KR101426441B1 - 두날리엘라 유래의 탄산 무수화 효소 및 파이오덱틸룸 트리코뉴툼 ｃｃｍｐ637 유래의 포스포에놀피부르산 카르복실아제를 발현하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 유기산의 생산방법 - Google Patents
두날리엘라 유래의 탄산 무수화 효소 및 파이오덱틸룸 트리코뉴툼 ｃｃｍｐ637 유래의 포스포에놀피부르산 카르복실아제를 발현하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 유기산의 생산방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 Dunaliella sp . 유래의 탄산 무수화 효소 및 P. tricornutum CCMP 632 유래의 포스포에놀피부르산 카르복실라제를 발현하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 유기산 생산방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 Escherichia coli BL21(DE3)::DspGCPtP2 균주는 숙신산, 젖산 등의 유기산 생산능이 우수하여, 미생물을 이용한 대사공학 등에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 두날리엘라(Dunaliella sp ) 유래의 탄산 무수화 효소 및 파이오덱틸룸 트리코뉴툼(P. tricornutum CCMP 632) 유래의 포스포에놀피부르산 카르복실아제를 발현하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 유기산의 생산방법에 관한 것이다.
해양에 서식하는 미세조류는 광합성을 하기 위해, 이산화탄소를 고정화(fixation)하는 탄소고정기작(CCM, carbon concentration mechanism)을 지니며, 광범위한 이산화탄소 농도에 적응할 수 있게 생리학적, 형태학적인 진화를 하였다.
현재까지 해양 미세조류의 CCM 기작 중에서 탄산 무수화 효소(carbonic anhydrase, CA)에 대한 연구는 많이 알려지지 않았으며, 초기 연구단계에서 높은 염도에 대한 생리적 적응에 따른 독특한 CA가 보고되었다. 2000년 이후에 밝혀진 CA의 종류는 현재까지 총 5개의 종류가 있으며, 각각 α-CA, β-CA, γ-CA, δ-CA, ζ-CA로 분류하며(Hewett-Emmett and Tashian. 1996, Trip et al., 2001), 각 그룹 간에는 단백질의 일차 구조의 유사성이 전혀 없기 때문에 서로 다른 경로를 통해서 진화한 것으로 여겨지고 있다. CA는 막에 위치하여 미생물 외부에 존재하는 이산화탄소를 생물체 내부로 도입하는 역할을 하며, 이때 생산되는 탄산(carbonic acid)은 주변 환경에 의하여 중탄산염(bicarbonate) 이온이나 탄산염 이온으로 전환된다.
한편, 또 다른 효소인 포스포에놀피부르산 카르복실라제(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEP carboxylase)는 미생물의 당분해(glycolysis) 과정에서 핵심적인 역할을 하는 중간물질을 생성하는 효소이다. 상기 효소의 기질인 대장균의 PEP(phosphoeolpyruvate)는 혐기적인 조건에서 젖산염(lactate), 포름산염(formate), 아세테이트(acetate) 및 에탄올로 전환된다. 그리고 상기 반응과 함께 피부르산 카르복실라제(pyruvate carboxylase, PYC)에 의하여 옥살아세테이트(oxaloacetate)가 만들어진다. 포스포에놀피부르산 카르복실아제는 효소 반응에서 기질로서 PEP를 사용하여 물과 이산화탄소를 이용하여 4탄소 물질인 옥살레이트(oxaloaceetae)를 생산한다. 상기 옥살레이트는 대사과정을 거쳐 숙신산 염 등으로 전환된다.
세포 내외에서 무기탄소인 중탄산염(HCO3)과 CO2의 상호 전환을 촉매하는 효소인 탄산 무수화 효소(carbonic anhydrase)는 이산화탄소 고정화에 중요 기능을 담당하고, 미생물 내 C4 물질 생산을 이끄는 포스포에놀피부르산 카르복실라제( phosphoenolpyruvate carboxylase)는 중탄산염과 물 분자를 이용하여 TCA 회로의 옥살로아세테이트(oxaloacetate)로 전환하는 반응을 이끄는 대사를 촉진하여, 결과적으로 숙신산 생산을 촉진한다.
