CN116773710A - 一种覆盖多种代谢物的代谢组和代谢流的试剂盒和使用方法 - Google Patents

一种覆盖多种代谢物的代谢组和代谢流的试剂盒和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种针对生物样品中含有羰基、含有羧基和含有磷酸基的多种代谢物的代谢组和代谢流分析的试剂盒及其使用方法。所述方法采用3‑硝基苯肼对代谢物进行衍生化后通过液相色谱质谱联用技术检测羰基、羧基和磷酸基代谢物。本发明方法覆盖了含有磷酸基的多种代谢物，扩大了衍生化代谢组学分析技术的代谢物覆盖范围。同时，本发明利用来源于衍生化试剂的质谱裂解碎片作为代谢流分析的定量碎片离子，简化了代谢流分析过程，减少了代谢流分析的工作量，提高了代谢流研究的分析效率。本发明试剂盒包括反应装置、代谢物标准品干燥固体粉末和衍生化试剂包，可以方便、快捷、高通量地实现对生物样品中的多种类代谢物进行代谢组和代谢流分析。

Description

一种覆盖多种代谢物的代谢组和代谢流的试剂盒和使用方法
相关申请
本申请是申请号为202110790654.9，申请日为2021年7月13日，发明名称为“一种覆盖多种代谢物的代谢组和代谢流分析方法和试剂盒”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明属于分析技术领域，具体涉及一种覆盖多种代谢物的代谢组和代谢流分析方法以及用于该方法的试剂盒。
背景技术
代谢研究在疾病的发生发展，分子机制及治疗新靶标的发现等方面起着至关重要的作用。代谢组学以高通量、无偏差的方式全面鉴定和量化生物系统中的内源性小分子(分子量<1,500Da)代谢物，是代谢研究的重要技术。基于液相色谱质谱联用(LC-MS)技术的代谢组学分析平台因其高灵敏度、高特异性的优势已成为最主要的代谢组学分析技术。但是，由于代谢物种类繁多、理化性质多样、浓度差异大，同时，很多具有重要生物学功能的代谢物丰度或质谱检测信号极低，导致LC-MS技术目前对代谢物进行全面覆盖分析仍存在重大技术挑战，成为严重制约代谢研究的瓶颈。
化学衍生化虽然可以提高代谢物的检测灵敏度，但是，一种衍生化试剂通常只能与一种功能基团发生反应，导致目前基于衍生化的代谢组学分析技术对代谢物的覆盖范围仍然非常有限。
鉴于现有的技术中检测灵敏度不足和代谢物种类覆盖少的缺点，需要开发一种能够覆盖多种代谢物、检测灵敏度高，且简单易操作的代谢组和代谢流分析的新方法。
发明内容
为改善上述技术问题，本发明提供了一种能够同时检测生物样品中多种代谢物的代谢组和代谢流分析方法及应用该方法的检测试剂盒。所述的多种代谢物包含了分子结构中含有羰基的代谢物、含有羧基的代谢物和含有磷酸基的代谢物，包括但不限于有机酸类、氨基酸类、糖类、核酸类、肉碱类和维生素类等代谢物。
本发明提供了一种可同时检测生物样品中多种代谢物的代谢组和代谢流分析方法，通过以下方案实现：
采用3-硝基苯肼作为衍生化试剂对生物样本中的代谢物进行衍生化反应得到代谢物衍生物，利用LC-MS(液相色谱-质谱联用)技术进行代谢组和代谢流分析。检测对象包括了含有羰基的、含有羧基的和含有磷酸基的多种代谢物。
根据本发明的实施方案，所述代谢物选自含有羰基的代谢物、含有羧基的代谢物和含有磷酸基的代谢物中的至少一种；优选为含磷酸基的代谢物，即分子结构中包含一个或多个磷酸基团的代谢物。
根据本发明的实施方案，所述含磷酸基的代谢物可选自1,3-二磷酸甘油酸、1-磷酸半乳糖、1-磷酸二氢鞘氨醇、1-磷酸葡萄糖、2,3-二磷酸甘油酸、2’,3’-二脱氧腺苷-5-三磷酸、2-磷酸甘油酸、2-硬脂酰甘油磷酸甘油、3’-腺苷单磷酸、3-磷酸甘油、3-磷酸甘油醛、3-磷酸甘油酸、5-氟脱氧尿苷单磷酸、5’-磷酸吡哆胺、5’-磷酸吡哆醇、5’-磷酸吡哆醛、5’-磷酸核糖基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺、5-胸苷酸、6-甲基巯鸟苷单磷酸、6-甲基巯嘌呤-5’-单磷酸核糖核苷酸、6-磷酸甘露糖、6-磷酸果糖、6-磷酸葡萄糖酸、6-磷酸山梨醇、6-巯黄嘌呤-5’-单磷酸、6-巯肌苷三磷酸、6-巯鸟苷单磷酸、6-巯鸟苷酸、6-巯基肌苷-5’-单磷酸、6-巯基嘌呤核糖核苷-5’-二磷酸、6-巯基嘌呤核糖核苷三磷酸、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸、N-乙酰-氨基葡萄糖-6-磷酸、N-乙酰神经氨酸-9-磷酸、O-磷酸酪氨酸、O-磷酸丝氨酸、O-磷酸苏氨酸、O-磷酸乙醇胺、1-(5’-磷酸核糖)-4-(N-琥珀酰甲酰胺)-5-氨基咪唑、β-甘油磷酸、氨基甲酰磷酸、胞苷2’,3’-环磷酸、胞苷-3’-单磷酸、胞苷单磷酸、二磷酸胞苷、二磷酸鸟苷、二磷酸腺苷、法尼焦磷酸、甘油磷酸胆碱、甘油磷酸甘油、甘油磷酸肌醇、甘油磷酰乙醇胺、钴胺素、果糖-1,6-二磷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、核糖-5-磷酸、核酮糖-5-磷酸、黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、肌醇-1-磷酸、肌苷酸、甲钴胺、景天庚酮糖-7-磷酸、磷酸二甲酯、磷酸二羟丙酮、磷酸二乙酯、磷酸核糖