CN111118050A - 一种构建高产磷脂酶b的重组大肠杆菌的方法及其培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种构建高产磷脂酶B的重组大肠杆菌的方法及其培养方法。本发明选取来自Pseudomonas fluorescens的磷脂酶B基因PLB,经密码子优化后,重组菌经破碎后得到的粗酶液中目标蛋白多以包涵体形式存在,通过添加分子伴侣共表达明显的提高了PLB蛋白的可溶性表达,与原始菌株相比,酶活提高了约9倍。最终通过对重组菌株产酶条件的研究,确定了产酶的最佳条件,在最佳条件下,PLB酶活可达到524.64 U/mg,较原始酶活提高了约26倍。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域,具体涉及一种构建高产磷脂酶B的重组大肠杆菌的方法及其培养方法。
背景技术
磷脂酶 B 的应用是将磷脂水解为各类小分子物质,如氨基酸、乙醇胺等,以满足工业应用上的需求。目前磷脂酶 B 被应用在很多方面,例如在动物饲料中的应用、医疗上的应用、制作面包、蛋黄、植物油和大豆原油中的精炼等方面。(1)在动物饲料中添加磷脂酶B,可以促进磷脂被分解转化为小分子易被吸收消化的物质,可以使动物的生长速度加快;另外一个方面是磷脂酶 B 可以将磷脂水解为溶血磷脂,成为性能很好的乳化剂,改善了动物在生长发育过程中饲料的利用率,节约投入的成本;(2)磷脂酶 B 属于抗菌消炎及抗过敏的酶类,可以作用于神经或者肌肉,能抵抗病毒的感染,在一些皮肤病上的治疗也有很好的效果;此外磷脂酶 B 可以用于化妆品中,可以加快受损皮肤的重生,降解掉已经被破坏的脂肪酸分子链,去除坏死组织,在化妆品中的开发应用中越来越普遍,越来越多的企业已经将磷脂酶 B 作为主要的研究对象。
分子伴侣是一类蛋白质,它可以有助于细胞内的其它多肽完成正确组装。形成有聚集倾向或是非天然构型的蛋白往往是系统 DnaK 和 GroEL 分子伴侣的作用对象。其中Hsp 70 分子伴侣家族的DnaK 系统(包括 DnaJ,GrpE 和Dnak分子伴侣),主要通过减少蛋白聚集和促进错误折叠的蛋白水解来减少IBs 的形成。Hsp 60 分子伴侣家族的 GroEL 系统(包括 GroES 和GroEL),介导可溶和不可溶的蛋白质状态的改变,并在 IBs 形成和降解中发挥着积极的作用。Takara公司将这几种伴侣蛋白通过组合提供了4种商品化的分子伴侣质粒使得研究分子伴侣对蛋白表达的影响更方便。
由于磷脂酶 B 具有的巨大商业价值,人们对于磷脂酶 B 开展了广泛而深入的研究,近年来,随着磷脂酶 B 的应用范围逐渐扩大,研究者愈加重视对磷脂酶 B 的制备研究。国内目前主要侧重于直接筛选产磷脂酶的野生菌,通过发酵优化提高表达水平。司武阳等研究者筛选出高产磷脂酶的菌株,并从不同的影响因素如碳源、复合氮源等对该菌发酵产酶的最佳条件进行探究,最高酶活达到18.6 U/mg;付建红等研究者通过超低温和碱性条件筛选得到高产磷脂酶的菌株,经过摇瓶发酵条件优化,磷脂酶活力最高达到17.5 U/mg。同时研究了一些磷脂酶基因的同源表达和异源表达,国内延晋雷等研究者在大肠杆菌中克隆表达了来源于液化沙雷氏菌的磷脂酶基因,经过发酵得到的胞外磷脂酶酶活为128.7U/mg。国外主要研究了磷脂酶基因在异源宿主系统进行表达,来源于米曲霉、酿酒酵母、粗糙脉孢菌的磷脂酶基因,已经成功克隆表达。虽然国内外研究者关于磷脂酶筛选及重组表达产酶的报道近年来逐渐增多,但其产酶表达水平还亟待提高来适应工业化生产。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种构建高产磷脂酶B的重组大肠杆菌的方法及其培养方法,该构建方法利用分子伴侣提高磷脂酶B目标蛋白的可溶性表达后,提高了磷脂酶B的产量,结合特定的培养方法,所得菌株产磷脂酶B的酶活力,适合大规模工业化生产。
一种构建高产磷脂酶B的重组大肠杆菌的方法,包括以下步骤:
第一步,将磷脂酶B基因PLB基因密码子优化后交由思普金生物科技有限公司合成于载体pET-28a的NcoI/XhoI酶切位点之间,转入克隆载体Trans1-T1,经过LB平板初筛后,挑点进行菌落PCR验证后测序,验证重组质粒构建是否正确;
第二步,将阳性菌株接种至5ml LB/KanR液体培养基,于37℃、200rpm 条件下振荡培养过夜,24小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取质粒pET28a-PLB;
第三步,将商品化的分子伴侣质粒pTf16与重组质粒pET28a-PLB混匀后,导入到大肠杆菌BL21(DE3)中共表达即得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-PLB/pTf16。