이에 본 발명자는 미세조류인 두날리엘라(Dunaliella sp.)의 탄산 무수화 효소(carbonic anhydrase)를 코딩하는 ca 및 파이오덱틸룸 트리코뉴툼 CCMP 632(Phaeodactylum tricornutum CCMP 632) 유래의 포스포에놀피부르산 카르복실라제(phosphoenolpyruvate carboxylase)를 코딩하는 ppc 를 포함하는 재조합 플라스미드를 제조하고, 이를 대장균에 형질전환함으로써, 유기산 생산능이 우수한 재조합 미생물을 제조하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 두날리엘라 유래의 탄산 무수화 효소(carbonic anhydrase)를 코딩하는 ca 유전자를 포함하는 플라스미드 및 파이오덱틸룸 트리코뉴툼 CCMP 632의 포스포에놀피부르산 카르복실라제(phosphoenolpyruvate carboxylase)를 코딩하는 ppc 유전자를 포함하는 플라스미드가 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용하여 유기산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 두날리엘라 유래의 탄산 무수화 효소(carbonic anhydrase)를 코딩하는 ca 유전자를 포함하는 플라스미드 및 파이오덱틸룸 트리코뉴툼 CCMP 632 유래의 포스포에놀피부르산 카르복실라제(phosphoenolpyruvate carboxylase)를 코딩하는 ppc 유전자를 포함하는 플라스미드가 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 이용하여 유기산을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 재조합 미생물은 숙신산, 젖산 등의 유기산 생산능이 우수하여, 미생물을 이용한 대사공학 등에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 ppc 유전자가 코딩하는 포스포에놀피부르산 카르복실라제의 당분해 과정을 나타낸 도이다.
도 2은 ca 유전자를 포함하는 플라스미드의 구조를 나타낸 도이다.
도 3는 ppc 유전자를 포함하는 플라스미드의 구조를 나타낸 도이다.
도 4은 ca 유전자의 염기서열을 분석한 도이다.
도 5는 ppc 유전자의 염기서열을 분석한 도이다.
도 6는 Escherichia coli BL21(DE3)::DspGCPtP2 균주에서 탄산 무수화 효소 및 포스포에놀피부르산 카르복실라제의 발현을 확인한 도이다.
도 2은 ca 유전자를 포함하는 플라스미드의 구조를 나타낸 도이다.
도 3는 ppc 유전자를 포함하는 플라스미드의 구조를 나타낸 도이다.
도 4은 ca 유전자의 염기서열을 분석한 도이다.
도 5는 ppc 유전자의 염기서열을 분석한 도이다.
도 6는 Escherichia coli BL21(DE3)::DspGCPtP2 균주에서 탄산 무수화 효소 및 포스포에놀피부르산 카르복실라제의 발현을 확인한 도이다.
본 발명은 두날리엘라(Dunaliella sp.) 유래의 탄산 무수화 효소(carbonic anhydrase)를 코딩하는 ca 유전자를 포함하는 플라스미드, 및 파이오덱틸룸 트리코뉴툼 CCMP 632 (P. tricornutum CCMP 632) 유래의 포스포에놀피부르산 카르복실라제 (phosphoenolpyruvate carboxylase)를 코딩하는 ppc 유전자를 포함하는 플라스미드가 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명의 재조합 미생물은 탄산 무수화 효소를 발현하고, 상기 효소는 이산화탄소를 생물체 내부로 도입하는 역할을 하며, 이때 생산되는 탄산(carbonic acid)은 주변 환경에 의하여 중탄산염(bicarbonate) 이온이나 탄산염 이온으로 전환 시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 재조합 미생물은 포스포에놀피부르산 카르복실라제를 발현하고, 상기 효소는 PEP를 사용하여 물과 이산화탄소를 이용하여 4탄소 물질인 옥살로아세테이트(oxaloacetae)를 생산한다. 상기 효소들은 이산화탄소를 고정하여 옥살레이트를 생산하며, 옥살로아세테이트의 생산은 숙신산 생산을 이끈다.
