CN108330083B - 一株嗜热链球菌及在生产搅拌型酸奶中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株嗜热链球菌及其应用，本发明提供了一株在传统腌制韭菜中分离到的嗜热链球菌LSE‑2014ZA001‑C198‑B‑03，它的的保藏编号为CGMCC No.13624。本发明菌株个有以下有益效果：菌株在3h就可以凝乳，凝乳酸度为46oT，发酵121h极限酸值为85oT；胞外多糖含量高于发酵乳生产中常用的商业菌种；菌株通过特异性引物扩增、测序表明能够表达谷氨酸脱羧酶，菌株可以合成γ‑氨基丁酸，发酵37℃发酵24h产量为2.01g/L；本发明菌株和保加利亚乳杆菌LSR‑L‑L1组合制备搅拌型酸奶，发酵的酸奶状态细腻、粘稠度高、拉丝性好、具有很好的酸香风味。
Description
技术领域
本发明属于微生物的技术领域，尤其涉及一株嗜热链球菌及在生产搅拌型酸奶中的应用。
背景技术
嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）作为一种重要的发酵剂，发酵的酸乳能产生独特的风味，酸乳已成为遍布世界各地的产业化健康美食。发酵乳制品的产业化，使得人们对发酵剂菌种（主要是嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌）提出更高的要求。目前我们国家大多数发酵乳生产企业使用的发酵剂主要依赖进口，因此通过企业自己不断筛选出候选菌株及全面了解菌株的多方面特性，以满足发酵乳生产，是我国发酵乳制品产业噬待解决的问题。
胞外多糖是乳酸菌在生长过程中分泌到细胞壁外的糖类化合物，有的依附于细胞壁形成荚膜多糖，有的进入培养基形成粘液多糖。胞外多糖特殊的物理特性及流变特性对于改善酸奶的质构具有关键作用，可以作为酸奶天然的粘稠剂、稳定剂、凝胶剂及乳化剂，为发酵乳提供黏性、稳定性和保水性。因此筛选具有能高产胞外多糖的菌株对满足当代消费者零添加剂或少添加的发酵乳制品具有重要意义。
γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）是一种泛分布于自然界的非蛋白质氨基酸。在生物体内由谷氨酸经谷氨酸脱羧酶催化转化而来，是一种重要的抑制性神经传递物质，参与很多代谢活动，如降血压、改善脑功能、镇静、增强长期记忆及肝、肾机能等功能。含有谷氨酸脱羧酶的乳酸菌也能将谷氨酸转化为γ-氨基丁酸，是GABA生产的一个重要途径。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一株凝乳速度快、高产胞外多糖、具有γ-氨基丁酸的合成性能的嗜热链球菌。
本发明的另一目的是提供嗜热链球菌LSE-2014ZA001-C198-B-03在生产搅拌型酸奶上的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案：一株嗜热链球菌LSE-2014ZA001-C198-B-03，它的保藏编号为CGMCC No.13624，保藏日期为 2017年01月13日。
与现有技术相比，本发明的有益效果有：
1、本发明菌株LSE-2014ZA001-C198-B-03的凝乳时间很快，菌株在3h就可以凝乳，凝乳酸度为46oT，发酵121h极限酸值为85oT，说明菌株的后酸较低，有利于在货架期内风味的维持。
2、本发明菌株LSE-2014ZA001-C198-B-03的胞外多糖含量高于发酵乳生产中常用的商业菌种。通过粘度的测定，其发酵的脱脂乳粘度明显高于对照菌种，同时发酵的脱脂乳更加粘稠。所以本发明菌株应用于酸奶生产能够明显提高酸奶的粘度，改善酸奶质地，减少添加剂的使用。
3、本发明菌株LSE-2014ZA001-C198-B-03，采用HPLC法对发酵液中的γ-氨基丁酸进行定量检测，本发明菌株可以合成γ-氨基丁酸，发酵37℃发酵24h产量为：2.01g/L，本发明菌株能够高产γ-氨基丁酸，所以能够用于食品或保健药品中。
4、本发明菌株LSE-2014ZA001-C198-B-03和保加利亚乳杆菌LSR-L-L1组合制备搅拌型酸奶，发酵的酸奶状态细腻、粘稠度高、拉丝性好、具有很好的酸香风味。
本发明保藏说明：
分类命名：嗜热链球菌；
拉丁名：（Streptococcus thermophilus）；
参椐的生物材料：LSE-2014ZA001- C198-B-03；
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏机构简称：CGMCC；
地址：北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号。
