CN110257447B - 一种提高乳酸乳球菌乳酸亚种菌株产gaba能力的方法 - Google Patents

一种提高乳酸乳球菌乳酸亚种菌株产gaba能力的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高乳酸乳球菌乳酸亚种菌株产GABA能力的方法。所述方法包括如下步骤：配制含1.0～4.0g/L谷氨酸钠的10％脱脂乳，灭菌后冷却至30～40℃，接种乳酸乳球菌乳酸亚种菌株，接种量为2～6％，于30～40℃条件下发酵24～72h。本发明通过筛选GABA高产菌株进行发酵，在发酵体系中添加合成GABA的前体物质谷氨酸钠，并通过均匀实验优化发酵条件，成倍提高了菌株发酵产物中GABA的产量，最终可达3.81g/L；同时最大可能保证了产品口感，在一定程度上为新型功能发酵乳制品的制备奠定了基础。本发明的方法工艺简单，操作便捷，生产成本低，适合大规模工厂发酵生产。

Description

一种提高乳酸乳球菌乳酸亚种菌株产GABA能力的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体地，涉及一种提高乳酸乳球菌乳酸亚种菌株产GABA能力的方法。
背景技术
γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid，GABA)作为一种重要的抑制性神经递质，备受人们关注。它是一种非蛋白质氨基酸，因其具有很高的生物活性而参与多种代谢活动，具有促进睡眠、调节心律失常、抗焦虑、抗疲劳、调节情绪、缓解压力等多种功效。
因GABA天然存在量低，很难大量提取获得，目前研究多在化学合成法、植物富集法、微生物发酵法等方法中优化其产量。鉴于化学合成安全性较差且成本高，植物富集的GABA含量很低，而微生物发酵产量高、成本低且微生物来源广，所以微生物发酵合成GABA的前景不容小觑。但是，目前微生物发酵法多侧重在发酵条件优化及产物GABA的纯化，少有针对乳酸菌大批量的筛选并选择特定性的菌株在产品中优化其产GABA量，产量仍然不理想。
综上，筛选GABA高产菌株来进行发酵生产，优化发酵体系及工艺，以达到提高GABA产量的目的，具有重要生产意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有GABA天然存在量低，而微生物发酵法多侧重在发酵条件优化及产物GABA的纯化上导致产量没有得到显著提升的问题，提供一种提高乳酸乳球菌乳酸亚种菌株产GABA能力的方法，通过添加GABA前体物质及优化菌株发酵条件，成倍提高了菌株在产品中GABA产量，在一定程度上为新型功能发酵乳制品奠定了基础。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
发明人发现，虽然现有技术中有部分乳酸菌能够高产代谢GABA，但并不是所有菌株均能在含有脱脂乳的发酵体系中高产代谢GABA。发明人从天然发酵食品中筛选出能够在牛乳中代谢高产GABA的两株菌株，即乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactissubsp.lactis)220007和乳酸乳球菌乳酸亚种220223。在此基础上，发明人对其发酵工艺进行了优化，发现在发酵体系中添加合成GABA的前体物质谷氨酸钠(L-MSG)，并优化发酵条件，成倍提高了菌株发酵产物中GABA的产量。
因此，本发明请求保护一种提高乳酸乳球菌乳酸亚种菌株产GABA能力的方法，包括如下步骤：配制含1.0～4.0g/L谷氨酸钠的10％脱脂乳，灭菌后冷却至30～40℃，接种乳酸乳球菌乳酸亚种菌株，接种量为2～6％，于30～40℃条件下发酵24～72h。
优选地，所述乳酸乳球菌乳酸亚种菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactis subsp.lactis)220007，于2018年10月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.16583。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
优选地，所述乳酸乳球菌乳酸亚种菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactis subsp.lactis)220223，于2018年10月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.16584。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