본 발명의 재조합 미생물을 제조하기 위하여, 두날리엘라(Dunaliella sp.) 유래의 탄산 무수화 효소(carbonic anhydrase)를 코딩하는 ca 유전자 및 파이오덱틸룸 트리코뉴툼 CCMP 632(P. tricornutum CCMP 632) 유래의 포스포에놀피부르산 카르복실라제(phosphoenolpyruvate carboxylase)를 코딩하는 ppc 유전자를 PCR을 통하여 특정 프라이머를 통하여 증폭하였다. 이 후, 두날리엘라 유래의 탄산 무수화 효소(carbonic anhydrase)를 코딩하는 ca 유전자를 pCDF-1b 플라스미드에 제한효소(SacI, KpnI)를 이용하여 재조합 플라스미드를 제작하였으며, 이를 pCDF::DspC라고 명명하였다.
또한, 파이오덱틸룸 트리코뉴툼 CCMP 632 유래의 포스포에놀피부르산 카르복실아제(phosphoenolpyruvate carboxylase)를 코딩하는 ppc 유전자를 pET-21a(+) 플라스미드에 제한효소(XhoI, EagI)를 이용하여 재조합 플라스미드를 제작하였으며, 이를 pET::PtP2라고 명명하였다.
상기 재조합된 플라스미드들을 E. coli BL 21 균주에 형질전환하여, 재조합 미생물을 제작하였다. 상기 재조합 미생물의 염기서열을 분석한 결과, 상기 두날리엘라 유래의 ca 유전자는 ν-탄산 무수화 효소(cabonic anhydrase)를 코딩하는 ν-ca 유전자임을 확인하였고, 상기 염기서열을 서열번호 1에 나타내었다.
또한, 파이오덱틸룸 트리코뉴툼 CCMP 632 유래의 포스포에놀피부르산 카르복실라제(phosphoenolpyruvate carboxylase)를 코딩하는 ppc 유전자는 포스포에놀피부르산 카르복실라제(phosphoenolpyruvate carboxylase)를 코딩하는 유전자임을 확인하였고, 상기 염기서열을 서열번호 2에 나타내었다.
본 발명에서 미생물은 대장균이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 재조합된 미생물을 Escherichia coli BL21(DE3)::DspGCPtP2 라고 명명하여, 2012년 04월 27일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행(KCTC)에 기탁하였으며, KCTC 12198BP의 수탁번호를 부여받았다.
본 발명의 Escherichia coli BL21(DE3)::DspGCPtP2 균주는 유기산 생산능이 우수하여, 미생물을 이용한 대사공학 등에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 상기 재조합 미생물(수탁번호:KCTC 12198BP)을 이용한 유기산 생산 방법을 제공한다.
상기 유기산 생산 방법은,
1) Escherichia coli BL21(DE3)::DspGCPtP2 균주를 성장 정체기까지 호기 배양하는 단계;
2)상기 1)단계의 배양 균주를 혐기성 조건에서 이소프로필 티오-β-D 갈락토사이드(ITPG) 및 글루코오스를 처리하는 단계; 및
3)상기 2)단계의 균주에 이산화탄소를 처리하여 혐기 발효시키는 단계를 포함한다.
상기 ITPG는 형질전환된 유전자의 발현을 유도하기 위한 물질로서, 당업계에서 통상 사용하는 투여량을 처리할 수 있다. 또한, 상기 글루코오스는 이에 제한되지 않으나, 5~60g/l를 처리할 수 있고, 바람직하게는 10g/l를 처리할 수 있다.
