CN115078591A

CN115078591A - 一种人源组织及细胞中甘油磷脂代谢定量检测试剂盒及其检测方法和应用

Info

Publication number: CN115078591A
Application number: CN202210836759.8A
Authority: CN
Inventors: 彭章晓; 沈珈西; 宁慧; 舒烈波; 张彦军; 陈敏; 方后琴; 胡哲
Original assignee: Shanghai Deer Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Deer Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-07-15
Filing date: 2022-07-15
Publication date: 2022-09-20
Anticipated expiration: 2042-07-15
Also published as: CN115078591B

Abstract

本发明提供一种人源组织及细胞中甘油磷脂代谢定量检测试剂盒，所述试剂盒包括至少一个混合标准测试品，所述混合标准测试品中包括28种甘油磷脂代谢物的标准品和36种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品。本发明进一步提供试剂盒的用途及对人源组织及细胞中甘油磷脂的检测方法。本发明提供的一种人源组织及细胞中甘油磷脂代谢定量检测试剂盒及其检测方法和应用，能够同时准确定量检测人源性组织或细胞样本中28种功能性磷脂以及36种关键的磷脂代谢酶，灵敏度高，特异性强，所需样本量少，检测时间短，提高了方法的灵敏度、精密度、效率和检测通量，成本低廉，且试剂盒有效期长，避免了资源浪费。

Description

一种人源组织及细胞中甘油磷脂代谢定量检测试剂盒及其检测方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种人源组织及细胞中甘油磷脂代谢定量检测试剂盒及其检测方法和应用。

背景技术

甘油磷脂是动物体内一类非常重要的脂质，它们既是细胞膜的基本组成成分，也是能量供应、信号传导的重要参与分子，因此甘油磷脂代谢异常跟诸多疾病(如：心血管疾病和癌症等)密切相关。甘油磷脂根据极性头部取代基的不同，一共可以分为6个亚类，即：磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)和心磷脂(CL)。每一亚类甘油磷脂根据甘油羟基sn-1和sn-2位上连接的脂肪酸的顺序不同、酯键的形式不同、脂肪酸C原子数目不同、脂肪酸不饱和程度和不饱和键的位置不同，又由数千种脂质分子组成。因此，动物体内甘油磷脂分子是非常复杂的，有数万种之多，对所有的甘油磷脂分子进行准确的定性定量是一件非常困难的事情。

然而，随着功能脂质组学的发展，大量的研究已经可以将一些特异性的脂质分子与特异性生理功能或病理机制相关联。这部分功能脂质数量不多，但发挥非常重要的生物学功能。因此，定量检测这部分功能性的甘油磷脂具有重要意义。机体中代谢物的水平与代谢物的合成、转运和代谢相关，若要了解疾病状态下机体的代谢状态，除了定量检测代谢物的浓度外，还需要检测相关代谢酶(合成酶、转运酶和代谢酶)的表达水平。甘油磷脂的检测主要是基于液相色谱质谱联用(LC-MS)平台来进行，而相关代谢酶的检测主要是通过酶联免疫法(ELISA)、蛋白印迹法(Western Blot)或免疫组化法来分析。代谢物和代谢酶的检测需要借助不同的平台，不同的样本以及不同的前处理方法来完成，非常的耗时费力，且无法实现高通量检测。目前，市面上尚无基于LC-MS平台的磷脂代谢物和代谢酶联合检测的试剂盒。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种人源组织及细胞中甘油磷脂代谢定量检测试剂盒及其检测方法和应用，基于LC-MS特别是UPLC-MS/MS分析平台，用于同时准确定量检测人源性组织/细胞中甘油磷脂及其相关代谢酶。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种人源组织及细胞中甘油磷脂代谢定量检测试剂盒，所述试剂盒包括至少一个混合标准测试品，所述混合标准测试品中包括28种甘油磷脂代谢物的标准品中的一种或多种，和/或36种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品中的一种或多种，所述28种甘油磷脂代谢物和36种甘油磷脂代谢酶分别如下表1所示。

本发明第二方面提供上述试剂盒在定量检测人源组织及细胞中甘油磷脂中的用途。

本发明第三方面提供一种对人源组织及细胞中甘油磷脂的检测方法，采用上述试剂盒，包括以下步骤：

1)制备待测样品：将样本采用有机试剂蛋白沉淀法通过提取剂1提取分别获取第一上清液和蛋白沉淀；将蛋白沉淀用复溶剂1复溶、酶解、除盐、干燥后，采用复溶剂2复溶，取上清液获得多肽溶液；将第一上清液采用水和提取剂2进行液液萃取法萃取磷脂后挥干，采用复溶剂3复溶，取上清液获得磷脂溶液；再将多肽溶液和磷脂溶液混合，获得待测样品；

2)制备标准测试品：将多种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品加入甲醇超声溶解获得多肽标准储备液，将多种甘油磷脂代谢物的标准品加入甲醇与氯仿的混合溶液超声溶解获得磷脂标准储备液，再取多肽标准储备液和磷脂标准储备液加入水、甲醇、氯仿的混合溶液超声溶解，获得标准测试品；

