CN109852571B

CN109852571B - 一种抗酸能力强的乳酸菌工程菌及构建方法和应用

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Publication number: CN109852571B
Application number: CN201910018206.XA
Authority: CN
Inventors: 张娟; 杨谨华; 刘为佳; 朱政明; 陈坚; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-01-09
Filing date: 2019-01-09
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2039-01-09
Also published as: CN109852571A

Abstract

本发明公开了一种抗酸能力强的乳酸菌工程菌及构建方法和应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明以编码多糖转运ATP结合蛋白MsmK的基因为目的基因，以乳酸菌为表达宿主，成功构建了一种可广泛应用于制备食品、药品、饲料以及化学品的乳酸菌工程菌；此乳酸菌工程菌的抗酸能力得到了显著提高，较野生菌株最高提高了213.7倍。

Description

一种抗酸能力强的乳酸菌工程菌及构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种抗酸能力强的乳酸菌工程菌及构建方法和应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。

背景技术

乳酸菌是一类在食品、医药、饲料、精细化学品等与人类生活密切相关的重要工业领域均具有重要的应用价值的细菌。但是，当乳酸菌被用作工业化生产之后，在其发酵过程中，随着菌体的代谢生长过程，酸性物质也随之产生并积累，导致细胞面临严重的酸胁迫。

酸胁迫是由乳酸菌代谢产物乳酸、乙酸等酸性物质造成的，随着菌体的代谢生长过程，酸性物质也随之产生并积累，这些积累的乳酸、乙酸等酸性物质通过被动扩散进入细胞质，由于胞内的pH通常较胞外的pH高0.5～1.0，进入胞内的乳酸、乙酸等迅速解离，导致胞内pH的快速降低，使得细胞面临严重的酸胁迫，严重影响了细胞的生理活性，大大降低了乳酸菌食品微生物制造的效率，其中，以乳酸的积累导致的酸胁迫是最重要的胁迫之一。

对于酸胁迫，为维持乳酸菌发酵生产的稳定性并提高生产效率，过去，工业上常常通过在乳酸菌发酵的过程中添加外源中和剂来维持pH处于稳定的范围，例如，通过添加碱性物质(氨水或NaOH)来控制发酵环境的pH值。

然而，碱性物质的添加往往会导致副产物的积累，而副产物中形成的盐类会再次导致细胞处于高渗的环境，从而造成渗透压胁迫的产生，再次影响菌体的生长与代谢。

目前，提高乳酸菌的乳酸、乙酸等酸胁迫抗性的方法则主要有诱变育种以及生化工程策略，但是，上述方法或存在成本问题，或存在成功率低的问题。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种抗酸能力提高且构建成本低、成功率高的乳酸菌工程菌。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种抗酸能力强的乳酸菌工程菌，所述工程菌含有重组质粒与表达宿主；所述重组质粒含有编码多糖转运ATP结合蛋白MsmK的目的基因以及表达载体；所述多糖转运ATP结合蛋白MsmK是微生物细胞膜上用于转运多糖的ATP结合蛋白；所述表达宿主为乳酸菌。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌Lactococcus lactisNZ9000。

在本发明的一种实施方式中，所述多糖转运ATP结合蛋白MsmK来源于乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000。

在本发明的一种实施方式中，编码所述多糖转运ATP结合蛋白MsmK的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148、pNZ8149载体、pNZ8151载体或pNZ8152载体。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148。

本发明还提供了一种提高乳酸菌抗酸能力的方法，所述方法为在乳酸菌中过量表达多糖转运ATP结合蛋白MsmK；所述多糖转运ATP结合蛋白MsmK是微生物细胞膜上用于转运多糖的ATP结合蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。

在本发明的一种实施方式中，所述过量表达为先通过编码多糖转运ATP结合蛋白MsmK的基因与表达载体构建含有编码多糖转运ATP结合蛋白MsmK的基因重组质粒，再将重组质粒导入乳酸菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148。

本发明提供了利用上述一种提高乳酸菌抗酸能力的方法制备得到的抗酸能力提高的乳酸菌。

在本发明的一种实施方式中，所述抗酸能力提高的乳酸菌含有重组质粒与表达宿主；所述重组质粒含有编码多糖转运ATP结合蛋白MsmK的目的基因以及表达载体；所述多糖转运ATP结合蛋白MsmK是微生物细胞膜上用于转运多糖的ATP结合蛋白；所述表达宿主为乳酸菌。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148。

本发明还提供了上述一种抗酸能力强的乳酸菌工程菌或上述一种提高乳酸菌抗酸能力的方法在制备食品、药品、饲料以及化学品方面的应用。

[有益效果]

