CN112881567A - 一种细胞中高丰度和低丰度分类的磷脂化合物的检测方法和应用 - Google Patents

一种细胞中高丰度和低丰度分类的磷脂化合物的检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物样品材料和分析技术领域，公开了一种细胞中高丰度和低丰度分类磷脂化合物的检测方法。本发明采用UPLC‑QqQ MS技术，通过UPLC使细胞中的磷脂类成分快速、有效地分离；采用ESI的正、负离子扫描模式，在多反应监测模式下，对细胞中甘油磷脂类成分进行分析，共检测到218种磷脂化合物，其中包括44种PC、LPC；37种PE、LPE；38种PI、LPI；24种PG；27种PA、LPA等，该方法具有高特异性、高灵敏度的特点，可作为细胞、血清等生物复杂体系分离分析的有效手段，为磷脂代谢组学的研究奠定了基础。

Description

一种细胞中高丰度和低丰度分类的磷脂化合物的检测方法和 应用
技术领域
本发明属于生物样品材料和分析技术领域，涉及一种细胞中高丰度和低丰度分类的磷脂化合物的检测方法和应用，可实现快速准确分析细胞中高丰度和低丰度分类的系列磷脂化合物。
背景技术
磷脂是细胞膜的主要组成成分，参与细胞信号转导、膜固定及底物转运等多种重要的代谢活动。多项研究表明磷脂在很多疾病如恶性肿瘤、阿尔兹海默症和肥胖等的发生发展中有着重要的作用，可作为潜在的生物标记物。磷脂可分为甘油磷脂和鞘磷脂两大类，其中甘油磷脂根据极性头基的不同，又可以分为磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酸(PA)和磷脂酰肌醇(PI)等六大类[1]。目前研究发现，哺乳细胞中的主要甘油磷脂有PC、PE、PS、PI和PG五类[2]，其中，PC和PE占到已发现总磷脂的3/4左右。其中已鉴别出1000多种磷脂类成分[3]。
由于极性头基、脂肪酸链的多样性，磷脂的种类多而繁杂。而这些结构上的多样性为磷脂分析鉴定带来了一定的挑战。主要是来自技术的各种限制，包括建立合适的处理、提取、分离、分析磷脂的流程等。但是随着仪器技术的发展，质谱、核磁共振及其他光谱手段为磷脂组学的分析研究提供了可能。
近年来，高效液相色谱串联质谱技术，特别是具有超高的选择性和灵敏度的三重四级杆质谱仪，被广泛应用于定量脂质组学的相关研究中。三重四级杆质谱可采用多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式。该模式在同一色谱时间里可以通过不同离子对快速切换扫描来完成多个反应的监测，实现复杂基质中特定物质的监测和定量，避免共洗脱物的干扰。因而检测得到的分子具有高灵敏度和高特异性的特点，尤其适用于低丰度物质的定量检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够快速准确检测细胞中高丰度和低丰度分类的磷脂化合物的方法。采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪，在多反应监测下分析细胞中高丰度和低丰度分类的磷脂化合物，实现复杂基质中特定物质的监测和定量，避免共洗脱物的干扰。因而检测得到的分子具有高灵敏度和高特异性的特点，尤其适用于低丰度物质的定量检测。
本发明采用的UPLC-QqQ MS技术，通过UPLC使细胞中的磷脂类成分快速、有效地分离；采用ESI的正、负离子扫描模式，对细胞中甘油磷脂类成分进行分析；最终建立高特异性、高灵敏度的目标磷脂组学分析方法，可作为细胞、血清等生物复杂体系分离分析的有效手段，为磷脂代谢组学的研究奠定了基础。
为了解决上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提出了一种能够快速准确检测细胞中高丰度和低丰度分类的磷脂化合物的方法，采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪及ESI的正、负离子模式，对细胞中甘油磷脂类成分进行分析。
具体包括以下步骤：
(1)标准样品的配制
