CN113583904A - 胞外多聚物鞘氨醇单胞菌以及在制备高凝胶强度三赞胶中的应用 - Google Patents

胞外多聚物鞘氨醇单胞菌以及在制备高凝胶强度三赞胶中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物多糖的制备，特别是指一种胞外多聚物鞘氨醇单胞菌以及在制备高凝胶强度三赞胶中的应用。是将拉丁文名称为Sphingomonas Sanxanigenens、保藏编号为CGMCC No.20172的胞外多聚物鞘氨醇单胞菌接种到灭菌后且含有碳源、氮源及必要营养物质的发酵培养基中，在温度28℃～32℃，pH＝6.5～7.5的条件下进行通气发酵，当发酵液粘度不再增长时发酵结束将发酵液调整pH至弱碱性，加入碱性蛋白酶保温处理，调pH至弱酸性并升温处理，经后提取制成高凝胶强度的三赞胶，本发明解决了现有技术制备的三赞胶凝胶强度较低等技术问题，具有所制备的三赞胶产品凝胶强度高等优点。

Description

胞外多聚物鞘氨醇单胞菌以及在制备高凝胶强度三赞胶中的 应用
技术领域
本发明属于微生物多糖的额制备，特别是指一种胞外多聚物鞘氨醇单胞菌以及在制备高凝胶强度三赞胶中的应用。
背景技术
三赞胶是一种新型的微生物多糖，是鞘氨醇胶的一个新品种，以鞘氨醇单胞菌为菌种，以淀粉或葡萄糖等为主要原料，经特定的生物发酵并经提取、干燥、粉碎得到一款水溶性胶体。三赞胶是第一个由国内自主研发并实现工业化的生物多糖胶，因其具有独特的理化特性及安全无毒性，国家卫生健康委2020年第4号公告批准三赞胶为食品添加剂新品种，作为增稠剂、稳定和凝固剂用于肉灌肠类、果蔬汁(浆)饮料、植物蛋白饮料。三赞胶因其具有较好的胶凝性、乳化性、增稠性、耐酸性、耐高温性，在食品领域中具有广阔的应用前景。
随着人们对于健康饮食关注程度的不断提高，高蛋白、高纤维的植物基饮品成为饮料的发展趋势；三赞胶的弱凝胶强度已不能满足对高蛋白、高纤维的稳定悬浮，提高三赞胶的凝胶强度以更好适应饮料市场的发展。
目前市售三赞胶凝胶强度约为25g/cm2～30g/cm2，如公开号为CN201910354160.9的专利文献中公开的以鞘氨醇单胞菌为菌种生产微生物多糖-三赞胶的方法，其中三赞胶产物的1％水溶液凝胶强度为25g/cm2～30g/cm2。公开号为CN202010017852.7的专利文献中公开了一种高黏度、高凝胶强度的透明三赞胶的制备方法，将0.1％～0.3％的粉体三赞胶溶解升温到75℃～95℃，保温15～45分钟，于45℃～60℃调pH＝10～11，保温搅拌10～35分钟，中和，40℃～50℃时加入0％～0.1％磷酸盐，加入0％～0.03％的单宁酸等，加入0.01％～0.06％的硫酸铝等交联剂等，离心、过滤、中和得到三赞胶，虽然使三赞胶的强度有所提高，但处理能力低、工艺复杂，成本高，不利于工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胞外多聚物鞘氨醇单胞菌，该菌种的拉丁文名称为Sphingomonas Sanxanigenens，其保藏编号为CGMCC No.20172。该菌种具有较好的产高凝胶强度的三赞胶的能力，采用上述菌种所制备的三赞胶在凝胶强度指标上明显优于现有产品。
本发明的整体技术构思是：
胞外多聚物鞘氨醇单胞菌,该菌种的拉丁文名称为Sphingomonas Sanxanigenens，其保藏编号为CGMCC No.20172。
本发明中的菌种已于2020年7月1日提交位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该保藏单位的简称为CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.20172。
本发明中的菌种由申请人自河北省新河县滏阳河畔采样分离纯化后得到，该菌为革兰氏阴性菌、杆状，单个或成对排列，菌落为白色、圆形，表面湿润，不透明，边缘整齐。采用上述菌种制备的三赞胶具有较好的凝胶强度特性。
拉丁文名称为Sphingomonas Sanxanigenens、其保藏编号为CGMCC No.20172的胞外多聚物鞘氨醇单胞菌在发酵制备高凝胶强度三赞胶中的应用。
本发明的具体技术特征还有：
为有利于菌种生长，优选的技术实现手段是，发酵在高通风量的条件下进行。更为优选的技术实现手段是，所述的通风量为800m3/h～3200m3/h。
为进一步提高三赞胶的凝胶强度，优选的技术实现手段是，发酵后采用碱性蛋白酶对发酵液进行预处理后提取制备高凝胶强度三赞胶。更进一步，将碱性蛋白酶预处理后的发酵液在弱酸条件下保温80℃～95℃后提取制备高凝胶强度三赞胶。
由于发酵过程中随着时间增长发酵液粘度越来越高，为保证发酵过程中的溶氧水平，以利于菌体生长以及终产物的合成，优选的技术实现手段是，包括如下工艺步骤：
A、将生产菌种接种到灭菌后且含有碳源、氮源及必要营养物质的发酵培养基中；生产菌种选用拉丁文名称为Sphingomonas Sanxanigenens、保藏编号为CGMCC No.20172的胞外多聚物鞘氨醇单胞菌；
B、在温度28℃～32℃，pH＝6.5～7.5的条件下，进行通气发酵；
C、当发酵液粘度不再增长时发酵结束；
