CN111733095B - 一株高产γ-氨基丁酸的德氏乳杆菌保加利亚亚种 - Google Patents

一株高产γ-氨基丁酸的德氏乳杆菌保加利亚亚种 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高产γ‑氨基丁酸的德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)LSR‑L‑L4，属于微生物发酵工程技术领域。该菌株保藏编号为CGMCC NO.14752。该菌株从大理特产乳扇中分离筛选获得，经16SrDNA鉴定为可食用菌株,具有产酸快、后酸低、对数生长快、稳定周期长、活菌数高等优势，且双乙酰含量11.45mg/L，具有优质发酵菌株特性。在脱脂乳中，LSR‑L‑L4作为单一发酵剂，在不添加其它外源物质发酵条件下，利用高效液相色谱仪检测，3‑6代该菌株γ‑氨基丁酸产量达473.200‑490.594mg/L。

Description

一株高产γ-氨基丁酸的德氏乳杆菌保加利亚亚种
技术领域
本发明属于微生物发酵工程技术领域，具体涉及一株高产γ-氨基丁酸的德氏乳杆菌保加利亚亚种。
背景技术
γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid，简称GABA)，是一种非蛋白氨基酸，广泛分布于自然界、动植物及微生物中。在生物体内由L-谷氨酸(L-Glu)或者L-谷氨酸钠(L-MSG)经过谷氨酸脱羧酶的作用，脱去一分子羧基而形成。在上世纪八十年代，Robert小组首先在动物脑部浸提液中发现γ-氨基丁酸的存在。而后日本厚生省、欧洲食品安全局(EFSA)和美国食品药品管理局(FDA)承认乳酸菌发酵生产的GABA为天然食品添加剂。2009年9月，我国卫生部批准γ-氨基丁酸为新资源食品。
GABA因较好的生理功能和应用前景受到广泛关注,γ-氨基丁酸是一种抑制性神经递质，能够有效地缓解抑郁，还能够刺激β细胞再生。据目前的研究发现GABA的生理活性主要表现在一下几个方面：治疗糖尿病；健脑安神；改善睡眠；调节血压；抵抗疲劳；缓压美容；促进脑活性化；防止皮肤老化、高效减肥；哺乳动物中枢神经系统重要的抑制性神经递质，提高精子活力，治疗癫痫等生理功能。
当人体缺乏GABA时会焦虑不安、疲倦、忧虑等，自然人每日摄取γ-氨基丁酸量应≤500mg。GABA的天然含量很低，单纯依靠天然物质的提取远远满足不了市场的需求。目前合成γ-氨基丁酸的方法分为两大类：化学法和生物法。化学法，流程复杂且使用较多的非环境友好型试剂，最后产物存在有机试剂残留的问题而不能在食品中添加。生物法包括植物法和微生物法，生物法主要是发芽的糙米和豆类，含有大量的γ-氨基丁酸；微生物法，微生物由于生长周期短，繁殖速度快，近些年广泛被应用于生产γ-氨基丁酸。目前发酵法生产的GA BA产品多成黄色，有气味，纯度不高于90％，天然菌株在发酵乳中产γ-氨基丁酸少，发酵性能差。现有技术公开了一株高产γ-氨基丁酸的乳酸菌及其应用(授权公告号：CN107475151 B)，其筛选出的一株副短乳杆菌(Lactobacillus parabrevis)HX12-19(保藏编号为：CCTCCM2017307),该菌株产γ-氨基丁酸的最大能力为235.6mg/L。
随着GABA逐渐被国内消费者认知，应用安全菌株生产天然原料GABA，提高天然菌株生产γ-氨基丁酸的能力，是开发GABA功能性食品必须解决的一个技术问题。
发明内容
为解决天然菌株在发酵乳中产出γ-氨基丁酸少、发酵性能差的问题；本发明提供了一株从大理特产乳扇中筛选的德氏乳杆菌保加利亚亚种LSR-L-L4；在发酵液中LSR-L-L4作为唯一发酵剂，γ-氨基丁酸产量达473.200-490.594mg/，为已报道天然菌单株菌最高产率。
本发明同时提供了一种德氏乳杆菌保加利亚亚种LSR-L-L4的筛选方法。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案：一株高产γ-氨基丁酸的德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii su bsp.Bulgaricus)LSR-L-L4，其特征在于：它的保藏编号为：CGMC C NO.14752，于2017年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。
本发明所述的一株高产γ-氨基丁酸的德氏乳杆菌保加利亚亚种L SR-L-L4的筛选方法，是以新鲜乳扇为样品，用选择性MRS液体培养基和MRS固体培养基进行富集培养，然后通过梯度稀释法进行分离纯化，得到形态一致的单一菌落，选取革兰氏染色为阳性、过氧化氢酶实验为阴性的单一菌落，经分子生物学16SrDNA鉴定，得到一株高产γ-氨基丁酸的德氏乳杆菌保加利亚亚种LSR-L-L4，所述的选择性MRS液体培养基包括以下组分：葡萄糖20g/L、酪蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸粉5g/L、无水乙酸钠5g/L、柠檬酸三铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、吐温-801g/L、硫酸锰0.25g/L及硫酸镁0.58g/L。
