CN117074699A - 一种筛选代谢蔗糖的干酪乳杆菌发酵剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种筛选代谢蔗糖的干酪乳杆菌发酵剂的方法，包括：sacA基因的扩增，待测菌蔗糖‑6‑磷酸水解酶氨基酸序列的确定，蔗糖‑6‑磷酸水解酶氨基酸序列的比对，以及待测菌对蔗糖利用情况的验证。本发明所述方法通过蔗糖‑6‑磷酸水解酶的氨基酸序列定向筛选代谢蔗糖的干酪乳杆菌，以筛选获得的干酪乳杆菌作为发酵剂应用在乳制品发酵，有利于发酵乳中干酪乳杆菌的产酸，提高发酵速率、提升发酵乳品质，在新型发酵剂筛选中具有重要的应用意义。
Description
技术领域
本发明属于微生物和基因工程技术领域，特别涉及一种筛选代谢蔗糖的干酪乳杆菌发酵剂的方法。
背景技术
作为一种典型的发酵食品，发酵乳已经被食用了数千年。公元前100年，希腊人首先提出了“发酵乳”的概念，如今，它的消费遍及全世界。大量研究结果表明，发酵乳中的维生素、蛋白质含量较高，易于肠道吸收，除具有调整肠道菌群的功能外，还具有降低胆固醇、抗肿瘤等重要的生理功能，因此，发酵乳制品倍受消费者青睐。发酵乳制品是以牛乳作为主要原料，经乳酸菌发酵或乳酸菌、酵母菌共同发酵制成的酸性乳制品，其作为一种乳产品，凭借独特的口感与风味深受人们的喜爱，已经畅销市场多年。有研究表明，影响消费者购买发酵乳制品的主要因素有品质、价格、可用性和品牌，其中，品质占比最重，因此，提升发酵乳制品的品质无疑是企业迎合市场最重要的手段。
发酵乳制备过程中，采用纯牛奶或者复原全脂乳、蔗糖进行基料的制备，通过添加发酵剂进行发酵，达到一定酸度或pH后进行产总酸、黏度、微生物数量和挥发性香气成分物质的检测，以最终评估其品质。乳糖和蔗糖代谢是发酵剂菌株利用的主要糖源，其中蔗糖代谢有四条代谢通路，其中磷酸烯醇式丙酮酸-蔗糖磷酸转移酶系统是乳杆菌中最主要的蔗糖代谢通路，而蔗糖-6-磷酸水解酶是其中最重要的限速酶，其主要功能是水解β-D-果呋喃糖苷中末端非还原性β-D-果呋喃糖苷残基。然而，蔗糖-6-磷酸水解酶仅在少数几种乳酸菌（主要包括变异链球菌、大肠杆菌等）中完成了结构表征，且目前发现的蔗糖-6-磷酸水解酶氨基酸序列的微小变化能够改变其底物特异性，直接影响其折叠结构，引发菌株对于蔗糖的代谢差异。同时蔗糖-6-磷酸水解酶在底物特异性伴随着菌株进化，而在其他蔗糖水解酶的同源物中也发现了酶活性显著差异及无酶活性的蛋白质。
因此，如何能够准确、快速的定向筛选代谢蔗糖的干酪乳杆菌，提高发酵产酸速率，是本领域亟待解决的问题。
发明内容
为了克服现有技术的问题，本发明提出了一种筛选代谢蔗糖的干酪乳杆菌发酵剂的方法，所述方法通过蔗糖-6-磷酸水解酶的氨基酸序列定向筛选代谢蔗糖的干酪乳杆菌，以筛选获得的干酪乳杆菌作为发酵剂应用在乳制品发酵，有利于发酵乳中干酪乳杆菌的产酸，提高发酵速率、提升发酵乳品质，在新型发酵剂筛选中具有重要的应用意义。
本发明的目的是这样实现的：
本发明提供了一种筛选代谢蔗糖的干酪乳杆菌发酵剂的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1，sacA基因的扩增：
提取待测干酪乳杆菌的基因组DNA，并扩增得到待测干酪乳杆菌的sacA基因全长序列；
其中，扩增sacA基因的PCR引物包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
步骤2，待测菌蔗糖-6-磷酸水解酶氨基酸序列的确定：
对步骤1获取的sacA基因全长序列，通过软件确定待测干酪乳杆菌的蔗糖-6-磷酸水解酶氨基酸序列；
步骤3，蔗糖-6-磷酸水解酶氨基酸序列的比对：
比对步骤2获得的待测干酪乳杆菌的蔗糖-6-磷酸水解酶氨基酸序列，如其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，则确定该待测干酪乳杆菌可代谢蔗糖。
进一步的，所述方法还包括以下步骤：
步骤4，待测菌对蔗糖利用情况的验证：
S41，待测干酪乳杆菌的活化；
S42，待测干酪乳杆菌对蔗糖利用情况的测定。
进一步的，步骤1中，提取待测干酪乳杆菌基因组DNA，具体包括以下步骤：
