CN115927050A - 一种具有缓解焦虑功能的嗜热链球菌发酵产品的制备方法 - Google Patents
一种具有缓解焦虑功能的嗜热链球菌发酵产品的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有缓解焦虑功能的嗜热链球菌发酵产品的制备方法，属于食品加工与发酵技术领域。本发明将食品级的安全菌株嗜热链球菌GDMCC No.60810应用于制备提升宿主血清中的血清素水平的产品中，安全健康，所述嗜热链球菌GDMCC No.60810可以显著提高血清中的血清素水平，使其在与血清素变化相关的认知与记忆障碍的疾病中发挥其调节作用，并且还能够显著促进肠道中双歧杆菌的丰度，其对胃肠液良好的耐受性，可有效发挥其在胃肠道内的益生作用。利用所述嗜热链球菌GDMCC No.60810发酵得到的乳品中，具有较高含量的乙偶姻、增强了乳品的风味。本发明将嗜热链球菌GDMCC No.60810应用于发酵产品的制备，将对多元化功能性乳制品的发展具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有缓解焦虑功能的嗜热链球菌发酵产品的制备方法，属于食品加工与发酵技术领域。
背景技术
随着居民生活条件的改善，消费者对食品的消费需求也在不断升级，其中营养健康元素是多数人关注的重点。发酵乳由牛乳经乳酸菌发酵而成，是补充蛋白质和矿物质等营养物质的有效途径，然而目前市售发酵乳产品同质化严重问题，逐渐成为影响乳企发展的问题之一。而功能型乳制品的崛起改变了这一现状，由于其符合了消费者对健康生活方式的追求，受到强烈关注，成为乳品企业竞争中的热点。
焦虑症，又称为焦虑性神经症，是神经症这一大类疾病中最常见的一种，以焦虑情绪体验为主要特征。特别以“高学历、高收入、高压力”为主要特征的城市新“三高”精英人群，更是成为被焦虑氛围挟裹的主体，抑郁、失眠、便秘等症状在这些人群的身上体现的更为明显。在其发病机制的研究中，谷氨酸、5-血清素、多巴胺等神经递质系统的功能和代谢异常是焦虑症研究的焦点。其中，血清素是大脑的一种重要的单胺类神经递质，其作为连接肠道微生物和大脑的一种重要信号分子，在调控神经系统、胃肠道功能、机体脂代谢和免疫系统等方面起着重要作用。研究表明，血清素是产生愉悦情绪的使者，它可以调节情绪，精力，抗抑郁的药物大多是通过提高血清素水平而作用的。目前市面上常见的抗抑郁药物，大多都是作用于血清素，以维持和提高大脑中的血清素含量，例如阿米替林、氟西汀、帕罗西汀、舍曲林、文拉法辛和度洛西汀等，但是长期服用抗抑郁药物存在一定的副作用，例如出汗、胃肠道不适、体重增加、失眠、疲倦、神经紧张、肌肉震颤和燥郁等。
认知障碍是一类精神健康病症，其主要影响学习、记忆、感知和解决问题，且包括健忘症，痴呆，和谵妄。也包括与对认知和记忆功能有影响的焦虑障碍，心境障碍，和精神障碍相关的认知症状。记忆障碍的特征为，由于神经解剖结构的损伤导致的阻碍记忆的存储，保留和回忆的病症。记忆障碍可以是进行性的，包括阿尔茨海默病，或他们可以是即时的，包括头部损伤引起的病症。同时随着生活压力和学习压力的增大，加上睡眠质量不好，很多人记忆力开始下降，因此，如何提高记忆力已经成了很多人关心的问题。
鉴于药物治疗存在的缺陷，针对抑郁、焦虑、认知障碍寻找一种健康有效的干预或治疗途径，显得意义重大。近年来的研究表明，血清素对机体发挥的作用可能受到肠道微生物影响。肠道中某些微生物具有产生血清素的能力，同时，微生物群及其代谢产物(如丁酸)能通过影响色氨酸羟化酶活性或色氨酸代谢去向，调节机体血清素水平。血清素作为连接肠道微生物和大脑的一种重要信号分子，在调控神经系统、胃肠道功能、机体脂代谢和免疫系统等方面起着重要作用。研究表明，生物活性营养素和肠道菌群可以通过多种机制改变DNA甲基化和组蛋白特征，人体肠道内的微生物可能在调节-脑轴的各种元素中发挥重要作用。目前，某些双歧杆菌和乳杆菌能够调节神经功能：在专利CN11454024A中公开了一株可提高脑中神经递质5-羟基色胺含量的鼠李糖乳杆菌，在专利CN107523526A中公开一株可提高大鼠外周血神经递质5-羟基色胺水平的罗伊氏乳杆菌，在专利CN113215034A中公开了一株可提高阿兹海默症小鼠血清中5-羟基色胺含量的短双歧杆菌，在专利CN113512514A中公开一株可使中枢5-羟基色胺水平上升的乳酸乳球菌。
嗜热链球菌是乳品行业发展重要的发酵菌株之一，针对嗜热链球菌的研究，大多集中于其发酵特性，如其对发酵乳产酸、风味形成及质构特性的影响，若能进一步挖掘嗜热链球菌的新特性并将其应用于发酵产品中，将具有广阔的应用和市场前景。
发明内容
发明人从我国青海西宁地区采集的牦牛曲拉中筛选出了一株嗜热链球菌，此菌株能够显著增加宿主血清中的血清素水平，并可同时增加粪便中双歧杆菌属的丰度，此菌株能够很好地耐受人体的胃液和肠液，在脱脂乳中能够很好地生长并产生挥发性风味物质乙醛和乙偶姻，为后续制备发酵食品奠定了良好的基础，有助于提升食品的风味。
