CN109406687B - 一种高通量检测双磷脂的方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开一种高通量检测双磷脂的方法，所述方法包括：将双磷脂标准品和磷脂酰甘油标准品分别衍生化，使用液相色谱串联质谱对所述双磷脂和所述磷脂酰甘油标准品进行分离、检测，建立关于所述双磷脂的高通量液相色谱串联质谱数据库；将样品衍生化，使用液相色谱串联质谱对所述样品进行分离、检测，获得所述样品的双磷脂特征性离子；将获得的所述双磷脂特征性离子在所述高通量液相色谱串联质谱数据库中进行搜索，获得所述样品中关于所述双磷脂的信息。本申请通过建立高分辨数据库，可实现对BMP的高通量分析，而衍生化方法不仅提高了BMP的信号强度，而且降低了同分异构体的干扰，提高了数据分析结果的准确性以及数据分析结果的可重复性。

Description

一种高通量检测双磷脂的方法

技术领域

本申请涉及分析化学领域，尤其但不限于涉及一种基于超高效液相色谱/高分辨质谱进行高通量检测双磷脂的方法。

背景技术

双磷脂Bis(monoacylglycero)phosphate(BMP)和磷脂酰甘油phosphatidylglycerol(PG)是结构上的同分异构体，但在生物体内有着不同的生物功能。PG是一类酸性磷脂并且是细胞膜的重要组成成分；BMP是一类靶向于晚期胞内体和溶酶体的内膜上，常被用于检测这些细胞器的标志物。BMP的独特结构使它能够抵抗大多数磷脂酶的降解，研究结果表明BMP的升高与多种疾病有着密切的关系。因此，越来越多的人关注BMP和疾病的关系。BMP类物质的代谢轮廓分析对研究人生命科学、疾病的进程等都有重要的研究意义。

BMP和PG的结构式如下，两者互为同分异构体，在缺少标准品的情况下色谱上很难区分开，正离子模式的二级碎片缺少脂肪酸链信息无法进一步定性，负离子模式虽然有脂肪酸链的信息，但二级碎片信息一致很难将其区分开。BMP的疏水端倾向于连接多不饱和脂肪酸，而PG更倾向于连接饱和或者单不饱和脂肪酸，但生物样本中脂肪酸链和双键数的组合使BMP的检测变得更加复杂。然而，迄今为止还没有基于液相色谱质谱联用(liquidChromatograph Mass Spectrometry，LC-MS)高通量BMP分析的报道。

发明内容

以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。

本申请提供了一种在液相色谱串联质谱仪上进行高通量检测BMP的方法，首先建立关于BMP的高通量液相色谱串联质谱数据库，然后通过将待测样品衍生化，样品中的BMP和PG的二级碎片显示出差异达到特异性鉴定BMP的方法，从而可以实现复杂样本中BMP的高通量检测。

具体地，本申请提供了一种高通量检测BMP的方法，所述方法包括：

将BMP标准品和PG标准品分别衍生化，使用液相色谱串联质谱对所述BMP标准品和所述PG标准品进行分离、检测，建立关于所述BMP的高通量液相色谱串联质谱数据库；

将样品衍生化，使用液相色谱串联质谱对所述样品进行分离、检测，获得所述样品的BMP特征性离子；

将获得的所述BMP特征性离子在所述高通量液相色谱串联质谱数据库中进行搜索，获得所述样品中关于所述BMP的信息。

在本申请的实施方案中，使用超高效液相色谱串联高分辨质谱对所述BMP标准品、所述PG标准品和所述样品进行分离、检测。

在本申请的实施方案中，所述衍生化试剂为三甲基硅烷化重氮甲烷。

在本申请的实施方案中，所述衍生化如下进行：反应加入甲基叔丁基醚、甲醇和水以及三甲基硅烷化重氮甲烷的混合液，反应条件为20℃-80℃，反应30分钟-120分钟，酸终止反应后，离心旋干备用。