D、对步骤C中制备的发酵液调整pH至弱碱性，加入碱性蛋白酶进行保温处理，调pH至弱酸性并升温处理，经后提取制成高凝胶强度的三赞胶；
步骤B中通气发酵的条件如下：
0～20小时：风量800m3/h～1800m3/h；
21～50小时：风量1800m3/h～2400m3/h；
51小时～放罐：风量2500m3/h～3200m3/h。
所述的步骤A、B中发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蔗糖或葡萄糖3％～5％；蛋白胨0.1％～0.3％；牛肉膏0.1％～0.15％；大豆浓缩蛋白0.1％～0.3％；磷酸二氢钾0.1％～0.2％；磷酸氢二钾0.1％～0.2％；硝酸钾0.15％～0.3％；硫酸镁0.015％～0.025％；硫酸锰0.001％～0.003％；氯化钠0.0008％～0.0012％；消泡剂0.03％～0.05％；余量为无菌水；pH＝7.5～8.0。
步骤B中pH的调整采用质量百分比浓度10％～30％的碱性溶液，碱性溶液的溶质选用可溶性碱、可溶性强碱弱酸盐中的一种或其结合。
为便于工业化发酵的进行，优选的技术方案是，所述的步骤A中将拉丁文名称为Sphingomonas Sanxanigenens、保藏编号为CGMCC No.20172的胞外多聚物鞘氨醇单胞菌经过扩大培养后，按照种子液：发酵培养基＝8％～12％的接种量将种子液接种于灭菌后的发酵培养基中。
所述的扩大培养包括：
(1)将将拉丁文名称为Sphingomonas Sanxanigenens、保藏编号为CGMCCNo.20172的胞外多聚物鞘氨醇单胞菌接种于摇瓶种子培养基制成摇瓶种子；
(2)将摇瓶种子经扩大培养后制成种子液；
(3)按种子液：发酵培养基＝8％～12％的接种量，将制成的种子液接入发酵罐内灭菌后的发酵培养基中进行发酵。
扩大培养中各步骤优选采用如下技术实现手段：
所述的步骤(1)中制备摇瓶种子的工艺条件是：挑取一环斜面菌种接入灭菌后的摇瓶种子培养基中，经振荡培养制成摇瓶种子，培养温度为28℃～32℃、转速为170～220转/分钟，培养周期为16～24小时；摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1.0％～1.5％；蛋白胨0.3％～0.5％；牛肉膏0.1％～0.15％；磷酸二氢钠0.1％～0.15％；硝酸钾0.15％～0.25％；硫酸镁0.1％～0.2％；硫酸锰0.001％～0.003％；氯化钠0.0008％～0.0012％；消泡剂0.005％～0.01％；余量为无菌水。
所述的步骤(2)中的扩大培养的种子培养液由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1.0％～1.5％；蛋白胨0.3％～0.5％；牛肉膏0.1％～0.15％；磷酸二氢钠0.1％～0.15％；硝酸钾0.15％～0.25％；硫酸镁0.1％～0.2％；硫酸锰0.001％～0.003％；氯化钠0.0008％～0.0012％；消泡剂0.003％～0.005％；余量为无菌水；
接种量为摇瓶种子：种子培养液的体积比＝8％～12％，温度28℃～32℃，通风量40m3/h～100m3/h，罐压0.008MPa～0.12MPa，培养周期20～30小时。
为便于进一步提高三赞胶的纯度及凝胶强度，优选的技术实现手段是，步骤D中后提取包括如下步骤：
D1、发酵液预处理
将发酵液升温并调节其pH＝9.5～11，采用碱性蛋白酶处理并保温，然后将反应液调节pH＝4.5～5.5，在80℃～95℃的温度下保温；
D2、提取
在步骤a预处理后的发酵液中加酸搅拌至纤维物析出，经离心机离心，得到三赞胶湿料；
D3、捏合
将步骤b中制备的三赞胶湿料加入捏合机中，边搅拌边用质量百分比浓度为10％～20％的碱性溶液调节三赞胶物料pH＝6.0～8.0，并形成均匀的膏状；
D4、干燥、粉碎、混合
将步骤c制备的膏状三赞胶干燥、粉碎、混合后支撑高凝胶强度的三赞胶。
更为优选的技术实现方式是：
步骤D1中调节pH＝9.5～11采用质量百分比浓度10％～20％的碱性溶液，碱性溶液的溶质选用可溶性碱、可溶性强碱弱酸盐中的一种或其结合；碱性蛋白酶处理的条件是加入占发酵液体积0.08％～0.2％、酶活为20-50u/g的碱性蛋白酶并保温2～6小时；将反应液调节pH＝4.5～5.5采用质量百分比浓度10％～20％的酸溶液，酸溶液的溶质选用盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、硝酸中的一种或其结合，在80℃～95℃的温度下保温10～30分钟。
步骤D2中的反应条件为按预处理后发酵液总体积的0.5～2倍加入体积百分比浓度为1％～10％的酸溶液搅拌至纤维物析出，酸溶液选用盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、硝酸中的一种或其结合。
步骤D3中的碱性溶液中的溶质选用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾中的一种或其结合。
步骤D4中的干燥温度80℃～115℃，干燥时间30～60分钟。