本发明的第一个目的是提供一株嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)，并已于2019年10月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60810，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
在一种实施方式中，所述的嗜热链球菌GDMCC No.60810菌株特性具有下述性质：
(1)菌株可以显著上调宿主血清中的血清素水平；
(2)菌株能够显著促进肠道中双歧杆菌的丰度；
(3)菌株具有良好的胃肠道耐受性和体内增殖能力。
本发明的第二个目的是提供一种菌剂，所述菌剂中含有所述嗜热链球菌GDMCCNo.60810。
在一种实施方式中，所述菌剂的制备方法为：
S1、将权利要求1所述嗜热链球菌连续活化两代，得到活化液；
S2、将活化液接种于培养基中，在30～40℃下培养15～20h，得到菌液；
S3、将得到的菌液离心后取沉淀，得到菌泥；
S4、将菌泥用生理盐水清洗3次后用冻干保护剂重悬至菌浓不低于1×109CFU/mL，得到菌悬液；
S5、将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干得到含有所述嗜热链球菌的菌剂。
在一种实施方式中，所述保护剂的成分包含130g/L脱脂奶粉。
本发明的第三个目的是提供一种可提高血清素水平的产品，具体为提高血清中血清素的含量，所述产品是利用所述的嗜热链球菌GDMCC No.60810或所述的菌剂制备得到。
在一种实施方式中，所述产品具有如(a)～(c)所示的一种或多种功能：
(a)缓解焦虑、抑郁；
(b)增强认知与减轻记忆障碍；
(c)调节胃肠道功能，提升肠道中双歧杆菌属的丰度。
在一种实施方式中，所述产品包括但不限于食品、药品。
在一种实施方式中，所述药品的剂型包括粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
在一种实施方式中，所述胶囊的制备方法为：
S1、嗜热链球菌GDMCC No.60810划线于M17乳糖固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；
S2、挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；
S3、将活化液按2％(v/v)的接种量接种于培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到菌泥；
S4、将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；
S5、菌悬液添加至浓度为30g/L的海藻酸钠溶液中至浓度为2×109CFU/mL后，充分搅拌，使得嗜热链球菌GDMCC No.60810的细胞均匀地分散于海藻酸钠溶液中，得到混合液；
S6、将混合液挤压到浓度为20g/L的氯化钙溶液中形成胶粒；待形成的胶粒静止固化30min后，过滤收集胶粒；
S7、将收集得到的胶粒进行冷冻干燥48h，得到粉剂；将粉剂装入到药用胶囊中，得到胶囊制品。
在一种实施方式中，所述片剂中还含有填充剂、粘合剂、稀释剂、润滑剂、增溶剂和甜味剂。
优选地，所述填充剂为淀粉，所述粘合剂包括羧甲基淀粉钠，所述润滑剂包括滑石粉，所述增溶剂和甜味剂包括蔗糖，所述稀释剂和粘合剂包括纤维素衍生物。
更优选地，称取嗜热链球菌GDMCC No.60810菌粉25.7重量份、淀粉55.0重量份、纤维素衍生物4.5重量份、羧甲基淀粉钠12.0重量份、滑石粉0.8重量份、蔗糖1.0重量份与水1.0重量份，得到原材料；将原材料混合，得到湿颗粒；将湿颗粒用压片机压片后再利用药物干燥机进行干燥，得到片剂。
在一种实施方式中，所述食品包括由所述的嗜热链球菌GDMCC No.60810或所述的菌剂发酵得到的发酵制品或含有权利要求1所述的嗜热链球菌的食品。
在一种实施方式中，所述发酵制品包括酸奶、奶酪、发酵豆乳。
优选地，所述酸奶的制备方法为以牛乳为原料，经均质、冷却，将所述嗜热链球菌GDMCC No.60810或含有嗜热链球菌GDMCC No.60810的冻干发酵剂，在42℃下发酵12h，发酵至pH 4.50～4.70。
优选地，所述奶酪的制备方法为：
S1、将牛乳经均质、杀菌后降温至40℃，添加其重量0.01％-0.1％的菌剂和0.003％-0.005％的CaCl2，充分搅拌30min后，在40℃的温度下发酵30-60min，得到发酵牛乳；
S2、向发酵牛乳中添加其重量0.2-2.5％的1％凝乳酶溶液，充分搅拌后，静置30-45min，得到凝乳；
S3、当凝乳pH值为4.5-5时，将所述凝乳装入60目的滤布槽内排乳清，得到半成品奶酪；在温度为4-8℃的条件下放置18-20h，制得奶酪。