将待测干酪乳杆菌接种于培养基中、静置培养，当OD600 = 0.8~1.0，取菌液离心除上清，向沉淀中加入TES溶液重悬菌体、离心去除上清，而后向菌体中加入溶菌酶重悬菌体，消化后加入RNase混匀，再加入蛋白酶K溶液、混匀，加入缓冲液GB振荡、水浴处理，加入无水乙醇并充分混匀，离心倒掉废液；加入缓冲液GD，离心倒掉废液；加入漂洗液PW洗涤，离心晾干吸附材料中的残余漂洗液；滴加预热的TE缓冲液，离心收集样品，低温保存备用。
进一步的，步骤1中，利用PCR技术扩增sacA基因，选择Ex Taq HS酶建立25 μL体系，PCR反应条件为：95 ℃，3min；[95 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，2 min] × 30个循环；72 ℃，5 min；4 ℃。
进一步的，步骤4中，S41待测干酪乳杆菌的活化的具体步骤为：
将待测干酪乳杆菌接种至MRS液体培养基，在37 ± 1℃下培养12 h，进行菌株的活化。
进一步的，步骤4中，S42待测干酪乳杆菌对蔗糖利用情况测定的具体步骤为：
首先，确定待测菌是否可利用蔗糖：将待测干酪乳杆菌接种至MRSS液体培养基，在37 ± 1℃下培养12 h，检测菌株对蔗糖的代谢情况；
而后，对确定可利用蔗糖的菌株作为发酵剂发酵乳基，计算蔗糖利用率：
发酵乳的制备：将生牛乳与蔗糖混合，经均质和巴氏杀菌处理，冷却后制备得到发酵基料；按照5×106 CFU/g的添加量将活化后的待测干酪乳杆菌接种于发酵基料中，在37℃下培养获得发酵乳；
蔗糖含量的检测：准确称取蔗糖标准品于100 mL容量瓶中，超纯水定容至100 mL，蔗糖的质量浓度分别为3、2.5、2、1.75、1.50、1.25、1.0、0.75、0.50和0.25 mg/mL；以标准品的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线；称取上述发酵乳至烧杯中，并添加去离子水，磁力搅拌器充分溶解；依次添加Carrez试剂A和Carrez试剂B，充分溶解、获得混合物；上述混合物离心后取上清液；用蒸馏水稀释上清液，通过滤膜过滤处理；在色谱柱和差示折射率检测器相结合，以硫酸水溶液为流动相，采用外标法检测发酵乳样品中的蔗糖含量，从而计算获得蔗糖利用率。
本发明相比现有技术的优点和有益效果是：
现有技术缺乏利用氨基酸测序手段定向筛选代谢蔗糖干酪乳杆菌的方法，仍利用菌种活化后，接种于含蔗糖的发酵基料中，培养一定时间后，通过测定基料中蔗糖含量、计算蔗糖利用率，从而判断干酪乳杆菌对蔗糖的利用情况，不仅操作繁琐、耗时长，并且受实验设备检出限、检测人员操作手法等的限制和影响，检测准确度难以保障。本发明所述方法，通过蔗糖-6-磷酸水解酶的氨基酸序列定向筛选代谢蔗糖的干酪乳杆菌，大大提高了干酪乳杆菌发酵剂的筛选效率和准确度，在新型发酵剂筛选中具有重要的应用意义。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为不同组干酪乳杆菌对蔗糖利用的对比图；
图2为不同组干酪乳杆菌菌株的蔗糖-6-磷酸水解酶SacA的氨基酸序列比较图；
图3为不同组发酵乳中蔗糖含量的对比图。
具体实施方式
本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。在本发明中，若非特指，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
原料，见表1。
实验仪器，见表2。
实施例
本实施例提供了一种筛选代谢蔗糖的干酪乳杆菌发酵剂的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1，sacA基因的扩增：
提取待测干酪乳杆菌的基因组DNA，并扩增得到待测干酪乳杆菌的sacA基因全长序列。
