CN110791509B - 片球菌素优化表达序列、表达载体及其制作方法和菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种片球菌素优化表达序列及其制作方法、表达载体和菌株。所述片球菌素密码子优化基因peda‑ops的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的强启动子PTEF的序列如SEQ ID NO.2所示。本发明首先根据酿酒酵母密码子偏好性优化了片球菌素基因获得peda‑ops，其次将peda‑ops连入不同组成型启动子表达载体进行表达，获得最适启动子PTEF。最后通过筛选获得高效表达片球菌素PedA的重组酿酒酵母工程菌Sc‑PTEF，为片球菌素的产业化奠定基础。

Description

片球菌素优化表达序列、表达载体及其制作方法和菌株
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及优化的片球菌素基因peda-ops、重组表达启动子PTEF以及包含peda-ops和启动子PTEF的重组酿酒酵母工程菌。
背景技术
李斯特菌作为一种致病菌，常规食品如肉类、乳制品以及蔬菜等均能成为其感染源。误食被李斯特菌感染的食品容易引起身体发生许多病变，因此需要对食品进行良好的包装和储存以防李斯特菌的感染。李斯特菌是一种嗜冷菌其在低温条件下能够进行生长和繁殖，因此在冰箱中低温保存的食物容易被李斯特菌感染。由于能够在低温环境下进行生长和繁殖，加大了李斯特菌的预防难度。研究发现来源于戊糖片球菌的片球菌素PedA对李斯特菌具有强烈的抑制作用，低剂量条件下可以很好的抑制李斯特菌的生长和繁殖。片球菌素PedA虽具有很好的抑制作用，但是天然菌PedA表达量低，导致PedA生产成本高，限制了PedA的产业化应用。因此提高PedA表达量，降低其生产成本具有重要的意义。
重组异源表达能够有效提升PedA的表达量，目前PedA的异源表达主要集中在大肠杆菌。PedA在大肠杆菌重组表达存在的许多难点限制了其产业化应用，这些难点包括：大肠杆菌不是食品级表达宿主；PedA必须和其它标签蛋白进行融合才能在大肠杆菌进行表达，加大了后处理工艺的难度(增加了纯化、去标签蛋白等工序)；大肠杆菌重组表达的PedA均在胞内，加大了工业化生产的难度。相比大肠杆菌表达系统，酿酒酵母表达系统具有食品安全、胞外分泌等特点。本专利以酿酒酵母为表达宿主，通过密码子优化、启动子筛选最终获得一株高效表达PedA的重组酿酒酵母工程菌Sc-PTEF，为PedA的产业化应用奠定基础。
发明内容
本发明首先根据酿酒酵母密码子偏好性优化了戊糖片球菌片球菌素基因获得密码子优化基因peda-ops；其次本发明将peda-ops在不同组成型启动子下进行表达，通过筛选获得最适启动子PTEF；最后本发明通过实验最终获得高效表达重组PedA的酿酒酵母工程菌Sc-PTEF，为PedA的产业化奠定基础。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种片球菌素优化表达序列，其特征在于，所述表达序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
进一步的改进，所述SEQ ID NO.1的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种片球菌素表达载体，含有如SEQ ID NO.1的所示核苷酸序列。
进一步的改进，还含有如SEQ ID NO.2的所示核苷酸序列。
一种片球菌素优化表达序列的制作方法，所述表达序列的制作方法如下：
步骤一、人工合成SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列作为模板；
步骤二、使用如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列作为引物，以SEQID NO.1所示的核苷酸序列进行PCR扩增获得第一PCR产物；使用如SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14所示的核苷酸序列作为引物，以α-信号肽的核苷酸序列SEQ ID NO.15作为模板进行PCR获得第二PCR产物；
步骤三、以第一PCR产物和第二PCR产物为模板进行重叠PCR得到SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
步骤四、将核苷酸序列SEQ ID NO.1连接到表达载体上。
进一步的改进，所述表达载体为表达载体pYES2，表达载体pYES2上连接有启动子。
进一步的改进，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2。
一种菌株，所述菌株为重组酿酒酵母工程菌，所述重组酿酒酵母工程菌含有表达载体，表达载体含有如SEQ ID NO.1的所示核苷酸序列。
进一步的改进，所述表达载体还含有如SEQ ID NO.2的所示核苷酸序列。
附图说明