申请人采用《卫健委2020年第4号公告》中记载的检测方法对本发明中所获得的三赞胶产品的凝胶强度进行了检测。具体检测方法如下：
1、仪器与设备
分析天平：精确至0.001g；恒温箱(温度范围：5℃～50℃)；凝胶强度仪；水浴锅(控温范围：室温～100℃)。
2、测试条件
探头形状与尺寸：1.0cm2不锈钢活塞式圆柱体；
探头移动速度：10mm/s。
3、分析步骤
试样制备
称取3g试样(精确至0.001g)，在转速8000r/min搅拌的条件下慢慢加入到装有300mL蒸馏水的盛液杯中，搅拌15min。将试样溶液倒入高型烧杯中，置于95℃的水浴锅内加热，用玻璃棒间断搅拌3次，每次搅拌5～10下，加热30min后取出烧杯，去掉上层泡沫，趁热将胶溶液倾入平底容器，液面高度为4cm，静置，自然冷却至凝胶后，放入恒温箱中20℃静置20h，待测。
4、测定
用凝胶强度仪测定3个平行样，取算术平均。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
1、本发明公开了一种拉丁文名称为Sphingomonas Sanxanigenens、保藏编号为CGMCC No.20172的胞外多聚物鞘氨醇单胞菌，采用上述菌种制备的三赞胶具有较好的凝胶强度。
2、在发酵过程中根据菌种特点，采用低罐压高通风量控制，在有利于菌种生长的同时，更为便于合成三赞胶。
3、发酵液经碱性蛋白酶处理，蛋白变为可溶性小分子，随废液排出，使三赞胶纯度得到提高，进一步提高了三赞胶的凝胶强度。
4、本申请在提取前弱酸条件下升温80℃～95℃，有利于三赞胶的凝胶强度进一步提高。
5、本发明的工艺处理简单，有利于高凝胶强度三赞胶的工业化生产。
6、经申请人通过实验测定，采用本发明方法制备的三赞胶的凝胶强度不低于60g/cm2，最高可达72g/cm2，明显优于现有产品和申请人了解到的现有技术，具有更好的工业适应性和应用前景。
本发明中的菌种已于2020年7月13日提交位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，该保藏单位简称CGMCC。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书所作出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
本实施例中的发酵在高通风量的条件下进行，所述的通风量为800m3/h～2500m3/h。
发酵后采用碱性蛋白酶对发酵液进行预处理后提取制备高凝胶强度三赞胶，将碱性蛋白酶预处理后的发酵液在弱酸条件下保温80℃后提取制备高凝胶强度三赞胶。
本实施例制备高凝胶强度的三赞胶包括如下工艺步骤：
A、将生产菌种接种到灭菌后且含有碳源、氮源及必要营养物质的发酵培养基中；生产菌种选用拉丁文名称为Sphingomonas Sanxanigenens、保藏编号为CGMCC No.20172的胞外多聚物鞘氨醇单胞菌；
B、在温度28℃，pH＝6.5的条件下，进行通气发酵；
C、当发酵液粘度不再增长时发酵结束；
D、对步骤C中制备的发酵液调整pH至弱碱性，加入碱性蛋白酶进行保温处理，调pH至弱酸性并升温处理，经后提取制成高凝胶强度的三赞胶；
步骤B中通气发酵的条件如下：
0～20小时：风量800m3/h；
21～50小时：风量1800m3/h；
51小时～放罐：风量2500m3/h。
所述的步骤A、B中发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蔗糖或葡萄糖3％；蛋白胨0.1％；牛肉膏0.1％；大豆浓缩蛋白0.1％；磷酸二氢钾0.1％；磷酸氢二钾0.1％；硝酸钾0.15％；硫酸镁0.015％；硫酸锰0.001％；氯化钠0.0008％；消泡剂0.03％；余量为无菌水；pH＝7.5。
步骤B中pH的调整采用质量百分比浓度10％的碱性溶液，碱性溶液的溶质选用氢氧化钠。
所述的步骤A中将拉丁文名称为Sphingomonas Sanxanigenens、保藏编号为CGMCCNo.20172的胞外多聚物鞘氨醇单胞菌经过扩大培养后，按照种子液：发酵培养基＝8％的接种量将种子液接种于灭菌后的发酵培养基中。
所述的扩大培养包括：
(1)将将拉丁文名称为Sphingomonas Sanxanigenens、保藏编号为CGMCCNo.20172的胞外多聚物鞘氨醇单胞菌接种于摇瓶种子培养基制成摇瓶种子；
(2)将摇瓶种子经扩大培养后制成种子液；
(3)按种子液：发酵培养基＝8％的接种量，将制成的种子液接入发酵罐内灭菌后的发酵培养基中进行发酵。
扩大培养中各步骤采用如下技术实现手段：
所述的步骤(1)中制备摇瓶种子的工艺条件是：挑取一环斜面菌种接入灭菌后的摇瓶种子培养基中，经振荡培养制成摇瓶种子，培养温度为28℃、转速为170转/分钟，培养周期为16小时；摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1.0％；蛋白胨0.3％；牛肉膏0.1％；磷酸二氢钠0.1％；硝酸钾0.15％；硫酸镁0.1％；硫酸锰0.001％；氯化钠0.0008％；消泡剂0.005％；余量为无菌水。