优选地，所述发酵豆乳的制备方法为：
S1、将干大豆研磨煮熟后用120目纱布过滤得到豆乳；
S2、将豆乳高温灭菌并冷却至室温；
S3、向豆乳中加入嗜热链球菌GDMCC No.60810，使嗜热链球菌GDMCC No.60810在豆乳中的活菌数达到107cfu/g，将接种好的样品放入37℃的培养箱中发酵。发酵完毕后，豆奶需在4℃下冷藏保存。
在一种实施方式中，所述含有嗜热链球菌GDMCC No.60810的食品包括巧克力、果蔬制品。
优选地，所述果蔬饮料的制备方法为：
S1、将水果和蔬菜榨汁后去渣得到果蔬汁；
S2、将果蔬汁杀菌后降温至37℃；
S3、向杀菌后的果蔬汁中添加嗜热链球菌GDMCC No.60810至浓度为不低于1×106CFU/mL，得到果蔬饮料。
优选地，所述巧克力的制备方法为：
S1、将可可块和白砂糖以1:1～1:3的质量比混合后加热，搅拌均匀，得到巧克力融浆；
S2、将乳化剂(液体卵磷脂、大豆磷脂、山梨醇酐单月桂酸酯)与嗜热链球菌GDMCCNo.60810菌粉以乳化剂：菌粉＝80～90：10～20的质量比混合均匀，并经进行精磨、除酸、除水、结晶、调温，最后选择合适的模型浇注成型，得到巧克力。
本发明的有益效果是：
1、本发明将食品级的安全菌株嗜热链球菌GDMCC No.60810应用于制备提升宿主血清中的血清素水平的产品中，安全健康。
2、本发明嗜热链球菌GDMCC No.60810可以显著提高血清中的血清素水平，从0.47mg/L上调到3.6mg/L，上调倍数达到6.7倍，使其在与血清素变化相关的认知与记忆障碍的疾病中发挥其调节作用，并且还能够显著促进肠道中双歧杆菌的丰度；且嗜热链球菌GDMCC No.60810具有良好的胃肠道耐受性及内增殖能力，可有效发挥其在胃肠道内的益生作用。
3、本发明嗜热链球菌GDMCC No.60810脱脂乳中菌株在乳体系发酵中具有良好的生长能力和产酸能力；菌株能够显著增加发酵乳制品乙偶姻的含量，增强奶油味，提升发酵食品的风味。
4、本发明嗜热链球菌GDMCC No.60810发酵的具有缓解焦虑功能的乳制品，对多元化功能性乳制品的发展具有重要意义。
生物材料保藏
本发明所提供的乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)CCFM1092，分类学命名为Lactococcus lactis subsp.Lactis，于2019年10月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60810，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1为嗜热链球菌GDMCC No.60810在M17固体培养基上的菌落照片；
图2为嗜热链球菌GDMCC No.60810的革兰氏染色菌株在1000倍显微镜下的观察照片；
图3为嗜热链球菌GDMCC No.60810提高小鼠血清中血清素变化的情况；
图4为嗜热链球菌GDMCC No.60810促进小鼠粪便中双歧杆菌属的情况；
图5为嗜热链球菌GDMCC No.60810的胃肠道耐受性评价和体内增殖情况；
图6为嗜热链球菌GDMCC No.60810在脱脂乳发酵中的生长情况；
图7为嗜热链球菌GDMCC No.60810在脱脂乳发酵中的产酸情况；
图8为嗜热链球菌GDMCC No.60810在脱脂乳发酵后的挥发性物质的含量。
具体实施方式
下面结合附图所描述的实施方式对本发明做以详细说明，其中所有附图中相同的数字表示相同的特征。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
除非另有解释，否则本文所用所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域技术人员通常所了解的相同的意义。尽管在本发明的实践或测试中可使用与本文所述方法和材料类似或等效的方法和材料，但下文阐述适宜的方法、材料实例仅具有说明性而并不对本发明进行任何的限定。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。
本文所用术语“菌株”是指具有共同特征的一种特定物种的微生物。除非指示相反含义，否则术语“菌株”与“细胞”在本文中可互换使用。
本文所用术语“平板”是指平板培养基，是被用于获得微生物纯培养的最常用的固体培养基形式，它是冷却凝固后的固体培养基在无菌培养皿中形成的培养基固体平面，常被简称为培养平板，或平板。
本文所用术语“培养基”是指一种培养基，它包括对于所述微生物的生长所需的化学元素连同至少一个碳源和一个氮源。
M17液体培养基：(1L)：大豆胨5.0g，蛋白胨2.5g，酪蛋白胨2.5g，酵母浸粉2.5g，牛肉浸粉5.0g，乳糖5.0g，抗坏血酸钠0.5g，β-甘油磷酸钠19.0g，硫酸镁0.25g，pH值为7.2±0.2。加入蒸馏水完全溶解后pH在6.8～7.2之间，115℃灭菌20min。