3)仪器分析：采用液相色谱质谱联用法分别测定步骤1)中的待测样品和步骤2)中的标准测试品，根据保留时间和母-子离子对信息指认目标分析物，再根据目标分析物的选择离子对色谱峰面积通过标准曲线法进行定量，确定待测样品中各种甘油磷脂代谢物及甘油磷脂代谢酶的含量。

如上所述，本发明提供的一种人源组织及细胞中甘油磷脂代谢定量检测试剂盒及其检测方法和应用，通过基于LC-MS特别是UPLC-MS/MS分析平台的试剂盒，能够同时准确定量检测人源性组织或细胞样本中28种功能性磷脂以及36种关键的磷脂代谢酶，灵敏度高，特异性强，且对于有一定质谱操作经验的工作者而言，上手快，通过阅读说明书即可操作。该种试剂盒所需样本量少，优化了前处理和检测方法，检测时间短，提高了方法的灵敏度、精密度、效率和检测通量，成本低廉，且试剂盒有效期长，避免了资源浪费，可以在单个人源性组织样本中实现甘油磷脂和相关代谢酶的高通量定量分析，为相关疾病诊断标志物筛选和药物靶标挖掘打下基础。

附图说明

图1显示为本发明中不同提取方案的回收率考察图。

图2显示为本发明中目标物的LC-MS/MS的提取离子图。

具体实施方式

本发明第一方面提供一种人源组织及细胞中甘油磷脂代谢定量检测试剂盒，所述试剂盒包括至少一个混合标准测试品，所述混合标准测试品中包括28种甘油磷脂代谢物的标准品中的一种或多种，和/或36种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品中的一种或多种，所述28种甘油磷脂代谢物和36种甘油磷脂代谢酶分别如下表1所示。

表1

在上述试剂盒中，不同所述混合标准测试品中28种甘油磷脂代谢物的标准品和36种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品的相应浓度不同。

在上述试剂盒中，同一混合标准测试品中28种甘油磷脂代谢物的标准品和36种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品的浓度相同。

在上述试剂盒中，所述混合标准测试品的个数为8-10个。

在一种实施方式中，所述混合标准测试品的个数为9个，9个所述混合标准测试品分别用S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9表示，所述S1～S9中各种甘油磷脂代谢物的标准品及甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品的浓度按浓度梯度由小至大依次排序。

在上述试剂盒中，所述混合标准测试品中28种甘油磷脂代谢物的标准品和36种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品复溶后的浓度范围均为0.005～110.00ng/mL，优选为0.01～100.00ng/mL。

在一种实施方式中，所述混合标准测试品复溶采用的溶剂为水、甲醇、氯仿的混合溶液。

具体来说，所述水、甲醇、氯仿的混合溶液中，所述水、甲醇、氯仿的体积之比(V/V/V)为1:3～5:1，优选为1:4:1。

所述混合标准测试品为含有28种甘油磷脂代谢物的标准品和36种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品的混合溶液挥干后得到的干粉。

在优选的实施方式中，所述S1中各种甘油磷脂代谢物的标准品及甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品复溶后的浓度均为0.005～0.015ng/mL，优选为0.01ng/mL；所述S2中各种甘油磷脂代谢物的标准品及甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品复溶后的浓度均为0.035～0.045ng/mL，优选为0.04ng/mL；所述S3中各种甘油磷脂代谢物的标准品及甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品复溶后的浓度均为0.09～0.11ng/mL，优选为0.10ng/mL；所述S4中各种甘油磷脂代谢物的标准品及甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品复溶后的浓度均为0.35～0.45ng/mL，优选为0.4ng/mL；所述S5中各种甘油磷脂代谢物的标准品及甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品复溶后的浓度均为0.90～1.10ng/mL，优选为1.00ng/mL；所述S6中各种甘油磷脂代谢物的标准品及甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品复溶后的浓度均为3.90～4.10ng/mL，优选为4.00ng/mL；所述S7中各种甘油磷脂代谢物的标准品及甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品复溶后的浓度均为9.50～10.50ng/mL，优选为10.00ng/mL；所述S8中各种甘油磷脂代谢物的标准品及甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品复溶后的浓度均为39.50～40.50ng/mL，优选为40.00ng/mL；所述S9中各种甘油磷脂代谢物的标准品及甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品复溶后的浓度均为99.50～100.50ng/mL，优选为100.00ng/mL。

在上述试剂盒中，所述试剂盒还包括有提取剂1、提取剂2、复溶剂1、复溶剂2、复溶剂3，所述提取剂1为甲醇、丙酮、甲酸的混合溶液，所述提取剂2为2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的氯仿溶液，所述复溶剂1为盐酸胍、碳酸氢铵的混合水溶液，所述复溶剂2为水、甲醇、甲酸的混合溶液，所述复溶剂3为甲醇、氯仿、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的混合溶液。

在一种实施方式中，所述提取剂1中，所述甲醇、丙酮、甲酸的体积之比(V/V/V)为30～50:70～50:0.1，优选为40:60:0.1。

在一种实施方式中，所述提取剂2为含0.05～0.15mM(mmol/L)2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的氯仿溶液。在进一步优选的实施方式中，所述提取剂2为含0.1mM 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的氯仿溶液。