所述的步骤(2)中的扩大培养的种子培养液由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1.0％；蛋白胨0.3％；牛肉膏0.1％；磷酸二氢钠0.1％；硝酸钾0.15％；硫酸镁0.1％；硫酸锰0.001％；氯化钠0.0008％；消泡剂0.003％；余量为无菌水；
接种量为摇瓶种子：种子培养液的体积比＝8％，温度28℃，通风量40m3/h，罐压0.008MPa，培养周期20小时。
步骤D中后提取包括如下步骤：
D1、发酵液预处理
将发酵液升温并调节其pH＝9.5，采用碱性蛋白酶处理并保温，然后将反应液调节pH＝4.5，在80℃的温度下保温；
D2、提取
在步骤a预处理后的发酵液中加酸搅拌至纤维物析出，经离心机离心，得到三赞胶湿料；
D3、捏合
将步骤b中制备的三赞胶湿料加入捏合机中，边搅拌边用质量百分比浓度为10％的碱性溶液调节三赞胶物料pH＝6.0，并形成均匀的膏状；
D4、干燥、粉碎、混合
将步骤c制备的膏状三赞胶干燥、粉碎、混合后支撑高凝胶强度的三赞胶。
步骤D1中调节pH＝9.5采用质量百分比浓度10％的碱性溶液，碱性溶液的溶质选用氢氧化钠；碱性蛋白酶处理的条件是加入占发酵液体积0.08％、酶活为20u/g的碱性蛋白酶并保温2小时；将反应液调节pH＝4.5采用质量百分比浓度10％的酸溶液，酸溶液的溶质选用盐酸，在80℃的温度下保温10分钟。
步骤D2中的反应条件为按预处理后发酵液总体积的0.5倍加入体积百分比浓度为1％的酸溶液搅拌至纤维物析出，酸溶液选用盐酸。
步骤D3中的碱性溶液中的溶质选用氢氧化钠。
步骤D4中的干燥温度80℃，干燥时间30分钟。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于:
本实施例中的发酵在高通风量的条件下进行，所述的通风量为1800m3/h～3200m3/h。
发酵后采用碱性蛋白酶对发酵液进行预处理后提取制备高凝胶强度三赞胶，将碱性蛋白酶预处理后的发酵液在弱酸条件下保温95℃后提取制备高凝胶强度三赞胶。
本实施例制备高凝胶强度的三赞胶包括如下工艺步骤：
A、将生产菌种接种到灭菌后且含有碳源、氮源及必要营养物质的发酵培养基中；生产菌种选用拉丁文名称为Sphingomonas Sanxanigenens、保藏编号为CGMCC No.20172的胞外多聚物鞘氨醇单胞菌；
B、在温度32℃，pH＝7.5的条件下，进行通气发酵；
C、当发酵液粘度不再增长时发酵结束；
D、对步骤C中制备的发酵液调整pH至弱碱性，加入碱性蛋白酶进行保温处理，调pH至弱酸性并升温处理，经后提取制成高凝胶强度的三赞胶；
步骤B中通气发酵的条件如下：
0～20小时：风量1800m3/h；
21～50小时：风量2400m3/h；
51小时～放罐：风量3200m3/h。
所述的步骤A、B中发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蔗糖或葡萄糖5％；蛋白胨0.3％；牛肉膏0.15％；大豆浓缩蛋白0.3％；磷酸二氢钾0.2％；磷酸氢二钾0.2％；硝酸钾0.3％；硫酸镁0.025％；硫酸锰0.003％；氯化钠0.0012％；消泡剂0.05％；余量为无菌水；pH＝8.0。
步骤B中pH的调整采用质量百分比浓度30％的碱性溶液，碱性溶液的溶质选用碳酸钠。
扩大培养中各步骤采用如下技术实现手段：
所述的步骤(1)中制备摇瓶种子的工艺条件是：挑取一环斜面菌种接入灭菌后的摇瓶种子培养基中，经振荡培养制成摇瓶种子，培养温度为32℃、转速为220转/分钟，培养周期为24小时；摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1.5％；蛋白胨0.5％；牛肉膏0.15％；磷酸二氢钠0.15％；硝酸钾0.25％；硫酸镁0.2％；硫酸锰0.003％；氯化钠0.0012％；消泡剂0.01％；余量为无菌水。
所述的步骤(2)中的扩大培养的种子培养液由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1.5％；蛋白胨0.5％；牛肉膏0.15％；磷酸二氢钠0.15％；硝酸钾0.25％；硫酸镁0.2％；硫酸锰0.003％；氯化钠0.0012％；消泡剂0.005％；余量为无菌水；
接种量为摇瓶种子：种子培养液的体积比＝12％，温度32℃，通风量100m3/h，罐压0.12MPa，培养周期30小时。
步骤D中后提取包括如下步骤：
D1、发酵液预处理
将发酵液升温并调节其pH＝11，采用碱性蛋白酶处理并保温，然后将反应液调节pH＝5.5，在95℃的温度下保温；
D2、提取
在步骤a预处理后的发酵液中加酸搅拌至纤维物析出，经离心机离心，得到三赞胶湿料；
D3、捏合
将步骤b中制备的三赞胶湿料加入捏合机中，边搅拌边用质量百分比浓度为20％的碱性溶液调节三赞胶物料pH＝8.0，并形成均匀的膏状；
D4、干燥、粉碎、混合
将步骤c制备的膏状三赞胶干燥、粉碎、混合后支撑高凝胶强度的三赞胶。
步骤D1中调节pH＝11采用质量百分比浓度20％的碱性溶液，碱性溶液的溶质选用碳酸钠；碱性蛋白酶处理的条件是加入占发酵液体积0.2％、酶活为50u/g的碱性蛋白酶并保温6小时；将反应液调节pH＝5.5采用质量百分比浓度20％的酸溶液，酸溶液的溶质选用硫酸，在95℃的温度下保温30分钟。