保藏日期：2017年01 月13日。
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.13624。
附图说明
图1为本发明所述的嗜热链球菌LSE-2014ZA001-C198-B-03的镜检照片。
图2为本发明所述的嗜热链球菌LSE-2014ZA001-C198-B-03的产酸曲线图。
图3为本发明所述的嗜热链球菌LSE-2014ZA001-C198-B-03的生长曲线图。
图4为本发明所述的嗜热链球菌 LSE-2014ZA001-C198-B-03的γ-氨基丁酸的标准品色谱图。
图5为本发明所述接种嗜热链球菌 LSE-2014ZA001-C198-B-03发酵液中γ-氨基丁酸的色谱图。
图6为本发明在未接种LSE-2014ZA001-C198-B-03发酵液的阴性对照色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明，但不限于实施例。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1： 菌种的分离纯化鉴定
1．菌种的分离纯化
将采集到的传统腌制韭菜样品剪碎称取10g，加入到100 mL MC液体培养基中42℃恒温培养18h。取培养液1mL用生理盐加入到9mL生理盐水中，充分震荡30s，依次进行梯度稀释，最高稀释度为108。采用MC固体培养基进行分离，取5、6、7、8四个梯度的稀释样品进倒板（37℃,48h）。初步根据菌落形态、大小、溶钙圈大小、颜色、培养基中生长位置（表面、内部、及底部）挑取不同表观特征且溶钙圈较大的菌落平板划线培养，进行纯化。再用同样的方法反复划线纯化数次， 使最终平板上为同一形态菌落为止。挑取单菌落接菌于 MRS 液体培养基中 37℃培养 18h， 以备保藏和鉴定使用。
2. 菌种的鉴定
2.1菌种的形态学特征
LSE-2014ZA001-C198-B-03的菌落在MC固体培养基上的菌落为紫红色，周围有溶钙圈。显微镜下为椭球形成对呈长链，见图1 LSE-2014ZA001-C198-B-03的镜检照片。
2.2菌种的分子生物学鉴定
将初步获得革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的菌株暂定为乳酸菌，然后根据UNI-Q柱式细菌DNA抽提试剂盒的实验步骤提取细菌基因组，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳观察提取到的基因组。以提取到的菌株的基因组为模板，采用细菌通用引物：27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3') 和1541R (5'- TAAGGAGGTGATCCAGCC -3')为上、下游引物，采用PCR扩增试剂盒，50µL的反应体系进行PCR反应。反应参数为：95℃预变性5min，35个循环的参数设置为94℃30s，55℃30s，72℃90s，72℃延伸10min。用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增DNA片段的大小，测序由上海生物工程技术服务有限公司完成。将经过测序所得到的序列用Blast软件在Genebank中搜索相似序列。
据设计的引物进行16SrDNA扩增，电泳显示在1500bp左右有阳性条带，与目的片段大小一致，将PCR产物送至测序公司进行测序。测序结果通过Blasten比对，与嗜热链球菌具有99%的相似性, 16SrDNA全长序列如SEQ ID NO.1所示。
结合菌株的生理生化特征和分子生物学16S rDNA 鉴定结果，本发明菌株LSE-2014ZA001-C198-B-03鉴定为嗜热链球菌，并将其命名为嗜热链球菌LSE-2014ZA001-C198-B-03，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为: CGMCCNo.13624。
3.LSE-2014ZA001-C198-B-03的产酸性能测定。
将在MC 液体培养基中活化三代的种子液按2%的接种量接种蛋白含量为3.5%的脱脂复原乳中，38℃恒温培养120h，12h之前酸度上升较快，每隔2h滴定一次酸度；12h后每隔24h和滴定一次酸度，记录凝乳时间和酸度。根据培养时间和酸度绘制菌株38℃培养120h的产酸曲线。
