CN109055331A

CN109055331A - 一种磷脂酶b及其在制备甘油磷酸胆碱中的应用

Info

Publication number: CN109055331A
Application number: CN201810789521.8A
Authority: CN
Inventors: 陈可泉; 卢媛媛; 王昕�; 李辉; 欧阳平凯
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2018-07-18
Filing date: 2018-07-18
Publication date: 2018-12-21

Abstract

本发明公开了一种磷脂酶B及其在制备甘油磷酸胆碱中的应用。该磷脂酶B的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。培养包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的重组细胞，从而获得磷脂酶B。将所得磷脂酶B应用于制备甘油磷脂酰胆碱中，解决了磷脂酶B的来源问题，同时较好的解决了磷脂酶B出现的包涵体问题，弥补了现有技术中，单用磷脂酶A₁催化中遇到的酰基转移的不足。为工业生产提供了一种可以高效生产甘油磷脂酰胆碱的方法。该方法可以显著的提高酶的催化效率、产品的得率和底物的利用率。

Description

一种磷脂酶B及其在制备甘油磷酸胆碱中的应用

技术领域

本发明属于生物催化技术和磷脂类产品的制备领域，特别涉及一种磷脂酶B及其在制备甘油磷脂酰胆碱中的应用。

背景技术

L-a-甘油磷脂酰胆碱（L-a-GPC,CAS号：28319-77-9）是自然界中天然存在的物质，是由磷脂分子上两条脂肪酸链完全被水解的产物，是体内卵磷脂代谢的产物之一。GPC是合成乙酰胆碱神经递质的前体，并能迅速分解磷脂降解的中间体，还可以迅速提供跨大脑血脑屏障的胆碱，被证明能够增强年轻个体的生长激素释放，增加阿兹海默氏症类型老年痴呆症患者的荷尔蒙分泌，如治疗阿兹海默症、小脑性共济失调、精神分裂症、双相情感障碍、神经和精神疾病等，还可以降低血脂、保护血管、改善老年人认知能力和记忆力。这些重要的医药价值和保健价值，使得GPC在医药领域和食品添加剂领域存在巨大的市场需求，但它在自然界中的含量较少，主要存在于动物器官、牛的乳汁和卷心菜中。因此，创建一种高效生产GPC的技术将具有重要的药用、社会和研究价值。

早期的GPC主要是从牛的胰脏组织中直接提取制备的，该方法技术及工艺比较基础，获取量相对较低。随着GPC药用、保健、临床价值的研究深入，研究人员发现了越来越多的GPC的制备方法，其中较具代表性的制备方法包括：化学法和生物酶水解法。由于化学法在制备GPC的方法存在部分的环境污染、成本过高、产品纯度低等问题。随着生物技术的发展，生物酶法逐渐成为GPC制备的新型技术，其具有环保、高效的特点，故成为现今GPC制备技术的研究热点。

目前已经有专利公开了利用商业化的磷脂酶A₁（Lecitase Μltra）在水相体系中制备GPC的研究，但是磷脂酶A₁只能专一性的水解Sn-1位的脂肪酸，磷脂酶A₂只能专一性的水解Sn-2位的脂肪酸；若单用磷脂酶A₁催化PC水解生成GPC，则要先进行一步酰基转移反应，将Sn-2位的脂肪酸转移到Sn-1位上，才能将剩余的脂肪酸全部水解下来。这就使得仅用磷脂酶A₁催化生成GPC反应的速率和PC的利用程度非常依赖于中间产物Sn-2-LPC的酰基转移的速率。

目前也已经有研究者采用了联合磷脂酶A₁和磷脂酶A₂的方法催化生产GPC的反应体系，但是由于磷脂酶A₂的来源有限且价格昂贵，极大地限制了这种技术的发展。而本研究使用的磷脂酶B，可以同时水解Sn-1位和Sn-2位的脂肪酸。目前磷脂酶B已经从动物、植物、微生物等不同的来源获得。但是动植物磷脂酶B来源有限且价格昂贵。要解决GPC的制备问题，就需要先解决磷脂酶B的来源问题，如何获取一种低廉的磷脂酶B是当今值得研究的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种磷酸酶B及其在制备甘油磷酸胆碱中的应用，通过构建产磷酸酶B的基因工程菌，发酵菌株，从而获得磷酸酶B，发酵条件简单，为以后工业化生产奠定了基础。