本发明保藏说明：
分类命名：德氏乳杆菌保加利亚亚种
拉丁名：(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)；
参椐的生物材料(株)：LSR-L-L4
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏机构简称：CGMCC；
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
保藏日期：2017年09月26日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.14752。
与现有技术相比，本发明的有益效果有：
1、本发明德氏乳杆菌保加利亚亚种LSR-L-L4从大理特产乳扇中分离筛选获得，安全性高，经16SrDNA鉴定为可食用菌株；
2、LSR-L-L4菌株性能测试产酸快，后酸低，活菌数高，对数生快，稳定周期长，产香好，具有优质发酵菌株特性。
3、德氏乳杆菌保加利亚亚种LSR-L-L4菌株在不添加任何外源物质条件下，作为单一发酵剂，在脱脂乳中按1.5％菌液接种，42℃发酵19.5h，用高效液相色谱仪检测，3至6代该菌株的γ-氨基丁酸产出值为473.200-490.594mg/L,样品检出值稳定性＞95％。
附图说明
图1为本发明所述德氏乳杆菌保加利亚亚种LSR-L-L4的16Sr DNA系统发育树。
图2为本发明所述德氏乳杆菌保加利亚亚种LSR-L-L4在蛋白含量为3.2％的脱脂乳中的产酸曲线。
图3为本发明所述德氏乳杆菌保加利亚亚种LSR-L-L4的生长曲线。
图4为本发明实施例4中所述γ-氨基丁酸标准溶液绘制的标准曲线。
图5为本发明实施例4中所述γ-氨基丁酸标准溶液的标准出峰图。
图6为本发明实施例4中所述LSR-L-L4样品产出γ-氨基丁酸的出峰图。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明，但不限于实施例。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：菌种的分离纯化和鉴定
1.菌种的分离纯化
1.1生理盐水和培养基的制备
生理盐水的制备：将8.5gNaCl溶解于1000ml双蒸水中，备用。
MRS(Man Rogosa Sharpe broth)液体培养基的制备：将20g葡萄糖、10g酪蛋白胨、10g牛肉浸膏、5g酵母浸粉、5g无水乙酸钠、2g柠檬酸三铵、2g磷酸氢二钾、1g吐温-80和0.25g硫酸锰及0.58g硫酸镁混合后，加双蒸水溶解并定容至1000ml，其中硫酸镁、硫酸锰精密称取，单独溶解后与其余成分混合，MRS液体培养基的P H值为6.2-6.4，备用。
MRS固体培养基制备:MRS液体培养基+1.5％琼脂粉，121℃，灭菌15min，备用。
1.2菌种的分离纯化
称取乳扇样品2g，捣碎，用上述生理盐水进行梯度稀释最高稀释度为9，取7、8、9三个梯度，涂布上述MRS固体培养基(碳酸钙3‰),42℃培养48h。培养结束后，在每个平板上挑取5个透明圈大、变色圈明显的菌落接种到上述MRS液体培养基中，42℃恒温培养。纯化菌株，反复平板划线，显微镜观察，平板上为同一形态菌落为止。选取革兰氏染色为阳性、过氧化氢酶实验为阴性的单一菌落，-80℃超低温冰箱保藏待鉴定。
2.菌种的鉴定
将初步获得革兰氏染色为阳性、过氧化氢酶实验为阴性的菌株暂定为乳酸菌，然后根据UNI-Q柱式细菌DNA抽提试剂盒，实验步骤提取细菌基因组，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳观察提取到的基因组。以提取到的菌株的基因组为模板，以采用细菌通用引物：27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1541R(5'-TAAGGAGGTGA TCCAGCC-3')为上、下游引物，采用PCR扩增试剂盒，以50μL的反应体系进行PCR反应。PCR反应参数为：95℃预变性5min，35个循环的参数设置为94℃30s，55℃30s，72℃90s，72℃延伸10m in。用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增DNA片段的大小，测序由上海生物工程技术服务有限公司完成。
据设计的引物进行16SrDNA扩增，电泳显示在1500bp左右有阳性条带，与目的片段大小一致，将PCR产物送至测序公司进行测序。测序结果见序列表。测序结果通过Blasten比对，菌株为德氏乳杆菌保加利亚亚种。
将经过测序所得到的序列用Blast软件在Genebank中搜索相似序列，经ClustalX序列比对后，采用MEGA5.0中的邻接法(Neigh bour-joining)进行系统发育树构建，分析样品中乳酸菌的遗传距离，系统发育树见附图1。根据MEGA5.0软件构件系统发育树，与德式乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)的同源性为100％，