在本申请的实施方案中，可选地，甲基叔丁基醚、甲醇、水、三甲基硅烷化重氮甲烷按200∶60∶50∶30的体积比添加。

在本申请的实施方案中，在衍生化反应中，可以用甲酸或乙酸终止反应。

在本申请的实施方案中，建立关于所述BMP的高通量液相色谱串联质谱数据库包括：BMP标准品和PG标准品的制备，BMP标准品和PG标准品的衍生化，BMP标准品和PG标准品的前处理，BMP标准品和PG标准品的液相色谱分离，BMP标准品和PG标准品的串联质谱检测，特征性离子碎片信息提取，以及高通量液相色谱串联质谱数据库建立。具体地，建立关于所述BMP的高通量液相色谱串联质谱数据库包括：

(1)标准品的制备：将BMP和PG的标准品分别用二氯甲烷∶甲醇＝2∶1溶解然后稀释到5μg/mL，吹干后备用；

(2)衍生化反应：将MP和PG的标准品溶液分别进行衍生化反应，衍生化试剂为三甲基硅烷化重氮甲烷，衍生化条件为：加入甲基叔丁基醚、甲醇和水以及三甲基硅烷化重氮甲烷的混合液，20℃-80℃，反应30分钟-120分钟，用甲酸或乙酸终止反，离心旋干备用，可选地，甲基叔丁基醚、甲醇、水、三甲基硅烷化重氮甲烷按200∶60∶50∶30的体积比添加；

(3)样品前处理：将衍生化后的标准品用氯仿甲醇2∶1(v∶v)的复溶试剂溶解，离心取上清转移到上样瓶中；

(4)液相色谱分离：利用与质谱串联的超高效液相色谱(Ultra High PerformanceLiquid Chromatography，UHPLC)及相应的流动相，在反向色谱柱C18分析柱上对衍生化标准品进行检测，液相色谱条件包括：色谱柱：Waters，色谱柱温：30℃；进样量lμl-5μl；流速：0.2ml/min；流动相组成：A相为10mM醋酸铵溶液和60％(v∶v)乙腈水溶液，B相为异丙醇，洗脱梯度如表1。

表1液相色谱分离的洗脱梯度

	时间	流速(mL/min)	A％	B％
					1	0	0.2	5	95
2	3	0.2	5	95
					3	20	0.2	95	5
4	24	0.2	95	5
					5	25	0.2	5	95
6	30	0.2	5	95

(5)串联质谱检测：将色谱分离后的标准品进入到质谱仪进行检测，利用高分辨质谱仪中的数据依懒性采集模式检测，质谱检测条件如下：一级全扫描模式分辨率：70000，二级碎片分辨率：17000。源参数如下：喷淋电压：3000伏；毛细管温度：320℃；加热器温度：300℃；鞘气流速：35arb；辅助气体流量：10arb。

(6)通过定性分析软件Xcalibur提取标准品采集所获得的PG和BMP的特征性碎片信息，选择出不同于PG离子的BMP特异的定性离子作为BMP鉴定的特征性碎片，将获得的母离子、特征碎片的信息输入到高分辨质谱仪工作站，依此建立BMP特征性碎片数据库用来进行高通量BMP分析。

在本申请的实施方案中，所述特征性离子碎片信息提取包括通过定性分析软件提取所述BMP和所述PG标准品衍生化物的母离子、碎片离子及保留时间信息，其中将BMP正离子模式中母离子对应的子离子的单酰基甘油磷酸酯中性丢失选为特征子离子，负离子模式中脂肪酸链碎片和单酰基甘油中性丢失选为特征离子。

在本申请的实施方案中，在所述正离子模式中，所述BMP的母离子为脂肪酸链14∶0至24∶4的所有分子，碎片离子包括单酰基甘油磷酸酯中性丢失，特征子离子为该中性丢失；在所述负离子模式中，所述BMP的母离子为脂肪酸链14∶0至24∶4的所有分子，碎片离子包括脂肪酸链碎片和单酰基甘油中性丢失，特征子离子为脂肪酸链碎片和中性丢失。