基因组DNA的具体操作步骤如下：按照1%（v/v）接种于MRS液体培养基中，37 ± 1℃静置培养；当OD600 = 0.8~1.0；取菌液2.5 mL，4 ℃，12000 × g离心5 min，去除上清；加入2 mL TES溶液重悬菌体，4 ℃，12000× g离心5 min，去除上清；加入200 µL 50 mg/mL溶菌酶重悬菌体，置于37 ℃，200 × g条件下消化1.5 h；加入20 μL RNase （10 mg/mL），轻柔混匀，室温放置5 min；加入20 μL蛋白酶K溶液，轻轻混匀；加入220 μL缓冲液GB，振荡15 s，70 ℃水浴处理10 min，简短离心；加入220 μL无水乙醇，充分混匀15 s；12000 × g离心30 s，倒掉废液；加入500 μL缓冲液GD，12000 × g离心30 s，倒掉废液；加入700 μL漂洗液PW，12000 × g离心30 s，再加入500 μL漂洗液PW洗涤；12000 × g离心2 min，置于室温放置7 min，晾干吸附材料中的残余漂洗液；滴加50 μL经65 ℃- 70 ℃预热的TE缓冲液，12000 × g离心2 min收集样品，保存于-20 ℃备用。
所述的MRS液体培养基，其配方为：无水乙酸钠5 g，柠檬酸氢二胺2 g，磷酸氢二钾2 g，硫酸镁0.58 g，四水硫酸锰0.19 g，吐温-80 1mL，葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母浸粉5g，牛肉粉5 g，溶解于900 mL去离子水中，用1 mol/L 氢氧化钠调pH值为6.5，定容至1 L；121 ℃高压灭菌15 min。
所述的TES溶液，其配方为：25 g蔗糖，5 mL Tris-Cl母液（1 M，pH＝8.0），6 mLEDTA母液（0.5 M，pH＝8.0），调pH 8.0，去离子水定容至100 mL，121℃高压灭菌15 min，室温保存。
扩增sacA基因以sacA-F/R为PCR引物，sacA-F和sacA-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。
sacA-F：5'- CAAGGTGGTAAGTTCTGGGGGTAACATTTCAAACAAGGT -3'；sacA-R：5'-GCTTGCGACAAGCCTTACGTTGTGGCGACA -3'。
选择Ex Taq HS酶建立25 μL体系，PCR反应条件为：95 ℃，3min；[95 ℃，30 s；60℃，30 s；72 ℃，2 min] × 30个循环；72 ℃，5 min；4 ℃，扩增sacA基因的全长序列。
步骤2，待测菌蔗糖-6-磷酸水解酶氨基酸序列的确定：
对步骤1获取的sacA基因全长序列，通过Snapgene确定待测干酪乳杆菌的蔗糖-6-磷酸水解酶氨基酸序列。
步骤3，蔗糖-6-磷酸水解酶氨基酸序列的比对：
比对步骤2获得的待测干酪乳杆菌的蔗糖-6-磷酸水解酶氨基酸序列，如其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，则确定该待测干酪乳杆菌可代谢蔗糖。
步骤4，待测菌对蔗糖利用情况的验证：
S41，待测干酪乳杆菌的活化：
按照1%（v/v）添加量将待测干酪乳杆菌接种于MRS，37 ± 1℃条件下培养12 h进行菌株的活化。
S42，待测干酪乳杆菌对蔗糖利用情况的测定：
① 菌株生长情况的检测
按照1×107 CFU/mL的终浓度将菌株接种至S-MRS培养基中，每间隔2 h进行OD600和pH值的测定，确定菌株的生长情况此实验进行三个生物学重复。
② 发酵乳中蔗糖含量的测定
93% (w/w) 生牛乳+ 5% (w/w) 蔗糖混合，经过20 MPa的均质，在95 ℃条件下巴氏杀菌5 min，冷却至37 ℃，制备得到发酵基料。按照5×106 CFU/g的添加量将待测干酪乳杆菌接种于发酵基料中，在37 ℃下培养24 h，3个生物学重复。