在一种实施方式中，所述复溶剂1为含95～105mM碳酸氢铵和5.9～6.1M(mol/L)盐酸胍的混合水溶液。在进一步优选的实施方式中，所述复溶剂1为含100mM碳酸氢铵和6.0M盐酸胍的混合水溶液。

在一种实施方式中，所述复溶剂2中，所述水、甲醇、甲酸的体积之比为90～100:10～1:0.1，优选为99:2:0.1。

在一种实施方式中，所述复溶剂3为含0.05～0.15mM 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的甲醇和氯仿的混合溶液，所述甲醇与氯仿的体积之比为75～85:25～15。在进一步优选的实施方式中，所述复溶剂3为含0.1mM 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的甲醇和氯仿的混合溶液，所述甲醇与氯仿的体积之比为80:20。

上述M即为mol/L。上述mM即为mmol/L。

在上述试剂盒中，所述试剂盒还包括有至少一个混合质控品，所述混合质控品中包括与混合标准测试品相同的各种甘油磷脂代谢物的标准品及甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品。同一混合质控品中各种甘油磷脂代谢物的标准品及甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品的浓度相同。

在一种实施方式中，所述混合质控品包括高浓度混合质控品(HQC)、中浓度混合质控品(MQC)、低浓度混合质控品(LQC)，所述高浓度混合质控品中各种甘油磷脂代谢物的标准品及甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品复溶后的浓度均为39.50-40.50ng/mL，优选为40.00ng/mL；所述中浓度混合质控品中各种甘油磷脂代谢物的标准品及甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品复溶后的浓度均为0.90-1.10ng/mL，优选为1.00ng/mL；所述低浓度混合质控品中各种甘油磷脂代谢物的标准品及甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品复溶后的浓度均为0.035-0.045ng/mL，优选为0.04ng/mL。

所述混合质控品与混合标准测试品相同，均为含有28种甘油磷脂代谢物的标准品和36种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品的混合溶液挥干后得到的干粉。

所述混合质控品复溶采用的溶剂与所述混合标准测试品复溶采用的溶剂相同。

在上述用途中，所述甘油磷脂包括甘油磷脂代谢物和甘油磷脂代谢酶。

在一种实施方式中，所述甘油磷脂代谢物包括28种，所述甘油磷脂代谢酶包括36种，具体见表1。

在上述步骤1)中，所述样本为人源性的组织或细胞。

在上述步骤1)中，所述有机试剂蛋白沉淀法为常规使用的有机试剂蛋白沉淀法。具体来说，所述有机试剂蛋白沉淀法为将样本在液氮中磨碎后，采用RIPA裂解液进行抽提样本中蛋白，获得的蛋白上清液采用提取剂1提取分别获取第一上清液和蛋白沉淀。

在一种实施方式中，所述RIPA裂解液为放射性免疫沉淀法分析用裂解液。所述RIPA裂解液的组成成分包括50mM Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，pH为7.4)、150mMNaCl、1％NP-40(乙基苯基聚乙二醇)。

在一种实施方式中，所述蛋白上清液在采用提取剂1提取前采用BCA法测定蛋白浓度。根据测定的蛋白浓度，不同蛋白上清液采用RIPA裂解液稀释至相同的浓度和体积。

在一种实施方式中，所述蛋白上清液与提取剂1的体积比为1:4～10，优选为1:5。

上述提取剂1一方面尽可能沉淀蛋白，另一方面最大程度提取人源组织中的甘油磷脂，并且提取剂1中提取的甘油磷脂便于用于后续的液液萃取。

在上述步骤1)中，所述提取剂1提取为先涡旋20～60s，再超声提取5～20min，然后在-20～4℃静置1～12h，最后以10000～20000g离心力在3～5℃下离心10～60min。

在一种实施方式中，所述提取剂1提取为先涡旋20s，再超声提取10min，然后在-20℃静置2h，最后以15000g离心力在4℃下离心30min。

在上述步骤1)中，所述蛋白沉淀加入的质量与复溶剂1加入的体积之比为0.01～2:100，g/mL。

在上述步骤1)中，所述复溶剂1复溶后以10000～15000g离心力离心5～20min。

在一种实施方式中，所述离心以12000g离心力离心10min。

在上述步骤1)中，所述酶解为常规使用的酶解方式。具体来说，所述酶解为蛋白经过还原、烷基化后利用胰酶在37℃条件过夜酶解的过程。

在上述步骤1)中，所述除盐为常规使用的除盐方式。具体来说，所述除盐为将酶解后的肽段采用SOLA^TMSPE 96孔板脱盐。

在上述步骤1)中，所述干燥为常规的冷冻干燥。

在上述步骤1)中，所述蛋白沉淀加入的质量与复溶剂2加入的体积之比为0.01～2:100，g/mL。

在上述步骤1)中，所述第一上清液、水、提取剂2的体积比为0.9～1.1:0.9～1:1.9～2.1，优选为1:1:2。

上述第一上清液、水、提取剂2的体积比，能够使液液萃取体系分层，提取的甘油磷脂会被萃取到下层的氯仿层中，提取剂2中的BHT有助于防止甘油磷脂的氧化降解。

在上述步骤1)中，所述液液萃取法为先涡旋20～40s，再以8000～12000g离心力在3～5℃下离心4～6min。在一种实施方式中，所述液液萃取法为先涡旋30s，再以10000g离心力在4℃下离心5min。