在本申请中，提到“脂肪酸链14∶0至24∶4”中的比值指的是，碳原子数与双键数的比值，例如脂肪酸链14∶0至24∶4指的是碳原子数14至24中的双键数从0至4的所有脂肪酸。

在本申请的实施方案中，在所述高通量检测BMP的方法中，使用液相色谱串联质谱对样品进行分离、检测包括：

(1)样品制备：称取新鲜的组织样品100mg，加入1mL氯仿∶甲醇＝2∶1溶液，匀浆5分钟，加入500μl超纯水，涡旋，静置10分钟，重复3次，3000rpm离心20分钟，取有机相转移到新的样品管中，氮气吹干备用；

(2)衍生化：将上述获得的样品进行衍生化反应，以提高样品在质谱上的信号响应，同时可以更好的与同分异构体分开，衍生化试剂为三甲基硅烷化重氮甲烷，衍生化条件为：加入甲基叔丁基醚、甲醇和水以及三甲基硅烷化重氮甲烷的混合液，20℃-80℃，反应30分钟-120分钟，用甲酸或乙酸终止反，离心旋干备用，可选地，甲基叔丁基醚、甲醇、水、三甲基硅烷化重氮甲烷按200∶60∶50∶30的体积比添加；

(3)样品前处理：将衍生化后的样品用仿甲醇2∶1(v∶v)的复溶试剂溶解，离心取上清转移到上样瓶中；

(4)液相色谱分离：利用与质谱串联的UHPLC及相应的流动相，在反向色谱柱C18分析柱上对样品进行分离，液相色谱条件包括：色谱柱：Waters，色谱柱温：30℃；进样量1μl-5μl；流速：0.2ml/min；流动相组成：A相为10mM醋酸铵溶液和60％(v∶v)乙腈水溶液，B相为异丙醇，洗脱梯度如表1。

(5)串联质谱检测：色谱分离后的样品进入到质谱进行检测，利用高分辨质谱仪中的数据依懒性采集模式检测，质谱检测条件如下：一级全扫描模式分辨率：70000，二级碎片分辨率：17000。源参数如下：喷淋电压：3000伏；毛细管温度：320℃；加热器温度：300℃；鞘气流速：35arb；辅助气体流量：10arb。

在本申请的实施方案中，所述数据库的建立包括将所述特征离子的母离子、特征子离子、保留时间等信息输入到液相色谱串联质谱工作站；将液相色谱串联质谱的色谱条件和质谱参数输入到工作站，在实际样本中用数据依赖性采集模式监控扫描，获得相应的谱图，然后通过定量分析软件Tracefinder对色谱图进行色谱峰积分，碎片匹配，得到标准品衍生化物及其丰度信息，建立基于液相色谱串联质谱的高通量双磷脂的分析方法。

在本申请的实施方案中，将报告的BMP含量丰富的组织样品采集的信息搜索建立的本地数据库，得到待测样本所含代谢物及其含量信息。

在本申请的实施方案中，考察所述方法的重复性。

在本申请的实施方案中，不同浓度的标准品(2ng/mL、10ng/mL、40ng/mL、200ng/mL、1ug/mL、4μg/mL、20μg/mL、100μg/mL)通过定性软件对获得的色谱峰进行色谱峰积分，用于评价衍生化方法的稳定性。

本申请的高通量液相色谱串联质谱法检测BMP的方法具有以下优势：

(1)衍生化方法稳定，且有良好的线性；

(2)排除同分异构体PG的干扰

(3)衍生化之后可以直接用液相色谱质谱连用仪检测，前处理步骤简单，通过衍生化之后可以显著提高检测灵敏度如图1；

(4)采用高通量液相色谱质谱连用仪进行检测，检测灵敏度高，特异性好，操作简单。BMP的数据库建立可以达到高通量分析的目的。

本申请的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本申请而了解。本申请的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