磷脂标准品除PI外，均用第一溶剂溶解，配制成浓度为1-10mg/mL(优选1mg/mL)的储备液；对于PI，用第二溶剂：第三溶剂：第四溶剂＝(20:9:1)-(20：7：3)(v/v/v)(优选为20:8:2；20:7:3；20:9:1)溶解标准品，配制成0.5-2mg/mL(优选0.5mg/mL)的储备液。然后用第五溶剂将所述全部的储备液稀释至不同浓度的标准品溶液。
实际检测时，以流动相A：流动相B＝(40：60)-(50：50)(v/v)(优选为50：50，40：60，45：55)的比例作为初始流动相，流动相A为含20mM甲酸铵的甲醇-水(5:95，v/v)溶液，流动相B为纯甲醇溶液，将标准品溶液配制成工作液。
混合对照品储备液：取上述各类标准品储备液，配制成浓度范围在0.01～1μg/mL的磷脂混合储备溶液(PC：0.01μg/mL；PE：0.2μg/mL；LPC：0.02μg/mL；LPE：1μg/mL；PA：0.25μg/mL；PG：0.375μg/mL；PS：1μg/mL；PI：0.1μg/mL；LPA：0.25μg/mL；LPS：1μg/mL；LPI：1μg/mL)，临用前稀释后进样。
其中，所述磷脂标准品是指磷脂酰胆碱：PC 14:0-14:0、PC 16:0-16:0、PC 16:0-18:1、PC16:0-20:4、PC 18:0-18:0、PC 18:0-18:1、PC 18:0-22:6、PC 20:0-20:0、PC 16:0-18:0；溶血磷脂酰胆碱：LPC 16:0、LPC 18:1、LPC 18:0；甘油磷脂酸：PA 16:0-16:0、PA 16:0-18:1；溶血甘油磷脂酸：LPA 16:0；磷脂酰丝氨酸：PS 16:0-16:0、PS 18:0-18:1；溶血磷脂酰丝氨酸：LPS18:0；磷脂酰肌醇：PI 16:0-16:0、PI18:0-18:0、PI 16:0-18:1、PI 18:0-20:4；溶血磷脂酰肌醇：LysoPI 18:0；磷脂酰甘油：PG 14:0-14:0、PG 16:0-18:1、PG 18:0-18:0；磷脂酰乙醇胺：PE14:0-14:0、PE 16:0-16:0、PE 18:0-18:0；溶血磷脂酰乙醇胺：LPE16:0、LPE 18:0。
其中，所述第一溶剂为氯仿、二氯甲烷等；优选地，为氯仿。
其中，所述第二溶剂为氯仿、二氯甲烷等；优选地，为氯仿。
其中，所述第三溶剂为甲醇、乙醇、丙酮等；优选地，为甲醇。
其中，所述第四溶剂为水、甲醇等；优选地，为水。
其中，所述第五溶剂为甲醇、乙醇、丙酮等；优选地，为甲醇。
本发明在步骤(1)之前还包括细胞样品通过提取体系进行前提取预处理步骤：本实验采用的方法为优化后BD法，即采用0.1N盐酸水溶液/甲醇/氯仿(1/1/1或1/2/2，v/v/v)混合溶液进行提取。具体操作流程总结如下：
(a)取对数期生长的细胞，吸弃培养基，用PBS清洗细胞两至三次；优选地，为两次。
(b)加入1-2mL 3-5℃预冷PBS溶液，吹打细胞数次，制备细胞悬液并计数；优选地，为1.5mL 4℃的预冷PBS溶液。
(c)取1-2mL细胞悬液于1.5mL离心管中，3-5℃低温离心3-7min，800rpm；优选地，为取1mL细胞悬液与1.5mL离心管中，4℃低温离心5min，800rpm。
(d)弃去上清，加入30-50μL内标溶液和1-2mL 0.1N盐酸水溶液/甲醇/氯仿(1/1/1或1/2/2，v/v/v)混合溶液，2000-3000r转速涡旋2-5min；优选地，为加入40μL内标溶液和1.2mL0.1N盐酸水溶液/甲醇/氯仿(1/1/1-1/2/2，v/v/v)混合溶液，2500r转速涡旋2min。
(e)3-5℃静置8-20min后，3-5℃低温高速离心8-20min，12000rpm；优选地，为4℃静置10min后，4℃低温高速离心15min，12000rpm。
(f)取出下层溶液并转移至新管，用氮气缓慢吹干后加入200-1000μL初始流动相，用于低丰度磷脂检测，另稀释一倍用于高丰度磷脂检测；优选地，初始流动相的量为400μL。
(0.1N盐酸水溶液：100mL容量瓶中加入0.9mL浓盐酸，用水定容至刻度线)
注：提取过程中，为保证磷脂化合物不被氧化，整个实验操作均需在低温下进行。
其中，所述细胞样品中磷脂的前提取方法为经过优化后的Bligh and Dyer(BD)法；所述提取体系为：0.1N盐酸水溶液/甲醇/氯仿(1/1/1，v/v/v)混合溶液、盐酸水溶液中的一种或两种；所述盐酸水溶液的浓度为0.1N。