M17固体培养基：按照M17液体培养基配制，然后加入18g琼脂粉。115℃灭菌20min。
雄性C57BL/6小鼠：购自北京维通利华公司。
对照菌株LMD9：为商业发酵剂，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。已有文献报道LMD9具有一定的体内定殖能力，且具有一定的体内调控作用。因此，在研究嗜热链球菌宿主调控上，将LMD9作为对照菌。
实施例1：嗜热链球菌GDMCC No.60810菌株分离鉴定方法
(1)制备合适的样品稀释梯度并培养
将-80℃冰箱中贮藏的青海西宁地区的牦牛曲拉取出，置于冰上解冻。震荡混匀后取0.5mL样品加入4.5mL无菌生理盐水中，完成一次10倍稀释，振荡混匀后再从该稀释液中取出0.5mL稀释液加入4.5mL无菌生理盐水中，完成第二次10倍稀释，以此类推，直至稀释到10-6，从每个梯度的稀释液中吸取100μL，均匀涂布于M17固体培养基平板上，倒置，放于37℃厌氧下培养36～48h，并及时观察。
(2)划线分离与纯化
将长出菌落的平板取出后，选取单菌落明显的梯度平板，挑取不同菌落形态的菌落，进行二次划线，直至纯化出所有单菌落。
(3)革兰氏染色和过氧化氢酶实验
挑取单菌落于载玻片上，经过涂片、干燥、固定、初染、水洗、媒染、水洗、脱色、复染、水洗、干燥后镜检，记录革兰氏染色结果(见图2)；并挑取单菌落于载玻片上，加入3％过氧化氢溶液，观察有无气泡产生，并记录过氧化氢酶接触结果。
(4)菌种保藏
将纯化完成后的每种菌株的单菌落挑入5mL液体M17培养基中，置于37℃厌氧下静置培养20～24h，吸取1mL菌液至保菌管中，6000rpm离心3min，倾去上清，加入1mL 37％无菌甘油溶液，重悬，置于-80℃保存。
(5)16S rDNA序列扩增
吸取1mL菌液6000rpm离心3min，倾去上清，水洗两次，离心倾去上清液，获得菌泥，以此为模板，进行PCR扩增，流程如下：
1)扩增体系20μL：
其中模板量为1μL，双向引物各1μL，Taq酶MasterMix为10μL，ddH2O为7μL。
所用引物为27F：AGA GTT TGA TCC TGG CCT CA(SEQ ID No 1)和1492R：GGT TACCTT GTT ACG ACT T(SEQ ID No 2)。
扩增片段的长度为1399bp。
2)扩增条件：
预变性：95℃3min，
第一步变性：94℃1min，
第二步退火：60℃37s，
第三步延伸：72℃2min，
循环次数：37次循环，
第四步最后延伸：72℃5min，
第五步保持：12℃10min。
(6)琼脂糖凝胶电泳
称取80mL琼脂糖加入锥形瓶中，加入80mL 1xTAE，微波间断式加热4min，至液体澄清透明，稍稍冷却，加入4μL核酸染料，摇匀，无气泡，倒入胶板槽中，冷却40min凝固后，置于电泳槽中，排气泡，依次加入PCR扩增产物，每个孔中加入2μL PCR扩增产物，120V 15min跑胶，结束后取出置于凝胶电泳成像仪中拍照保存，记录PCR成功样品的编号，将成功的PCR产物置于-20℃冰箱中保藏。
(7)测序与鉴定
将PCR成功的样品送到英潍捷基(上海)贸易有限公司进行检测，根据反馈的序列结果，在美国国家生物技术信息中心(NCBI)序列数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中进行BLAST检索，选取匹配度最高的菌株信息进行结果记录。经分析鉴定，本发明提供的菌株为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。序列结果如下：
gTCACTTAgGCGGCTGGCTCAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGATTGGCTTTAAGAGATTAGCTCGCCGTCACCGACTCGCAACTCGTTGTACCAACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATTACCGGCAGTCTCGCTAGAGTGCCCAACTGAATGATGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCAccTgTCACCGATGTACCGAAGTAACTTTCTATCTCTAGAAATAGCATCGGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCGGCACTGAATCCCGGAAAGGATCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGCTTTCGCCACCGGTGTTCCTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTCTCCCCTTCTGCACTCAAGTTTGACAGTTTCCAAAGCGAACTATGGTTGAGCCACAGCCTTTAACTTCAGACTTATCAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTCGGGACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTGGTAAGCTACCGTCACAGTGTGAACTTTCCACTCTCACACCCGTTCTTGACTTACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCGGTCAGGGTTGCCCCCATTGCCGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGTATCGTCGCCTAGGTGAGCCATTACCTCACCTACTAGCTAATACAACGCAGGTCCATCTTGTAGTGGAGCAATTGCCCCTTTCAAATAAATGACATGTGTCATCCATTGTTATGCGGTATTAGCTATCGTTTCCAATAGTTATCCCCCGCTACAAGGCAGGTTACCTACGCGTTACTCACCCGTTCGCAACTCATCCAAGAAGAGCAAGCTCCTCTCTTCAGCGTTCTACTGCAgTATAGC
实施例2：嗜热链球菌GDMCC No.60810提高小鼠血清中血清素水平
取体重在18-20g的健康雄性C57BL/6小鼠作为实验动物品系，将动物分为3组，分别为正常对照组(Control)，嗜热链球菌对照菌株LMD9组和嗜热链球菌GDMCC No.60810组。每天灌胃对应的菌株，灌胃浓度为每只小鼠109CFU/只，所有分组均为自由饮水和摄食。每周两次检测小鼠的体重及摄食量。在第28天时，对灌胃结束的小鼠禁12小时后，麻醉小鼠并迅速摘眼球取血，辅以颈椎脱臼法处死。收集处死后小鼠的血液样本，将血液样本于4℃静置1h，3000rpm离心15min，小心收集上层血清。
血清代谢物检测方法：小心吸取血清100μL于1.5mL离心管中；加入400μL甲醇(提前-20℃预冷)沉淀蛋白，加入后会产生大量白色絮状物；涡旋30s，放置样本于-20℃冰箱孵育1h，提高蛋白沉淀率；4℃下，15000rpm高速离心15min；取上清液400μL蒸发至干。加入100μL甲醇：水(4:1，v/v)后涡旋30s，复溶；4℃下，15000rpm高速离心15min，移取上清液适当体积装入进样小瓶上机检测；QC制备：从制备好的待测样品中移取等量体积至新的进样瓶中混合均匀；Blank制备：1mL甲醇：水(4:1，v/v)至进样瓶混合均匀。使用UltiMate 3000HPLC系统(Thermo Fisher Scientific，MA，USA)串联高分辨率Q-Exactive质谱仪(ThermoFisher Scientific，MA，USA)在全扫描模式下进行代谢组的分析。使用Waters AcquityUPLCHSS反相T3柱(Waters，M，USA；2.1×100mm×1.8μm)于35℃柱温下进行代谢物的色谱分离。测得的血清中血清素的含量如图3。
由图3可知，与Control组相比，嗜热链球菌GDMCC No.60810可引起正常小鼠血清中血清素的显著变化，上调7.2倍。同时显著大于对照菌株LMD9。因此嗜热链球菌GDMCCNo.60810具有显著调节血清中血清素的功能。
实施例3：嗜热链球菌GDMCC No.60810促进小鼠粪便中双歧杆菌属增殖
取体重在18-20g的健康雄性C57BL/6小鼠作为实验动物品系，将动物分为3组，分别为正常对照组(Control)，嗜热链球菌对照菌株LMD9组和嗜热链球菌GDMCC No.60810组。每天灌胃对应的菌株，灌胃浓度为每只小鼠109CFU/只，所有分组均为自由饮水和摄食。每周两次检测小鼠的体重及摄食量。在第28天时，采集各组小鼠的粪便，放于冰上，然后立即转入-80℃冰箱，用DNA快速提取试剂盒按说明书方法步骤提取粪便中的DNA，对样本16SrDNA的V3-V4区进行PCR扩增，用胶回收试剂盒对扩增片段进行纯化回收，在Illuminamiseq pe300平台进行高通量测序，采用QIIME2分析平台对扩增子进行分析。
血清中的血清素变化会一定程度上会受到肠道微生物的调控。肠道中某些微生物具有产生血清素的能力，同时，微生物群及其代谢产物能通过影响色氨酸羟化酶活性或色氨酸代谢去向，调节机体血清素水平。研究表明，双歧杆菌的变化与机体血清素的水平有着密切联系。由图4可知，与Control组相比，在灌胃28天后，嗜热链球菌GDMCC No.60810能够显著增加粪便中双歧杆菌属的丰度，从2.8％提高到了7.0％。而对照菌株LMD9却显著降低了双歧杆菌属的丰度。