附图说明

附图用来提供对本申请技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请技术方案的限制。

图1：BMP标准品衍生化前后质谱信号对比图。

图2：本申请的高通量检测BMP的方法的流程示意图。

图3：负离子模式的二级质谱图。图3A为BMP的二级质谱图，图3B为PG的二级质谱图，图3C为衍生化之后的BMP二级质谱图，图3D为衍生化之后PG的二级质谱图。

图4：正离子模式的二级质谱图。图4A为衍生化后的BMP的二级质谱图，图4B为衍生化后PG的二级质谱图。

图5：BMP标准品衍生化之后的线性评价。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将结合附图对本申请的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。

实施例1

基于超高效液相-obitrap质谱仪的高通量分析方法的建立

基于超高效液相-obitrap质谱仪的高通量分析方法的建立流程如图2，具体实施步骤如下：

标准品BMP和PG以及相应的内标均采购自avanti公司。标准品首先用三氯甲烷甲醇混合液溶解，然后保存在低温环境下(-20℃～80℃)，需要进行样品实际检验或者标准曲线制备时，再利用二氯甲烷甲醇混合液稀释至所需浓度为工作液。

1.样品制备与预处理：

BMP标准品和PG标准品的制备：取100μl浓度为5μg/mL BMP和PG标准品、内标工作液等比例混合后转移到新的1.5mL EP管用氮吹仪吹干；往1.5mL的上述EP管中的BMP和PG标准品加入400μl甲基叔丁基醚、甲醇和水的混合液，重悬后加入50μl三甲基硅烷化重氮甲烷，混匀30s后20℃-60℃反应30分钟；反应完后通过加入5μl冰乙酸终止反应，加入500μl甲基叔丁基醚、甲醇和水的混合液，涡旋混合后在12000rpm，常温离心10分钟，取上清液800μl转移到新的1.5mL EP管中，旋干；将衍生化后的样品用复溶试剂溶解，离心取上清转移到上样瓶中，等待上机分析。

样品制备：取新鲜组织样品100mg，加入氯仿∶甲醇＝2∶1溶液1mL，匀浆5分钟，加入500μl超纯水，涡旋，静置10分钟，重复3次，3000rpm离心20分钟，取有机相转移到新的样品管中，氮气吹干。进行衍生化反应；将衍生化后的样品用复溶试剂溶解，离心取上清转移到上样瓶中，等待上机分析。

2.衍生化物自动二级质谱数据采集：

液相色谱分离：将旋干的BMP和PG标准品用100μl二氯甲烷甲醇(2∶1，v∶v)混合液复溶样品配置成5μg/mL的溶液，离心后取上清转移到新的上样瓶中，利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在反向C18分析柱上对样品上清液中的BMP和PG进行色谱洗脱分离，通过控制洗脱条件，分离出BMP和相同链长的同分异构体PG；

液相色谱条件为：色谱柱Waters Cortecs C18 Column：2.1×100mm，粒度：1.6μm；色谱柱柱温：40℃；进样量2μl；流速：0.22mL/min；流动相组成：A相为10mM醋酸铵溶液和60％(v∶v)乙腈水溶液，B相为异丙醇；洗脱梯度如表1。

质谱检测：液相色谱上分离出的BMP和PG衍生化物进入到高分辨质谱进行检测，利用高分辨质谱的数据依赖性采集模式检测代谢物。质谱分别采用正离子模式和负离子模式，正离子扫描范围m/z 240-2000，负离子扫描范围为m/z 200-2000，一级全扫描模式分辨率：70000，二级碎片分辨率：17500，分别在碰撞能为15NEC、30NEC、45NEC的条件下进行自动二级质谱扫描。源参数如下：喷淋电压：3000伏；毛细管温度：320℃；加热器温度：300℃；鞘气流速：35arb；辅助气体流量：10arb。

3.特征离子碎片信息提取

通过定性分析软件Xcalibur提取衍生化物的母离子、碎片离子及保留时间信息。经过PG和BMP子离子的对比发现：在正离子中，BMP的特征子离子包括单酰基甘油磷酸酯中性丢失；在负离子模式中，BMP的碎片离子包括脂肪酸链碎片和单酰基甘油中性丢失，特征子离子为脂肪酸链碎片和中性丢失。特征离子选择的具体过程如图3。