一种磷酸酶B，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该磷脂酶B的基因序列来源于荧光假单胞菌（Pseμdomonas flμorescens），其原始基因序列如SEQ ID NO.2所示，将SEQ IDNO.2所示的基因序列进行适合大肠杆菌表达的密码子优化，形成大量包涵体，无法得到可溶性蛋白，不能用于进一步的催化制备甘油磷脂酰胆碱。

一种重组细胞，包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

上述重组细胞的构建方法，将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列克隆到表达质粒上，得重组质粒；将重组质粒转化宿主菌，即得重组细胞。

上述重组细胞的构建方法，具体包括的步骤：

第一步，在SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的两端设计酶切位点NcoI和XhoI，亚克隆到载体pET-28a上，获得重组质粒pET-28a-plb；

第二步，将重组质粒pET-28a-plb转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到磷脂酶B的表达菌种BL21（DE3）/pET-28a-plb。

上述重组细胞的培养方法，具体步骤如下：

1)挑取BL21（DE3）/pET-28a-plb单菌落，接种于LB培养基，置于37℃过夜培养;

2)将该菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基体积的1-5%，37℃培养2~3小时，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，28℃过夜培养。

上述磷酸酶B在制备甘油磷脂酰胆碱中的应用。

所述应用的步骤如下：向磷酸盐缓冲溶液中加入磷酸胆碱（PC），均质1h至磷酸胆碱（PC）在体系中分散均匀，再加入磷脂酶B粗酶液，使得体系中酶蛋白浓度为1g/L，反应温度为37 ℃、200 r /min振荡反应并定时取样，液相检测GPC的含量。

有益效果：

本发明通过对来源于Pseμdomonasflμorescens的磷脂酶B进行密码子优化得到了可以在大肠杆菌中正常表达的基因序列，并构建了产磷脂酶B的重组大肠杆菌，解决了磷脂酶B的来源问题，同时较好的解决了磷脂酶B出现的包涵体问题，弥补了现有技术中，单用磷脂酶A1催化中遇到的酰基转移的不足。为工业生产提供了一种可以高效生产甘油磷脂酰胆碱的方法。该方法可以显著的提高酶的催化效率、产品的得率和底物的利用率。

附图说明

图1为本发明中重组质粒的构建图；

图2为磷脂酶A₁和磷脂酶A₂作用磷酸胆碱PC的位点的图；

图3为磷脂酶B催化磷酸胆碱生成甘油磷脂酰胆碱的反应路径图，其中，1-上清，2-沉淀；

图4为30℃时蛋白电泳图，其中，1-上清，2-沉淀；

图5为20℃低温诱导蛋白电泳图，其中，1-上清，2-沉淀；

图6为分子伴侣共表达蛋白电泳图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详细介绍。

实施例1 重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-plb的构建

根据已报导的Pseμdomonasflμorescens来源磷脂酶B的氨基酸序列（NCBI登录号：GΜ367870）进行密码子优化后合成该序列，密码子优化后的序列如SEQ ID NO.1所示，两端设计酶切位点NcoI和XhoI。

上游引物P1：（CATGCCATGGGCATGAAAAAAGTTATGCTG）

下游引物P2：（CCGCTCGAGGAAACGGTAGGTAGC），亚克隆到载体PET-28a上，获得重组质粒pET-28a-PLB。将构建好的重组质粒PET-28a-PLB转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到磷脂酶B的表达菌株BL21（DE3）pET-28a-PLB。