上述高产磷脂酶B的重组大肠杆菌的培养方法,包括以下步骤:
步骤1,挑选重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-PLB/pTf16至有50 mg/L卡那霉素和34mg/L的氯霉素的5 mL LB 培养基中,在37℃、200rpm条件下振荡至OD600≈1,然后转接至新鲜50 mg/L卡那霉素和34 mg/L的氯霉素的100 mL LB培养基中继续培养至OD600≈0.6~0.8;
步骤2,加入IPTG 0.2~0.5mmol/L,20~25℃下诱导表达7~9h;
步骤3,收集发酵液中的菌体,6000-8000rpm离心8~10min,用PBS清洗两次后,将细胞超声破碎,破碎后的悬浊液在4℃,12000 rpm 的条件下离心,然后将上清粗酶液纯化后进行酶活测定。
有益效果:
与现有技术相比,本发明一种构建高产磷脂酶B的重组大肠杆菌的方法及其培养方法具有如下优势:
1、目前国内已知报道的磷脂酶 B 酶活最佳可达到128.7U/mg,而采用此方法生酶活可达到524.64 U/mg,可满足大规模工业生产要求。
2、通过添加分子伴侣共表达明显的提高了PLB在大肠杆菌中的可溶性表达,与原始菌株相比,酶活提高了约9倍。
3、探索产酶条件,在最适产酶条件下,酶活可以达到524.64 U/mg,与原始菌株相比,酶活提高了约26倍。
附图说明
图1为质粒pET28a-PLB构建图谱;
图2为BL21(DE3)/pET28a-PLB 菌株PLB表达情况;
图3为4种不同分子伴侣共表达菌株的酶活情况;
图4为不同OD条件下诱导表达下酶活情况;
图5为不同浓度IPTG诱导下的酶活情况;
图6为不同温度下诱导表达下的酶活情况;
图7为不同诱导时间下的酶活情况。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明,但这并非是对本发明的限制,本领域技术人员根据本发明的基本思想,可以做出各种修改或改进,但是只要不脱离本发明的基本思想,均在本发明的范围之内。
本发明中所用的生物材料均为商业化产品,可随意购买。
实施例1 高产磷脂酶B的重组大肠杆菌的构建
1.1 BL21(DE3)/pET28a-PLB菌株的构建
选取来自Pseudomonas fluorescens 的PLB 基因,经密码子优化后,交由思普金生物科技有限公司合成于载体pET-28a的NcoI/XhoI酶切位点之间,构建质粒pET28a-PLB,其质粒图谱如图1所示。
将重组质粒pET28a-PLB 转化进入将连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1。PCR筛选阳性菌株Trans1-T1-pET28a-PLB并进行DNA测序,验证重组质粒构建正确。
将阳性菌株接种至5ml LB/KanR液体培养基,所述LB/KanR液体培养基组成为:蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L,于37℃、200rpm 条件下振荡培养过夜。24小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取质粒pET28a-PLB。取2μL pET28a-PLB质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),PCR 筛选阳性菌株。
1.2 BL21(DE3)/pET28a-PLB菌株的诱导表达及SDS-PAGE验证
将阳性菌株接种至5ml LB/KanR 液体培养基,于37℃、200rpm 条件下振荡培养至OD600≈1,再按10:100的比例接种于100mL新鲜的LB/KanR 液体培养基,37℃、200rpm 条件下振荡培养至OD600≈0.6,加入0.5 mmol/L IPTG,28℃的条件下诱导12h进行表达,通过离心(6000~8000 rpm,8~10min),收集发酵液中的菌体,用PBS清洗两次后,将细胞超声破碎,破碎后的悬浊液在4℃,12000 rpm 的条件下离心,得到的沉淀和上清液分别进行SDS-PAGE验证,其SDS-PAGE 胶图如图2所示。然后将上清粗酶液采用镍柱纯化蛋白的方法纯化后进行酶活测定。所述LB/KanR液体培养基的组成为:蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L。
1.3 分子伴侣与质粒pET28a-PLB共表达菌株的构建及诱导表达