菌株的产酸曲线见图2。菌株在3h就可以凝乳，凝乳酸度为48oT。菌株的凝乳时间很快，说明菌株可以在短时间内快速产酸。同时与4种商业嗜热链球菌进行对照，LSE-2014ZA001-C198-B-03的产酸速度均高于对照。嗜热链球菌作为一种重要的发酵剂快速产酸可以提高生产效率。发酵72h后酸度不再明显上升，发酵121h极限酸值为85oT，说明菌株的后酸较低，有利于在货架期内风味的维持。
本实例提供了从传统腌制韭菜中分离嗜热链球菌的筛选方法，采用选择性培养基MC进行富集培养，然后通过梯度稀释法进行分离纯化得到菌株。对菌株的产酸能力进行测定，该菌株能够快速产酸、凝乳时间为3h，且38℃恒温培养发酵72h后酸度不再明显上升，发酵121h极限酸值为85oT，说明菌株的后酸较低，有利于在货架期内风味的维持。
实施例2：LSE-2014ZA001-C198-B-03胞外多糖产量测定。
1.LSE-2014ZA001-C198-B-03生长曲线测定
采用生长曲线仪测定LSE-2014ZA001-C198-B-03的生长曲线，每1h测定一次OD值，绘制菌株在MRS液体培养基中38℃恒温培养72h的生长曲线，以便测定菌株不同生长期的胞外多糖产量。
菌株生长曲线如图3所示，0-2小时为生长延滞期菌株几乎不增值；2-9h为对数生长期这个阶段菌体数量急剧上升；9-24h为稳定期，菌体数量达到最大值不再上升，菌体的各种代谢产物不断积累；24h以后随着体系中营养物质的不断消耗菌体进入衰退期。
2.LSE-2014ZA001-C198-B-03胞外多糖提取
在MC液体培养基中活化三代的种子液按2%的接种量接种至10mL蛋白含量为3.5%的脱脂复原乳中，38℃恒温培养，分别取培养2h、9h、18h、36h的发酵液测定胞外多糖含量。100℃水浴加热15min，冷却，加入80g/100mL三氯乙酸至终质量浓度为4g/100mL，4℃恒温静置18h后离心（12000r/min，20min，4℃）去除沉淀蛋白。上清液添加95%乙醇至终浓度为75%，4℃静置22h（12000r/min，20min，4℃）。沉淀用去离子水溶解，所得的水溶液在去离子水中透析3天，每8天换一次水，定容至10mL。以同样的方法处理搅拌型酸奶商业菌种（嗜热链球菌）A、B、C三种。同时实验过程中以蛋白含量为3.5%的脱脂复原乳为阴性对照。
菌株LSE-2014ZA001-C198-B-03与商业菌种A、B、C在不同的生长时间胞外多糖产量见表1。由实验结果可知LSE-2014ZA001-C198-B-03的胞外多糖含量高于商业菌种A、B、C。
表1：菌株LSE-2014ZA001-C198-B-03与商业菌种A、B、C在不同的生长时间胞外多糖产量不同生长期胞外多糖产量
本发明菌株胞外多糖的产量随着发酵时间从延滞期进入稳定期逐渐增加，对数生长期达到最高，衰退期含量减少。菌株胞外多糖的积累与生长期是一致的，菌株的胞外多糖产量在18h时达到最高为254.8mg/L。LSE-2014ZA001-C198-B-03的胞外多糖含量高于发酵乳生产中常用的商业菌种A、B、C。
3.LSE-2014ZA001-C198-B-03发酵乳粘度测定
同时以常用的三种商业菌种A、B、C为对照。在MC液体培养基中活化三代的种子液按2%的接种量接种至30mL蛋白含量为3.5%的脱脂复原乳中，38℃恒温发酵12h。一组发酵结束立即进行粘度测定，一组发酵结束后冷藏18h后再行粘度测定。使用粘度计测定粘度，发酵结束立即进行粘度测定转速为12r、发酵结束后冷藏18h粘度测定转速为6r。LSE-2014ZA001-C198-B-03与商业菌种A、B、C发酵脱脂乳的粘度测定见表2。
表2 ：LSE-2014ZA001-C198-B-03与商业菌种A、B、C发酵脱脂乳的粘度
通过粘度的测定，LSE-2014ZA001-C198-B-03发酵的脱脂乳粘度明显高于对照菌种，同时发酵的脱脂乳更加粘稠。所以菌株LSE-2014ZA001-C198-B-03应用于酸奶生产能够明显提高酸奶的粘度，改善酸奶质地，减少添加剂的使用。
实施例3：LSE-2014ZA001-C198-B-03的γ-氨基丁酸合成性能测定
菌株γ-氨基丁酸产量测定：
采用高效液相色谱法测定发酵液中的γ-氨基丁酸产量，
色谱条件：Luna-C18色谱柱（2.5*4.6mm，5µm）；检测波长：334nm；流速：0.8mL/min；柱温：35℃；进样量：20µL；进样方式：手动进样。
柱前衍生：取200µL标准品或发酵液、600µLOPA衍生试剂于5mLEP管中，震荡均匀，再取800µL磷酸二氢钾缓冲液，混匀，经0.22µm的过滤膜过滤1-2次后，进样。
γ-氨基丁酸标准曲线：将1.00mg/mL标准储备液用双蒸水分别稀释成浓度为50、100、200、400、600、800µg/mL的不同浓度梯度的而标准溶液，分别衍生进样后，以γ-氨基丁酸的色谱峰面积为纵坐标，相应的浓度为横坐标，绘制标准曲线。