본 발명의 재조합 미생물이 생산하는 유기산은 숙신산, 젖산, 개미산 등이 있으며, 바람직하게는 숙신산 및 젖산이고, 더욱 바람직하게는 숙신산이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예
1:
ca
유전자 및
ppc
유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 제조
1. 중합효소 연쇄반응(
PCR
)을 이용한 유전자 서열 증폭
본 발명에 사용된 유전자 증폭은 하기 표 1의 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)을 수행하였고, ca 유전자 서열 및 ppc 유전자서열을 확보하였다. 상기 유전자 서열의 증폭반응을 위하여, 변성온도(denaturing temperature) 94oC, 결합온도(annealing temperature) 68oC, 신장온도(extension temperature) 72oC에서 진행되었으며, 총 35회 반응을 수행하였다. 반응에 사용한 중합효소는 NEB(New England Biolabs Inc.) 사의 제품을 사용하였다.
| 유전자 | 발현 효소 | 유전자출처 | 이용 플라스미드 | 프라이머 | 제한효소 |
| ca | carbonic anhydrase | Dunaliella sp | pCDF-1b | (F) 5'-GTGGGTACC ATGTTACAGTCGTCATTT CGCCATGC-3' (R) 5'-TGGGACCTCTTACTTCTTAGGCCTTGTTGCAAGC-3' |
SacI, KpnI |
| ppc | phosphoenolpyruvate carboxylase | P. tricornutum CCMP 632 | pET-21a(+) | (F) 5'-CGGCCGATGATTGACGCCGCCAGCAAGC-3' (R) 5'-CCGCTCGAGCGGTTATCCACTGTTTCGCATTCCCT-3' |
XhoI, EagI |
2. 재조합 플라스미드 제조(
pCDF
::
DspC
및
pET
::
PtP2
)
상기 실시예 1-1에서 확보한 유전자 뉴클레오티드 단편과 단백질 발현 벡터를 말단부위를 선택적으로 절단하는 제한효소를 사용하여 절단하고, 전기영동으로 크기를 확인하였다. 상기 뉴클레오티드가 확인된 아가로오스겔(agarose gel)을 절단하여 50oC에서 녹인 후, 정제하여, 4oC에서 라이게이션(ligation) 과정을 수행하였다. 사용한 리가아제(ligase)는 NEB 사의 제품을 사용하였다. 라이게이션 반응을 통하여, 2 종의 원형 플라스미드 pCDF::DspC(pCDF-1b와 ca 유전자 서열을 포함하는 플라스미드) 및 pET::PtP2(pET-21a(+)와 ppc 유전자 서열을 포함하는 플라스미드)를 제조하였다. 이의 구조를 도 2 및 도 3에 나타내었다.
실시예
2: 재조합 플라스미드에 의해 형질전환된 재조합 대장균의 제조
상기 실시예 1에서 제조된 2종의 재조합 플라스미드 pCDF::DspC, pET::PtP2를 이종 미생물인 대장균 BL21(DE3)에 삽입하기 전, 벡터의 안정성과 숙주 균주로의 형질전환시 효율 향상을 위해 대장균을 이용하여 컴피턴트 세포(competent cell)로 제조하였다.
컴피턴스 세포는 하기와 같은 과정으로 제조하였다. 37℃ 액체 LB에서 배양한 대장균 BL21(DE3)을 지수기에 회수하여, 0oC에서 충분히 차게한 후 원심분리를 통해 상등액을 제거하였다. 세포벽을 플라스미드 이동이 용아하게 처리하기 위하여 MgCl2 용액을 넣어 1시간 동안 0oC에서 보관하였다. 다시 원심분리를 하여 상등액을 제거하고 CaCl2 용액을 이용해 뭉친 세포를 풀어서 0oC에서 1시간 동안 보관하였다.
상기와 같이 준비된 컴피턴트 세포 100 ㎕를 분주하여 상기 실시예 1에서 제조된 플라스미드를 넣어 0oC에서 30분동안 반응시키고, 42oC의 온수조에서 1분 동안 열처리하고, 0oC에서 5분 동안 얼음조에서 처리하는 열충격 형질전환 방법을 수행하여 플라스미드를 컴피턴트 세포에 형질전환 하였다.