结合菌株的生理生化特征和分子生物学16SrDNA鉴定结果，本发明菌株，为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii s ubsp.Bulgaricus)，LSR-L-L4，菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为:CGMCC No.14752。
实施例2：德氏乳杆菌保加利亚亚种LSR-L-L4产酸性能测定
将德氏乳杆菌保加利亚亚种LSR-L-L4在MRS液体培养基中活化三代，作为种子液，MRS液体培养基的制作方法同实施例1。按1.5％的接种量，接种蛋白含量为3.2％的10mL脱脂乳奶管中，平行样接三组。42℃恒温培养120h，12h之前酸度上升较快，每隔1h滴定一次酸度；12h后每隔24h滴定一次酸度，记录凝乳时间和酸度变化。根据培养时间和酸度绘制菌株42℃培养120h的产酸曲线。
酸度滴定：取发酵乳样品10.0g，加入20.0g蒸馏水，混合均匀，加入2mL0.5％酚酞指示剂，用0.1mol/L的NaOH标准溶液滴定至微红色，并在30S内不褪色为宜。记录消耗的NaOH标准滴定溶液毫升数，滴定酸度(吉尔涅尔度°T)为100g发酵乳消耗0.1000mol/LNaOH标准溶液的体积。代入公式进行计算：
X＝c×V×100/m×0.1
X—发酵乳样品的酸度，单位为度(°T)；
c—NaOH标准溶液的摩尔浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
V—滴定时消耗NaOH标准溶液体积，单位为毫升(mL)；
m—发酵乳样品的质量，单位为克(g)；
菌株在5h凝乳，凝乳酸度为56°T,12h酸度80°T，发酵120h极限酸值为118°T。LSR-L-L4菌株，在短时间内快速产酸，菌株后酸低。利用LSR-L-L4快速产酸、后酸低的特性，可作为发酵剂提高生产效率。德氏乳杆菌保加利亚亚种LSR-L-L4的产酸曲线见附图2。
实施例3：德氏乳杆菌保加利亚亚种LSR-L-L4生长曲线、活菌数和双乙酰含量测定
1.LSR-L-L4生长曲线的测定
采用芬兰Bioscreen全自动曲线生长分析仪,提前30min开启，预热。蜂窝板紫外杀菌30min。LSR-L-L4种子液1.5％接种MRS液体管，震荡混均。快速接入蜂窝板，按顺序每孔接入200uL，对照组MRS液体培养基，三平行样，检测2-12代。
打开生长曲线仪控制面板,设置温度42℃，震荡间隔30min，测定时间24h。在420-580nm波长下，测定菌株OD值24h，每半小时震荡一次。8.5h菌株对数期峰值OD580＝1.210，9h-24h菌株稳定期，19.5h生长趋于稳定OD580＝1.132。菌株前期生长较快，后期稳定性强，符合发酵剂菌株选育特性。LSR-L-L4第3代生长曲线见附图3。
2.LSR-L-L4活菌数检测和双乙酰含量测定
根据生长曲线，19.5h生长趋于稳定OD580＝1.132，将LSR-L-L4培养至19.5h，检测活菌数、双乙酰含量。
LSR-L-L4活菌数检测，代数2-12代，活菌数均达到109cfu/mL，远超发酵乳活菌数标准106cfu/mL，LSR-L-L4活菌数检测结果见表1。
表1：
Figure BDA0002532644090000091
双乙酰含量测定：采用领苯二胺比色法测定，检测LSR-L-L4双乙酰含量11.45mg/L，产香较好，符合5-30mg/L酸奶产香阈值。乳制品乙醛和双乙酰的比值为2.5：1时，酸奶香味最佳，LSR-L-L4双乙酰含量11.45mg/L，能更好搭配的其它菌株如嗜热链球菌，做出酸香俱佳的酸奶。
实施例4:德氏乳杆菌保加利亚亚种LSR-L-L4产γ-氨基丁酸检测
仪器：高效液相色谱仪、分析天平、超声波溶解器、真空泵、微孔滤膜、容量瓶、水相微孔滤膜(0.22μm)、注射器(5mL)。色谱柱：谱柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6×250mm,5μm)。
试剂：甲醇(纯度≥99.9％)，邻苯二甲醛(OPA)，β-巯基乙醇，γ-氨基丁酸标准品(纯度≥99.9％)，上述四种均为色谱纯，三水合乙酸钠，冰醋酸，硼酸，氢氧化钠，磷酸二氢钾。
LSR-L-L4产γ-氨基丁酸的检测检测步骤如下：
(1)γ-氨基丁酸标准溶液
精密称取0.100gγ-氨基丁酸标准品于烧杯中，用双蒸水超声波溶解器溶解，定容于100ml容量瓶中，摇匀，得到1.00mg/mL的γ-氨基丁酸标准溶液，分别吸取500uL、1ml、2ml、4ml、6ml、8ml和10ml到10ml容量瓶，双蒸水定容。7种γ-氨基丁酸标准溶液的浓度分别为0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml和1mg/ml，4℃保存备用。
(2)流动相制备
流动相A:15mmol醋酸-醋酸钠配制：精密称取1.5830g三水合乙酸钠于烧杯中用双蒸水超声波溶解溶解，定容于1000mL容量瓶中。加入90μL冰醋酸，调节PH至6.0，盐酸调节，摇匀，真空泵微孔滤膜(0.45uL)过滤。超声波溶解器溶解20min，4℃冰箱保存备用。