所述盐酸水溶液的加入有助于改善BD法对于酸性磷脂的提取效率。
(2)标准样品数据库的建立
测试所用离子源为电喷雾离子源(ESI)，扫描方式为正、负离子扫描，多反应监测(MRM)模式，采集每种磷脂标准样品的碎片离子质谱图，形成目标化合物的数据库。
(3)色谱条件
色谱测试采用的色谱柱为UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm，Waters，USA)，UPLC BEH C8色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm，Waters，USA)，UPLC BEH RP18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm，Waters，USA)；优选地，为UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm，Waters，USA)。
色谱柱的柱温为25℃-60℃；优选地，为50℃。
自动进样器温度为3℃-6℃；优选地，为4℃。
进样量为5μL-10μL；优选地，为10μL。
流速为0.15mL/min-0.5mL/min；优选地，为0.4mL/min。
流动相A为含20mM甲酸铵的甲醇-水(5:95，v/v)溶液或甲酸铵的乙腈-水(5:95，v/v)溶液，流动相B为纯甲醇溶液或纯乙腈溶液。
流动相洗脱梯度程序为：0.1min时流动相A/流动相B的体积比为50/50；逐渐改变梯度到0.5min时，流动相A/流动相B的体积比变为30/70；再改变梯度到7min时，流动相A/流动相B的体积比变为0/100，并维持至9.5min；到9.6min时，流动相A/流动相B的体积比变为50/50，并维持至13min。
(4)质谱条件
质谱测试使用的离子源为电喷雾离子源(ESI)，扫描方式为正、负离子扫描；检测方式为多反应监测(MRM)。
ESI离子源参数：
在正离子模式下，气帘气压力(Curtain gas,CUR)、雾化气压力(Ion SourceGas1)和辅助器压力(Ion Source Gas2)分别为10psi-30psi，20psi-60psi，40psi-60psi；优选地，为20psi，50psi，50psi；
电子源电压(IonSprayVoltage)为4.5KV-6.5KV；优选地，为5.5KV；
离子源温度(Temperature)为450℃-550℃；优选地，为500℃。
在负离子模式下，气帘气压力(Curtain gas,CUR)、雾化气压力(Ion SourceGas1)和辅助器压力(Ion Source Gas2)分别为10psi-30psi，20psi-60psi，40psi-60psi；优选地，为15psi，50psi，50psi；
电子源电压(IonSprayVoltage)为-5.5KV～-3.5KV；优选地，为-4.5KV；
离子源温度(Temperature)为450℃-550℃；优选地，为500℃。
(5)高丰度和低丰度磷脂的分离检测
所述高丰度磷脂选自PC、PE、LPC、LPE，所述低丰度磷脂选自PI、PS、PG、LPA。
本发明所述高丰度磷脂PC在ESI+模式下容易受到同分异构体的干扰，ESI-模式下色谱峰更为纯净，因此高丰度磷脂的检测拟选用ESI-模式。
本发明所述低丰度磷脂在细胞内含量较低，本发明发现低丰度磷脂在ESI+模式下各类低丰度磷脂出峰良好，色谱图较纯净，说明其不易受到同分异构体的干扰。但是由于ESI+模式下，每类磷脂的子离子均采用特征碎片，无法采集到脂肪酸链的信息，因此不能完全忽视同分异构体的影响。因此为保证实验的严谨性，应使用碳链数总数和不饱和度总数表征每个磷脂，如PA 16:0-18:1、PA 16:1-18:0、PA 14:0-20:1均应为PA34:1。
在一个具体实施方式中，所述方法包括以下步骤：
(1)标准样品的配制
除PI外，所有磷脂标准品均用氯仿溶解，配制成浓度为1mg/mL的储备液，用甲醇将储备液稀释至不同浓度的标准品溶液。实际检测时，以流动相A：流动相B＝50:50(v/v)的比例作为初始流动相，将标准品溶液配制成工作液。对于PI，用氯仿：甲醇：水(20:9:1，v/v/v)溶解标准品，配制成0.5mg/mL的储备液。不同浓度标准品溶液及工作液的配制方法同其他磷脂标准品。