在上述步骤1)中，所述挥干为常规的对下层有机层进行挥发干燥。

在上述步骤1)中，所述第一上清液与复溶剂3加入的体积比为150～250：200～300，优选为200：250。

在上述步骤1)中，所述多肽溶液与磷脂溶液的体积比为1:4～6，优选为1:5。所述多肽溶液与磷脂溶液的下层有机层为氯仿层。

上述多肽溶液与磷脂溶液的体积比，能分别复溶多肽(甘油磷脂代谢酶)和磷脂(甘油磷脂代谢物)，又要使复溶之后的两种溶液能够完全混合成一个不分层的均匀体系，用于LC-MS的定量分析。

在上述步骤1)中，所述多肽溶液与磷脂提取物溶液混合为涡旋混合，所述涡旋混合的时间为8～12s，优选为10s。

在上述步骤2)中，所述多肽标准储备液中，多种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品的浓度为0.5～2mg/mL，优选为1mg/mL。

具体来说，例如浓度为1mg/mL多肽标准储备液，可采用精确称取1mg每种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品加入1mL的甲醇进行超声溶解后配成。

所述多种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品为36种。

在上述步骤2)中，所述甲醇超声溶解的条件为：温度：冰水浴；超声时间：1～5min。在一种实施方式中，所述甲醇超声溶解的条件为：温度：0℃；超声时间：3min。

在上述步骤2)中，所述磷脂标准储备液中，多种甘油磷脂代谢物的标准品的浓度为0.5～2mg/mL，优选为1mg/mL。

具体来说，例如浓度为1mg/mL磷脂标准储备液，可采用精确称取1mg每种甘油磷脂代谢物的标准品加入1mL的甲醇与氯仿的混合溶液进行超声溶解后配成。

所述多种甘油磷脂代谢物的标准品为28种。

在上述步骤2)中，所述甲醇与氯仿的混合溶液超声溶解的条件为：温度：冰水浴；超声时间：1～5min。在一种实施方式中，所述甲醇与氯仿的混合溶液超声溶解的条件为：温度：0℃；超声时间：3min。

在上述步骤2)中，所述甲醇与氯仿(V/V)的体积比为1～3:1，优选为2:1。

在上述步骤2)中，所述标准测试品中各种甘油磷脂代谢物的标准品及甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品的浓度范围为0.005～110.00ng/mL，优选为0.01～100.00ng/mL。

在上述步骤2)中，所述水、甲醇、氯仿的混合溶液中含有0.05～0.15mM(mmol/L)2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，水、甲醇、氯仿的体积比(V/V/V)为0.9～1.1:3～5:0.9～1.1。

在一种实施方式中，所述水、甲醇、氯仿的混合溶液中含有0.1mM(mmol/L)2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，水、甲醇、氯仿的体积比(V/V/V)为1:4:1。

在上述步骤2)中，所述水、甲醇、氯仿的混合溶液超声溶解的条件为：温度：冰水浴；超声时间：1～5min。在一种实施方式中，所述水、甲醇、氯仿的混合溶液超声溶解的条件为：温度：0℃；超声时间：3min。

在上述步骤2)中，所述标准测试品在-80℃冻存。可以有效的避免标准测试品降解，延长标准测试品的存放时间。

在上述步骤2)中，在所述标准测试品中选择质控品。

在上述步骤3)中，所述液相色谱质谱联用法(LC-MS)为超高液相色谱串联质谱联用法(UPLC-MS/MS)。

在一种实施方式中，所述超高液相色谱串联质谱联用法(UPLC-MS/MS)中，所述超高液相色谱(UPLC)的测定条件为：

色谱柱：T3液相色谱柱；柱温：40-60℃；进样量：0.5-2μL；流速：0.2-0.4mL/min；流动相A相为水，内含体积百分比为0.05-0.15％的甲酸和9-11mmol/L的甲酸铵；流动相B相为体积比为25-35:65-75的乙腈与异丙醇混合溶液，内含0.05-0.15％的甲酸和9-11mmol/L的甲酸铵；分析时间为40min；梯度洗脱。

在进一步优选的实施方式中，所述超高液相色谱(UPLC)的测定条件为：

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3液相色谱柱(内径2.1×柱长100mm，粒径1.7μm)；柱温：50℃；进样量：1μL；流速：0.3mL/min；流动相A相为水，内含体积百分比为0.1％的甲酸和10mmol/L的甲酸铵；流动相B相为体积比为30:70的乙腈与异丙醇混合溶液，内含0.1％的甲酸和10mmol/L的甲酸铵；分析时间为40min；梯度洗脱。