图1密码子优化基因peda-ops与原始基因peda序列比对图。
图2不同启动子重组酿酒酵母工程菌摇瓶培养抑菌效果图。
图3重组工程菌Sc-PTEF 5L发酵罐不同培养时间发酵上清SDS-PAGE图。
图4重组工程菌Sc-PTEF 5L发酵罐总蛋白含量曲线图。
具体实施方式
以下实施例中未加以具体说明的分子生物学实验技术，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或以试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和仪器若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实验材料与试剂：
1、菌株与质粒
大肠杆菌菌株Topl0实验室保存；酿酒酵母INVSc1以及表达载体pYES2购自赛默飞世尔科技有限公司。
2、酶与试剂盒
高保真Q5酶，购自NEB公司，质粒提取，胶纯化，限制性内切酶、试剂盒购自上海生工公司。
3、培养基
大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。LB-AMP为LB培养基加100μg/mL氨苄青霉素。
酿酒酵母培养基为YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。酿酒酵母筛选培养基为SC，具体成分参照pYES2表达手册。
实施例1片球菌素密码子优化及表达载体构建
针对酿酒酵母表达系统，对来源于戊糖片球菌的片球菌素基因(KT345707.1)进行密码子优化获得peda-ops。peda-ops的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，peda-ops与原始基因peda的相似性为78％(图1)。
由于表达载体pYES2没有带信号肽，为了能够让重组PedA胞外分泌必须加入信号肽，本发明通过重叠PCR将酿酒酵母α-信号肽和peda-ops融合在一起，将融合好的产物连接至表达载体pYES2，获得表达载体pYESα-peda-ops。实验过程如下：(1)用引物pe-Fw(AAAAAACCCCGGATCGGACTA)和pe-Rev(CTCCTTGACGTTAAAGTATAG)扩增获得主框架；(2)用引物peda-Fw(GAGAGGCTGAAGCTAAGTACTACGGTAA)和peda-Rev(CGATCCGGGGTTTTTTTTAACACTTGTGGTTAC)扩增peda-ops，用引物α-Fw(TTTAACGTCAAGGAGATGAGATTTCCTTCAAT)和α-Rev(TTACCGTAGTACTTAGCTTCAGCCTCTC)扩增α-信号肽，(3)通过重叠PCR将α-信号肽和peda-ops融合在一起；(4)融合后的产物通过无缝克隆的方式连接至表达载体pYES2，获得表达载体pYESα-peda-ops。
实施例2不同启动子表达载体的构建
本发明总共选取3种强组成型启动子重组表达peda-ops，这三种组成型启动子分别为PGAP、PTEF和PPGK，均来自酿酒酵母。这种不同启动子的构建过程大致如下(以启动子PGAP表达载体，其他以此类推)：(1)首先以表达载体pYESα-peda-ops表达载体为模板，通过引物p-Fw和p-Rev扩增获得主框架(去除了pYES2的PGAL启动子)；(2)以酿酒酵母基因组为模板，用引物gap-Fw和引物gap-Rev扩增PGAP启动子；(3)通过无缝克隆将启动子PGAP连接至主框架获得表达载体pYES-PGAPα-peda-ops。通过实验获得三种不同启动子表达载体分别为pYES-PGAPα-peda-ops、pYES-PTEFα-peda-ops和pYES-PPGKα-peda-ops。
表1不同启动子表达载体所用引物
引物 序列(5’-3’)
p-Fw ATGAGATTTCCTTCAATTTTT
p-Rev ACTAGTGGATCATCCCCACGC
PGK-Fw GGGGATGATCCACTAGTTATTTTAGATTCCTGACTTCA
PGK-Rev ATTGAAGGAAATCTCATTGTTTTTATATTTGTTGT
TEF-Fw GGGGATGATCCACTAGTTACTTTGTACGTTCAAAA
TEF-Rev AATTGAAGGAAATCTCATTTTGTAATTAAAACTTAGATT
GAP-Fw GGGGATGATCCACTAGTTCGAGTTTATCATTATCAATA
GAP-Rev AATTGAAGGAAATCTCATTCGAAACTAAGTTCTTGGTG
实施例3不同启动子重组菌种构建及筛选
将表达载体pYES-PGAPα-peda-ops、pYES-PTEFα-peda-ops和pYES-PPGKα-peda-ops通过电转化转入酿酒酵母INVSc1，转化子均匀涂布于SC固体平板(不含尿嘧啶)，30℃，静置培养4天。将平板长出的酿酒酵母重组转化子用牙签逐个挑至每孔含有2mL YPD培养基的24孔板中，30℃，220rpm培养48h后，离心取上清进行抑菌实验测定。抑菌实验测定具体步骤如下：(1)将李斯特菌(ATCC10417)培养至对数生长期(OD600大约为1)，将培养好的菌液按照1μl/ml加入到无菌培养基中制作平板。(2)用半径为3mm的打孔器在固体平板上打孔，将不同的上清培养液加入孔中(加入体积为75μL)，冰箱放置2小时；(3)从冰箱取出平板，在37℃静置培养24小时后测定抑菌圈，根据抑菌圈的大小，初步判断每个菌的表达量，每种启动子均挑选一个抑菌效果最好的重组菌进行摇瓶比较。