将实验室现有的5种商品化的分子伴侣质粒(pGro7; pG-KJE8; pTf16; pG-Tf2)分别与重组质粒pET28a-PLB混匀后,分别导入到大肠杆菌BL21(DE3)中,将单菌落接种至50mg/L卡那霉素和34 mg/L 的氯霉素的5mL LB培养基中,于37℃、200rpm条件下振荡培养至OD600≈1。再按10:100的比例接种于50 mg/L卡那霉素和34 mg/L的氯霉素的100mL液体培养基,37℃、200rpm条件下振荡培养至OD600≈0.6,加入0.5 mmol/L IPTG,28℃的条件下诱导12h进行表达,通过离心(6000~8000 rpm,8~10min),收集发酵液中的菌体,用PBS 清洗两次后,将细胞超声破碎,破碎后的悬浊液在4℃,12000rpm的条件下离心,将上清粗酶液采用镍柱纯化蛋白的方法纯化后进行酶活测定,5种分子伴侣与菌株共表达的酶活对比如图3所示(与分子伴侣共表达蛋白的酶活均有所提高,其中与分子伴侣pKJE7质粒共表达的蛋白酶活最高)。
实施例2 BL21(DE3)/pET28a-PLB/pTf16菌株产酶条件优化
阳性菌株BL21(DE3)/pET28a-PLB/pTf16接种至含50 mg/L卡那霉素和34 mg/L的氯霉素5mlLB液体培养基,37℃、200rpm条件下振荡培养至OD600≈1。按10:100的比例接种于含50mg/L卡那霉素和34 mg/L的氯霉素100mL的LB液体培养基,37℃、200rpm条件下振荡培养至OD600≈0.6~0.8(如图4所示,0.6~0.8之间其酶活都较好,但由图中可以看出在0D600为0.8时诱导,其产酶的酶活也最强)。加入IPTG 0.2~0.5mmol/L(如图5所示,浓度为0.2~0.3mmol/L之间酶活较好,但是0.3mmol/L浓度的IPTG效果最佳);在20~25℃(如图6所示,20~25℃之间酶活较好,25℃最佳)、200rpm 条件下振荡培养7~9h(如图7所示,诱导时长为9h时其产酶的酶活最强)。收集发酵液中的菌体,离心(6000~8000rpm,8~10min),用PBS清洗两次后,将细胞超声破碎,破碎后的悬浊液在4℃,12000rpm的条件下离心,然后将上清粗酶液纯化后进行酶活测定。酶活结果分别如图4-7所示,即当重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-PLB/pTf16 培养至OD600≈0.8时,加入IPTG浓度 0.3 mmol/L,在25℃的条件下诱导表达9h,PLB 的活性最高。在最适产酶条件下,酶活可以达到524 U/mg。
Claims (2)
1.一种构建高产磷脂酶B的重组大肠杆菌的方法,其特征在于,包括以下步骤:
第一步,将磷脂酶B基因PLB基因密码子优化后交由思普金生物科技有限公司合成于载体pET-28a的NcoI/XhoI酶切位点之间,转入克隆载体Trans1-T1,经过LB平板初筛后,挑点进行菌落PCR验证后测序,验证重组质粒构建是否正确;
第二步,将阳性菌株接种至5ml LB/KanR液体培养基,于37℃、200rpm 条件下振荡培养过夜, 24小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取质粒pET28a-PLB;
第三步,将商品化的分子伴侣质粒pTf16与重组质粒pET28a-PLB混匀后,导入到大肠杆菌BL21(DE3)中共表达即得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-PLB/pTf16。
2.基于权利要求1所述的高产磷脂酶B的重组大肠杆菌的培养方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1,挑选重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-PLB/pTf16至有50 mg/L卡那霉素和34mg/L的氯霉素的5 mL LB 培养基中,在37℃、200rpm条件下振荡至OD600≈1,然后转接至新鲜50 mg/L卡那霉素和34 mg/L的氯霉素的100 mL LB培养基中继续培养至OD600≈0.6~0.8;
步骤2,加入IPTG 0.2~0.5mmol/L,20~25℃下诱导表达7~9h;
步骤3,收集发酵液中的菌体,6000-8000rpm离心8~10min,用PBS清洗两次后,将细胞超声破碎,破碎后的悬浊液在4℃,12000 rpm 的条件下离心,然后将上清粗酶液纯化后进行酶活测定。
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