(1)本发明首次发现在乳酸菌中过量表达MsmK蛋白可显著提高乳酸菌的抗酸能力；

(2)本发明通过在乳酸乳球菌中过量表达MsmK蛋白，得到了抗酸能力显著提高的重组乳酸乳球菌Lactococcus lactis(MsmK)；

(3)利用本发明的方法得到的重组乳酸乳球菌Lactococcus lactis(MsmK)对酸的抗性较野生型有了明显的提高，其对乳酸的抗性较野生型提高了213.7倍；

(4)利用本发明的方法得到的重组乳酸乳球菌Lactococcus lactis(MsmK)在构建时具有成本低、成功率高，可适应大规模工业化生产。

附图说明

图1：重组质粒Vector/MsmK的结构图。

图2：重组质粒Vector/OppC的结构图。

图3：重组质粒Vector/BglF的结构图。

图4：重组菌株Lactococcus lactis(MsmK)、Lactococcus lactis(OppC)、Lactococcus lactis(BglF)和生长菌株的生长曲线图。

图5：pH 4.0(乳酸调节)条件下重组菌株Lactococcus lactis(MsmK)与对照菌株的存活率对比。

图6：重组菌株Lactococcus lactis(MsmK)和对照菌株酸胁迫前后的胞内ATP含量对比。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000来源于荷兰NIZO研究所。

下述实施例中涉及的培养基如下：

氯霉素平板：蛋白胨(英国Oxoid公司)1％(m/v)、酵母粉(Oxoid)0.5％(m/v)、氯化钠1％(m/v)及琼脂条2％(m/v)，灭菌后添加终浓度10μg/mL氯霉素。

GM17液体培养基：在M17培养基(Oxoid)中补充5‰(m/v)的葡萄糖(Glucose)。

GM17氯霉素平板：在M17培养基(Oxoid)中补充5‰(m/v)的葡萄糖(Glucose)及2％(m/v)的琼脂条，灭菌后添加终浓度10μg/mL氯霉素。

实施例1：重组菌株的构建

具体步骤如下：

(1)从NCBI数据库的中得到如SEQ ID NO.1所示的msmK基因序列(msmK基因是编码多糖转运ATP结合蛋白MsmK的基因，多糖转运ATP结合蛋白MsmK是膜上用于转运多糖的ATP结合蛋白)、如SEQ ID NO.2所示的oppC基因序列(oppC是编码寡肽转运系统渗透酶蛋白OppC的基因，寡肽转运系统渗透酶蛋白OppC是膜上用于转运寡肽的蛋白)、如SEQ ID NO.3所示的bglF基因序列(bglF是编码麦芽糖ABC转运体渗透酶蛋白BglF的基因，BglF是膜上用于转运麦芽糖ABC的渗透酶蛋白)，根据的基因序列设计分别如表1所示的引物；

(2)以L.lactis NZ9000的基因组为模板，分别以表1中的引物通过PCR扩增获得SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的基因片段；

(3)将PCR产物和载体pNZ8148分别用表1中的限制性内切酶进行双酶切，酶切产物经纯化后，进行连接；

(4)将连接产物转化大肠杆菌MC1061(商业化菌株)感受态，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后再进行测序鉴定，最终获得含有正确序列的重组质粒Vector/MsmK(结构如图1所示)、Vector/OppC(结构如图2所示)、Vector/BglF(结构如图3所示)；

(5)从重组E.coli MC1061中提取重组质粒，电转化感受态L.lactis NZ9000细胞，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后，最终获得含有正确重组质粒的菌株Lactococcus lactis(MsmK)、Lactococcus lactis(OppC)、Lactococcus lactis(BglF)；

其中，电转化条件为：1μL质粒中与40μL的感受态细胞混合，移入预冷的电转杯中，冰上放置10min；调节电压2000V，电容25μf，电阻200Ω进行电击；电击完毕后，立即向电转杯中加入含有20mM MgCl₂和2mM CaCl₂的GM17培养基(培养基配方：M17broth培养基+0.5％glucose)；然后置于30℃静置培养1.5h，涂布于含有氯霉素的GM17平板上，培养36h，挑取转化子验证。

表1引物与酶切位点

实施例2：重组菌株的生长性能试验

具体步骤如下：

(1)将仅含有空白质粒pNZ8148的菌株Lactococcus lactis(Vector)(对照)和实施例1得到的菌株Lactococcus lactis(MsmK)、Lactococcus lactis(OppC)、Lactococcuslactis(BglF)分别接种于加了10μg/mL氯霉素的GM17液体培养基中进行活化，放在30℃培养箱中静置培养过夜；