实施例4、摇瓶培养比较
将挑选的三个不同启动子重组菌进行摇瓶比较分析，这三个菌分别命名为Sc-PTEF(启动子为PTEF)、Sc-PPGK(启动子为PPGK)和Sc-PGAP(启动子为PPGK)，摇瓶培养过程大致如下：(1)将单菌落接种于装有5ml YPD培养基的50ml离心管，200rpm，30℃培养36小时；(2)将培养好的种子液，按10％的比例接入25ml YPD培养基的250ml摇瓶，200rpm，30℃培养，每隔24小时加入1％的葡萄糖，连续培养48小时后取样进行平板抑菌实验，抑菌实验参照实施例3中提供的方法进行。实验结果如图2所示，由图2可知，重组菌Sc-PTEF的抑菌圈最大(抑菌半径为7mm)，其次为Sc-PGAP(抑菌半径为6mm)和Sc-PPGK(抑菌半径为5.5mm)
实施例5重组菌Sc-PTEF 5L发酵罐发酵培养
将重组菌Sc-PTEF在5L发酵罐进行发酵培养，发酵过程大致如下，(1)首先挑单菌落至25ml YPD培养基的250ml摇瓶，200rpm，30℃培养；(2)将培养好的一级种子液接种于100ml YPD培养基的500ml摇瓶，200rpm，30℃培养；(3)将培养好的二级种子液进行并瓶获得大约0.5L二级种子液；(4)将二级种子液按10％的比例接入5L发酵罐。5L发酵罐的培养条件为30℃，500rpm，pH控制在5.0，发酵过程中流加葡萄糖，每隔24小时取样测定重组PedA的表达量。
重组PedA表达量测定方法如下：(1)首先测定发酵液上清中总蛋白的含量：使用改良型的Bradford试剂盒测定发酵上清液中的总蛋白含量。取100μL的样品稀释液(对照组加入100μL蒸馏水)，加入1mL Bradford试剂，迅速混匀，室温静置15分钟，在595nm下测定吸光值；(2)将发酵液上清进行SDS-PAGE蛋白胶电泳；(3)通过软件Quantity One分析重组PedA在上清蛋白所占的比例，根据比例乘以总蛋白含量便得到重组PedA的表达量。
由图3可知，不同时间发酵上清中主要以重组PedA为主。由图4可知，随着发酵时间的增加重组PedA的表达量也逐渐增加，当发酵时间为96小时，表达量达到最大，总蛋白含量为0.95g/L。目前大肠杆菌重组表达高密度发酵PedA的最高表达量约为0.35g/L，天然菌摇瓶培养PedA的表达量约为1.5mg/L，因此本发明重组酿酒酵母工程菌PedA的表达量具有明显的优势，为PedA的产业化奠定基础。
序列表
<110> 深圳市圣西马生物技术有限公司
<120> 片球菌素优化表达序列、表达载体及其制作方法和菌株
<130> 7
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
aagtactacg gtaacggtgt tacttgtggt aagcactctt gttctgttga ctggggtaag 60
gctactactt gtatcatcaa caacggtgct atggcttggg ctactggtgg tcaccaaggt 120
aaccacaagt gttaa 135
<210> 2
<211> 571
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
tactttgtac gttcaaaata caatgcagta gatatattta tgcatattac atataataca 60
tatcacatag gaagcaacag gcgcgttgga cttttaattt tcgaggaccg cgaatcctta 120
catcacaccc aatcccccac aagtgatccc ccacacacca tagcttcaaa atgtttctac 180
tcctttttta ctcttccaga ttttctcgga ctccgcgcat cgccgtacca cttcaaaaca 240
cccaagcaca gcatactaaa tttcccctct ttcttcctct agggtgtcgt taattacccg 300
tactaaaggt ttggaaaaga aaaaagagac cgcctcgttt ctttttcttc gtcgaaaaag 360
gcaataaaaa tttttatcac gtttcttttt cttgaaaatt tttttttttg atttttttct 420
ctttcgatga cctcccattg atatttaagt taataaacgg tcttcaattt ctcaagtttc 480
agtttcattt ttcttgttct attacaactt tttttacttc ttgctcatta gaaagaaagc 540