实施例2 培养表达大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-plb

挑取表达磷脂酶B的基因工程菌单菌落，接种于LB培养基，置于37℃过夜培养；再将该菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基体积的1-5%，37℃培养2-3小时至OD 0.4-0.6，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，30℃过夜培养，离心收集表达磷脂酶B的基因工程菌，进行细胞破碎，8000rpm，条件下，离心20min收集上清酶液，随后进行酶活力检测。

酶活力检测的检测方法：按照一定比例稀释后的100µL酶液加入到5mL含有蛋黄卵磷脂的PBS缓冲液 (pH 7.0)中，使蛋黄卵磷脂的终浓度为60g/L，充分混匀后置于 40℃水浴锅中反应5min，加入终止剂95%的乙醇，震荡，加入酚酞试剂，然后用NaOH(已知浓度)溶液滴定，观察颜色，确定空白中颜色变色临界点为滴定的终点，将样品滴定终点与空白的颜色保持一致，计算碱液的消耗量；磷脂酶酶活力定义为：一个磷脂酶活力单位(Μ)为在指定条件下每分钟水解磷脂产生1µmol游离脂肪酸所需的酶量。

磷脂酶酶活力计算公式：X=1000×(V-W)×c×n×t

其中：X-样品的酶活，单位为Μ/mL；V测量样品用去NaOH溶液的量，单位为mL；W测量空白用去NaOH溶液的量，单位为mL；c NaOH溶液的浓度，单位为mol/L；n酶液的稀释倍数；t测定酶活时的反应时间，单位为min

根据上述方法检测，所得结果酶活仅为10Μ/mg。

实施例3 磷脂酶B表达菌株蛋白表达的研究

挑取表达磷脂酶B的基因工程菌单菌落，接种于5mLLB培养基，加入50mg/mL的卡那霉素，置于37℃培养6-8h；再将该菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基体积的1-5%，加入50mg/mL的卡那霉素，37℃培养2-3小时至OD 0.4-0.6，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，30℃培养12h，离心收集表达磷脂酶B的基因工程菌，进行细胞破碎，8000rpm，条件下，离心20min收集上清酶液，将上酶液和破碎沉淀进行蛋白电泳验证磷脂酶B的蛋白表达。在30℃，IPTG0.5mmol/L的诱导条件下，研究发现出现了比较严重的包涵体现象（如图3）。经过了降温至20℃诱导，以及降低诱导剂浓度至0.1mmol/L的诱导条件下，经蛋白胶验证均未能较好的解决包涵体问题（结果如图4）。

后期，我们使用了分子伴侣共表达系统，分子伴侣能够帮助蛋白正确折叠，提高蛋白的可溶性表达，减少包涵体的形成，较好的增强目的蛋白可溶性的表达（结果如图5）。因此后续使用共表达系统来继续进行下一步的研究。

实施例4 分子伴侣共表达质粒的构建

将原先构建好的pET28a-plb质粒和分子伴侣质粒共同转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到磷脂酶B和分子伴侣的共表达菌种BL21（DE3）/pET28a-plb。