焦磷酸、磷酸肌醇、磷酸肌酸、磷酸甲酯、磷酸丝氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸腺苷、磷酸胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、硫胺素单磷酸、硫胺素焦磷酸、巯黄嘌呤单磷酸、巯鸟苷-5’-二磷酸、巯鸟苷-5’-三磷酸、六磷酸二腺苷、六磷酸肌醇、鸟苷-2’,3’-环磷酸、鸟苷-3’,5’-环磷酸、鸟苷三磷酸、鸟苷一磷酸、尿苷-2’,3’-环磷酸、尿苷-3’-单磷酸、尿苷-5’-单磷酸、尿苷-5’-二磷酸、尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖、尿苷二磷酸半乳糖、尿苷二磷酸葡萄糖、葡萄糖-1,6-二磷酸、葡萄糖-6-磷酸、氰钴胺、三磷酸二腺苷、三磷酸尿苷、三磷酸脱氧腺苷、三磷酸腺苷、四磷酸二腺苷、天冬氨酰-4-磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧尿甘二磷酸、脱氧腺苷单磷酸、五磷酸二腺苷、腺苷-2’,3’-环磷酸、腺苷-3’,5’-环磷酸、烟酰胺核糖醇、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、脱氧胞苷一磷酸、1-磷酸鞘氨醇、1-磷酸鞘氨醇(d16:1-P)、1-磷酸鞘氨醇(d19:1-P)、1-硬脂酰甘油磷酸甘油、1-硬脂酰甘油磷酸丝氨酸、木酮糖-5-磷酸、赤藓糖-4-磷酸、氨基葡萄糖-6-磷酸、尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸、6-磷酸葡萄糖酸-D-内酯、乳清酸、1-磷酸核糖、6-磷酸肌醇、腺苷-3’,5’-二磷酸、甘油磷酸中的至少一种。
根据本发明的实施方案，所述生物样品选自哺乳动物的尿液、血液、脑脊液、组织、细胞、唾液和粪便样本。
根据本发明的实施方案，所述衍生化反应中还可以加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺作为偶联剂。
根据本发明的实施方案，所述衍生化反应中还可以加入碱作为催化剂，所述碱可以为有机碱，例如为吡啶、三乙胺、二异丙基乙胺、N,N-二甲氨基吡啶中的至少一种。
根据本发明的实施方案，该分析方法可采用衍生化试剂特异性碎片离子作为定量离子对涉及的代谢物进行代谢流分析，例如含有羰基的代谢物和含有羧基的代谢物衍生物，选用m/z为137的碎片离子作为定量离子，对于含有磷酸基的代谢物衍生物，选用m/z为232的碎片离子作为定量离子。该方法无需对代谢物的质谱裂解行为进行解析，从而简化了代谢流分析流程。
根据本发明的实施方案，所述代谢流分析代谢物包括了含有羰基的、含有羧基的和含有磷酸基的多种代谢物，优选选自α-酮戊二酸、柠檬酸、富马酸、异柠檬酸、乳酸、马来酸、丙酮酸、琥珀酸、葡萄糖酸、葡萄糖、1,3-二磷酸甘油酸、1-磷酸半乳糖、1-磷酸二氢鞘氨醇、1-磷酸葡萄糖、2,3-二磷酸甘油酸、2’,3’-二脱氧腺苷-5-三磷酸、2-磷酸甘油酸、2-硬脂酰甘油磷酸甘油、3’-腺苷单磷酸、3-磷酸甘油、3-磷酸甘油醛、3-磷酸甘油酸、5-氟脱氧尿苷单磷酸、5’-磷酸吡哆胺、5’-磷酸吡哆醇、5’-磷酸吡哆醛、5’-磷酸核糖基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺、5-胸苷酸、6-甲基巯鸟苷单磷酸、6-甲基巯嘌呤-5’-单磷酸核糖核苷酸、6-磷酸甘露糖、6-磷酸果糖、6-磷酸葡萄糖酸、6-磷酸山梨醇、6-巯黄嘌呤-5’-单磷酸、6-巯肌苷三磷酸、6-巯鸟苷单磷酸、6-巯鸟苷酸、6-巯基肌苷-5’-单磷酸、6-巯基嘌呤核糖核苷-5’-二磷酸、6-巯基嘌呤核糖核苷三磷酸、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸、N-乙酰-氨基葡萄糖-6-磷酸、N-乙酰神经氨酸-9-磷酸、O-磷酸酪氨酸、O-磷酸丝氨酸、O-磷酸苏氨酸、O-磷酸乙醇胺、1-(5’-磷酸核糖)-4-(N-琥珀酰甲酰胺)-5-氨基咪唑、β-甘油磷酸、氨基甲酰磷酸、胞苷2’,3’-环磷酸、胞苷-3’-单磷酸、胞苷单磷酸、二磷酸胞苷、二磷酸鸟苷、二磷酸腺苷、法尼焦磷酸、甘油磷酸胆碱、甘油磷酸甘油、甘油磷酸肌醇、甘油磷酰乙醇胺、钴胺素、果糖-1,6-二磷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、核糖-5-磷酸、核酮糖-5-磷酸、黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、肌醇-1-磷酸、肌苷酸、甲钴胺、景天庚酮糖-7-磷酸、磷酸二甲酯、磷酸二羟丙酮、磷酸二乙酯、磷酸核糖焦磷酸、磷酸肌醇、磷酸肌酸、磷酸甲酯、磷酸丝氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸腺苷、磷酸胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、硫胺素单磷酸、硫胺素焦磷酸、巯黄嘌呤单磷酸、巯鸟苷-5’-二磷酸、巯鸟苷-5’-三磷酸、六磷酸二腺苷、六磷酸肌醇、鸟苷-2’,3’-环磷酸