상기 열충격 형질전환방법을 실시한 샘플을 37℃에서 1시간 동안 배양하여 형질전환 과정을 거친 세포들의 정상 생장을 유도하였다. 이 세포들을 항생제인 암피실린과 스트렙토마이신이 포함된 고체 LB 배지(LB 아가 플레이트, 트립톤 10g/l, NaCl 5g/l, 효모 추출액 5g/l, 아가 15g/l)에 일정량 도말(spreading)하였다. 이 고체 배지에서 작은 원형 콜로니 형태로 자라는 것을 확인하고, 콜로니를 선별하여 암피실린과 스트렙토마이신이 포함된 5 ml의 LB 배지에서 배양을 하였다. 일반적인 플라스미드 추출 방법을 이용하여 추출한 상기 플라스미드는 Dunaliella sp.의 ca와 P. tricornutum CCMP 632의 ppc의 염기서열 분석을 의뢰하였고, Dunaliella sp.의 ca서열을 서열번호 1 및 P. tricornutum CCMP 632의 ppc를 서열번호 2에 나타내으며, 이의 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다. 또한, 상기 제조한 재조합 균주(Escherichia coli BL21(DE3)::DspGCPtP2)를 2012년 04월 27일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행(KCTC)에 기탁하였으며, KCTC 12198BP의 수탁번호를 부여받았다.
도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 서열번호 1의 ca 유전자는 ν-탄산 무수화 효소(cabonic anhydrase)를 코딩하는 ν-ca 유전자임을 확인하였고, 서열번호 2의 ppc 유전자는 포스포에놀피부르산 카르복실라제(phosphoenolpyruvate carboxylase)를 코딩하는 유전자임을 확인하였다.
실험예
1. 재조합 대장균의 단백질 확인
실시예 2에서 제조된 재조합 미생물인 Escherichia coli BL21(DE3)::DspGCPtP2 균주의 단백질 발현을 확인하기 위하여, 상기 균주를 항생제가 포함된 50 ml의 액체 LB 배지에 넣고 37oC의 진탕배양기에서 200rpm의 속도로 지수기까지 배양하였다. 지수기가 되었을 때, 삽입된 유전자 서열이 발현되도록 이소프로필 티오-β-D 갈락토사이드(IPTG)를 첨가하고, 단백질을 관찰에 용이한 입체구조를 이루도록 26oC에서 6시간 동안 배양하였다. 배양한 대장균에서 단백질을 확보하기 위하여 원심분리한 후, PBS 완충액으로 현탁하였다. 이 후, 30% 농도의 AMP와 함께 2분 동안 초음파처리 하고, 1분 동안 초음파처리를 정지하는 사이클을 10회 반복하였다. 이 후, 원심분리하여 용해성의 상청액을 분리하고, 나머지 잔여물(debris)을 PBS 완충액으로 현탁하였고, 2분동안 초음파처리하고, 1분 동안 초음파처리를 정지하는 사이클을 5회 반복하였다. 이 후, 상기 상청액과 잔여물을 SDS-PAGE에서 전기영동하였다. SDS-PAGE에서 사용된 겔(gel)은 6%의 분리(resolving) 부분과 5%의 적층(stacking) 부분으로 이루어졌다. 상기 SDS-PAGE 전기영동 결과를 도 6에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, Escherichia coli BL21(DE3)::DspGCPtP2 균주에서 발현된 단백질이 탄산 무수화 효소(carbonic anhydrase)와 포스포에놀피부르산 카르복실라제(phospoenolpyruvate carboxylase의 단백질 크기와 일치하는 것을 확인하였다. 또한, CA(carbonic anhydrase)는 비수용성 형태로, 포스포에놀피부르산 카르복실라제(phosphoenolpyruvate carboxylase)는 수용성 형태로 발현되는 것을 확인하였다.
실험예
2.