优选地，所述方法包括如下步骤：配制含2.0～3.5g/L谷氨酸钠的10％脱脂乳，灭菌后冷却至30～40℃，接种乳酸乳球菌乳酸亚种菌株，接种量为3～5％，于30～35℃条件下发酵48～68h。
更优选地，所述10％脱脂乳中谷氨酸钠的终浓度为3.0g/L。
更优选地，所述乳酸乳球菌乳酸亚种菌株的接种量为4％。
更优选地，所述发酵的温度为32℃，发酵时间为48h。
优选地，所述乳酸乳球菌乳酸亚种菌株的种子液是按1～5％的接种量将活化菌液接种至10％脱脂乳中，于37℃条件下发酵24h后得到。
作为一种优选的具体实施方式，所述方法包括如下步骤：
S1.菌种复苏和活化：将基于大批量菌株(≥1000株)筛选后产GABA能力高的乳酸乳球菌乳酸亚种220007或220223进行复苏和活化；
S2.种子液的制备：挑取单菌落于2～20mL 10％的脱脂乳中扩培，于37℃恒温培养24h得到活化菌液；按1～5％的接种量将活化菌液接种至10％的脱脂乳中，于37℃恒温培养24h得到种子液；
S3.制备发酵基料：配制含1.0～4.0g/L谷氨酸钠(L-MSG)的10％脱脂乳，在灭菌锅中105℃下灭菌15min；
S4.接种：将灭菌后的发酵基料冷却至30～40℃，接种乳酸乳球菌乳酸亚种220007或220223，接种量为2～6％；
S5.发酵：经步骤S4所得物料于30～40℃条件下进行发酵，发酵时间为24～72h；
S6.检测：将步骤S5发酵结束后的料液上HPLC测定GABA含量。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过筛选GABA高产菌株进行发酵，在发酵体系中添加合成GABA的前体物质谷氨酸钠，并通过均匀实验优化发酵条件，成倍提高了菌株发酵产物中GABA的产量，最终可达3.81g/L；同时最大可能保证了产品口感，在一定程度上为新型功能发酵乳制品的制备奠定了基础。
(2)本发明的方法工艺简单，操作便捷，生产成本低，适合大规模工厂发酵生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
芝士粉(型号：4800112)购自Kerry；酵母提取物购自安琪酵母股份有限公司；谷氨酸钠购自国药集团化学试剂有限公司；甘蔗汁、龙眼汁、水蜜桃汁均为当地超市采购、在实验室打浆制得。
实施例1
一种提高乳酸乳球菌乳酸亚种菌株产GABA能力的方法，包括如下步骤：
S1.菌种复苏和活化：将基于大批量菌株(≥1000株)筛选后产GABA能力高的乳酸乳球菌乳酸亚种220007或220223进行复苏和活化；
S2.种子液的制备：挑取单菌落于10mL 10％的脱脂乳中扩培，于37℃恒温培养24h得到活化菌液；按4％的接种量将活化菌液接种至10％的脱脂乳中，于37℃恒温培养24h得到种子液；
S3.制备发酵基料：配制含1.5g/L谷氨酸钠(L-MSG)的10％脱脂乳，在灭菌锅中105℃下灭菌15min；
S4.接种：将灭菌后的发酵基料冷却至30℃，接种乳酸乳球菌乳酸亚种220007或220223，接种量为2％；
S5.发酵：经步骤S4所得物料于30℃条件下进行发酵，发酵时间为60h；
S6.检测：将步骤S5发酵结束后的料液上HPLC测定GABA含量。
实施例2
一种提高乳酸乳球菌乳酸亚种菌株产GABA能力的方法，包括如下步骤：
S1.菌种复苏和活化：将基于大批量菌株(≥1000株)筛选后产GABA能力高的乳酸乳球菌乳酸亚种220007或220223进行复苏和活化；
S2.种子液的制备：挑取单菌落于10mL 10％的脱脂乳中扩培，于37℃恒温培养24h得到活化菌液；按4％的接种量将活化菌液接种至10％的脱脂乳中，于37℃恒温培养24h得到种子液；
S3.制备发酵基料：配制含3.0g/L谷氨酸钠(L-MSG)的10％脱脂乳，在灭菌锅中105℃下灭菌15min；
S4.接种：将灭菌后的发酵基料冷却至32℃，接种乳酸乳球菌乳酸亚种220007或220223，接种量为4％；
S5.发酵：经步骤S4所得物料于32℃条件下进行发酵，发酵时间为48h；
S6.检测：将步骤S5发酵结束后的料液上HPLC测定GABA含量。
实施例3
一种提高乳酸乳球菌乳酸亚种菌株产GABA能力的方法，包括如下步骤：
S1.菌种复苏和活化：将基于大批量菌株(≥1000株)筛选后产GABA能力高的乳酸乳球菌乳酸亚种220007或220223进行复苏和活化；