混合对照品储备液：取上述各类标准品储备液，配制成浓度范围在0.01～1μg/mL的磷脂混合储备溶液(PC：0.01μg/mL；PE：0.2μg/mL；LPC：0.02μg/mL；LPE：1μg/mL；PA：0.25μg/mL；PG：0.375μg/mL；PS：1μg/mL；PI：0.1μg/mL；LPA：0.25μg/mL；LPS：1μg/mL；LPI：1μg/mL)，临用前稀释后进样。
(2)标准样品数据库的建立
测试所用离子源为电喷雾离子源(ESI)，扫描方式为正、负离子扫描，多反应监测(MRM)模式，采集每种磷脂标准样品的碎片离子质谱图，形成目标化合物的数据库。
(3)色谱条件
色谱测试采用UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm，Waters，USA)，柱温为50℃，自动进样器温度为4℃，进样量为10μL。流速为0.4mL/min，流动相A为含20mM甲酸铵的甲醇-水(5:95，v/v)溶液，流动相B为纯甲醇溶液；流动相洗脱梯度如表1。
(4)质谱条件
质谱测试使用的离子源为电喷雾离子源(ESI)，扫描方式为正、负离子扫描；检测方式为多反应监测(MRM)；
ESI离子源参数：
正离子模式：气帘气压力(Curtain gas,CUR)，雾化气压力(Ion Source Gas1)和辅助器压力(Ion Source Gas2)分别为20psi,50psi,50psi；电子源电压(IonSprayVoltage)为5.5KV；离子源温度(Temperature)为500℃。
负离子模式：气帘气压力(Curtain gas,CUR)，雾化气压力(Ion Source Gas1)和辅助器压力(Ion Source Gas2)分别为15psi,50psi,50psi；电子源电压(IonSprayVoltage)为-4.5KV；离子源温度(Temperature)为500℃；其他参数见表2。
(5)高丰度和低丰度磷脂的分离检测
高丰度磷脂PC在ESI+模式下容易受到同分异构体的干扰，ESI-模式下色谱峰更为纯净，因此高丰度磷脂的检测拟选用ESI-模式。
低丰度磷脂在细胞内含量较低，本发明发现低丰度磷脂在ESI+模式下各类低丰度磷脂出峰良好，色谱图较纯净，说明其不易受到同分异构体的干扰。但是由于ESI+模式下，每类磷脂的子离子均采用特征碎片，无法采集到脂肪酸链的信息，因此不能完全忽视同分异构体的影响。因此为保证实验的严谨性，应使用碳链数总数和不饱和度总数表征每个磷脂，如PA 16:0-18:1、PA16:1-18:0、PA14:0-20:1均应为PA 34:1。
本发明还提供了上述方法在细胞中高丰度和低丰度分类磷脂组学上的应用。
本发明的有益效果包括：能够快速准确检测细胞中高丰度和低丰度分类的磷脂化合物的技术。采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪，在多反应监测下分析细胞中高丰度和低丰度分类的磷脂化合物，实现复杂基质中特定物质的监测和定量，避免共洗脱物的干扰。检测得到的分子具有高灵敏度和高特异性的特点，尤其适用于低丰度物质的定量。其中低丰度磷脂的检出率大大提高，说明该平台非常适用于细胞样品中磷脂的定量定性，扩大了磷脂组学信息。
附图说明
图1是ESI-模式下各类高丰度磷脂出峰情况。
图2是ESI+模式下各类低丰度磷脂出峰情况。
图3是ESI-模式下各类高丰度磷脂和ESI+模式下各类低丰度磷脂出峰情况。
图4是UPLC-QqQMS平台检测到的磷脂种类分布。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例
RAW264.7细胞中高丰度和低丰度磷脂的检测
(1)RAW264.7细胞前处理
取对数期生长的细胞，吸弃培养基，用PBS清洗细胞两次，加入1.5mL经4℃预冷的PBS溶液，吹打细胞数次，制备细胞悬液并计数。取1mL细胞悬液于1.5mL离心管中，低温离心，弃去上清，加入40μL内标溶液(PC 17:0-17:0、Lyso PC 17:0、PA 17:0-17:0、LPA17:0、PS 17:0-17:0、LPS 17:1、LPI 17:1、PG 15:0-15:0、PE 17:0-17:0、LPE 17:1)和1.2mL0.1N盐酸水溶液/甲醇/氯仿混合溶液(1/1/1，v/v/v)，2500r涡旋2分钟。