在进一步优选的实施方式中，所述梯度洗脱的具体程序见表2，为：

0-1min，A相：B相体积比为98：2-98：2；

1-15min，A相：B相体积比为98：2-60：40；

15-32min，A相：B相体积比为60：40-2：98；

32-37min，A相：B相体积比为2：98-2：98；

37-37.1min，A相：B相体积比为2：98-98：2；

37.1-40min，A相：B相体积比为98：2-98：2。

表2梯度洗脱参数

保留时间(min)	流速(mL/min)	流动相A％	流动相B％
				0	0.3	98	2
1	0.3	98	2
				15	0.3	60	40
32	0.3	2	98
				37	0.3	2	98
37.1	0.3	98	2
				40	0.3	98	2

在一种实施方式中，所述超高液相色谱串联质谱联用法(UPLC-MS/MS)中，所述质谱(MS/MS)的测定条件为：

电离方式：电喷雾离子源(ESI)；离子源温度为440-460℃，优选为450℃；气帘气(CUR)为30-40psi，优选为35psi；碰撞气(CAD)为7-9psi/medium，优选为8psi/medium；离子喷雾电压(IS)为-4500.00/5500V；离子源Gas1:45-55psi，优选为50psi；Gas2:45-55psi，优选为50psi；监测方式为多反应监测(MRM)模式进行一/二级质谱分析。

上述质谱(MS/MS)中，包括有二级质谱，二级是可以把一级的碎片离子当作母离子然后再进行打碎分析。

在一种实施方式中，所述超高液相色谱串联质谱联用法(UPLC-MS/MS)中，28种甘油磷脂代谢物和36种甘油磷脂代谢酶的去簇电压、碰撞电压、母离子、子离子、保留时间以及对应的加合模式见表3所示。

表3

在上述步骤3)中，所述标准曲线法包括以下步骤：

A1)将含有一系列不同浓度的28种甘油磷脂代谢物的标准品和36种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品的标准测试品，分别进行液相色谱质谱联用法分析，获得其色谱峰面积与对应浓度之间线性关系，绘制相应的标准曲线，用加权最小二乘法进行回归运算，得到待测物的线性回归方程；

A2)将待测样品进行UPLC-MS/MS分析，将获得的28种甘油磷脂代谢物和36种甘油磷脂代谢酶特征肽段的色谱峰面积，代入步骤A1)中相应成分的标准工作曲线的回归方程，计算得到待测样品中相应分析物的浓度。

更优选地，步骤A1)或A2)中，所述标准工作曲线中，以28种甘油磷脂代谢物和36种甘油磷脂代谢酶特征肽段的色谱峰面积为纵坐标(Y轴)，其相应成分的浓度为横坐标(X轴)。

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

以下实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购得的常规产品。例如，用于样本研磨的全自动样品快速研磨仪、用于样本冻干的冷冻干燥机、用于样本超声提取的超声波清洗机、用于样本混匀的漩涡振荡器、用于样本浓缩干燥的冷冻浓缩离心干燥器、用于离心的台式高速冷冻离心机、用于蛋白浓度分析的酶标仪。其中，用于样本分析检测的超高效液相色谱仪(UPLC)产自Waters公司，用于样本分析检测的质谱仪为Sciex公司生产的型号为4500(QQQ/Qtrap)、5500(QQQ/Qtrap)、、6500(QQQ/Qtrap)三重四极杆系列质谱系统。

实施例1

1、制备待测样品

取人肝癌组织30mg作为样本，在液氮中磨碎后，利用RIPA裂解液抽提样本中蛋白，获得的蛋白上清液采用BCA法测定蛋白浓度。根据测定的蛋白浓度，取蛋白上清液进行后续处理，如取多个蛋白上清液，不同蛋白上清液采用RIPA裂解液稀释至相同的浓度和体积，不同蛋白上清液的蛋白取样量为100μg。

准备试剂盒，试剂盒组成见下表4。

表4

取200μL蛋白上清液加入1mL提取剂1涡旋30s，超声提取10min，在-20℃静置2h，以15000g离心力在4℃下离心30min，分别收集第一上清液和蛋白沉淀。其中，提取剂1为甲醇、丙酮、甲酸的混合溶液，甲醇、丙酮、甲酸的体积之比为40:60:0.1。

将100μg蛋白沉淀用1mL的复溶剂1重新溶解，以12000g离心力离心10min后获得上清液和蛋白。收集上清液，采用BCA法测定上清液中总蛋白浓度。将50μg蛋白进行酶解，酶解后的肽段采用SOLA^TMSPE 96孔板脱盐后，冷冻干燥。采用300μL复溶剂2复溶，获得多肽溶液。其中，复溶剂1为含100mM碳酸氢铵和6.0M盐酸胍的混合水溶液，复溶剂2为水、甲醇、甲酸的混合溶液，水、甲醇、甲酸的体积之比为99:2:0.1。

将200μL第一上清液加入200μL纯水和400μL的提取剂2，涡旋30s，以10000g离心力在4℃下离心5min。取下层氯仿层挥干，用250μL复溶剂3复溶，获得磷脂溶液。其中，提取剂2为含0.1mM BHT的氯仿溶液，复溶剂3为含0.1mM BHT的甲醇和氯仿的混合溶液，甲醇与氯仿的体积之比为80:20。