Escherichia
coli
BL21
(
DE3
)::
DspGCPtP2
(수탁번호:
KCTC
12198
BP
)
를 이용한 유기산의 생산
실시예 2에서 제조한 재조합 미생물인 Escherichia coli BL21(DE3)::DspGCPtP2 균주의 유기산 생산을 확인하기 위하여 상이동발효(phase transition fermentation) 방법을 수행하였다. 500 ml 크기의 발효기 내 200 ml의 액체 LB 배지에서 본 발명의 Escherichia coli BL21(DE3)::DspGCPtP2 균주를 배양하였고, 항생제 암피실린과 스트렙토마이신을 첨가하였다. 37oC, 150 rpm에서 진탕 배양하였고, pH 적정을 위하여 MgCO3를 첨가하였다. 대장균을 호기 배양하여 균의 성장이 정체기에 이르렀을 때, 유전자 발현을 위한 IPTG 및 유기산 생산을 위한 10 g/l 농도의 글루코오스(glucose) 용액을 첨가하였다. 두 가지 용액을 첨가하고 배양기에 이산화탄소 가스를 충분히 넣어서 혐기 발효하였다. 배양액의 탄소원이 모두 소비된 후, 상기 시료 1 ml를 채취하여 원심분리 및 필터 처리를 하였다. 이 후 고속(능)액체크로마토그래피를 수행하였다. 고속(능)액체크로마토그래피 분석 조건으로, 5mM의 황산용액을 이동상으로 사용하였다. RI 검출기로 시료를 분석하였으며, 사용한 컬럼은 Aminex HPX-87H (Biorad, U.S.A.)이고 50oC 오븐에 위치시켰다. 분석 결과는 하기의 표 2에 나타내었다.
| 유기산(g/l) | E. coli BL21 | E. coli BL21::CPtP2 |
| 숙신산(succinic acid) | 0.97 | 3.84 |
| 젖산(latic acid) | 4.27 | 5.51 |
표 2에 나타난 바와 같이, 보통의 대장균에 비하여 본 발명의 Escherichia coli BL21(DE3)::DspGCPtP2 균주에서 유기산인 숙신산 및 젖산 생산량이 현저히 증가함을 확인하였다. 보다 구체적으로 숙신산은 약 3.96배, 젖산은 1.07배 증가함을 확인하였고, 전체 생산된 유기산의 양은 약 2배 정도 증가됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 재조합 미생물(Escherichia coli BL21(DE3)::DspGCPtP2 균주)을 이용하여 숙신산, 젖산등의 유용한 유기산을 대량 생산할 수 있음을 확인하였다.
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Dunaliella sp and phosphoenolpyruvate carboxylase from
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<160> 2
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<210> 1
<211> 930
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<220>
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<400> 1
atgttacagt cgtcatttcg ccatgcgggg tggagtttcc ctttccgcca cccccctgca 60
tccggagccc ttgagaagac cctggctggt gtaggctcct tgttccgtgt gctgggctct 120
gctattgatg gctttggagc cacgctgcaa gggcctggag cgttgagaga acaagttcag 180
cccaatctgg cctgggcccc caccaagctg gatgagcgct gcccgccctc gcgcggccag 240
gtggtgaacc tgccatccat ggccgcgatg ccgtctttga agcatgttgt gttgccgctc 300
aagggcgaca acgtctttat cgctcccaat gccaatgtga tgggtgacgt gaagattggc 360
gccaactcct ccatctggta tggagccgta ttgagaggtg acgtgaacag cattgaagta 420
ggcagcaaca ccaacattca ggacaacgcc atcatccacg tggccaagca cagcatcagt 480
ggcgatgcca agcccacaat cattggcaac aacgtgacaa ttgggcatgg agccactgtg 540
catgccgcca ccattgaaga caacgtgctc attgggatgg gggcgacagt gcttgatgga 600
tgcgtggtgg aggctggagc gattgtagca gcaggatcaa tggtaactcc agggaagaga 660
gtgcctgcag ggcaggtctg ggcaggcaac cccgcgcgct acctgaggga tgtggagcca 720
gaggagcacg gctttgtgga gtcaagtgcc tctaattatg ccgagctggc agacttgcat 780