(2)分别以2％的接种量将上述得到的种子液转接至新鲜的氯霉素(10μg/mL)GM17液体培养基中，30℃静置培养；

(3)在培养过程中，每隔2小时取样，测定600nm波长下的OD值；

(4)培养至OD₆₀₀ 0.4时加入10ng/mL的Nisin诱导表达硫胺素转运蛋白，以时间为横坐标，OD₆₀₀值为纵坐标，绘制生长曲线(绘制得到的生长曲线如图4)。

结果如图4所示，经生长性能试验分析，重组菌株Lactococcus lactis(MsmK)的生物量和对照菌株没有太大差距，说明在L lactis NZ9000中过量表达MsmK蛋白对菌株的生长性能没有影响，而重组菌株Lactococcus lactis(OppC)、Lactococcus lactis(BglF)的生物量明显低于对照菌株，说明在L lactis NZ9000中过量表达OppC和BglF蛋白会对菌株的生长造成抑制。

实施例3：重组菌株在乳酸胁迫条件下的耐受性试验

具体步骤如下：

将仅含有空白质粒pNZ8148的菌株Lactococcus lactis(Vector)(对照)和实施例1得到的菌株Lactococcus lactis(MsmK)分别在GM17培养基中于30℃的条件下诱导培养6h，离心收集细胞，经0.85％的生理盐水洗涤两次后重悬于与所收集的菌液等体积的新鲜的pH 4.0(乳酸调节)的GM17(含有氯霉素10μg/mL)中，分别胁迫1.5h、2.5h以及3h；将胁迫后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积的生理盐水中，取10μL重悬液，稀释不同梯度点种于GM17氯霉素平板上测定活菌数和存活率(结果如图5所示)；

其中，存活率＝(N/N₀)×100％；

式中，N₀是未经酸胁迫处理的菌悬液在平板上的活菌落数；N是胁迫后平板上长出的活菌落数。

由图5可知，经耐受性实验分析，在pH 4.0的GM17中胁迫3h后，重组菌株Lactococcus lactis(MsmK)的存活率为对照的213.7倍，说明重组菌株Lactococcuslactis(MsmK)对酸胁迫的耐受性显著提高。

实施例4：重组菌株胞内ATP含量的测定

具体步骤如下：

将仅含有空白质粒pNZ8148的菌株Lactococcus lactis(Vector)(对照)和实施例1得到的菌株Lactococcus lactis(MsmK)分别在GM17培养基中于30℃的条件下诱导培养6h，用等体积磷酸缓冲液(200mmol·L^-1，pH 7.0)洗涤2次重悬于与所收集的菌液等体积的新鲜的pH 4.0(乳酸调节)的GM17(含有氯霉素10μg/mL)中，分别胁迫1h、2.5h，取4.0mL菌液、离心、洗涤，收集菌体并用液氮预冻液氮预冻，保存备用，用ATP检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)测定胞内ATP的含量(结果如图6所示)。

由图6可知，酸胁迫前重组菌株胞内ATP含量仅有对照菌株的72％，酸胁迫后重组菌株内ATP含量较对照菌株提高了1.2倍，结果表明，在酸胁迫环境下，重组菌株可以释放更多的ATP，满足胁迫条件下细胞对能量的需求，进而增强L.lactis NZ9000的抗酸胁迫能力。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种抗酸能力强的乳酸菌工程菌及构建方法和应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1137

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgacaacac tcgttttaga caaaatttac aaaaaatatc ccaatgccac tcaatatgcc 60

gttgaagatt tcaatattga cattaaagat aaagaattta tcgtattcgt tggaccttca 120

ggttgtggga aatcgacaac tttacggatg gttgctggac ttgaagatat taccgaaggt 180

gaatttaaaa ttgatggtaa ggtcatgaat gacgtcgctc caaaagaccg tgatatcgct 240

atggttttcc aaaactatgc gctttatcca cacatgactg tttttgacaa catggccttt 300

ggtttgaaac ttcgtaaatt caaaaaagat gaaatcaaac gtcgtgttga tgaagcagga 360

gctattcttg gattgactga cttgcttgat cgtaaacccg ctgatttatc aggtggtcaa 420

cgtcaacgtg tagcaatggg acgtgcgatt gtccgtgatg ctaaggtctt tcttatggat 480

gaacctttgt caaacttgga tgctaaactc cgtgtttcta tgcggacaga aattgcgaaa 540

attcaccgtc gtattggtgc aacaaccatt tacgttaccc atgaccaaac tgaagcaatg 600

acacttgctg accgtattgt tatcatgtct tcatcgccaa actcagataa gactgggaca 660

gtggggcgcg tggaacaaat cggaacgcct caagaacttt ataatgaacc agcaaataaa 720

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ggaaaattga caaataatga aggattaaat atggaccttc ctgaaggaaa agcaaaattg 840