流动相B:甲醇(纯度≥99.9％)，色谱纯。
(3)衍生试剂OPA(邻苯二甲醛)制备
A 0.5M硼酸钾制备：精密称取1.55g硼酸，1.30g氢氧化钾于烧杯中，用双蒸水超声波溶解器溶解，定溶于50mL容量瓶中，摇匀，使用PH计调节pH至9.0，使用硝酸调节PH值。
B邻苯二甲醛(OPA)溶液制备：精密称取0.15g OPA，用双蒸水超声波溶解器溶于2.5mL甲醇，再溶于50mL 0.5M硼酸钾溶液中，然后加125uLβ-巯基乙醇，混匀。避光4℃保存，现配现用。
(4)磷酸二氢钾缓冲液制备
精密称取磷酸二氢钾1.0000g，用双蒸水超声波溶解器溶解，定容至100ml容量瓶中，摇匀，4℃保存。
(5)检测样品的制备
选取LSR-L-L4菌株3-6代种子液，按1.5％菌液接种，转接入10mL脱脂乳奶管(脱脂乳的蛋白质含量为3.2％)，不添加任何外源物质，LSR-L-L4菌株作为单一发酵剂，42℃单菌株发酵19.5h；准确吸取1mL于1.5mL离心管中，10000r/min,离心20min，取上清液0.5mL，加入等体积的三氯乙酸(沉降蛋白)；再次10000r/min离心20min，取上清800uL于1.5mL离心管中，4℃保存待检。
(6)高效液相色谱分析条件
色谱柱：谱柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6×250mm,5μm)、检测波长：334nm、柱温25℃、流速0.6ml/min、进样量20uL，样品分析时间20min。
流动相梯度洗脱程序见下表2。
表2：
时间/min A％ B％
0 70 30
5 50 50
7.5 40 60
10 40 60
10.1 50 50
12.5 70 30
20 70 30
表2中，流动相A为15mmol醋酸-醋酸钠甲醇,流动相B为甲醇(色谱纯)。
(7)柱前衍生
取100μL标准品/样品，300μLOPA衍生试剂于5mLEP管中，震荡均匀，衍生1min。衍生完成加入400μL磷酸二氢钾缓冲液，快速摇匀，5mL注射器吸取，卸下针头，套上水相0.22μm微孔滤膜过滤到1mLPE进样瓶,检测。整个流程2min内完成。
(8)标准曲线绘制
7个γ-氨基丁酸标准溶液浓度，每个标准溶液浓度平行样检测3次，检测结果取平均值。标准曲线为Y＝12539*X+17.46，R2＝0.9990，其中X为GABA浓度(mg/mL)，Y为峰面积(MAU＊S)，γ-氨基丁酸检测值见表3，标准曲线见图4。
表3：
浓度(mg/ml) 峰面积(MAU＊S)
0.05 703.4
0.10 1321.4
0.20 2512.7
0.40 4991.2
0.60 7502.5
0.80 9793.6
1.00 12794.0
(9)LSR-L-L4样品γ-氨基丁酸产出值检测
采用外标法计算，标准曲线为Y＝12539*X+17.46，检测峰面积如下表4，带入标准曲线，计算结果保留小数点后三位有效数字，计算结果X乘以稀释倍数16为γ-氨基丁酸产出值。标准溶液检测峰形见图5，LSR-L-L4检测峰形见图6。
表4：
菌株LSR-L-L4代数 峰面积(MAU＊S) γ-氨基丁酸产出值(mg/L)
3 388.698 490.594
4 371.931 473.200
5 367.530 467.584
6 376.496 479.024
如表4所示,不添加其它外源物质条件下，LSR-L-L4单菌株在脱脂乳中发酵，按1.5％菌液接种，42℃发酵19.5h，用高效液相色谱仪检测，3至6代该菌株的γ-氨基丁酸产出值为473.200-490.594mg/L。γ-氨基丁酸产量达473.200-490.594mg/L,为已报道天然菌单株菌最高产率，具有较高的开发利用前景,样品检出值稳定性＞95％。
序列表
<110> 云南皇氏来思尔乳业有限公司
<120> 一株高产γ-氨基丁酸的德氏乳杆菌保加利亚亚种
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 1489
<212> DNA
<213> 德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)
<400> 1
gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc gagctgaatt caaagattcc 60
ttcgggatga tttgttggac gctagcggcg gatgggtgag taacacgtgg gcaatctgcc 120
ctaaagactg ggataccact tggaaacagg tgctaatacc ggataacaac atgaatcgca 180
tgattcaagt ttgaaaggcg gcgtaagctg tcactttagg atgagcccgc ggcgcattag 240
ctagttggtg gggtaaaggc ctaccaaggc aatgatgcgt agccgagttg agagactgat 300