aaattcgaga actcaaagac ctttgaggag ttgagcgcgg agcgagctat tgaggtcgac 840
cgctacgttg ccagtgactc caccaatagc gtgcaccaaa tgtggatctt tgataagcag 900
accttgcttg caacaaggcc taagaagtaa 930
<210> 2
<211> 2634
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> it is DNA sequence coding phosphoenolpyruvate carboxylase of
P.tricornutum CCMP 632
<400> 2
atgattgacg ccgccagcaa gctcaccgcg acggaagccc tgggcgtgac gcgcgtcttt 60
tccatcatgc tcaatctcgt caacgccgcc gaagtccagc accgcaaccg acagattcgg 120
gcacacgagt ccaccaagga cccctccggt ggccctctcc ccaaaacgga agattccatt 180
cgcggaacca tggagacgct gttggaatcg aaacaggcga caccggaaga aatatttgcc 240
cagctgcaga agcaaaaagt ggaaatcgtc ctgacggctc atccgactca agtccagcgc 300
aaatcgcttc tgcgcaagta ccgtcgcgtt tcggagatgc tcgcttattt ggagcgaccc 360
gatttggatg gttttgaaaa gtcgtccgcc caaacgagct tgcaaacaat cttgagcagc 420
atttggggag ctgacgaaat tcgaagacaa aaaccgacac cacaacaaga ggccgcaggg 480
ggtaacgcaa tattggagtc ggttttgtgg gacgcggtgc cagcctatct gcgcaaattg 540
gatcaacagt gccgacttac cctggggcag tcgctgcccg tggacgtatg ccccatcaag 600
tttgcttcct ggatcggtgg ggatcgcgat ggtaacccca acgtgacgcc cgaagttacc 660
cgcgaggttg ttctgcaaca acgattgcgg gctgctcgtt tgcttctcaa ggacatgtac 720
gatttgatct ccgaattggc aatttctagc cgcttttcgc ccgccatgga tgccttggca 780
gattccgtca aggactcgca gcataagcgt gaaaagtacc gtcgtgtgat tggacacttg 840
atcaaacgtc tcgtcaaaac ggcccgtgaa tgtgaattag aattgtcgaa actcaacacc 900
tcagctagta tggtcagtca gactctcgtt gaggaagcag tggatggttg gcaagacgtc 960
gatgctcttg acgatgcgac tgatttgatc aagcctttgc gcataatgta cgattcgttg 1020
gttgaaacgg gcttcggttt ggtggccgac ggtttattgg tcgatatcat tcgtcgattg 1080
tatgtgtttg gtatgtccct cgtgcccttg gatattcgcg aggagagtac caagcacacg 1140
gaagcgttag atgccattac gcgttggttg ggaattggct cctatagtga atggaccgaa 1200
gaggctcgtc tcagctggtt gacttctgag ctttccaaca aacgtccctt gtaccgaatt 1260
cgcgaattgc ccaagctggg tttcaatgac agtgtcttga agacgctcaa cgtattcggc 1320
accatagcta ccctacgacc atcttgtttg ggagcctacg tcattagtca ggcgcagacc 1380
gcaagtgatg tcttggccgt catgcttttg caaaagcagt acggtatgac ggacaagaac 1440
agaaacatga tgcgtgtggt tccgttgttt gagaccttga atgacttgac caacgcgccc 1500
gacaaactcg aacagctctt cagtattccg ctttacgtcg gcgccgtcaa agggaaacag 1560
gaagtaatgg tcgggtatag tgacagtgcc aaggatgccg gacgtctggc tgcctgctgg 1620
gcgcagtaca actcgcaaga acgaatggtg aaggtagcgg cgaagcacaa cattgaattg 1680
actttcttcc acggcaaagg gggtaccgta ggacgtggcg gtaacccatc cgtctatcgt 1740
gccattatga gccatccgcc caataccatt aatggccgtt tccgggtgac ggaacagggt 1800
gaaatgataa cgcaaaactt tggagctccg tccattgctg aacgaacttt ggacatttac 1860