cttaaagaac aaggttacga aggaaaagaa gtgattcttg gaatccgtcc agaagatatt 900

caagcaagca atttggcaca acaagcttat ccaaatcaaa ccattgaggc agaagttgtc 960

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aacttgaata aatcacattt ctttgacgct caaactgaac accgtatcgt tgattaa 1137

<210> 2

<211> 1032

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggaaaatt taaataaaga cttcaccctt gttggttcaa agggttcaga ttcaacagaa 60

aaaattgcga aacctgcctt gagttttttc caagatgctt ggcgtcgttt caagaaaaat 120

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gcatttgttg tgccacaatc aaaagcaaac tattttaatc caaataaatc acaagtttat 240

ggaaatcttc cacccaaact ttcgggtgat ttaccatttt ggaatggtga tttcaaagct 300

cctggttcag ctgaaaaaac agatgtttat aaagctcaag gtgttccgga aaaagataaa 360

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cgtatttcat tgattattgc ccttgctgcg gctctaattg acttagtaat tggggtgacc 480

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ctctcactca catttatctt ctttggagat ggtttgcgtg atgcatttga ccctagagca 1020

agtgaggatt ag 1032

<210> 3

<211> 1383

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgactaaaa agaaaaaaag aaaacaaacc gaaagtaatg tttctcctga agaaaaatct 60

attaaactac gtgaagtttt ccaaaaaggt aataccgtta caaaattaac tttcttcgtg 120

atgggcctga atcaaataaa aaacaaacag tgggtaaaag gatttacttt cttaattctt 180

gaaattgcat ttattggttg gcttcttttc tctggactta gtgctttttc tcttttgagt 240

agcttaggtc caaataaaac acttaaagaa acaacagacg ccaatggctt tccagttatt 300

attcaacccg atcactctgt tttgatttta ctttggggac tcattgcttg tcttgtcgtt 360

gttctcttta ttttacttta ctggttcaac tatcgttcaa acaaacatct ctactattta 420

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cctactgttt acatgatttc gatggctttc acaaactatg atcgtctaca tgctactgct 600

ttctcatgga ccggttttca agcctttggt aatgtcttaa ccggggattt agcgggaaca 660

ttcttccccg ttcttggttg gacattagta tgggcaattg tagcaacagc aacaacattt 720

ctcggtggtg ttttacttgc cttactcatt gagtcaactg gaattaaatt taaaggattc 780

tggagaacag tttttgttat cgtctttgcc gttccacaat ttgtaaccct attaatgatg 840

gcacaatttt tggaccaaca aggagctttt aatggaattt tgatgaatct tcatctaatt 900

tccaatccga tcaactttat tggtgcggct tctgacccaa tggttgcaag aatcactgtt 960

atatttgtta atatgtggat tggtatccct gtttcaatgc ttgtatctac agcaattatc 1020

caaaaccttc cccaagacca aatcgaagct gcacgtattg atggagcaaa tagtttaaat 1080

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atgaatccaa actaccaagg agcaggttca accgaccttc ttgttacttg gctctacaac 1260

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attgttaatg catcaatttc attagtagca taccgtcgta ccaatgcatt taaggagggc 1380

taa 1383

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

catgccatgg ggatgacaac actcgtttta gacaaaat 38

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

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gctctagatt aatcaacgat acggtgttca gt 32

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<211> 39

<212> DNA

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<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

catgccatgg ggatgactaa aaagaaaaaa agaaaac 37

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cccaagcttt tagccctcct taaatgcatt g 31

Claims

1.多糖转运ATP结合蛋白MsmK在提高乳酸乳球菌抗酸能力中的应用，其特征在于，在乳酸乳球菌中过量表达多糖转运ATP结合蛋白MsmK；所述多糖转运ATP结合蛋白MsmK是微生物细胞膜上用于转运多糖的ATP结合蛋白；编码所述多糖转运ATP结合蛋白MsmK的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述过量表达为先将编码多糖转运ATP结合蛋白MsmK的基因与表达载体连接以构建含有编码多糖转运ATP结合蛋白MsmK的基因的重组质粒，再将重组质粒导入乳酸乳球菌中。