4.基于UHPLC/Obitrap的数据库分析方法建立

将上述特征离子对的母离子、特征子离子、保留时间等信息输入到UHPLC/Obitrap工作站。洗脱梯度和其他色谱条件与上述一致，将色谱条件和质谱参数输入到工作站，在实际样本中用数据依赖性采集模式监控扫描，获得相应的谱图，然后通过定量分析软件Tracefinder对色谱图进行面积积分，碎片匹配，得到待测样本所含的代谢物及其含量信息，建立基于UHPLC-obitrap的高通量双磷脂的分析方法。

对比例

图3为基于UHPLC/Obitrap的高通量双磷脂分析。按照实施例1的方法，但不对样品进行衍生化，获得BMP和PG的二级质谱，如图3A和3B。

从图3可以看出，BMP和PG的二级碎片是一样的，所以互为同分异构体的两者是无法直接从二级上区分开的。

图3C和3D为BMP与PG标品衍生化后的色谱图。经过衍生化之后BMP和PG可以明显的区分开，并且BMP的特征性碎片可以用来鉴定BMP的脂质分子。

实施例2：基于UHPLC/Obitrap的高通量双磷酸检测方法学考察

将组织样本混合成质量控制(Quality Control，QC)样本，按下述不同考察对象分别进行预处理。

分析方法的重复性考察

取50mg新鲜组织样品，加入500ul氯仿∶甲醇∶水混合液(20∶10∶5，v∶v∶v)提取脂质，取有机相转移到新的样品管中吹干，用衍生化试剂四甲基硅烷进行衍生化反应后旋干。旋干样品重溶于100μl氯仿甲醇混合液中，用于液质连用分析。平行做8个QC组织样本的重复处理。

将8个QC样本在UHPLC/Obitrap平台进行BMP的高通量分析。对所测得数据利用Tracfinder软件进行峰匹配，得到BMP脂质分子9个，利用获得的9个双磷脂对UHPLC/Obitrap平台做方法重复性考察。

结果显示平均相对标准偏差为22％，其中峰面积相对标准偏差小于20％的BMP占66.7％。从这个结果可以看出，高通量双磷脂的检测方法经过脂质的提取，双磷酸脂的甲基化、仪器检测一系列的操作后仍然具有良好的重复性。

分析方法线性考察

分别配置2ng/mL、10ng/mL、40ng/mL、200ng/mL、1ug/mL、4ug/mL、20ug/mL、100ug/mL的不同浓度的BMP(18∶0)溶液，与内标BMP(14∶0)进行1∶1比例混合，衍生化之后旋干，旋干样品用100μl氯仿甲醇混合液溶解，用于样品分析，考察BMP检测方法的线性范围。

如图4所示，在UHPLC/Obitrap平台运用Xcalibur软件对峰面积进行积分，以标准品BMP与内标的比值与浓度做相关性分析，在相关系数大于0.9972时，线性范围10ng/mL～50μg/mL，从结果可以看出，该方法有很好的线性范围，内标法的运用可以排除基质和提取效率的干扰。

讨论

本申请公开了一种基于超高效液相色谱/轨道离子阱质谱数据依赖采集模式进行BMP高通量分析的方法。本申请首先通过超高效液相色谱/轨道离子阱质谱的全扫描模式采集衍生化后标准品的质谱信息，找到特征性离子碎片信息和m/z信息，根据离子碎片信息推测带不同脂肪酸链信息的BMP的特征离子碎片，将所有信息汇总整合得到BMP的高分辨数据库，然后通过定量分析软件对待测样品的谱图进行碎片匹配及色谱峰提取，得到待测样品中BMP的定量信息，从而建立超高效液相色谱/轨道离子阱质谱的数据依赖性的双磷脂的高通量分析方法。

本申请通过建立本地高分辨数据库，可实现对BMP的高通量分析，而稳定的衍生化的方法不仅提高了BMP的信号强度，而且降低了同分异构体的干扰，提高了数据分析结果的准确性以及数据分析结果的可重复性。