准确称取蔗糖标准品于100 mL容量瓶中，超纯水定容至100 mL，蔗糖的质量浓度分别为3、2.5、2、1.75、1.50、1.25、1.0、0.75、0.50和0.25 mg/mL；以标准品的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线。称取发酵乳5.0 g至100 mL烧杯中，并添加25.0 g去离子水，磁力搅拌器充分溶解；依次添加2.5mL Carrez试剂A和Carrez试剂B，充分溶解30min、获得混合物；上述混合物以5000×g，离心15 min；用蒸馏水将上清液稀释至100 mL，通过0.22 μm滤膜过滤处理；在Bio-Rad Aminex® HPX-87P（300 mm×7.8 mm×9 μm）色谱柱和2414型差示折射率检测器（RID）相结合，以5 mM硫酸水溶液为流动相，流速为550 μL/min，柱温设定为60 ℃，进样量为2 μL，采用外标法检测样品中的乳糖和蔗糖含量，从而计算获得蔗糖利用率。
所述Carrez试剂A，其配方为：称取10.60 g亚铁氰化钾，去离子水溶解至100 mL。所述Carrez试剂B，其配方为：称取21.90 g二水乙酸锌，去离子水溶解，添加3 mL乙酸溶解，定容至100 mL。
本实施例选取六株干酪乳杆菌，分别为LC_N16、N17、N31、N40、N80和N88。分别依照上述方法判断以上六株菌对蔗糖的代谢效果。
结果分析：
各株干酪乳杆菌的生长见图1，LC_N16、N17和N40在蔗糖为单一糖源下，其生长在4小时进入对数期，12小时进入稳定期；而LC_N31、N80和N88在蔗糖为单一糖源下，16小时内其OD600值均小于0.250，表明这三株菌不利用蔗糖。
比较LC_N16、N17、N40与LC_N31、N80、N88菌株的在蔗糖-6-磷酸水解酶SacA的氨基酸序列。结果见图2，LC_N16、N17、N40中β-果糖苷酶SacA的5个氨基酸（缬氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、缬氨酸）与LC组的不同（异亮氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸），其中从苏氨酸突变成丙氨酸时，氨基酸的极性和电荷发生了改变。
利用蔗糖的干酪乳杆菌的蔗糖-6-磷酸水解酶SacA的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：
HFKQGGKFMKEATWSTAARYQPYSSWAPDYIMKLKAQVAASKWRTKTHVQPDTGLINDPCSLNFFNNKWHLYYQQFPFGPVHGLKSWAHAVSKDLFNWRRVPGDLLPDNEYDSHGAYTGSALVTHGTLRLMYTGNARDDQWHRHSTQLGAVLGADGRLFKDPKPLVLTPPTGYTQEFRDPFLFNYEGQTYVLIGGQRPDHTGAILLYAKQTDKSWRFVAPLSIPDEFCGYMVECPNITFINGKVVLVYCPQGLDQDFFEYENVYPNIALVADSFDPTTGNLTHQRLQNIDKGFDFYATRLANTDDDGTLAISWLGLPDTTYPTDDDGWAGVLSYVRQLTLRDDHVCLYPHPAIKNLRETAVEDLPVIQQHDDEWTVTNLEGAFELALTLAAGQKTTIHLPDGDHDQLLIHLDSDSGQGMIQRENRNNGGSLRQFGFPAGKTVEIRLFIDVSVFELFIDQGYRVVSGRFFGNEAPTAARVTPPSAASDVVSWNLKKDNGGL。
发酵乳中蔗糖含量的测定结果见图3，LC_N16、N17和N40三株菌消耗的蔗糖分别为1.2 g、1.43 g和1.35 g，其对蔗糖利用率分别为24%、28.6%和27%；而LC_N31、N80和N88菌株消耗的蔗糖分别为0.028 g、0.027 g和0.029 g，其对蔗糖利用率分别为0.56%、0.54%和0.58%。证实上述利用蔗糖-6-磷酸水解酶的氨基酸序列定向筛选代谢蔗糖的干酪乳杆菌。
综上所述，基于蔗糖-6-磷酸水解酶的氨基酸序列定向筛选代谢蔗糖的干酪乳杆菌，以期作为发酵剂应用在乳制品发酵，以提高发酵速率，提升发酵乳品质，是本领域亟待解决的技术问题。
最后应说明的是，以上仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳布置方案对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (6)