800µg/mLγ-氨基丁酸标准的色谱图见图4，出峰时间为28.6。能够与杂质峰完全分离，峰形为对称的高斯峰。
LSE-2014ZA001-C198-B-03发酵液中γ-氨基丁酸产量测定：用添加1%谷氨酸、蛋白含量为3.5%的脱脂复原为发酵培养基，按照2%接种量接入LSE-2014ZA001-C198-B-03种子液，37℃，恒温发酵24h。震荡均匀，取发酵液1mL，10000r/min，离心5min，取上清液200µL。柱前衍生后，按照所述的色谱条件对发酵液中的γ-氨基丁酸产量进行测定。菌株发酵液通过HPLC在28.6min时也有对应的γ-氨基丁酸的峰，γ-氨基丁酸的色谱图见图 5,说明菌株具有合成γ-氨基丁酸的活力。同时以不接种嗜热链球菌LSE-2014ZA001-C198-B-03的添加1%谷氨酸、蛋白含量为3.5%的脱脂复原为阴性对照，按照上述的方法同样处理进行γ-氨基丁酸的测定，结果见图6菌株发酵液通过HPLC，在28.6min时没有对应的γ-氨基丁酸的峰，说明空白发酵培养基中没有γ-氨基丁酸。
高效液相结果表明，空白培养基中没有γ-氨基丁酸，所以不会对实验结果产生干扰。嗜热链球菌LSE-2014ZA001-C198-B-03的γ-氨基丁酸产量为：2.01g/L
本实施例菌体如果能够表达谷氨酸脱羧酶就能够将培养基中的谷氨酸脱羧转化为γ-氨基丁酸，菌株LSE-2014ZA001-C198-B-03通过特异性引物扩增、测序表明能够表达谷氨酸脱羧酶。同时采用HPLC法对发酵液中的γ-氨基丁酸进行定量检测，LSE-2014ZA001-C198-B-03可以合成γ-氨基丁酸发酵，37℃发酵24h产量为2.01g/L。所以LSE-2014ZA001-C198-B-03应用于发酵乳生产能够对人体健康起到积极的促进作用。γ-氨基丁酸相关的研究已经比较深入，它能降血压、改善脑功能、镇静、增强长期记忆。菌株LSE-2014ZA001-C198-B-03能够高产γ-氨基丁酸，所以能够用于食品或保健药品中。
实施例4：LSE-2014ZA001-C198-B-03在酸奶发酵中的应用
LSE-2014ZA001-C198-B-03 与保加利亚乳杆菌LSR-L-L1按照10:1进行组合（LSR-L-L1为本实验室分离获得并目前已经在生产中应用，其保藏编号为：CGMCC No.14750，作为酸奶发酵剂制备搅拌型酸奶。
步骤1 种子液制备：取LSE-2014ZA001-C198-B-03MRS培养液，按照2%接种量，接入115℃、15min灭菌且蛋白含量为3.0%脱脂牛奶中。将保加利亚乳杆菌LSR-L-L1在MRS发酵液中活化三代。
步骤2 LSE-2014ZA001-C198-B-03发酵剂制备：将步骤1所述的种子液按照2%接种量，接入装有1000mL蛋白含量为3.0%的脱脂牛奶中；将步骤1所述的保加利亚乳杆菌LSR-L-L1MRS种子液按照1%接种量，接入装有1000mL蛋白含量为3.0%的脱脂牛奶中。
步骤3发酵基料制备：配制蛋白含量3%的新鲜牛奶，115℃、15min灭菌。
步骤4 酸奶制备：将步骤3制得的发酵剂接入50kg的牛奶基料。 38℃恒温发酵4h凝乳，继续发酵6h酸度达到90OT发酵结束，均质，放置于4℃冰箱中冷藏后熟，测定粘度酸度及进行感官评定。一组发酵结束立即进行粘度测定，一组发酵结束后冷藏18h后再行粘度测定。使用粘度计测定粘度，发酵结束立即进行粘度测定转速为12r、发酵结束后冷藏18h粘度测定转速为6r，粘度及酸度的测定结果见表3。
表3 ：LSE-2014ZA001-C198-B-03C198-B-03 与LSR-L-L1组合发酵制备的酸奶的粘度及酸度
本实施例 LSE-2014ZA001-C198-B-03C198-B-03 与保加利亚乳杆菌LSR-L-L1按照10:1进行组合制备发酵剂，发酵的酸奶状态细腻、粘稠度高、拉丝性好、具有很好的酸香风味, 而且6h出发酵适合生产应用。所以作为高产胞外多糖的LSE-2014ZA001-C198-B-03C198-B-03是进行酸奶发酵的优良菌种，同时LSE-2014ZA001-C198-B-03C198-B-03高产γ-氨基丁酸对于人体的健康具有积极的促进作用。
序列表
<110> 云南皇氏来思尔乳业有限公司
<120> 一株嗜热链球菌及在生产搅拌型酸奶中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1375
<212> DNA
<213> 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)