、鸟苷-3’,5’-环磷酸、鸟苷三磷酸、鸟苷一磷酸、尿苷-2’,3’-环磷酸、尿苷-3’-单磷酸、尿苷-5’-单磷酸、尿苷-5’-二磷酸、尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖、尿苷二磷酸半乳糖、尿苷二磷酸葡萄糖、葡萄糖-1,6-二磷酸、葡萄糖-6-磷酸、氰钴胺、三磷酸二腺苷、三磷酸尿苷、三磷酸脱氧腺苷、三磷酸腺苷、四磷酸二腺苷、天冬氨酰-4-磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧尿甘二磷酸、脱氧腺苷单磷酸、五磷酸二腺苷、腺苷-2’,3’-环磷酸、腺苷-3’,5’-环磷酸、烟酰胺核糖醇、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、脱氧胞苷一磷酸、1-磷酸鞘氨醇、1-磷酸鞘氨醇(d16:1-P)、1-磷酸鞘氨醇(d19:1-P)、1-硬脂酰甘油磷酸甘油、1-硬脂酰甘油磷酸丝氨酸、木酮糖-5-磷酸、赤藓糖-4-磷酸、氨基葡萄糖-6-磷酸、尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸、6-磷酸葡萄糖酸-D-内酯、乳清酸、1-磷酸核糖、6-磷酸肌醇、腺苷-3’,5’-二磷酸、甘油磷酸中的至少一种。
根据本发明的实施方案，所述分析方法，包括以下步骤：
(A)衍生化反应：向代谢物提取液中加入相同体积3-硝基苯肼的溶液，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的溶液和碱溶液，混合均匀，待反应完后，得到代谢物衍生物；
(B)代谢组分析：利用LC-MS技术，检测3-硝基苯肼衍生化后的代谢物；
(C)代谢流分析：在LC-MS数据采集时，选择衍生化试剂特异性碎片离子作为代谢物衍生物的定量离子；
根据本发明的实施方案，步骤(A)中所述溶液使用的溶剂可以为有机溶剂，例如醇类溶剂，如甲醇、乙醇、异丙醇中的至少一种；
根据本发明的实施方案，步骤(A)中所述碱可以为有机碱，例如为吡啶、三乙胺、二异丙基乙胺、N,N-二甲氨基吡啶中的至少一种；所示碱溶液可以为碱的醇溶液，所述醇可以为甲醇、乙醇、异丙醇中的至少一种。
根据本发明示例性的实施方案，所述分析方法，包括以下步骤：
(A1)收集生物样本；
(A2)将生物样本用80％(v/v)甲醇-水混合溶液离心后取上清液，得到代谢物提取液；
(A3)衍生化反应：向步骤(2)中的代谢物提取液中依次加入相同体积3-硝基苯肼甲醇溶液，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的甲醇溶液和吡啶-甲醇溶液，混合均匀，待反应完后，得到代谢物衍生物。
(A4)代谢组分析：利用LC-MS技术，检测3-硝基苯肼衍生化后的代谢物；
(A5)代谢流分析：在LC-MS数据采集时，选择衍生化试剂特异性碎片离子作为代谢物衍生物的定量离子。
根据本发明的实施方案，步骤(A2)中不使用卤代溶剂，优选不使用氯代溶剂，更优选不使用二氯甲烷、氯仿和/或四氯化碳。
根据本发明的实施方案，步骤(A3)中，所述3-硝基苯肼的浓度为5-200mM，例如为1-100mM，示例性为35mM；
根据本发明的实施方案，步骤(A3)中，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的浓度为5-200mM，例如为10-100mM，示例性为21mM；
根据本发明的实施方案，步骤(A3)中，所述吡啶的浓度为0.1-2(v/v)，例如为0.2-1％(v/v)，示例性为0.5％(v/v)；
根据本发明的实施方案，步骤(A3)中，所述反应的温度为0-25℃，例如为2-10℃，示例性为4℃；
根据本发明的实施方案，步骤(A3)中，所述反应的时间为5-120min，例如为10-60min，示例性为30min。
根据本发明的实施方案，步骤(A5)中，对于含有羰基的代谢物和含有羧基的代谢物衍生物，优选m/z(质荷比)为137的碎片离子作为定量离子，对于含有磷酸基的代谢物衍生物，优选m/z为232的碎片离子作为定量离子。
根据本发明的实施方案，所述代谢物选自生物样品中的有机酸、氨基酸、糖类、核酸类、肉碱类和维生素类等代谢物。
本发明还提供一种用于实施上述方法的试剂盒。该试剂盒包括反应装置、代谢物标准品干燥固体粉末和衍生化试剂包；
所述衍生化试剂包包含3-硝基苯肼干燥固体粉末、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺干燥固体粉末和吡啶-甲醇溶液；
所述反应装置可以是适用于LC-MS检测的市售48孔板或96孔板；
所述代谢物标准品干燥固体粉末为将代谢物标准品混合溶液等量分装成若干份后冷冻干燥得到的粉末。本领域一般技术人员可理解，用于制备代谢物标准品干燥固体粉末的标准品混合溶液包含两个不同浓度，用于衍生化反应的阳性对照和代谢物液相色谱保留时间的确定。
根据本发明的实施方案，所述代谢物标准品选自有机酸类、氨基酸类、糖类、核酸类、肉碱类和维生素类代谢物标准品之一种或多种。