acggctggcg tatgtcgcga agctttttct gagcgcgtgg aaccgtcgca agcatggcgc 1920
gaccagatgc aacggatctc cgatgtgagt tgtgccgagt accgccactt agtccgtgag 1980
gaaccgcggt ttgttcccta ctttcgccag gcgacaccgg agttggaact cggaagtttg 2040
aacataggca gtcgtccggc caaacgtaac ccgaaaggcg gtattgaaag tctccgcgcg 2100
attccgtgga cctttgcttg gacgcagacg cgcacacact tatcggcgtg gctgggagtt 2160
ggcgctggtc tcacaacgac agatcaaagc gaattgaaga cgcttcgagc aatgtacatt 2220
gaatggcctt ggtttcgtga aactattgat ctaattgcca tgattgtatc caagacagac 2280
ttttccatat ccaaaaatta tgacgatcaa ctggtggaaa agaaagaagg tttgttgaag 2340
ctgggagacg aggtcaggga gaaaatggtg caaactcgtc aagctgttct tgatgtgacc 2400
gagtctacgg atgttgctgg ggctcacgtc gcccttatgc gagggtcgtc gaccattcgt 2460
catccatacg tcgatccggt caacgttatt caagccgaat tgctcaagcg attgcgagtc 2520
atggacaaga aaaagtctct gtcggcggat gaaatggaag aacaagaaat tttaaaggat 2580
gccctgatta tcagtatcaa tggcatcgct cagggaatgc gaaacagtgg ataa 2634
Claims (8)
- 두날리엘라(Dunaliella sp.) 유래의 탄산 무수화 효소(carbonic anhydrase)를 코딩하는, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 ca 유전자를 포함하는 플라스미드 및 파이오덱틸룸 트리코뉴툼 CCMP 632(P.tricornutum CCMP 632) 유래의 포스포에놀피부르산 카르복실아제(phosphoenolpyruvate carboxylase)를 코딩하는 ppc 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드로 형질전환된 것으로서, 젖산을 생산하는 재조합 대장균(Escherichia coli BL21(DE3)::DspGCPtP2 균주, 수탁번호:KCTC 12198BP).
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 포스포에놀피부르산 카르복실라제를 코딩하는 ppc 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 재조합 대장균.
- 삭제
- 삭제
- 1)제 1항의 재조합 대장균(Escherichia coli BL21(DE3)::DspGCPtP2 균주, 수탁번호:KCTC 12198BP)을 성장 정체기까지 호기 배양하는 단계;
2)상기 1)단계의 배양균주를 혐기성 조건에서 이소프로필 티오-β-D 갈락토사이드 및 글루코오스를 처리하는 단계; 및
3)상기 2)단계의 균주에 이산화탄소를 처리하여 혐기 발효시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로하는, 젖산의 생산 방법.
- 삭제
- 삭제
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|---|---|---|---|---|
| WO2010111344A2 (en) | 2009-03-24 | 2010-09-30 | Microbia, Inc. | Methods and microorganisms for production of c4-dicarboxylic acids |
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| 2011 한국생물공학회 춘계학술발표대화 초록 (2011. 4.14-16) * |
| 2011 한국생물공학회 춘계학술발표대화 초록 (2011. 4.14-16)* |
| Enzyme and Microbial Technology 45: 491-497 (2009) * |
| Enzyme and Microbial Technology 45: 491-497 (2009)* |
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|---|---|---|---|---|
| KR101762110B1 (ko) * | 2015-08-06 | 2017-07-28 | 코스맥스 주식회사 | 바이오 탄산 제주 용암해수의 제조방법 및 이를 이용한 화장료 조성물 |
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