S2.种子液的制备：挑取单菌落于10mL 10％的脱脂乳中扩培，于37℃恒温培养24h得到活化菌液；按4％的接种量将活化菌液接种至10％的脱脂乳中，于37℃恒温培养24h得到种子液；
S3.制备发酵基料：配制含4.0g/L谷氨酸钠(L-MSG)的10％脱脂乳，在灭菌锅中105℃下灭菌15min；
S4.接种：将灭菌后的发酵基料冷却至36℃，接种乳酸乳球菌乳酸亚种220007或220223，接种量为5％；
S5.发酵：经步骤S4所得物料于36℃条件下进行发酵，发酵时间为68h；
S6.检测：将步骤S5发酵结束后的料液上HPLC测定GABA含量。
实施例4
一种提高乳酸乳球菌乳酸亚种菌株产GABA能力的方法，包括如下步骤：
S1.菌种复苏和活化：将基于大批量菌株(≥1000株)筛选后产GABA能力高的乳酸乳球菌乳酸亚种220007或220223进行复苏和活化；
S2.种子液的制备：挑取单菌落于10mL 10％的脱脂乳中扩培，于37℃恒温培养24h得到活化菌液；按4％的接种量将活化菌液接种至10％的脱脂乳中，于37℃恒温培养24h得到种子液；
S3.制备发酵基料：配制含3.5g/L谷氨酸钠(L-MSG)的10％脱脂乳，在灭菌锅中105℃下灭菌15min；
S4.接种：将灭菌后的发酵基料冷却至34℃，接种乳酸乳球菌乳酸亚种220007或220223，接种量为4％；
S5.发酵：经步骤S4所得物料于34℃条件下进行发酵，发酵时间为72h；
S6.检测：将步骤S5发酵结束后的料液上HPLC测定GABA含量。
实施例5
一种提高乳酸乳球菌乳酸亚种菌株产GABA能力的方法，包括如下步骤：
S1.菌种复苏和活化：将基于大批量菌株(≥1000株)筛选后产GABA能力高的乳酸乳球菌乳酸亚种220007或220223进行复苏和活化；
S2.种子液的制备：挑取单菌落于10mL 10％的脱脂乳中扩培，于37℃恒温培养24h得到活化菌液；按4％的接种量将活化菌液接种至10％的脱脂乳中，于37℃恒温培养24h得到种子液；
S3.制备发酵基料：配制含2.5g/L谷氨酸钠(L-MSG)的10％脱脂乳，在灭菌锅中105℃下灭菌15min；
S4.接种：将灭菌后的发酵基料冷却至38℃，接种乳酸乳球菌乳酸亚种220007或220223，接种量为3％；
S5.发酵：经步骤S4所得物料于38℃条件下进行发酵，发酵时间为54h；
S6.检测：将步骤S5发酵结束后的料液上HPLC测定GABA含量。
对比例1
一种利用乳酸乳球菌乳酸亚种菌株发酵产GABA的方法，包括如下步骤：
S1～S2与实施例1相同；
S3.制备发酵基料：配制含1.5％芝士粉的10％脱脂乳，在灭菌锅中105℃下灭菌15min；
S4.接种：将灭菌后的发酵基料冷却至30℃，接种乳酸乳球菌乳酸亚种220007或220223，接种量为2％；
S5.发酵：经步骤S4所得物料于30℃条件下进行发酵，发酵时间为60h；
S6.检测：将步骤S5发酵结束后的料液上HPLC测定GABA含量。
对比例2
一种利用乳酸乳球菌乳酸亚种菌株发酵产GABA的方法，包括如下步骤：
S1～S2与实施例2相同；
S3.制备发酵基料：配制含0.2％酵母抽提物的10％脱脂乳，在灭菌锅中105℃下灭菌15min；
S4.接种：将灭菌后的发酵基料冷却至32℃，接种乳酸乳球菌乳酸亚种220007或220223，接种量为4％；
S5.发酵：经步骤S4所得物料于32℃条件下进行发酵，发酵时间为48h；
S6.检测：将步骤S5发酵结束后的料液上HPLC测定GABA含量。
对比例3
一种利用乳酸乳球菌乳酸亚种菌株发酵产GABA的方法，包括如下步骤：
S1～S2与实施例3相同；
S3.制备发酵基料：配制含5.0％甘蔗汁的10％脱脂乳，在灭菌锅中105℃下灭菌15min；
S4.接种：将灭菌后的发酵基料冷却至36℃，接种乳酸乳球菌乳酸亚种220007或220223，接种量为5％；
S5.发酵：经步骤S4所得物料于36℃条件下进行发酵，发酵时间为68h；
S6.检测：将步骤S5发酵结束后的料液上HPLC测定GABA含量。
对比例4
一种利用乳酸乳球菌乳酸亚种菌株发酵产GABA的方法，包括如下步骤：
S1～S2与实施例4相同；
S3.制备发酵基料：配制含3.0％龙眼汁的10％脱脂乳，在灭菌锅中105℃下灭菌15min；
S4.接种：将灭菌后的发酵基料冷却至34℃，接种乳酸乳球菌乳酸亚种220007或220223，接种量为4％；
S5.发酵：经步骤S4所得物料于34℃条件下进行发酵，发酵时间为72h；
S6.检测：将步骤S5发酵结束后的料液上HPLC测定GABA含量。
对比例5