根据本发明的实施方案，所述标准品可以选自如下所述的成分：1,3-二磷酸甘油酸、1-磷酸半乳糖、1-磷酸二氢鞘氨醇、1-磷酸葡萄糖、2,3-二磷酸甘油酸、2’,3’-二脱氧腺苷-5-三磷酸、2-磷酸甘油酸、2-硬脂酰甘油磷酸甘油、3’-腺苷单磷酸、3-磷酸甘油、3-磷酸甘油醛、3-磷酸甘油酸、5-氟脱氧尿苷单磷酸、5’-磷酸吡哆胺、5’-磷酸吡哆醇、5’-磷酸吡哆醛、5’-磷酸核糖基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺、5-胸苷酸、6-甲基巯鸟苷单磷酸、6-甲基巯嘌呤-5’-单磷酸核糖核苷酸、6-磷酸甘露糖、6-磷酸果糖、6-磷酸葡萄糖酸、6-磷酸山梨醇、6-巯黄嘌呤-5’-单磷酸、6-巯肌苷三磷酸、6-巯鸟苷单磷酸、6-巯鸟苷酸、6-巯基肌苷-5’-单磷酸、6-巯基嘌呤核糖核苷-5’-二磷酸、6-巯基嘌呤核糖核苷三磷酸、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸、N-乙酰-氨基葡萄糖-6-磷酸、N-乙酰神经氨酸-9-磷酸、O-磷酸酪氨酸、O-磷酸丝氨酸、O-磷酸苏氨酸、O-磷酸乙醇胺、1-(5’-磷酸核糖)-4-(N-琥珀酰甲酰胺)-5-氨基咪唑、β-甘油磷酸、氨基甲酰磷酸、胞苷2’,3’-环磷酸、胞苷-3’-单磷酸、胞苷单磷酸、二磷酸胞苷、二磷酸鸟苷、二磷酸腺苷、法尼焦磷酸、甘油磷酸胆碱、甘油磷酸甘油、甘油磷酸肌醇、甘油磷酰乙醇胺、钴胺素、果糖-1,6-二磷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、核糖-5-磷酸、核酮糖-5-磷酸、黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、肌醇-1-磷酸、肌苷酸、甲钴胺、景天庚酮糖-7-磷酸、磷酸二甲酯、磷酸二羟丙酮、磷酸二乙酯、磷酸核糖焦磷酸、磷酸肌醇、磷酸肌酸、磷酸甲酯、磷酸丝氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸腺苷、磷酸胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、硫胺素单磷酸、硫胺素焦磷酸、巯黄嘌呤单磷酸、巯鸟苷-5’-二磷酸、巯鸟苷-5’-三磷酸、六磷酸二腺苷、六磷酸肌醇、鸟苷-2’,3’-环磷酸、鸟苷-3’,5’-环磷酸、鸟苷三磷酸、鸟苷一磷酸、尿苷-2’,3’-环磷酸、尿苷-3’-单磷酸、尿苷-5’-单磷酸、尿苷-5’-二磷酸、尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖、尿苷二磷酸半乳糖、尿苷二磷酸葡萄糖、葡萄糖-1,6-二磷酸、葡萄糖-6-磷酸、氰钴胺、三磷酸二腺苷、三磷酸尿苷、三磷酸脱氧腺苷、三磷酸腺苷、四磷酸二腺苷、天冬氨酰-4-磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧尿甘二磷酸、脱氧腺苷单磷酸、五磷酸二腺苷、腺苷-2’,3’-环磷酸、腺苷-3’,5’-环磷酸、烟酰胺核糖醇、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、脱氧胞苷一磷酸、1-磷酸鞘氨醇、1-磷酸鞘氨醇(d16:1-P)、1-磷酸鞘氨醇(d19:1-P)、1-硬脂酰甘油磷酸甘油、1-硬脂酰甘油磷酸丝氨酸、木酮糖-5-磷酸、赤藓糖-4-磷酸、氨基葡萄糖-6-磷酸、尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸、6-磷酸葡萄糖酸-D-内酯、乳清酸、1-磷酸核糖、6-磷酸肌醇、腺苷-3’,5’-二磷酸、甘油磷酸、α-酮戊二酸、柠檬酸、富马酸、异柠檬酸、乳酸、马来酸、丙酮酸、琥珀酸、葡萄糖酸和/或葡萄糖。
根据本发明的实施方案，所述衍生化试剂包的使用方法为将3-硝基苯肼干燥固体粉末和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的干燥固体粉末均经准确称量后置于玻璃溶剂瓶中，在进行衍生化反应前溶解使用。吡啶-甲醇溶液中吡啶含量为0.1-2％(v/v)，优选含量为0.5％(v/v)。
根据本发明的实施方案，所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(a)将代谢物提取液等量添加于反应装置的各个孔中，记为样本孔；
(b)溶剂溶解代谢物标准品干燥固体粉末，加入到反应装置孔中，记为标准品孔；
(c)溶剂溶解3-硝基苯肼干燥固体粉末和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的干燥固体粉末，等量加入到所述样本孔和标准品孔中；
(d)向所述样本孔和标准品孔中加入碱溶液，反应完成后取样检测，采用所述代谢组分析和代谢流分析。
根据本发明的实施方案，步骤(b)和步骤(c)中所述溶剂可以为有机溶剂，例如醇类溶剂，如甲醇、乙醇、异丙醇中的至少一种；
根据本发明的实施方案，步骤(d)中所述碱可以为有机碱，例如为吡啶、三乙胺、二异丙基乙胺、N,N-二甲氨基吡啶中的至少一种；所示碱溶液可以为碱的醇溶液，所述醇可以为甲醇、乙醇、异丙醇中的至少一种。
根据本发明示例性的实施方案，所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(a1)收集生物样本；