步骤D2中的反应条件为按预处理后发酵液总体积的2倍加入体积百分比浓度为1％～10％的酸溶液搅拌至纤维物析出，酸溶液选用盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、硝酸中的一种或其结合。
步骤D3中的碱性溶液中的溶质选用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾中的一种或其结合。
步骤D4中的干燥温度115℃，干燥时间60分钟。
其余内容同实施例1。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于:
本实施例中的发酵在高通风量的条件下进行，所述的通风量为1300m3/h～2900m3/h。
发酵后采用碱性蛋白酶对发酵液进行预处理后提取制备高凝胶强度三赞胶，将碱性蛋白酶预处理后的发酵液在弱酸条件下保温80℃～95℃后提取制备高凝胶强度三赞胶。
本实施例制备高凝胶强度的三赞胶包括如下工艺步骤：
A、将生产菌种接种到灭菌后且含有碳源、氮源及必要营养物质的发酵培养基中；生产菌种选用拉丁文名称为Sphingomonas Sanxanigenens、保藏编号为CGMCC No.20172的胞外多聚物鞘氨醇单胞菌；
B、在温度30℃，pH＝7的条件下，进行通气发酵；
C、当发酵液粘度不再增长时发酵结束；
D、对步骤C中制备的发酵液调整pH至弱碱性，加入碱性蛋白酶进行保温处理，调pH至弱酸性并升温处理，经后提取制成高凝胶强度的三赞胶；
步骤B中通气发酵的条件如下：
0～20小时：风量1300m3/h；
21～50小时：风量1600m3/h；
51小时～放罐：风量2900m3/h。
所述的步骤A、B中发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蔗糖或葡萄糖4％；蛋白胨0.2％；牛肉膏0.13％；大豆浓缩蛋白0.2％；磷酸二氢钾0.15％；磷酸氢二钾0.15％；硝酸钾0.22％；硫酸镁0.02％；硫酸锰0.002％；氯化钠0.001％；消泡剂0.04％；余量为无菌水；pH＝7.8。
步骤B中pH的调整采用质量百分比浓度20％的碱性溶液，碱性溶液的溶质选用氢氧化钠、氢氧化钾的结合。
扩大培养中各步骤采用如下技术实现手段：
所述的步骤(1)中制备摇瓶种子的工艺条件是：挑取一环斜面菌种接入灭菌后的摇瓶种子培养基中，经振荡培养制成摇瓶种子，培养温度为30℃、转速为195转/分钟，培养周期为20小时；摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1.25％；蛋白胨0.4％；牛肉膏0.13％；磷酸二氢钠0.13％；硝酸钾0.2％；硫酸镁0.15％；硫酸锰0.002％；氯化钠0.0001％；消泡剂0.008％；余量为无菌水。
所述的步骤(2)中的扩大培养的种子培养液由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1.3％；蛋白胨0.4％；牛肉膏0.13％；磷酸二氢钠0.13％；硝酸钾0.2％；硫酸镁0.15％；硫酸锰0.002％；氯化钠0.001％；消泡剂0.004％；余量为无菌水；
接种量为摇瓶种子：种子培养液的体积比＝10％，温度30℃，通风量70m3/h，罐压0.064MPa，培养周期25小时。
步骤D中后提取包括如下步骤：
D1、发酵液预处理
将发酵液升温并调节其pH＝10，采用碱性蛋白酶处理并保温，然后将反应液调节pH＝5，在87℃的温度下保温；
D2、提取
在步骤a预处理后的发酵液中加酸搅拌至纤维物析出，经离心机离心，得到三赞胶湿料；
D3、捏合
将步骤b中制备的三赞胶湿料加入捏合机中，边搅拌边用质量百分比浓度为15％的碱性溶液调节三赞胶物料pH＝7，并形成均匀的膏状；
D4、干燥、粉碎、混合
将步骤c制备的膏状三赞胶干燥、粉碎、混合后支撑高凝胶强度的三赞胶。
步骤D1中调节pH＝10采用质量百分比浓度15％的碱性溶液，碱性溶液的溶质选用氢氧化钠、氢氧化钾、浓氨水、碳酸钠、碳酸钾中的一种或其结合；碱性蛋白酶处理的条件是加入占发酵液体积0.14％、酶活为35u/g的碱性蛋白酶并保温4小时；将反应液调节pH＝5采用质量百分比浓度15％的酸溶液，酸溶液的溶质选用盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、硝酸中的一种或其结合，在87℃的温度下保温20分钟。
步骤D2中的反应条件为按预处理后发酵液总体积的1.25倍加入体积百分比浓度为5.5％的酸溶液搅拌至纤维物析出，酸溶液选用盐酸、硝酸的混合物。
步骤D3中的碱性溶液中的溶质选用碳酸钠、碳酸钾的混合物。
步骤D4中的干燥温度95℃，干燥时间45分钟。
其余内容同实施例1。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于:
本实施例中的发酵在高通风量的条件下进行，所述的通风量为1000m3/h～2600m3/h。
发酵后采用碱性蛋白酶对发酵液进行预处理后提取制备高凝胶强度三赞胶，将碱性蛋白酶预处理后的发酵液在弱酸条件下保温87℃后提取制备高凝胶强度三赞胶。
