轻标和“重”同位素标记的标准品溶液S重标，将S轻标进行稀释，然后分别加入S重标作为内标，混合均匀，得到一系列不同浓度的标准溶液，其中内标的浓度为S重标浓度的十分之一；
B.烟气提取液的制备：将加热不燃烧烟弹的一端插入加热装置中，并将烟弹滤嘴端插入含有剑桥滤片的捕集器上；打开烟草加热开关对烟弹进行加热至350±10℃，在加热的同时中进行抽吸，抽吸时间2～3秒；相同条件下连续抽吸3支，捕集烟气的总粒相物；将捕集有总粒相物的滤片置于容器中，加入10～50mL甲醇进行超声或振荡提取，提取结束后用甲醇补齐重量，即得，备用；
C.供试品溶液的制备：取步骤B得到的所述烟气提取液均分为两份，分别加入轻/重稳定同位素标记的吉拉德试剂P进行衍生化，得到“轻”同位素标记的样品溶液S轻样和“重”同位素标记的样品溶液S重样，将两种样品溶液按照体积比S轻样：S重样＝9:1混合，得到所述供试品溶液；
D.标准曲线的建立：精密吸取步骤A制备得到的一系列不同浓度的标准溶液各10μL注入液相色谱-串联质谱仪，质谱扫描模式为多反应监测扫描，扫描[M-79]+子离子；
由“轻”同位素标记的标准品峰面积和相应的内标峰面积之比为纵坐标，“轻”同位素标记的标准品的浓度为横坐标绘制标准曲线，求出各标准曲线的斜率a和截距b；
E.测定
精密吸取步骤B制备得到的所述供试品溶液10μL注入液相色谱-串联质谱仪，在步骤C相同的色谱和质谱条件下，将“轻”同位素标记的含羰基化合物的峰面积和“重”同位素标记的含羰基化合物峰面积之比代入公式1中，计算出测试含羰基化合物在加热不燃烧卷烟中的平均每支含量；
Figure FDA0003708374590000031
其中，m为被测含羰基化合物的平均每支含量，ng/支，
x为“轻”同位素标记的含羰基化合物的峰面积和“重”同位素标记的含羰基化合物峰面积之比，
a和b为标准曲线的斜率和截距，
V为提取液的体积，mL，
n为测试的加热不燃烧卷烟数量，支。
11.根据权利要求10所述的测定方法，其特征在于，所述标准品选自3-羟基-2-丁酮、3-甲基-2-环戊烯-1-酮、2,3-丁二酮、苯甲醛、己醛、4-庚酮、庚醛、壬醛和紫罗兰酮中的一种或多种。
12.根据权利要求11所述的测定方法，其特征在于，所述标准品选自3-羟基-2-丁酮、3-甲基-2-环戊烯-1-酮、2,3-丁二酮、苯甲醛、己醛、4-庚酮、庚醛、壬醛和紫罗兰酮的全部。
13.根据权利要求10所述的测定方法，其特征在于，所述步骤A中，所述标准品各自独立地制备所述标准溶液，或者准确称量后的所述标准品混合后制备所述标准溶液。
14.根据权利要求10所述的测定方法，其特征在于，所述定量测定中，吉拉德试剂P衍生化的各标准品多反应监测扫描参数包括母离子、定量/定性子离子和相应的碰撞能，见下表所示，其中[M-79]+子离子用于定量；
9种含羰基标准品衍生后的多反应监测参数
Figure FDA0003708374590000041
15.权利要求1至14中任一项所述的测定方法在定性和定量测定卷烟烟气中含羰基香味成分中的应用，所述卷烟选自加热不燃烧卷烟或加热燃烧卷烟。
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