cggccacatt gggactgaga cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag tagggaatct 360
tccacaatgg acgcaagtct gatggagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg ttttcggatc 420
gtaaagctct gttgttggtg aagaaggata gaggcagtaa ctggtcttta tttgacggta 480
atcaaccaga aagtcacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa 540
gcgttgtccg gatttattgg gcgtaaagcg agcgcaggcg gaatgataag tctgatgtga 600
aagcccacgg ctcaaccgtg gaactgcatc ggaaactgtc attcttgagt gcagaagagg 660
agagtggaat tccatgtgta gcggtggaat gcgtagatat atggaagaac accagtggcg 720
aaggcggctc tctggtctgc aactgacgct gaggctcgaa agcatgggta gcgaacagga 780
ttagataccc tggtagtcca tgccgtaaac gatgagcgct aggtgttggg gactttccgg 840
tcctcagtgc cgcagcaaac gcattaagcg ctccgcctgg ggagtacgac cgcaaggttg 900
aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag 960
caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcctgtgcta cacctagaga taggtggttc 1020
ccttcgggga cgcagagaca ggtggtgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt 1080
gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt gtctttagtt gccatcatta agttgggcac 1140
tctaaagaga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgc 1200
cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatgggcagt acaacgagaa gcgaacccgc 1260
gagggtaagc ggatctctta aagctgttct cagttcggac tgcaggctgc aactcgcctg 1320
cacgaagctg gaatcgctag taatcgcgga tcagcacgcc gcggtgaata cgttcccggg 1380
ccttgtacac accgcccgtc acaccatgga agtctgcaat gcccaaagtc ggtgggataa 1440
cctttatagg agtcagccgc ctaaggcagg gcagatgact ggggtgaag 1489

Claims (1)

1.一株德氏乳杆菌保加利亚亚种( Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)LSR-L-L4，其特征在于：它的保藏编号为CGMCC NO.14752，于2017年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
CN202010522485.6A 2020-06-10 2020-06-10 一株高产γ-氨基丁酸的德氏乳杆菌保加利亚亚种 Active CN111733095B (zh)

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Production of fermented red beans with multiple bioactivities using co-cultures of Bacillus subtilis and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus;Jyun-KaiJhan等人;《LWT - Food Science and Technology》;20151031;1281-1287 *
富含γ-氨基丁酸酸奶的制备及质构特性研究;闫天文等人;《中国食物与营养》;20140731;49-53 *

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