本实施例制备高凝胶强度的三赞胶包括如下工艺步骤：
A、将生产菌种接种到灭菌后且含有碳源、氮源及必要营养物质的发酵培养基中；生产菌种选用拉丁文名称为Sphingomonas Sanxanigenens、保藏编号为CGMCC No.20172的胞外多聚物鞘氨醇单胞菌；
B、在温度29℃，pH＝6.8的条件下，进行通气发酵；
C、当发酵液粘度不再增长时发酵结束；
D、对步骤C中制备的发酵液调整pH至弱碱性，加入碱性蛋白酶进行保温处理，调pH至弱酸性并升温处理，经后提取制成高凝胶强度的三赞胶；
步骤B中通气发酵的条件如下：
0～20小时：风量1000m3/h；
21～50小时：风量1800m3/h～2400m3/h；
51小时～放罐：风量2600m3/h。
所述的步骤A、B中发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蔗糖或葡萄糖3.5％；蛋白胨0.15％；牛肉膏0.11％；大豆浓缩蛋白0.18％；磷酸二氢钾0.13％；磷酸氢二钾0.13％；硝酸钾0.18％；硫酸镁0.018％；硫酸锰0.0018％；氯化钠0.0009％；消泡剂0.035％；余量为无菌水；pH＝7.5～8.0。
步骤B中pH的调整采用质量百分比浓度18％的碱性溶液，碱性溶液的溶质选用碳酸钾。
扩大培养中各步骤采用如下技术实现手段：
所述的步骤(1)中制备摇瓶种子的工艺条件是：挑取一环斜面菌种接入灭菌后的摇瓶种子培养基中，经振荡培养制成摇瓶种子，培养温度为29℃、转速为180转/分钟，培养周期为18小时；摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1.1％；蛋白胨0.35％；牛肉膏0.11％；磷酸二氢钠0.11％；硝酸钾0.18％；硫酸镁0.13％；硫酸锰0.0018％；氯化钠0.0009％；消泡剂0.006％；余量为无菌水。
所述的步骤(2)中的扩大培养的种子培养液由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1.1％；蛋白胨0.35％；牛肉膏0.11％；磷酸二氢钠0.11％；硝酸钾0.18％；硫酸镁0.13％；硫酸锰0.0018％；氯化钠0.0009％；消泡剂0.0035％；余量为无菌水；
接种量为摇瓶种子：种子培养液的体积比＝9％，温度29℃，通风量60m3/h，罐压0.005MPa，培养周期23小时。
步骤D中后提取包括如下步骤：
D1、发酵液预处理
将发酵液升温并调节其pH＝9.8，采用碱性蛋白酶处理并保温，然后将反应液调节pH＝4.8，在85℃的温度下保温；
D2、提取
在步骤a预处理后的发酵液中加酸搅拌至纤维物析出，经离心机离心，得到三赞胶湿料；
D3、捏合
将步骤b中制备的三赞胶湿料加入捏合机中，边搅拌边用质量百分比浓度为13％的碱性溶液调节三赞胶物料pH＝6.5，并形成均匀的膏状；
D4、干燥、粉碎、混合
将步骤c制备的膏状三赞胶干燥、粉碎、混合后支撑高凝胶强度的三赞胶。
步骤D1中调节pH＝9.8采用质量百分比浓度13％的碱性溶液，碱性溶液的溶质选用氢氧化钠、氢氧化钾、浓氨水、碳酸钠、碳酸钾中的一种或其结合；碱性蛋白酶处理的条件是加入占发酵液体积0.1％、酶活为25u/g的碱性蛋白酶并保温3小时；将反应液调节pH＝4.8采用质量百分比浓度12％的酸溶液，酸溶液的溶质选用乙酸，在85℃的温度下保温13分钟。
步骤D2中的反应条件为按预处理后发酵液总体积的0.8倍加入体积百分比浓度为3％的酸溶液搅拌至纤维物析出，酸溶液选用乙酸。
步骤D3中的碱性溶液中的溶质选用碳酸氢钾。
步骤D4中的干燥温度90℃，干燥时间35分钟。
其余内容同实施例1。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于:
本实施例中的发酵在高通风量的条件下进行，所述的通风量为1600m3/h～3000m3/h。
发酵后采用碱性蛋白酶对发酵液进行预处理后提取制备高凝胶强度三赞胶，将碱性蛋白酶预处理后的发酵液在弱酸条件下保温93℃后提取制备高凝胶强度三赞胶。
本实施例制备高凝胶强度的三赞胶包括如下工艺步骤：
A、将生产菌种接种到灭菌后且含有碳源、氮源及必要营养物质的发酵培养基中；生产菌种选用拉丁文名称为Sphingomonas Sanxanigenens、保藏编号为CGMCC No.20172的胞外多聚物鞘氨醇单胞菌；
B、在温度31℃，pH＝7.2的条件下，进行通气发酵；
C、当发酵液粘度不再增长时发酵结束；
D、对步骤C中制备的发酵液调整pH至弱碱性，加入碱性蛋白酶进行保温处理，调pH至弱酸性并升温处理，经后提取制成高凝胶强度的三赞胶；
步骤B中通气发酵的条件如下：
0～20小时：风量1600m3/h；
21～50小时：风量2200m3/h；
51小时～放罐：风量3000m3/h。
所述的步骤A、B中发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蔗糖或葡萄糖4.5％；蛋白胨0.25％；牛肉膏0.14％；大豆浓缩蛋白0.25％；磷酸二氢钾0.18％；磷酸氢二钾0.18％；硝酸钾0.28％；硫酸镁0.022％；硫酸锰0.0025％；氯化钠0.001％；消泡剂0.045％；余量为无菌水；pH＝7.5～8.0。