(a2)将生物样本用80％(v/v)甲醇-水混合溶液离心后取上清液，得到代谢物提取液；
(a3)将制得的代谢物提取液等量添加于反应装置的各个孔中，记为样本孔；
(a4)甲醇溶解代谢物标准品干燥固体粉末，加入到反应装置孔中，记为标准品孔；
(a5)甲醇溶解3-硝基苯肼干燥固体粉末和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的干燥固体粉末，等量加入到所述样本孔和标准品孔中；
(a6)再向所述样本孔和标准品孔中加入吡啶-甲醇溶液，0-25℃条件下反应5-120min，取样检测，采用所述代谢组分析和代谢流分析方法。
有益效果
本发明的方法采用3-硝基苯肼进行代谢物的衍生化，可同时检测含羰基、羧基和磷酸基团的代谢物，扩大了对代谢物中广泛存在的各种成分的覆盖范围，因此兼容性更强。
本发明采用了来源于衍生化试剂3-硝基苯肼的质谱裂解碎片作为代谢流分析的定量碎片离子。现有基于MRM数据采集方式的代谢流分析，在数据采集前，需要先对代谢物的质谱裂解行为进行分析，推断代谢物质谱裂解碎片中所含有的同位素标记数目，从而确定碎片离子的质荷比，该工作通常需要花费大量的时间，并且要求分析人员具备质谱裂解相关知识。应用本发明的方法，无需再对代谢物的质谱裂解行为进行解析，从而简化了代谢流分析过程，减少了代谢流分析的工作量，提高了代谢流研究的分析效率。
用于本方法的试剂盒操作简便、分析通量高，可极大地提高代谢分析的工作效率。
附图说明
图1为含磷酸基代谢物结构通式(R为代谢物中除去磷酸基的其它部分，n≥1)。
图2为衍生化试剂盒示意图。
图3为3-硝基苯肼衍生化(A)羰基、(B)羧基和(C)磷酸基代谢物反应通式(R为代谢物中除去羰基、羧基和磷酸基之后余下的部分)。
图4为卵母细胞代谢组主成分分析图。
图5为代谢流分析涉及的碎片离子结构图。
图6为衍生化方法与非衍生化方法代谢流监测离子通道对比。
图7为本发明衍生化反应过程图和碎片离子结构图。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1
在该实施例中示例了首先采用3-硝基苯肼对小鼠卵母细胞中含羰基、羧基和磷酸基的代谢物进行同步衍生化，然后利用LC-MS技术对代谢物衍生物进行分析。
3-硝基苯肼衍生化羰基、羧基和磷酸基团的反应通式如图3所示：
具体实施方式如下：
1.仪器
Shimadzu LC-30AD高效液相色谱仪，Sciex QTRAP 6500+质谱仪，配备电喷雾离子源。
2.样本制备
收集小鼠GV期和MII期卵母细胞各60枚，置于500μL 80％(v/v)甲醇-水溶液中，涡旋1min，在4℃，14000rpm，离心15min，取上清液加入到反应装置的孔中。
3.代谢物标准品溶液配制
取代谢物标准品干燥固体粉末，加入1mL 80％(v/v)甲醇-水溶液，涡旋溶解后，加入到反应装置的孔中。
4.衍生化试剂配制
取3-硝基苯肼干燥固体粉末和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的干燥固体粉末，各加入1mL甲醇溶解。
5.样本衍生化
向上述加入代谢物提取液和标准品溶液的孔中依次加入50μL 3-硝基苯肼甲醇溶液，50μL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺甲醇溶液和50μL吡啶-甲醇溶液，混匀，在4℃条件下反应30min。
6.检测方法
质谱条件：电喷雾离子源采用正负离子切换扫描模式，喷雾电压4500V，离子源温度500℃，雾化气45psi，气帘气25psi，脱溶剂气45psi。
色谱条件：采用HSS T3色谱柱(2.1mm×150mm，1.8μm，Waters)，流动相A是0.03％甲酸-水溶液，流动相B是0.03％甲酸-乙腈溶液。洗脱梯度为：0-1.5min，5％ B；35.5-36min，73-90％ B；39-39.2min，90-5％ B；44min，5％ B。流速为0.3mL/min，柱温为40℃。
7.分析结果
采用本发明的分析方法和试剂盒，对样品量仅为60的小鼠GV期和MII期卵母细胞代谢组进行了检测，如图4所示，主成分分析表明，同一时期的卵母细胞样品聚类较好，两个时期的样品可以明显分开，表明本发明的分析方法具有极高的检测灵敏度，且该分析方法和试剂盒适用于代谢组学分析。
实施例2
在该实施例中示例了采用3-硝基苯肼对HeLa细胞中含羰基、羧基和磷酸基的代谢物进行衍生化后，在代谢流数据采集时选择衍生化试剂特异性碎片离子作为定量离子进行代谢流分析。如图5所示，对于羰基和羧基代谢物衍生物，选用m/z为137的碎片离子作为定量离子，对于磷酸化代谢物衍生物，选用m/z为232的碎片离子作为定量离子。
具体实施方式如下：
1.仪器
Shimadzu LC-30AD高效液相色谱仪，Sciex QTRAP 6500+质谱仪，配备电喷雾离子源。
2.样本制备
分别收集葡萄糖-6-磷酸异构酶野生型和葡萄糖-6-磷酸异构酶敲除型HeLa细胞，置于500μL 80％(v/v)甲醇-水溶液中，涡旋1min，在4℃，14000rpm，离心15min，取上清液加入到反应装置的孔中。
3.代谢物标准品溶液配制
取代谢物标准品干燥固体粉末，加入1mL 80％(v/v)甲醇-水溶液溶液，涡旋溶解后，加入到反应装置的孔中。