实施例4：嗜热链球菌GDMCC No.60810的胃肠道耐受性和体内增殖评价
将-80℃保存的嗜热链球菌GDMCC No.60810接种于M17液体培养基中，在37℃下培养24h，传代培养2～3次，至菌浓度达108～109CFU/mL；取出在M17培养基中活化后的10μL菌液加至0.99mL的模拟胃液和模拟肠液中，于旋涡混合仪中档旋振3次。加入模拟胃液的菌液于37℃中培养0h，2h后进行活菌计数实验操作。加入模拟肠液的菌液于37℃中培养0h，1h进行活菌计数实验操作。
模拟胃液和肠液的配制如下：
①模拟胃液：
称取定量的胃蛋白酶(Sigma,p7000)溶解于2/3所需体积的生理盐水(0.5％w/v)，用浓盐酸调节pH至3.0，用0.22μm无菌滤膜过滤后定容到所需体积，使终浓度达到3g/L。模拟胃液现配现用。
②模拟肠液：
称取定量的胰蛋白酶(Sigma，p1500)，胆盐(oxoid，LP0055)溶解于2/3所需体积的生理盐水(0.5％w/v)，用0.1mol/L的NaOH调节pH至8.0，用0.22μm无菌滤膜过滤后定容到所需体积，使终浓度分别达到1g/L和0.3％。模拟肠液现配现用。
为了探究嗜热链球菌是否具备一定的肠道增殖能力。按照实施例3和4的动物实验设计，于0、7、28天收集粪便，检测粪便中嗜热链球菌的量。用DNA快速提取试剂盒按说明书方法步骤提取粪便中的DNA，用嗜热链球菌的特异性引物扩增后，用qPCR仪检测嗜热链球菌的绝对生物量。
引物序列为：
F:5-TTATTTGAAAGGGGCAATTGCT-3；R:5GTGAACTTTCCACTCTCACAC-3。
由图5A可知，与对照菌株相比，嗜热链球菌GDMCC No.60810菌株具有较高的耐酸耐胆盐能力。预示着嗜热链球菌GDMCC No.60810具有良好的胃肠道耐受性。同时在持续的菌株干预下，体内嗜热链球菌的增殖能力会在灌胃7天后显著增加，并在第7、28天维持稳定(图5B)。说明GDMCC No.60810可能会在肠道内具备一定的增殖能力。
实施例5：嗜热链球菌GDMCC No.60810在脱脂乳发酵中的生长情况
将-80℃保存的嗜热链球菌GDMCC No.60810接种于M17液体培养基中，在37℃下培养24h，传代培养2～3次，至菌浓度达108～109CFU/mL；取出在M17培养基中活化后的菌液按2％体积比接种于脱脂乳中，使体系中的菌量达到106～107CFU/g；将接种好的样品放入42℃的培养箱中发酵，每隔6h取样，检测发酵过程菌量的变化，结果如图6所示。由图6可知，嗜热链球菌GDMCC No.60810在发酵6h后，增长大约1.5个数量级，发酵24h达到和LMD9同等的活菌数，因此，嗜热链球菌GDMCC No.60810在脱脂乳中具有良好的生长能力，其可以作为慢发酵菌株的选择。
实施例6：嗜热链球菌GDMCC No.60810在脱脂乳发酵中的产酸情况
将-80℃保存的嗜热链球菌GDMCC No.60810接种于M17液体培养基中，在37℃下培养24h，传代培养2～3次，至菌浓度达108～109CFU/mL；取出在M17培养基中活化后的菌液按2％体积比接种于脱脂乳中，使体系中的菌量达到106～107CFU/g；将接种好的样品放入42℃的培养箱中发酵，每隔6h取样，检测发酵过程pH的变化，结果如图7所示。由图7可知，嗜热链球菌GDMCC No.60810在发酵12h后，pH达到4.94，在24h时，pH达到4.53。而LMD9发酵12h和24h产酸快且多，说明嗜热链球菌GDMCC No.60810可作为发酵乳慢发酵的菌株，且其可能减缓后酸化过程。
实施例7：嗜热链球菌GDMCC No.60810在脱脂乳发酵后的挥发性物质的含量
按照实施例5和6的发酵条件进行发酵，在12h取样进行发酵乳挥发性物质含量测定。
挥发性物质测定方法如下：气相色谱条件及升温程序：选Rtx-WAX毛细管(30m×0.25mm，0.25mm)，进样口温度225℃，分流比10，载气(氦气)流速1mL/min。升温程序设置初始温度30℃，保持3min，以15℃/min升温至225℃，保持5min；质谱条件：离子化方式EI，发射能量70eV，发射电流200μA，检测器电压1.4kV，离子源温度240℃，接口温度230℃，四级杆温度150℃，质量扫描范围m/z 30～500；将GC-MS得到的谱图，在NIST 2001标准谱库的检索及标准品比对进行物质定性，用峰面积归一化法定量。结果见图8。
由图8可知，嗜热链球菌GDMCC No.60810发酵12h后产生的乙醛和乙偶姻高于菌株LMD9，尤其是乙偶姻的含量为LMD9产生的2倍多，可达到24μg/Kg。可为发酵乳提供奶油味。因此，嗜热链球菌GDMCC No.60810具有优良的产香特性。
实施例8：嗜热链球菌GDMCC No.60810的应用
嗜热链球菌GDMCC No.60810可用于制备片剂，片剂的具体制备过程如下：