步骤一：先制备转化有伴侣蛋白PKJE7质粒的E.coli细胞，

具体方法如下：

（1）在10μL的伴侣蛋白PKJE7质粒体系中加入25μL的E.coli感受态细胞，冰上放置25min；

（2）在42℃水浴锅中热击45s；

（3）再在冰上放置2-3min；

（4）在该体系中加入800μL的SOC培养基，在37℃的摇床培养1h，4000rcf，离心1min；

（5）将沉淀重悬后涂板；

（6）过夜培养得到单菌落；

步骤二：接下来制备含有伴侣蛋白PKJE7质粒的E.coli感受态细胞

具体方法如下：

（7）从上述步骤（6）的LB平板挑取单菌落，接种于5mL的LB培养基中，37℃过夜培养；

（8）1%-2%接种量转接至50mL LB中，27℃，培养2-2.5h左右，使OD=0.5-0.6；

（9）冰浴20min，使其停止生长；

（10）4℃条件下，1600g，离心5min，倒去上清液；

（11）将沉淀清缓的悬浮于2mL冰冷的0.1mol/L的MgCl₂（pH7.2）溶液中，1600g，离心5min，弃去上清液；

（12）将沉淀清缓的悬浮于冰冷的含有20%甘油的0.1mol/L的CaCl₂（pH7.2）溶液中；

（13）冰浴20-30min，4℃，1100g，离心5min，弃去上清；

（14）细胞沉淀用500μL冰冷的含有20%甘油的0.1mol/LCaCl₂（pH7.2）溶液中悬浮，-80℃保存，备用，分装为100μL/G管；

步骤三：将目的蛋白表达质粒按照步骤一的转化方法转化进入含有伴侣蛋白PKJE7质粒的E.coli感受态细胞，然后在含有卡纳霉素和氯霉素的平板上培养，筛选出正确的转化体。

实施例5 磷脂酶B和分子伴侣的共表达菌种BL21（DE3）/pET28a-plb的培养

挑取分子伴侣共表达磷脂酶B的基因工程菌单菌落，接种于5mLLB培养基，加入50mg/mL的卡那霉素和35mg/mL的氯霉素，置于37℃培养6-8h；再将该菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基体积的1-5%，加入50mg/mL的卡那霉素和35mg/mL的氯霉素，37℃培养2-3小时，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L和L-阿拉伯糖诱导剂至0.5mmol/L后，37℃培养12h后，离心收集表达磷脂酶B的基因工程菌，进行细胞破碎，4℃，8000rpm，条件下，离心20min收集上清酶液。

实施例6 分子伴侣共表达的磷脂酶B表达菌株蛋白表达的研究

新构建的磷脂酶B的表达菌株的蛋白表达情况如图5所示，从图中可以看出，已经较好的解决了包涵体的问题，按照实施例2中酶活测定方法，测定此磷酸酯酶B的酶活达到187Μ/mg，提高了18倍左右。

实施例7 利用分子伴侣共表达所产的磷脂酶B催化PC水解生成GPC的反应

在磷酸盐缓冲溶液中，加入利用分子伴侣共表达所产的磷脂酶B的粗酶液，PC含量60g/L，37℃，200rpm震荡反应，反应时间1-24h，定时取样，高效液相色谱法检测产物GPC的含量和底物PC的含量。反应最终得到的GPC的转化率为90%，PC的消耗率为95%以上。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一种磷脂酶B及其在制备甘油磷脂酰胆碱中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catgccatgg gcatgaaaaa agttatgctg 30

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccgctcgagg aaacggtagg tagc 24

<210> 3

<211> 1272

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaaaaaag ttatgctgaa aaccaccctg tctctggctg ttaccctggc ttctacccag 60