1.一种筛选代谢蔗糖的干酪乳杆菌发酵剂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1，sacA基因的扩增：
提取待测干酪乳杆菌的基因组DNA，并扩增得到待测干酪乳杆菌的sacA基因全长序列；
其中，扩增sacA基因的PCR引物包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
步骤2，待测菌蔗糖-6-磷酸水解酶氨基酸序列的确定：
对步骤1获取的sacA基因全长序列，通过软件确定待测干酪乳杆菌的蔗糖-6-磷酸水解酶氨基酸序列；
步骤3，蔗糖-6-磷酸水解酶氨基酸序列的比对：
比对步骤2获得的待测干酪乳杆菌的蔗糖-6-磷酸水解酶氨基酸序列，如其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，则确定该待测干酪乳杆菌可代谢蔗糖。
2.根据权利要求1所述筛选代谢蔗糖的干酪乳杆菌发酵剂的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
步骤4，待测菌对蔗糖利用情况的验证：
S41，待测干酪乳杆菌的活化；
S42，待测干酪乳杆菌对蔗糖利用情况的测定。
3.根据权利要求1所述筛选代谢蔗糖的干酪乳杆菌发酵剂的方法，其特征在于，步骤1中，提取待测干酪乳杆菌基因组DNA，具体包括以下步骤：
将待测干酪乳杆菌接种于培养基中、静置培养，当OD600 = 0.8~1.0，取菌液离心除上清，向沉淀中加入TES溶液重悬菌体、离心去除上清，而后向菌体中加入溶菌酶重悬菌体，消化后加入RNase混匀，再加入蛋白酶K溶液、混匀，加入缓冲液GB振荡、水浴处理，加入无水乙醇并充分混匀，离心倒掉废液；加入缓冲液GD，离心倒掉废液；加入漂洗液PW洗涤，离心晾干吸附材料中的残余漂洗液；滴加预热的TE缓冲液，离心收集样品，低温保存备用。
4. 根据权利要求1所述筛选代谢蔗糖的干酪乳杆菌发酵剂的方法，其特征在于，步骤1中，利用PCR技术扩增sacA基因，选择Ex Taq HS酶建立25 μL体系，PCR反应条件为：95 ℃，3min；[95 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，2 min] × 30个循环；72 ℃，5 min；4 ℃。
5.根据权利要求2所述筛选代谢蔗糖的干酪乳杆菌发酵剂的方法，其特征在于，步骤4中，S41待测干酪乳杆菌的活化的具体步骤为：
将待测干酪乳杆菌接种至MRS液体培养基，在37 ± 1℃下培养12 h，进行菌株的活化。
6.根据权利要求2所述筛选代谢蔗糖的干酪乳杆菌发酵剂的方法，其特征在于，步骤4中，S42待测干酪乳杆菌对蔗糖利用情况测定的具体步骤为：
首先，确定待测菌是否可利用蔗糖：将待测干酪乳杆菌接种至MRSS液体培养基，在37± 1℃下培养12 h，检测菌株对蔗糖的代谢情况；
而后，对确定可利用蔗糖的菌株作为发酵剂发酵乳基，计算蔗糖利用率：
发酵乳的制备：将生牛乳与蔗糖混合，经均质和巴氏杀菌处理，冷却后制备得到发酵基料；按照5×106 CFU/g的添加量将活化后的待测干酪乳杆菌接种于发酵基料中，在37 ℃下培养获得发酵乳；
蔗糖含量的检测：准确称取蔗糖标准品于100mL容量瓶中，超纯水定容至100 mL，蔗糖的质量浓度分别为3、2.5、2、1.75、1.50、1.25、1.0、0.75、0.50和0.25 mg/mL；以标准品的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线；称取上述发酵乳至烧杯中，并添加去离子水，磁力搅拌器充分溶解；依次添加Carrez试剂A和Carrez试剂B，充分溶解、获得混合物；上述混合物离心后取上清液；用蒸馏水稀释上清液，通过滤膜过滤处理；在色谱柱和差示折射率检测器相结合，以硫酸水溶液为流动相，采用外标法检测发酵乳样品中的蔗糖含量，从而计算获得蔗糖利用率。
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