嗜热链球菌GDMCC No.60810划线于M17固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到嗜热链球菌GDMCC No.60810菌粉；
其中，培养基的制备方法为M17乳糖培养基：胰蛋白胨，5.0g/L；大豆蛋白胨，5.0g/L；牛肉膏，5.0g/L；酵母浸粉，2.5g/L；七水硫酸镁，0.25g/L；抗坏血酸，0.5g/L；β-甘油磷酸钠五水合物，19.0g/L；乳糖，5g/L；加入蒸馏水完全溶解后pH在6.8～7.2之间，115℃灭菌20min。
保护剂的成分包含：130g/L脱脂奶粉。
称取嗜热链球菌GDMCC No.60810菌粉25.7重量份、淀粉55.0重量份、纤维素衍生物4.5重量份、羧甲基淀粉钠12.0重量份、滑石粉0.8重量份、蔗糖1.0重量份与水1.0重量份，得到原材料；将原材料混合，得到湿颗粒；将湿颗粒用中南制药机械厂的压片机进行压片后使用青州市益康中药机械有限公司的小型药物干燥机进行干燥，得到片剂。
实施例9：嗜热链球菌GDMCC No.60810的应用
嗜热链球菌GDMCC No.60810可用于制备胶囊制品，胶囊制品的具体制备过程如下：嗜热链球菌GDMCC No.60810划线于M17乳糖固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；菌悬液添加至浓度为30g/L的海藻酸钠溶液中至浓度为2×109CFU/mL后，充分搅拌，使得嗜热链球菌GDMCC No.60810的细胞均匀地分散于海藻酸钠溶液中，得到混合液；将混合液挤压到浓度为20g/L的氯化钙溶液中形成胶粒；待形成的胶粒静止固化30min后，过滤收集胶粒；将收集得到的胶粒进行冷冻干燥48h，得到粉剂；将粉剂装入到药用胶囊中，得到胶囊制品；
其中，培养基的制备方法为M17乳糖培养基：胰蛋白胨，5.0g/L；大豆蛋白胨，5.0g/L；牛肉膏，5.0g/L；酵母浸粉，2.5g/L；七水硫酸镁，0.25g/L；抗坏血酸，0.5g/L；β-甘油磷酸钠五水合物，19.0g/L；乳糖，5g/L；加入蒸馏水完全溶解后pH在6.8～7.2之间，115℃灭菌20min。
实施例10：嗜热链球菌GDMCC No.60810的应用
嗜热链球菌GDMCC No.60810可用于制备发酵牛乳，发酵牛乳的具体制备过程如下：
(1)冻干发酵剂的制作
嗜热链球菌GDMCC No.60810划线于M17固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到嗜热链球菌GDMCC No.60810菌粉。
(2)发酵酸奶的制作
配制含量为11％的牛乳，在14MPa～21MPa，40℃～85℃条件下均质，冷却到21℃～30℃，投入2％～4％嗜热链球菌GDMCC No.60810或者与其它乳酸菌组合发酵剂，42℃下发酵12h，可滴定酸度在0.7～0.9(以乳酸计)，pH在4.50～4.70时为发酵终点。
实施例11：嗜热链球菌GDMCC No.60810的应用
嗜热链球菌GDMCC No.60810可用于制作奶酪，奶酪的具体制备过程如下：
(1)冻干发酵剂的制作
嗜热链球菌GDMCC No.60810划线于M17固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到嗜热链球菌GDMCC No.60810菌粉。
(2)奶酪的制作
将合格牛乳预热至45-50℃后进行均质，得到均质牛乳；
将均质牛乳进行杀菌处理后降温至40℃；
添加其重量0.01％-0.1％的发酵剂和0.003％-0.005％的CaCl2，充分搅拌30min后，在40℃的温度下发酵30-60min，得到发酵牛乳；
向发酵牛乳中添加其重量0.2-2.5％的1％凝乳酶溶液，充分搅拌后，静置30-45min，得到凝乳；
当凝乳pH值为4.5-5时，将所述凝乳装入60目的滤布槽内排乳清，得到半成品奶酪；在温度为4-8℃的条件下放置18-20h，制得奶酪。
实施例12：嗜热链球菌GDMCC No.60810的应用
嗜热链球菌GDMCC No.60810可用于制备发酵豆乳，发酵豆乳的具体制备过程如下：
(1)冻干发酵剂的制作
嗜热链球菌GDMCC No.60810划线于M17固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到嗜热链球菌GDMCC No.60810菌粉。
(2)发酵豆乳的制作
称取干大豆100g加1L去离子水过夜浸泡，浸泡后的大豆在沸水中煮沸后继续煮2min，加入600mL去离子水60℃研磨6min继续煮至沸腾，煮沸后继续煮5min，冷却后用120目纱布过滤，105℃灭菌10min，冷却至室温。
将-80℃保存的本发明嗜热链球菌GDMCC No.60810菌粉接种于M17培养基中，在37℃下培养24h，传代培养2～3次，至108～109cfu/mL。取出在M17中活化后的菌液按2％～4％体积比接种于已灭过菌的新鲜豆乳中，使体系中的活菌数达到107cfu/g，将接种好的样品放入37℃的培养箱中发酵。发酵完毕后，豆乳需在4℃下冷藏保存。