atagcaatct aatctaagtt ttaattacaa a 571
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 3
atgagatttc cttcaatttt t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 4
actagtggat catccccacg c 21
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 5
ggggatgatc cactagttat tttagattcc tgacttca 38
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 6
attgaaggaa atctcattgt ttttatattt gttgt 35
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 7
ggggatgatc cactagttac tttgtacgtt caaaa 35
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 8
aattgaagga aatctcattt tgtaattaaa acttagatt 39
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 9
ggggatgatc cactagttcg agtttatcat tatcaata 38
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 10
aattgaagga aatctcattc gaaactaagt tcttggtg 38
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 11
gagaggctga agctaagtac tacggtaa 28
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 12
cgatccgggg ttttttttaa cacttgtggt tac 33
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 13
tttaacgtca aggagatgag atttccttca at 32
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 14
ttaccgtagt acttagcttc agcctctc 28
<210> 15
<211> 267
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 15
atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60
ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120
tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180
aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240
tctctcgaga aaagagaggc tgaagct 267

Claims (2)

1.一种片球菌素表达载体，其特征在于，含有表达序列peda-ops的核苷酸序列，peda- ops的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；通过重叠PCR将酿酒酵母α-信号肽和peda-ops融合在一起，将融合好的产物连接至表达载体pYES2，获得表达载体pYESα-peda-ops；以表达载体pYESα-peda-ops表达载体为模板，通过引物p-Fw：ATGAGATTTCCTTCAATTTTT和p-Rev：ACTAGTGGATCATCCCCACGC扩增获得主框架；以酿酒酵母基因组为模板，用引物TEF- Fw：GGGGATGATCCACTAGTTACTTTGTACGTTCAAAA和引物TEF- Rev：AATTGAAGGAAATCTCATTTTGTAATTAAAACTTAGATT扩增PTEF启动子；通过无缝克隆将启动子PTEF连接至主框架获得表达载体pYES-PTEFα-peda-ops。
2.一种菌株，其特征在于，所述菌株为重组酿酒酵母工程菌，所述重组酿酒酵母工程菌含有权利要求1所述的表达载体pYES-PTEFα-peda-ops。
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片球菌素基因的克隆及表达;韩烨等;《华北农学报》;20090428(第02期);全文 *

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