将40μL多肽溶液与200μL磷脂溶液涡旋混合，获得待测样品。

待测样品在上机分析之前存放于-20℃环境中，整个待测样品制备过程保证低温。

2、制备标准测试品

分别精确称取1mg的28种甘油磷脂代谢物的标准品和36种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品，其中，甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品加入甲醇在冰水浴超声溶解3min获得多肽标准储备液，甘油磷脂代谢物的标准品加入体积比为2:1的甲醇与氯仿的混合溶液在冰水浴超声溶解3min获得磷脂标准储备液。

再分别取一定量的多肽标准储备液和磷脂标准储备液加入含有0.1mM BHT的体积比为1:4:1的水、甲醇、氯仿的混合溶液在冰水浴超声溶解3min，配制浓度为100ng/mL的标准测试品S9。然后，用含有0.1mM BHT的体积比为1:4:1的水、甲醇、氯仿的混合溶液梯度稀释标准测试品S9，配制S1～S8(浓度分别为0.01、0.04、0.10、0.40、1.00、4.00、10.00、40.00ng/mL)。同时，根据需要配制高浓度混合质控品(HQC，浓度为40ng/mL)、中浓度混合质控品(MQC，浓度为1ng/mL)、低浓度混合质控品(LQC，浓度为0.04ng/mL)。

挥干标准测试品S1～S9、LQC、MQC、HQC，标准测试品和质控品在上机分析之前存放于-20℃环境中。

3、仪器分析

采用UPLC-MS/MS分别测定待测样品和标准测试品，根据相对保留时间和母-字离子对信息指认出待测物的特征峰，再根据标准曲线进行定量，确定待测样品中各待测物的含量。

UPLC-MS/MS分析法中，UPLC的测定条件为：

梯度洗脱的具体程序为：

0-1min，A相：B相体积比为98：2-98：2；

1-15min，A相：B相体积比为98：2-60：40；

15-32min，A相：B相体积比为60：40-2：98；

32-37min，A相：B相体积比为2：98-2：98；

37-37.1min，A相：B相体积比为2：98-98：2；

37.1-40min，A相：B相体积比为98：2-98：2。

UPLC-MS/MS分析法中，MS/MS的测定条件为：

电离方式：电喷雾离子源(ESI)；离子源温度为450℃；气帘气(CUR)为35psi；碰撞气(CAD)为8psi/medium；离子喷雾电压(IS)为-4500.00/5500V；离子源Gas1:50psi；Gas2:50psi；监测方式为多反应监测(MRM)模式进行MS/MS质谱分析。

UPLC-MS/MS分析法中，目标分析物的去簇电压、碰撞电压、母离子、子离子、保留时间以及对应的加合模式见表3所示。

实施例2

为了保障本发明中检测方法的稳定、灵敏、准确、可靠，我们从灵敏度、线性范围、回收率及精密度等方面进行了方法学考察。

1、线性及灵敏度考察

取试剂盒中标准品干粉，按实施例1的步骤2制备的标准测试品S1～S9，采用UPLC-MS/MS法按实施例1的步骤3的检测条件进行测定，进行检测方法的线性范围和检测限考察，检测结果见下表5。由表5可知，本检测方法的灵敏度高，低至pg/ml级别，线性方法宽，宽至3-4个数量级，能够满足人源性组织样本中甘油磷脂代谢物和甘油磷脂代谢酶丰度差异巨大的检测需求。

表5目标物的检测限和线性范围考察

注：S/N：信号/噪音

2、提取剂的选择和优化

要在同一份样本中实现蛋白和磷脂的高效提取，提取剂的组成以及比例至关重要，为了考察不同提取剂组成对蛋白和磷脂提取的影响，本发明利用质控样本考察不同提取剂对蛋白和磷脂提取效率的影响。每个提取条件做三个重复，以多肽和磷脂的整体平均提取率作为提取剂优化的考查指标，结果如图1、表6、表7所示。

由图1、表6、表7可知，提取方案1能兼顾蛋白沉淀效率和磷脂的提取效率，提取剂1取甲醇/丙酮/甲酸＝40:60:0.1(V/V/V)的组合能有效破坏蛋白的表面亲水结构和电荷状态，造成蛋白沉淀，提高蛋白沉淀效率。提取剂2中的氯仿与提取剂1和水以2:1:1的比例混合时，会出现很好的分层，提取剂1中的磷脂会转移到氯仿层中，分离氯仿层后便能获得提取的磷脂，水、提取剂1和提取剂2的比例会很大程度影响溶剂体系的分层以及磷脂在不同溶剂层中的转移。提取剂2中0.1mM的BHT可以有效防止磷脂的氧化降解。

表6

表7

3、回收率和精密度考察

采用样品加标的方式，考察LQC、MQC、HQC中，目标分析物的回收率和精密度，每个加标水平做5次重复，按实施例1的步骤1制备待测样品，采用超高液相色谱二级质谱联用法(UPLC-MS/MS)按实施例1的步骤3的检测条件进行测定，检测结果见图2。计算回收率及精密度，所得回收率及方法精密度如下表8所示，方法回收率在70％-92％之间，精密度在20％以内，方法稳定可靠。