步骤B中pH的调整采用质量百分比浓度25％的碱性溶液，碱性溶液的溶质选用氢氧化钾。
扩大培养中各步骤采用如下技术实现手段：
所述的步骤(1)中制备摇瓶种子的工艺条件是：挑取一环斜面菌种接入灭菌后的摇瓶种子培养基中，经振荡培养制成摇瓶种子，培养温度为31℃、转速为210转/分钟，培养周期为22小时；摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1.4％；蛋白胨0.45％；牛肉膏0.14％；磷酸二氢钠0.14％；硝酸钾0.22％；硫酸镁0.8％；硫酸锰0.0025％；氯化钠0.0011％；消泡剂0.008％；余量为无菌水。
所述的步骤(2)中的扩大培养的种子培养液由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1.4％；蛋白胨0.45％；牛肉膏0.14％；磷酸二氢钠0.14％；硝酸钾0.22％；硫酸镁0.18％；硫酸锰0.0025％；氯化钠0.0011％；消泡剂0.0045％；余量为无菌水；
接种量为摇瓶种子：种子培养液的体积比＝11％，温度31℃，通风量90m3/h，罐压0.1MPa，培养周期28小时。
步骤D中后提取包括如下步骤：
D1、发酵液预处理
将发酵液升温并调节其pH＝10.5，采用碱性蛋白酶处理并保温，然后将反应液调节pH＝5.2，在93℃的温度下保温；
D2、提取
在步骤a预处理后的发酵液中加酸搅拌至纤维物析出，经离心机离心，得到三赞胶湿料；
D3、捏合
将步骤b中制备的三赞胶湿料加入捏合机中，边搅拌边用质量百分比浓度为18％的碱性溶液调节三赞胶物料pH＝7.5，并形成均匀的膏状；
D4、干燥、粉碎、混合
将步骤c制备的膏状三赞胶干燥、粉碎、混合后支撑高凝胶强度的三赞胶。
步骤D1中调节pH＝10.5采用质量百分比浓度18％的碱性溶液，碱性溶液的溶质选用碳酸钠、碳酸钾的结合；碱性蛋白酶处理的条件是加入占发酵液体积0.18％、酶活为40u/g的碱性蛋白酶并保温5小时；将反应液调节pH＝5.2采用质量百分比浓度18％的酸溶液，酸溶液的溶质选用磷酸，在90℃的温度下保温25分钟。
步骤D2中的反应条件为按预处理后发酵液总体积的1.8倍加入体积百分比浓度为8％的酸溶液搅拌至纤维物析出，酸溶液选用磷酸。
步骤D3中的碱性溶液中的溶质选用碳酸氢钾。
步骤D4中的干燥温度110℃，干燥时间50分钟。
其余内容同实施例1。
上述实施例中所制备产品的凝胶强度如下表。
1％水溶液的凝胶强度(g/m<sup>2</sup>)
实施例1制备的产品 68.7
实施例2制备的产品 72.0
实施例3制备的产品 63.3
实施例4制备的产品 66.1
实施例5制备的产品 65.4

Claims (18)

1.胞外多聚物鞘氨醇单胞菌,其特征在于该菌种的拉丁文名称为Sphing omonasSanxanigenens，其保藏编号为CGMCC No.20172。
2.根据权利要求1所述的胞外多聚物鞘氨醇单胞菌在发酵制备高凝胶强度三赞胶中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于发酵在高通风量的条件下进行。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的通风量为800m3/h～3200m3/h。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于发酵后采用碱性蛋白酶对发酵液进行预处理后提取制备高凝胶强度三赞胶。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于将碱性蛋白酶预处理后的发酵液在弱酸条件下保温80℃～95℃后提取制备高凝胶强度三赞胶。
7.根据权利要求2～6中任一项所述的应用，其特征在于包括如下工艺步骤：
A、将生产菌种接种到灭菌后且含有碳源、氮源及必要营养物质的发酵培养基中；生产菌种选用拉丁文名称为Sphingomonas Sanxanigenens、保藏编号为CGMCC No.20172的胞外多聚物鞘氨醇单胞菌；
B、在温度28℃～32℃，pH＝6.5～7.5的条件下，进行通气发酵；
C、当发酵液粘度不再增长时发酵结束；
D、对步骤C中制备的发酵液调整pH至弱碱性，加入碱性蛋白酶进行保温处理，调pH至弱酸性并升温处理，经后提取制成高凝胶强度的三赞胶；
步骤B中通气发酵的条件如下：
0～20小时：风量800m3/h～1800m3/h；
21～50小时：风量1800m3/h～2400m3/h；