实施例13：嗜热链球菌GDMCC No.60810的应用
嗜热链球菌GDMCC No.60810可用于制备果蔬饮料，果蔬饮料的具体制备过程如下：
嗜热链球菌GDMCC No.60810划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到嗜热链球菌GDMCC No.60810菌粉；
保护剂的成分包含：130g/L脱脂奶粉。
将新鲜水果和蔬菜洗净后榨汁，得到果蔬汁；将果蔬汁在温度140℃下高温热杀菌2秒，得到杀菌后的果蔬汁；将杀菌后的果蔬汁降温至约37℃后在杀菌后的果蔬汁中添加嗜热链球菌GDMCC No.60810菌粉至浓度为不低于1×106CFU/mL，得到果蔬饮料，果蔬饮料需在4℃下冷藏保存。
实施例14：嗜热链球菌GDMCC No.60810的应用
嗜热链球菌GDMCC No.60810可用于制备巧克力，巧克力的具体制备过程如下：
嗜热链球菌GDMCC No.60810划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用冻干保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到嗜热链球菌GDMCC No.60810菌粉；
保护剂的成分包含：130g/L脱脂奶粉。
将可可块和白砂糖以1:1～1:3的质量比混合后加热，搅拌均匀，得到巧克力融浆；先将乳化剂(液体卵磷脂、大豆磷脂、山梨醇酐单月桂酸酯)与嗜热链球菌GDMCC No.60810菌粉以乳化剂：菌粉＝80～90：10～20的质量比混合均匀，再进行精磨、除酸、除水、结晶、调温，最后选择合适的模型浇注成型，得到巧克力，巧克力需在4℃下冷藏保存。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一株嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)，其特征在于，所述嗜热链球菌已于2019年10月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60810。
2.一种菌剂，其特征在于，所述发酵剂的制备方法为：
S1、将权利要求1所述嗜热链球菌进行活化得到活化液；
S2、将活化液接种于培养基中，在30～40℃下培养15～20h，得到菌液；
S3、将得到的菌液离心后取沉淀，得到菌泥；
S4、将菌泥清洗后用冻干保护剂重悬至菌浓不低于1×109CFU/mL，得到菌悬液；
S5、将菌悬液预培养后冻干得到含有权利要求1所述嗜热链球菌的菌剂。
3.权利要求1所述的嗜热链球菌或权利要求2所述的菌剂在制备提高血清素水平的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述产品具有如(a)～(c)所示的一种或多种功能：
(a)缓解焦虑、抑郁；
(b)增强认知与减轻记忆障碍；
(c)调节胃肠道功能，提升肠道中双歧杆菌属的丰度。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品包括但不限于食品、药品。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药品的剂型包括粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述食品包括由权利要求1所述的嗜热链球菌或权利要求2所述的菌剂发酵得到的发酵制品或含有权利要求1所述的嗜热链球菌的食品。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵制品包括酸奶、奶酪、发酵豆乳。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述含有权利要求1所述的嗜热链球菌的食品包括巧克力、果蔬制品。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在巧克力或果蔬制品的制备中添加权利要求1所述的嗜热链球菌。
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| CN106434461A (zh) * | 2016-10-12 | 2017-02-22 | 内蒙古农业大学 | 一株嗜热链球菌菌株及其用途 |
| CN110269098A (zh) * | 2019-05-30 | 2019-09-24 | 江南大学 | 一种具有缓解焦虑、改善睡眠的发酵乳制备方法 |
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