4.衍生化试剂配制
取3-硝基苯肼干燥固体粉末和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的干燥固体粉末，各加入1mL甲醇溶解。
5.样本衍生化
向上述加入代谢物提取液和标准品溶液的孔中依次加入50μL 3-硝基苯肼甲醇溶液，50μL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺甲醇溶液和50μL吡啶-甲醇溶液，混匀，在4℃条件下反应30min。
6.检测方法
质谱条件：电喷雾离子源采用负离子切换扫描模式，喷雾电压4500V，离子源温度500℃，雾化气45psi，气帘气25psi，脱溶剂气45psi。
色谱条件：采用HSS T3色谱柱(2.1mm×150mm，1.8μm，Waters)，流动相A是0.03％甲酸的水溶液，流动相B是0.03％甲酸的乙腈溶液。洗脱梯度为：0-1.5min，5％ B；35.5-36min，73-90％ B；39-39.2min，90-5％ B；44min，5％ B。流速为0.3mL/min，柱温为40℃。
7.分析结果
如图6所示，以α-酮戊二酸为例，采用传统的非衍生化方法，在进行数据采集前，首先需要对α-酮戊二酸的质谱裂解行为进行研究，从而推断出每个同位素体在进行质谱裂解后，其碎片离子所含有的同位素标记数量，然后以这些碎片离子作为定量离子进行LC-MS数据采集；而本发明采用衍生化方法后，每个同位素体均能产生相同的来源于3-硝基苯肼的碎片离子，采用该碎片离子作为定量离子，无需再对碎片离子包含的同位素数量进行推断，并且能够减少需要监测的离子通道数量。表1为两组HeLa细胞中代谢物的同位素分布结果，每组包含了5个生物学重复。
表1两组HeLa细胞中代谢物的同位素分布结果
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种试剂盒，包括反应装置、代谢物标准品干燥固体粉末和衍生化试剂包；
所述衍生化试剂包包含3-硝基苯肼干燥固体粉末、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺干燥固体粉末和吡啶-甲醇溶液；
所述反应装置可以是适用于LC-MS检测的市售48孔板或96孔板；
所述代谢物标准品干燥固体粉末为将代谢物标准品混合溶液等量分装成若干份后冷冻干燥得到的粉末；
所述试剂盒能够用于同时检测生物样品中多种代谢物的代谢组和代谢流分析方法，其中，采用3-硝基苯肼作为衍生化试剂对生物样本中的代谢物进行衍生化后利用LC-MS(液相色谱-质谱联用)技术进行代谢组和代谢流分析。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述衍生化试剂包包含3-硝基苯肼干燥固体粉末、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的干燥固体粉末和吡啶-甲醇溶液；优选地，所述吡啶-甲醇溶液中吡啶含量为0.1-2％(v/v)，优选含量为0.5％(v/v)；
优选地，所述代谢物标准品选自有机酸类、氨基酸类、糖类、核酸类、肉碱类和维生素类代谢物中的至少一种；
优选地，所述代谢物标准品选自如下所述的成分：1,3-二磷酸甘油酸、1-磷酸半乳糖、1-磷酸二氢鞘氨醇、1-磷酸葡萄糖、2,3-二磷酸甘油酸、2’,3’-二脱氧腺苷-5-三磷酸、2-磷酸甘油酸、2-硬脂酰甘油磷酸甘油、3’-腺苷单磷酸、3-磷酸甘油、3-磷酸甘油醛、3-磷酸甘油酸、5-氟脱氧尿苷单磷酸、5’-磷酸吡哆胺、5’-磷酸吡哆醇、5’-磷酸吡哆醛、5’-磷酸核糖基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺、5-胸苷酸、6-甲基巯鸟苷单磷酸、6-甲基巯嘌呤-5’-单磷酸核糖核苷酸、6-磷酸甘露糖、6-磷酸果糖、6-磷酸葡萄糖酸、6-磷酸山梨醇、6-巯黄嘌呤-5’-单磷酸、6-巯肌苷三磷酸、6-巯鸟苷单磷酸、6-巯鸟苷酸、6-巯基肌苷-5’-单磷酸、6-巯基嘌呤核糖核苷-5’-二磷酸、6-巯基嘌呤核糖核苷三磷酸、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸、N-乙酰-氨基葡萄糖-6-磷酸、N-乙酰神经氨酸-9-磷酸、O-磷酸酪氨酸、O-磷酸丝氨酸、O-磷酸苏氨酸、O-磷酸乙醇胺、1-(5’-磷酸核糖)-4-(N-琥珀酰甲酰胺)-5-氨基咪唑、β-甘油磷酸、氨基甲酰磷酸、胞苷2’,3’-环磷酸、胞苷-3’-单磷酸、胞苷单磷酸、二磷酸胞苷、二磷酸鸟苷、二磷酸腺苷、法尼焦磷酸、甘油磷酸胆碱、甘油磷酸甘油、甘油磷酸肌醇、甘油磷酰乙醇胺、钴胺素、果糖-1,6-二磷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、核糖-5-磷酸、核酮糖-5-磷酸、黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、肌醇-1-磷酸、肌苷酸、甲钴胺、景天庚酮糖-7-磷酸、磷酸二甲酯、磷酸二羟丙酮、磷酸二乙酯、磷酸核糖焦磷酸、磷酸肌醇、磷酸肌酸、磷酸甲酯、磷酸丝氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸腺苷、磷酸胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、硫胺素单磷酸、硫胺素焦磷酸、巯黄嘌呤单磷酸、巯鸟苷-5’-二磷酸、巯鸟苷-5’-三磷酸、六磷酸二腺苷、六磷酸肌醇、鸟苷-2’,3’-环磷酸、鸟苷-3’,5’-环磷酸、鸟苷三磷酸、鸟苷一磷酸、尿苷-2’,3’-环磷酸、尿苷-3’-单磷酸、尿苷-5’-单磷酸、尿苷-5’-二磷酸、尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖、尿苷二磷酸半乳糖、尿苷二磷酸葡萄糖、葡萄糖-1,6-二磷酸、葡萄糖-6-磷酸、氰钴胺、三磷酸二腺苷、三磷酸尿苷、三磷酸脱氧腺苷、三磷酸腺苷、四磷酸二腺苷、天冬氨酰-4-磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧尿甘二磷酸、脱氧腺苷单磷酸、五磷酸二腺苷、腺苷-2’,3’-环磷酸、腺苷-3’,5’-环磷酸、烟酰胺核糖醇、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、脱氧胞苷一磷酸、1-磷酸鞘氨醇、1-磷酸鞘氨醇(d16:1-P)、1-磷酸鞘氨醇(d19:1-P)、1-硬脂酰甘油磷酸甘油、1-硬脂酰甘油磷酸丝氨酸、木酮糖-5-磷酸、赤藓糖-4-磷酸、氨基葡萄糖-6-磷酸、尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸、6-磷酸葡萄糖酸-D-内酯、乳清酸、1-磷酸核糖、6-磷酸肌醇、腺苷-3’,5’-二磷酸、甘油磷酸、α-酮戊二酸、柠檬酸、富马酸、异柠檬酸、乳酸、马来酸、丙酮酸、琥珀酸、葡萄糖酸、葡萄糖中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，其中的分析方法采用衍生化试剂特异性碎片离子作为定量离子对涉及的代谢物进行代谢流检测和分析；
优选地，所述生物样品选自哺乳动物的尿液、血液、脑脊液、组织、细胞、唾液和粪便样本；
优选地，所述代谢物选自有机酸类、氨基酸类、糖类、核酸类、肉碱类和维生素类代谢物中的至少一种；
优选地，所述衍生化反应中还可以加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺作为偶联剂。
优选地，所述衍生化反应中还可以加入碱作为催化剂，所述碱为有机碱，例如为吡啶、三乙胺、二异丙基乙胺、N,N-二甲氨基吡啶中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中的分析方法包括以下步骤：
(A)衍生化反应：向代谢物提取液中加入相同体积3-硝基苯肼的溶液，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的溶液和碱溶液，混合均匀，待反应完后，得到代谢物衍生物；
(B)代谢组分析：利用LC-MS技术，检测3-硝基苯肼衍生化后的代谢物；
(C)代谢流分析：在LC-MS数据采集时，选择衍生化试剂特异性碎片离子作为代谢物衍生物的定量离子；
优选地，步骤(A)中所述溶液使用的溶剂为有机溶剂，例如醇类溶剂，如甲醇、乙醇、异丙醇中的至少一种；
优选地，步骤(A)中所述碱为有机碱，例如为吡啶、三乙胺、二异丙基乙胺、N,N-二甲氨基吡啶中的至少一种；所示碱溶液可以为碱的醇溶液，所述醇可以为甲醇、乙醇、异丙醇中的至少一种。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的试剂盒，其特征在于，分析方法包括以下步骤：
(A1)收集生物样本；
(A2)将生物样本用80％(v/v)甲醇-水溶液离心后取上清液，得到代谢物提取液；
(A3)衍生化反应：向步骤(A2)中的代谢物提取液中依次加入相同体积3-硝基苯肼甲醇溶液，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的甲醇溶液和吡啶-甲醇溶液，混合均匀，待反应结束后，得到代谢物衍生物。
(A4)代谢组分析：利用LC-MS技术，检测3-硝基苯肼衍生化后的代谢物；
(A5)代谢流分析：在LC-MS数据采集时，选择衍生化试剂特异性碎片离子作为代谢物衍生物的定量离子进行代谢流分析；
优选地，步骤(A3)中，所述3-硝基苯肼的浓度为5-200mM，例如为1-100mM；
优选地，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的浓度为5-200mM，例如为10-100mM；
优选地，所述吡啶的浓度为0.1-2％(v/v)，例如为0.2-1％(v/v)；
优选地，反应温度为0-25℃，例如为2-10℃；
优选地，反应的时间为5-120min，例如为10-60min。
6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述定量离子为3-硝基苯肼碎片离子。
7.根据权利要求1-6任一项所述的试剂盒，其特征在于，对于含有羰基的代谢物衍生物和含有羧基的代谢物衍生物，以m/z为137的碎片离子作为定量离子，对于含有磷酸基的代谢物衍生物，以m/z为232的碎片离子作为定量离子。