atcttcgctg ctggtttcgc tctgaacgaa cagtctatct ctggtatggg taccggtttc 120

gctggtcgtt cttcttctgc tgacgacgct tctaccgttt acggtaaccc ggctggtatg 180

tctcgtctga aacgtgaaca ggttaccggt ggtgttgctg ttgttgacgc tcacaccgac 240

atctctaaca cctcttcttc tccgaacggt ggttctaaca aaggtgacat ggttccgttc 300

accgctgttc cgatgggttt ctacgttaaa ccgatcgacg accactgggc tttcggtttc 360

ggtgtttacg ttccgctggg tctgatcacc gactacgaaa acggtttcgc tggtcgttac 420

ttcggttcta aatctgaagt tcaggttatc accttccagc cgaccgtttc ttacgctttc 480

aacgacaaag tttctatcgg tttcggtccg accatcaacc gtatcgacgg tgctctggaa 540

tctaacctgt ctatcaccca ggctgctccg gacggtaaag ttaaaatcaa aggtgacgac 600

accgctctgg gttacaacgt tggtctgctg gttcaggcta ccgacaccac ccgtctgggt 660

ctgacctacc actctaaagt tgactacaaa ctggaaggta acaccaaagt taactacggt 720

gttctgggtg ctatcggtct gggtgctaac cagaaatacg acgcttctct gaaaatcacc 780

accccggaat ctatcgactt ctctgttacc caggctatca acgaccgttg gaacgtttac 840

gctggttcta cctggacccg ttggtctcag ctggaaaaaa tcaccgttaa aaactctggt 900

gttcagccgc tgctggctgg tcagttcggt gaaatcaccg aagaccagaa ctggcacgac 960

tcttgggctt acgctgttgg tacctcttac cagctgaaca aagaatgggt tctgcgtacc 1020

ggtctgacct tcgaccaggc tccgaccaac aacgttgacc gttctccgcg tatcccgacc 1080

ggtgaccgta ccatcttctc tatcggtgct ggttggtctc cgaccgaaga cctgaccatc 1140

gacgttgctt actcttacct gaaagaagaa tctgttaaaa tccgtaacga aaacaaccgt 1200

ggtcagacct acgacgctaa atacgaaaac tctgctaacg gtttcggtgt tggtgctacc 1260

taccgtttct aa 1272

<210> 4

<211> 1272

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaaaaaag tcatgctcaa aaccaccctt agccttgccg ttacccttgc ctccactcag 60

attttcgcgg ccggctttgc cctcaacgaa caaagcatca gcggtatggg aactggtttt 120

gccgggcgat cttcttctgc agacgacgca agcactgttt atggcaaccc tgccggcatg 180

tcgcgcctca agcgtgaaca agtgaccggt ggcgtagccg tcgtcgatgc tcatacagat 240

atcagcaata ccagctccag ccccaacggc ggcagcaaca aaggcgacat ggtgcccttc 300

accgctgtac ctatgggctt ctatgtcaaa ccgatcgatg atcactgggc attcggcttc 360

ggcgtctatg tgccgctcgg cctgatcact gattatgaaa acggttttgc cggccgttac 420

ttcggcagca agtccgaagt acaagtgatc accttccagc caaccgtcag ctacgccttc 480

aatgacaagg tgtcgatcgg tttcggcccg accatcaacc gtatagacgg tgcgctggaa 540

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gtactcggcg cgatcggcct cggtgccaac cagaagtacg acgcttcgct gaagatcact 780

acgcctgagt ccatcgactt ctccgttact caggcgatca acgatcgctg gaacgtttac 840

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gtgcagccgc tgctggccgg tcagttcggt gaaatcaccg aagaccagaa ctggcatgac 960

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gacgtcgcct actcgtacct gaaagaagag tcggtcaaga tccgcaacga aaacaaccgt 1200

ggccagacct acgatgccaa gtatgaaaac tcggcgaacg gtttcggtgt tggcgcgacc 1260

taccgcttct ga 1272

Claims

1.一种磷酸酶B，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种重组细胞，其特征在于，包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

3.基于权利要求2所述的一种重组细胞的构建方法，其特征在于，将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列克隆到表达质粒上，得重组质粒；再将重组质粒转化宿主菌，即得重组细胞。

4.根据权利要求3所述的一种重组细胞的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：第一步，在SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的两端设计酶切位点NcoI和XhoI，亚克隆到载体pET-28a上，获得重组质粒pET-28a-plb；第二步，将重组质粒pET-28a-plb转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到磷脂酶B的表达菌种BL21（DE3）/pET-28a-plb。

5.基于权利要求2的重组细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：1）挑取BL21（DE3）/pET-28a-plb单菌落，接种于LB培养基，置于37℃过夜培养；2）将该菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基体积的1-5%，37℃培养2~3小时，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，28℃过夜培养。

6.基于权利要求1所述的磷酸酶B在制备甘油磷脂酰胆碱中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：向磷酸盐缓冲溶液中加入磷酸胆碱，均质1h至磷酸胆碱在体系中分散均匀，再加入磷脂酶B粗酶液，使得体系中酶蛋白浓度为1g/L，反应温度为37 ℃、200 r /min振荡反应并定时取样，液相检测GPC的含量。