一种利用乳酸乳球菌乳酸亚种菌株发酵产GABA的方法，包括如下步骤：
S1～S2与实施例5相同；
S3.制备发酵基料：配制含3.0％水蜜桃汁的10％脱脂乳，在灭菌锅中105℃下灭菌15min；
S4.接种：将灭菌后的发酵基料冷却至38℃，接种乳酸乳球菌乳酸亚种220007或220223，接种量为3％；
S5.发酵：经步骤S4所得物料于38℃条件下进行发酵，发酵时间为54h；
S6.检测：将步骤S5发酵结束后的料液上HPLC测定GABA含量。
应用例
采用HPLC测定按照实施例1～5的方法、对比例1～5的方法发酵后产生的GABA含量，并进行对比。HPLC测定方法步骤如下：
1、溶液配制
(1)硼酸缓冲液
称取2.47g硼酸，溶于80mL蒸馏水，然后用2mol/L的氢氧化钠溶液调至pH＝10.2。
(2)衍生剂
称取0.1g邻苯二甲醛(OPA)于10mL棕色容量瓶，加入1mL甲醇(色谱级)待充分溶解后，再加入160μL的β-巯基乙醇，然后用pH＝10.2的硼酸缓冲液定容至10mL。
(3)流动相
流动相A：称取2.0412g乙酸钠，溶于1000mL纯水，而后加入0.22mL三乙胺，并用5％(v/v)醋酸溶液调至pH＝7.2，最后加入5mL四氢呋喃，过0.45μm水系滤膜、超声脱气后备用。
流动相B：将500mL乙腈(色谱级)和500mL甲醇(色谱级)等体积混合，超声脱气后备用。
2、HPLC分析方法
(1)样品前处理：取适当发酵乳/发酵液置于离心管中，分别在7830rpm/12000rpm，4℃条件下离心3min，而后取适量的上清液，与5％(w/v)三氯乙酸溶液等体积混合，并于12000rpm、4℃条件下，离心15min。
(2)衍生处理：取适量经前处理完的样品，与衍生剂等体积混合，室温衍生2min后，上机分析。
(3)衍生方法：
衍生方法及各参数如表1所示。
表1 HPLC分析参数设置
Figure BDA0002101574730000071
Figure BDA0002101574730000081
HPLC测定结果见下表2，结果表明：实施例1～5发酵体系中添加的前体物质为L-MSG，乳酸乳球菌乳酸亚种发酵后所产生的GABA含量远远高于对比例1～5中添加的前体物质为芝士粉、酵母抽提物、甘蔗汁、龙眼汁、水蜜桃汁时乳酸乳球菌乳酸亚种发酵后所产生的GABA含量；而当实施例1～5发酵体系中L-MSG的添加量不同、发酵条件不同时，发酵液中GABA含量也不同。
表2实施例1～5与对比例1～5产生的GABA含量
Figure BDA0002101574730000082
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种提高乳酸乳球菌乳酸亚种菌株产GABA能力的方法，其特征在于，包括如下步骤：配制含2.0～3.5g/L谷氨酸钠的10％脱脂乳，灭菌后冷却至30～40℃，接种乳酸乳球菌乳酸亚种菌株，接种量为3～5％，于30～35℃条件下发酵48～68h；
所述乳酸乳球菌乳酸亚种菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactissubsp.lactis)220007，于2018年10月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.16583或乳酸乳球菌乳酸亚种菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)220223，于2018年10月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.16584。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述10％脱脂乳中谷氨酸钠的终浓度为3.0g/L。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述乳酸乳球菌乳酸亚种菌株的接种量为4％。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述发酵的温度为32℃，发酵时间为48h。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述乳酸乳球菌乳酸亚种菌株的种子液是按1～5％的接种量将活化菌液接种至10％脱脂乳中，于37℃条件下发酵24h后得到。
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