8.根据权利要求1-7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述代谢物选自含有羰基的代谢物、含有羧基的代谢物和含有磷酸基的代谢物；优选为含磷酸基的代谢物；
优选地，所述含磷酸基的代谢物为分子结构中包含一个或多个磷酸基团的代谢物。
9.根据权利要求1-8任一项所述的试剂盒，其特征在于，代谢流分析代谢物优选选自α-酮戊二酸、柠檬酸、富马酸、异柠檬酸、乳酸、马来酸、丙酮酸、琥珀酸、葡萄糖酸、葡萄糖、1,3-二磷酸甘油酸、1-磷酸半乳糖、1-磷酸二氢鞘氨醇、1-磷酸葡萄糖、2,3-二磷酸甘油酸、2’,3’-二脱氧腺苷-5-三磷酸、2-磷酸甘油酸、2-硬脂酰甘油磷酸甘油、3’-腺苷单磷酸、3-磷酸甘油、3-磷酸甘油醛、3-磷酸甘油酸、5-氟脱氧尿苷单磷酸、5’-磷酸吡哆胺、5’-磷酸吡哆醇、5’-磷酸吡哆醛、5’-磷酸核糖基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺、5-胸苷酸、6-甲基巯鸟苷单磷酸、6-甲基巯嘌呤-5’-单磷酸核糖核苷酸、6-磷酸甘露糖、6-磷酸果糖、6-磷酸葡萄糖酸、6-磷酸山梨醇、6-巯黄嘌呤-5’-单磷酸、6-巯肌苷三磷酸、6-巯鸟苷单磷酸、6-巯鸟苷酸、6-巯基肌苷-5’-单磷酸、6-巯基嘌呤核糖核苷-5’-二磷酸、6-巯基嘌呤核糖核苷三磷酸、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸、N-乙酰-氨基葡萄糖-6-磷酸、N-乙酰神经氨酸-9-磷酸、O-磷酸酪氨酸、O-磷酸丝氨酸、O-磷酸苏氨酸、O-磷酸乙醇胺、1-(5’-磷酸核糖)-4-(N-琥珀酰甲酰胺)-5-氨基咪唑、β-甘油磷酸、氨基甲酰磷酸、胞苷2’,3’-环磷酸、胞苷-3’-单磷酸、胞苷单磷酸、二磷酸胞苷、二磷酸鸟苷、二磷酸腺苷、法尼焦磷酸、甘油磷酸胆碱、甘油磷酸甘油、甘油磷酸肌醇、甘油磷酰乙醇胺、钴胺素、果糖-1,6-二磷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、核糖-5-磷酸、核酮糖-5-磷酸、黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、肌醇-1-磷酸、肌苷酸、甲钴胺、景天庚酮糖-7-磷酸、磷酸二甲酯、磷酸二羟丙酮、磷酸二乙酯、磷酸核糖焦磷酸、磷酸肌醇、磷酸肌酸、磷酸甲酯、磷酸丝氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸腺苷、磷酸胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、硫胺素单磷酸、硫胺素焦磷酸、巯黄嘌呤单磷酸、巯鸟苷-5’-二磷酸、巯鸟苷-5’-三磷酸、六磷酸二腺苷、六磷酸肌醇、鸟苷-2’,3’-环磷酸、鸟苷-3’,5’-环磷酸、鸟苷三磷酸、鸟苷一磷酸、尿苷-2’,3’-环磷酸、尿苷-3’-单磷酸、尿苷-5’-单磷酸、尿苷-5’-二磷酸、尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖、尿苷二磷酸半乳糖、尿苷二磷酸葡萄糖、葡萄糖-1,6-二磷酸、葡萄糖-6-磷酸、氰钴胺、三磷酸二腺苷、三磷酸尿苷、三磷酸脱氧腺苷、三磷酸腺苷、四磷酸二腺苷、天冬氨酰-4-磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧尿甘二磷酸、脱氧腺苷单磷酸、五磷酸二腺苷、腺苷-2’,3’-环磷酸、腺苷-3’,5’-环磷酸、烟酰胺核糖醇、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、脱氧胞苷一磷酸、1-磷酸鞘氨醇、1-磷酸鞘氨醇(d16:1-P)、1-磷酸鞘氨醇(d19:1-P)、1-硬脂酰甘油磷酸甘油、1-硬脂酰甘油磷酸丝氨酸、木酮糖-5-磷酸、赤藓糖-4-磷酸、氨基葡萄糖-6-磷酸、尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸、6-磷酸葡萄糖酸-D-内酯、乳清酸、1-磷酸核糖、6-磷酸肌醇、腺苷-3’,5’-二磷酸、甘油磷酸中的至少一种。
10.权利要求1至9中任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)将代谢物提取液等量添加于反应装置的各个孔中，记为样本孔；
(b)溶剂溶解代谢物标准品干燥固体粉末，加入到反应装置孔中，记为标准品孔；
(c)溶剂溶解3-硝基苯肼干燥固体粉末和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的干燥固体粉末，等量加入到所述样本孔和标准品孔中；
(d)向所述样本孔和标准品孔中加入碱溶液，反应完成后取样检测，采用所述代谢组分析和代谢流分析。
优选地，步骤(b)和步骤(c)中所述溶剂为有机溶剂，例如醇类溶剂，如甲醇、乙醇、异丙醇中的至少一种；
优选地，步骤(d)中所述碱为有机碱，例如为吡啶、三乙胺、二异丙基乙胺、N,N-二甲氨基吡啶中的至少一种；所示碱溶液可以为碱的醇溶液，所述醇可以为甲醇、乙醇、异丙醇中的至少一种。
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