表8方法回收率及精密度

实施例3

按实施例1的步骤1-3，对现有肝癌组织中目标磷脂和代谢酶的含量进行定量检测，检测结果见表9。由表9可知，目标物都能得到准确定量。

表9目标分析物在肝癌组织中的含量

实施例4

1、制备待测样品

取人肝癌Huh-7细胞约2*10⁶个，超声破碎后，利用RIPA裂解液抽提样本中蛋白，获得的蛋白上清液采用BCA法测定蛋白浓度。根据测定的蛋白浓度，取蛋白上清液进行后续处理，如取多个蛋白上清液，不同蛋白上清液采用RIPA裂解液稀释至相同的浓度和体积，不同蛋白上清液的蛋白取样量为100μg。

准备试剂盒，试剂盒的组成见表4。

将100μg蛋白沉淀用1mL的复溶剂1重新溶解，以12000g离心力离心10min后获得上清液和蛋白。收集上清液，采用BCA法测定上清液中总蛋白浓度。将50μg的蛋白进行酶解，酶解后的肽段采用SOLA^TMSPE 96孔板脱盐后，冷冻干燥。采用300μL复溶剂2复溶，获得多肽溶液。其中，复溶剂1为含100mM碳酸氢铵和6.0M盐酸胍的混合水溶液，复溶剂2为水、甲醇、甲酸的混合溶液，水、甲醇、甲酸的体积之比为99:2:0.1。

将200μL第一上清液加入200μL纯水和400μL的提取剂2，涡旋30s，以10000g离心力在4℃下离心5min。取下层氯仿层挥干，用250μL复溶剂3复溶，获得磷脂提取物溶液。其中，提取剂2为含0.1mM BHT的氯仿溶液，复溶剂3为含0.1mM BHT的甲醇和氯仿的混合溶液，甲醇与氯仿的体积之比为80:20。

将40μL多肽溶液与200μL磷脂提取物溶液涡旋混合，获得待测样品。

2、制备标准测试品

标准测试品的制备过程同实施例1中步骤2。

3、仪器分析

超高液相色谱二级质谱联用法(UPLC-MS/MS)的检测过程同实施例1中步骤3，检测结果见表10。由表10可知，目标物都能得到准确定量。

表10目标分析物在肝癌细胞Huh-7中的含量

综上所述，本发明提供的一种人源组织及细胞中甘油磷脂代谢定量检测试剂盒及其检测方法和应用，能够同时准确定量检测人源性组织或细胞样本中28种功能性磷脂以及36种关键的磷脂代谢酶，灵敏度高，特异性强，所需样本量少，检测时间短，提高了方法的灵敏度、精密度、效率和检测通量，成本低廉，且试剂盒有效期长，避免了资源浪费。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括至少一个混合标准测试品，所述混合标准测试品中包括28种甘油磷脂代谢物的标准品中的一种或多种，和/或36种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品中的一种或多种，

所述28种甘油磷脂代谢物分别为：棕榈酰溶血磷脂酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、1-硬脂酰2-油酰基磷脂酰丝氨酸、硬脂酰溶血磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰肌醇、二硬脂酰磷脂酰肌醇、1-棕榈酰2-油酰基磷脂酰肌醇、1-硬脂酰2-花生四烯酰基磷脂酰肌醇、硬脂酰溶血磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、1-棕榈酰2-油酰基磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二十烷酰溶血磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰2-油酰基磷脂酰胆碱、1-棕榈酰2-花生四烯酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰2-油酰基磷脂酰胆碱、1-硬脂酰2-二十二碳六烯基磷脂酰胆碱、棕榈酰溶血磷脂酰胆碱、油酰溶血磷脂酰胆碱、硬脂酰溶血磷脂酰胆碱、棕榈酰溶血磷脂酰乙醇胺、硬脂酰溶血磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰2-硬脂酰基磷脂酰胆碱；

所述36种甘油磷脂代谢酶分别为：烷基二羟丙酮磷酸合酶、胞质酰基辅酶A硫酯水解酶、乙酰辅酶A羧化酶、酰基载体蛋白、CDP-二酰甘油-肌醇-3-磷脂酰转移酶、1-酰基甘油-3-磷脂酰基转移酶2、二羟丙酮磷酸酰基转移酶、丝氨酸棕榈酰基转移酶2、二酰基甘油O-酰基转移酶1、三磷酸腺苷结合盒转运体A8、三磷酸腺苷结合盒转运体A1、磷脂酸胞苷酰基转移酶2、磷脂酰胆碱-固醇酰基转移酶、3-磷酸甘油脱氢酶1、肉碱O-棕榈酰转移酶2、乙酰辅酶A乙酰转移酶、3-磷酸甘油脱氢酶2、磷脂酰丝氨酸合成酶、脂肪酸合成酶、磷酸胆碱胞苷酰基转移酶、肉碱O-棕榈酰转移酶1、CDP-二酰甘油-甘油-3-磷酸-3磷脂酰转移酶、丙二酸辅酶A连接酶、溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3、溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶2、三磷酸腺苷结合盒转运体A6、溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶1、磷酸胆碱转移酶1、酰基辅酶A：溶血磷脂酰甘油酰基转移酶、磷脂乙醇胺胞苷酰基转移酶、1-酰基甘油-3-磷脂酰基转移酶1、乙酰辅酶A乙酰基转移酶、甘油3磷酸酰基转移酶1、1-酰基甘油-3-磷脂酰基转移酶3、1-酰基甘油-3-磷脂酰基转移酶5、胆碱-乙醇胺磷酸转移酶。