所述0.1N盐酸水溶液的配制方法为在100mL容量瓶中加入0.9mL浓盐酸，用水定容至刻度线。
然后4℃静置10分钟后，低温高速离心，取出下层溶液并转移至新管。用氮气缓慢吹干后加入400μL初始流动相(流动相A：流动相B＝50：50(v/v))，用于低丰度磷脂检测。另稀释一倍用于高丰度磷脂检测。
注：所述提取过程中，为保证磷脂化合物不被氧化，整个实验操作均需在低温下进行。
(2)RAW264.7细胞中磷脂组学的检测
(2.1)色谱检测：
色谱测试部分采用的色谱柱为UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm，Waters，USA)；色谱柱柱温为50℃。
自动进样器温度为4℃；进样量为10μL。
流速为0.4mL/min；流动相A为含20mM甲酸铵的甲醇-水(5:95，v/v)溶液，流动相B为纯甲醇溶液。
流动相洗脱梯度如下表1：
表1流动相洗脱梯度
Figure BDA0002878145320000071
(2.2)质谱检测：
质谱测试部分使用的离子源为电喷雾离子源(ESI)，扫描方式为正、负离子扫描；检测方式为多反应监测(MRM)。
ESI离子源参数：
在正离子模式下，气帘气压力(Curtain gas,CUR)、雾化气压力(Ion SourceGas1)和辅助器压力(Ion Source Gas2)分别为20psi，50psi，50psi；
电子源电压(IonSprayVoltage)为5.5KV；
离子源温度(Temperature)为500℃。
在负离子模式下，气帘气压力(Curtain gas,CUR)、雾化气压力(Ion SourceGas1)和辅助器压力(Ion Source Gas2)分别为15psi，50psi，50psi；
电子源电压(IonSprayVoltage)为-4.5KV；
离子源温度(Temperature)为500℃。
其他参数见下表2：
表2采集的低丰度和高丰度磷脂离子对、质谱参数
Figure BDA0002878145320000081
Figure BDA0002878145320000091
Figure BDA0002878145320000101
RAW264.7细胞提取的磷脂化合物经过UPLC-QqQ MS平台获得了很好的分离检测，实验在预设MRM的条件下，高丰度磷脂和低丰度磷脂共检测到218种磷脂化合物。图3为LC-MS/MS分离图。经分析，其中44种PC、LPC；37种PE&LPE；38种PI、LPI；24种PG；27种PA、LPA等(图4)。其中低丰度磷脂的检出率大大提高，说明该平台非常适用于细胞样品中磷脂的定量定性，扩大了磷脂组学信息。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
[1].Britta Bruegger.Lipidomics:Analysis of the lipid composition ofcells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry[M].KornbergR.D.Annual review of biochemistry,vol 83.2014:79-98.
[2].Ivanova P T,Milne S B,Myers D S,et al.Lipidomics:a massspectrometry based,systems level analysis of cellular lipids[J].CurrentOpinion in Chemical Biology,2009,13(5-6):526.
[3].Kimura T,Jennings W,Epand R M.Roles of specific lipid species inthe cell and their molecular mechanism[J].Progress in Lipid Research,2016,62(DEC):75–92.