51小时～放罐：风量2500m3/h～3200m3/h。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的步骤A、B中发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蔗糖或葡萄糖3％～5％；蛋白胨0.1％～0.3％；牛肉膏0.1％～0.15％；大豆浓缩蛋白0.1％～0.3％；磷酸二氢钾0.1％～0.2％；磷酸氢二钾0.1％～0.2％；硝酸钾0.15％～0.3％；硫酸镁0.015％～0.025％；硫酸锰0.001％～0.003％；氯化钠0.0008％～0.0012％；消泡剂0.03％～0.05％；余量为无菌水；pH＝7.5～8.0。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于步骤B中pH的调整采用质量百分比浓度10％～30％的碱性溶液，碱性溶液的溶质选用可溶性碱、可溶性强碱弱酸盐中的一种或其结合。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的步骤A中将拉丁文名称为Sphingomonas Sanxanigenens、保藏编号为CGMCC No.20172的胞外多聚物鞘氨醇单胞菌经过扩大培养后，按照种子液：发酵培养基＝8％～12％的接种量将种子液接种于灭菌后的发酵培养基中。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于所述的扩大培养包括：
(1)将将拉丁文名称为Sphingomonas Sanxanigenens、保藏编号为CGMCC No.20172的胞外多聚物鞘氨醇单胞菌接种于摇瓶种子培养基制成摇瓶种子；
(2)将摇瓶种子经扩大培养后制成种子液；
(3)按种子液：发酵培养基＝8％～12％的接种量，将制成的种子液接入发酵罐内灭菌后的发酵培养基中进行发酵。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于所述的步骤(1)中制备摇瓶种子的工艺条件是：挑取一环斜面菌种接入灭菌后的摇瓶种子培养基中，经振荡培养制成摇瓶种子，培养温度为28℃～32℃、转速为170～220转/分钟，培养周期为16～24小时；摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1.0％～1.5％；蛋白胨0.3％～0.5％；牛肉膏0.1％～0.15％；磷酸二氢钠0.1％～0.15％；硝酸钾0.15％～0.25％；硫酸镁0.1％～0.2％；硫酸锰0.001％～0.003％；氯化钠0.0008％～0.0012％；消泡剂0.005％～0.01％；余量为无菌水。
13.根据权利要求11所述的应用，其特征在于所述的步骤(2)中的扩大培养的种子培养液由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1.0％～1.5％；蛋白胨0.3％～0.5％；牛肉膏0.1％～0.15％；磷酸二氢钠0.1％～0.15％；硝酸钾0.15％～0.25％；硫酸镁0.1％～0.2％；硫酸锰0.001％～0.003％；氯化钠0.0008％～0.0012％；消泡剂0.003％～0.005％；余量为无菌水；
接种量为摇瓶种子：种子培养液的体积比＝8％～12％，温度28℃～32℃，通风量40m3/h～100m3/h，罐压0.008MPa～0.12MPa，培养周期20～30小时。
14.根据权利要求7～13中任一项所述的应用，其特征在于步骤D中后提取包括如下步骤：
D1、发酵液预处理
将发酵液升温并调节其pH＝9.5～11，采用碱性蛋白酶处理并保温，然后将反应液调节pH＝4.5～5.5，在80℃～95℃的温度下保温；
D2、提取
在步骤a预处理后的发酵液中加酸搅拌至纤维物析出，经离心机离心，得到三赞胶湿料；
D3、捏合
将步骤b中制备的三赞胶湿料加入捏合机中，边搅拌边用质量百分比浓度为10％～20％的碱性溶液调节三赞胶物料pH＝6.0～8.0，并形成均匀的膏状；
D4、干燥、粉碎、混合
将步骤c制备的膏状三赞胶干燥、粉碎、混合后支撑高凝胶强度的三赞胶。
15.根据权利要求7～13中任一项所述的应用，其特征在于步骤D1中调节pH＝9.5～11采用质量百分比浓度10％～20％的碱性溶液，碱性溶液的溶质选用可溶性碱、可溶性强碱弱酸盐中的一种或其结合；碱性蛋白酶处理的条件是加入占发酵液体积0.08％～0.2％、酶活为20～50u/g的碱性蛋白酶并保温2～6小时；将反应液调节pH＝4.5～5.5采用质量百分比浓度10％～20％的酸溶液，酸溶液的溶质选用盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、硝酸中的一种或其结合，在80℃～95℃的温度下保温10～30分钟。
16.根据权利要求7～13中任一项所述的应用，其特征在于步骤D2中的反应条件为按预处理后发酵液总体积的0.5-2倍加入体积百分比浓度为1％～10％的酸溶液搅拌至纤维物析出，酸溶液选用盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、硝酸中的一种或其结合。
17.根据权利要求7～13中任一项所述的应用，其特征在于步骤D3中的碱性溶液中的溶质选用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾中的一种或其结合。
18.根据权利要求7～13中任一项所述的应用，其特征在于步骤D4中的干燥温度80℃～115℃，干燥时间30～60分钟。
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