虽然本申请所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本申请而采用的实施方式，并非用以限定本申请。任何本申请所属领域内的技术人员，在不脱离本申请所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本申请的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。

Claims (3)

1.一种高通量检测双磷脂的方法，所述方法包括：

将双磷脂标准品和磷脂酰甘油标准品分别衍生化，使用液相色谱串联质谱对所述双磷脂标准品和所述磷脂酰甘油标准品进行分离、检测，建立关于双磷脂的高通量液相色谱串联质谱数据库；

将样品衍生化，使用液相色谱串联质谱对所述样品进行分离、检测，获得所述样品的双磷脂特征性离子；

将获得的所述双磷脂特征性离子在所述高通量液相色谱串联质谱数据库中进行搜索，获得所述样品中关于所述双磷脂的信息；

其中，使用超高效液相色谱串联高分辨质谱对所述双磷脂标准品和所述磷脂酰甘油标准品以及所述样品进行分离、检测；

所述衍生化所采用的衍生化试剂为三甲基硅烷化重氮甲烷；

所述衍生化如下进行：加入甲基叔丁基醚、甲醇和水以及三甲基硅烷化重氮甲烷的试剂混合液，反应条件为20℃-80℃，反应时间为30分钟-120分钟，用甲酸或乙酸终止反应后，离心旋干备用；

所述建立关于双磷脂的高通量液相色谱串联质谱数据库包括：双磷脂标准品和磷脂酰甘油标准品的制备，双磷脂标准品和磷脂酰甘油标准品的衍生化，双磷脂标准品和磷脂酰甘油标准品的前处理，双磷脂标准品和磷脂酰甘油标准品的液相色谱分离，双磷脂标准品和磷脂酰甘油标准品的串联质谱检测，特征性离子碎片信息提取，以及高通量液相色谱串联质谱数据库建立；

所述特征性离子碎片信息提取包括通过定性分析软件提取所述双磷脂标准品和所述磷脂酰甘油标准品衍生化物的母离子、碎片离子及保留时间信息，其中，将双磷脂正离子模式中母离子对应的子离子的单酰基甘油磷酸酯中性丢失选为特征子离子，负离子模式中脂肪酸链碎片和单酰基甘油中性丢失选为特征离子；

在所述正离子模式中，所述双磷脂的母离子为脂肪酸链14:0至24:4的所有分子，碎片离子包括单酰基甘油磷酸酯中性丢失，特征子离子为所述单酰基甘油磷酸酯中性丢失；在所述负离子模式中，所述双磷脂的母离子为脂肪酸链14:0至24:4的所有分子，碎片离子包括脂肪酸链碎片和单酰基甘油中性丢失，特征子离子为所述脂肪酸链碎片和单酰基甘油中性丢失；

所述液相色谱串联质谱的液相色谱条件为：色谱柱Waters Cortecs C18柱：2.1×100mm；粒度：1.6μm；色谱柱柱温：40℃；进样量2μl；流动相组成：A相为10mM醋酸铵溶液和60％(v:v)乙腈水溶液，B相为异丙醇；

梯度洗脱程序如下：

2.根据权利要求1所述的高通量检测双磷脂的方法，其中所述高通量液相色谱串联质谱数据库的建立包括将所述特征离子对应的母离子、特征子离子、保留时间信息输入到液相色谱串联质谱工作站。

3.根据权利要求1所述的高通量检测双磷脂的方法，其中，所述液相串联质谱分别采用正离子模式和负离子模式，正离子扫描范围为m/z 240-2000，负离子扫描范围为m/z 200-2000，一级全扫描模式分辨率：70000，二级碎片分辨率：17500，分别在碰撞能为15NCE、30NCE、45NCE的条件下进行自动二级质谱扫描，源参数如下:喷淋电压:3000伏；毛细管温度；320℃；加热器温度；300℃；鞘气流速：35arb；辅助气体流量：10arb。

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