2.根据权利要求1所述的一种试剂盒，其特征在于，所述混合标准测试品中28种甘油磷脂代谢物的标准品和36种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品复溶后的浓度范围均为0.005～110.00ng/mL；所述混合标准测试品复溶采用的溶剂为水、甲醇、氯仿的混合溶液。

3.根据权利要求1所述的一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括有提取剂1、提取剂2、复溶剂1、复溶剂2、复溶剂3，所述提取剂1为甲醇、丙酮、甲酸的混合溶液，所述提取剂2为2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的氯仿溶液，所述复溶剂1为盐酸胍、碳酸氢铵的混合水溶液，所述复溶剂2为水、甲醇、甲酸的混合溶液，所述复溶剂3为甲醇、氯仿、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的混合溶液。

4.根据权利要求1所述的一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括有至少一个混合质控品，所述混合质控品中包括与混合标准测试品相同的各种甘油磷脂代谢物的标准品及甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品。

5.根据权利要求1-4任一所述的试剂盒在定量检测人源组织及细胞中甘油磷脂中的用途。

6.一种对人源组织及细胞中甘油磷脂的检测方法，采用根据权利要求1-4任一所述的试剂盒，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的一种对人源组织及细胞中甘油磷脂的检测方法，其特征在于，步骤1)中包括以下条件中的任一项或多项：

A1)所述有机试剂蛋白沉淀法为将样本在液氮中磨碎后，采用RIPA裂解液进行抽提样本中蛋白，获得的蛋白上清液采用提取剂1提取分别获取第一上清液和蛋白沉淀；所述蛋白上清液与提取剂1的体积比为1:4～10；

A2)所述提取剂1提取为先涡旋20～60s，再超声提取5～20min，然后在-20～4℃静置1～12h，最后以10000～20000g离心力在3～5℃下离心10～60min；

A3)所述蛋白沉淀加入的质量与复溶剂1加入的体积之比为0.01～2:100，g/mL；

A4)所述复溶剂1复溶后以10000～15000g离心力离心5～20min；

A5)所述蛋白沉淀加入的质量与复溶剂2加入的体积之比为0.01～2:100，g/mL；

A6)所述第一上清液、水、提取剂2的体积比为0.9～1.1:0.9～1:1.9～2.1；

A7)所述液液萃取法为先涡旋20～40s，再以8000～12000g离心力在3～5℃下离心4～6min；

A8)所述第一上清液与复溶剂3加入的体积比为150～250：200～300；

A9)所述多肽溶液与磷脂溶液的体积比为1:4～6。

8.根据权利要求6所述的一种对人源组织及细胞中甘油磷脂的检测方法，其特征在于，步骤2)中包括以下条件中的任一项或多项：

B1)所述甲醇超声溶解的条件为：温度：冰水浴；超声时间：1～5min；

B2)所述甲醇与氯仿的混合溶液超声溶解的条件为：温度：冰水浴；超声时间：1～5min；

B3)所述甲醇与氯仿的体积比为1～3:1；

B4)所述水、甲醇、氯仿的混合溶液中含有0.05～0.15mM 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，水、甲醇、氯仿的体积比为0.9～1.1:3～5:0.9～1.1；

B5)所述水、甲醇、氯仿的混合溶液超声溶解的条件为：温度：冰水浴；超声时间：1～5min。

9.根据权利要求6所述的一种对人源组织及细胞中甘油磷脂的检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述液相色谱质谱联用法为超高液相色谱串联质谱联用法；

所述超高液相色谱的测定条件为：

色谱柱：T3液相色谱柱；柱温：40-60℃；进样量：0.5-2μL；流速：0.2-0.4mL/min；流动相A相为水，内含体积百分比为0.05-0.15％的甲酸和9-11mmol/L的甲酸铵；流动相B相为体积比为25-35:65-75的乙腈与异丙醇混合溶液，内含0.05-0.15％的甲酸和9-11mmol/L的甲酸铵；分析时间为40min；梯度洗脱；

所述质谱的测定条件为：

电离方式：电喷雾离子源；离子源温度为440-460℃；气帘气为30-40psi；碰撞气为7-9psi/medium；离子喷雾电压为-4500.00/5500V；离子源Gas1:45-55psi；Gas2:45-55psi；监测方式为多反应监测MRM模式。

10.根据权利要求9所述的一种对人源组织及细胞中甘油磷脂的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的具体程序为：0-1min，A相：B相体积比为98：2-98：2；1-15min，A相：B相体积比为98：2-60：40；15-32min，A相：B相体积比为60：40-2：98；32-37min，A相：B相体积比为2：98-2：98；37-37.1min，A相：B相体积比为2：98-98：2；37.1-40min，A相：B相体积比为98：2-98：2。