<400> 1
ctcaccgact tcgggtgtta caaactctcg tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg 60
ggaacgtatt caccgcggcg tgctgatccg cgattactag cgattccgac ttcatgtagg 120
cgagttgcag cctacaatcc gaactgagat tggctttaag agattagctc gccgtcaccg 180
actcgcaact cgttgtacca accattgtag cacgtgtgta gcccaggtca taaggggcat 240
gatgatttga cgtcatcccc accttcctcc ggtttattac cggcagtctc gctagagtgc 300
ccaactgaat gatggcaact aacaataggg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca 360
tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc accacctgtc accgatgtac cgaagtaact 420
ttctatctct agaaatagca tcgggatgtc aagacctggt aaggttcttc gcgttgcttc 480
gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt caattccttt gagtttcaac 540
cttgcggtcg tactccccag gcggagtgct taatgcgtta gctgcggcac tgaatcccgg 600
aaaggatcca acacctagca ctcatcgttt acggcgtgga ctaccagggt atctaatcct 660
gttcgctccc cacgctttcg agcctcagcg tcagttacag accagagagc cgctttcgcc 720
accggtgttc ctccatatat ctacgcattt caccgctaca catggaattc cactctcccc 780
ttctgcactc aagtttgaca gtttccaaag cgaactatgg ttgagccaca gcctttaact 840
tcagacttat caaaccgcct gcgctcgctt tacgcccaat aaatccggac aacgctcggg 900
acctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgt ccctttctgg taagctaccg 960
tcacagtgtg aactttccac tctcacaccc gttcttgact tacaacagag ctttacgatc 1020
cgaaaacctt cttcactcac gcggcgttgc tcggtcaggg ttgcccccat tgccgaagat 1080
tccctactgc tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc agtcccagtg tggccgatca 1140
ccctctcagg tcggctatgt atcgtcgcct aggtgagcca ttacctcacc tactagctaa 1200
tacaacgcag gtccatcttg tagtggaaca attgcccctt tcaaataaat gacatgtgtc 1260
atccattgtt atgcggtatt agctatcgtt tccaatagtt atcccccgct acaaggcagg 1320
ttacctacgc gttactcacc cgttcgcaac tcatccaaga agagcaagct cctct 1375
Claims (2)
1.一株嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）LSE-2014ZA001-C198-B-03，其特征在于：其保藏编号为CGMCC No .13624。
2.根据权利要求 1 所述的一株嗜热链球菌LSE-2014ZA001- C198-B-03在生产搅拌型酸奶中的应用。
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