Claims (11)

1.一种细胞中高丰度和低丰度分类磷脂化合物的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)标准样品的配制：
磷脂标准品除PI外，均用第一溶剂溶解，配制成浓度为1-10mg/mL的储备液；对于PI，用第二溶剂：第三溶剂：第四溶剂＝(20:9:1)-(20：7：3)(v/v/v)溶解标准品，形成0.5-2mg/mL的储备液；然后用第五溶剂将所述磷脂标准品的储备液稀释至不同浓度的标准品溶液；实际检测时，用流动相A：流动相B＝(40：60)-(50：50)(v/v)作为初始流动相将所述标准品溶液配制成工作液；
(2)标准样品数据库的建立：
测试所用离子源为电喷雾离子源ESI，扫描方式为正、负离子扫描，多反应监测MRM模式，采集每种磷脂标准样品的碎片离子质谱图，形成目标化合物的数据库；
(3)设置色谱条件；
(4)设置质谱条件；
(5)高丰度和低丰度磷脂的分离检测：取上述各类标准品储备液，配制成浓度范围在0.01～1μg/mL的磷脂混合储备溶液(PC：0.01μg/mL；PE：0.2μg/mL；LPC：0.02μg/mL；LPE：1μg/mL；PA：0.25μg/mL；PG：0.375μg/mL；PS：1μg/mL；PI：0.1μg/mL；LPA：0.25μg/mL；LPS：1μg/mL；LPI：1μg/mL)，临用前稀释后进样。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)之前还包括细胞样品通过提取体系进行前提取预处理步骤：(a)取对数期生长的细胞，吸弃培养基，用PBS清洗细胞两至三次；(b)加入1-2mL 3-5℃预冷PBS溶液，吹打细胞，制备细胞悬液并计数；(c)取1-2mL细胞悬液于1.5mL离心管中，3-5℃低温离心3-7min；800rpm；(d)弃去上清，加入30-50μL内标溶液和1-2mL 0.1N盐酸水溶液/甲醇/氯仿的体积比为1/1/1或1/2/2/的混合溶液，2000-3000r转速涡旋2-5分钟；(e)3-5℃静置8-20分钟后，3-5℃低温高速离心8-20min；12000rpm；(f)取出下层溶液并转移至新管，用氮气吹干后加入400μL初始流动相，用于低丰度磷脂检测，另稀释一倍用于高丰度磷脂检测；
其中，所述细胞样品中磷脂的前提取方法为经过优化后的Bligh and Dyer(BD)法；所述提取体系为：盐酸水溶液/甲醇/氯仿的体积比为1/1/1或1/2/2的混合溶液、盐酸水溶液中的一种或两种；所述盐酸水溶液的浓度为0.1N。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述第一溶剂为氯仿、二氯甲烷中的一种或两种；所述第二溶剂为氯仿、二氯甲烷中的一种或两种；所述第三溶剂为甲醇、乙醇、丙酮中的一种或几种；所述第四溶剂为水、甲醇中的一种或两种；所述第五溶剂为甲醇、乙醇、丙酮中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述色谱条件中的梯度洗脱程序为：0.1min时流动相A/流动相B的体积比为50/50；逐渐改变梯度到0.5min时，流动相A/流动相B的体积比变为30/70；再改变梯度到7min时，流动相A/流动相B的体积比变为0/100，并维持至9.5min；到9.6min时，流动相A/流动相B的体积比变为为50/50，并维持至13min。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述流动相A为含20mM甲酸铵的体积比为5:95的甲醇-水溶液或含20mM甲酸铵的体积比为5:95的乙腈-水溶液；所述流动相B为纯甲醇溶液或纯乙腈溶液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述色谱条件中的色谱柱选自UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm，Waters，USA)，UPLC BEH C8色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm，Waters，USA)，UPLC BEH RP18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm，Waters，USA)中的一种；所述色谱柱的柱温为25-60℃；所述色谱柱的流速为0.15-0.5mL/min；所述色谱柱进行进样时，自动进样器的温度为3-6℃；进样量为5-10μL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述质谱条件中的质谱使用的离子源为电喷雾离子源ESI；所述质谱参数选自磷脂分子的离子对质荷比、电子源电压、离子源温度、碰撞电压、气帘气压力、雾化气压力、辅助器压力。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述ESI正离子模式下，气帘气压力、雾化气压力和辅助器压力分别为10-30psi，20-60psi，40-60psi；电子源电压为4.5-6.5KV；离子源温度为450-550℃；所述ESI负离子模式下，气帘气压力、雾化气压力和辅助器压力分别为10-30psi，20-60psi，40-60psi；电子源电压为-5.5KV～-3.5KV；离子源温度为450-550℃。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高丰度磷脂选自PC、PE、LPC、LPE，所述低丰度磷脂选自PI、PS、PG、LPA。
10.根据权利要求1-9之任一项所述的方法在细胞中高丰度和低丰度分类磷脂组学中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述高丰度磷脂选自PC、PE、LPC、LPE，所述低丰度磷脂选自PI、PS、PG、LPA。
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