CN110564626B - 一株米曲霉菌株及其培养方法与制备蔗果三糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株米曲霉菌株及其培养方法与制备蔗果三糖的方法，该米曲霉菌株于2019年08月28日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC No.18128，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明还提供该米曲霉菌株的培养方法和利用该菌株制备蔗果三糖的方法。该菌株能够显著地提高蔗糖转化为蔗果三糖的能力，得到的蔗果三糖的粗溶液中蔗果三糖的质量含量达到55％以上，较现有技术提高20％以上。

Description

一株米曲霉菌株及其培养方法与制备蔗果三糖的方法
技术领域
本发明属于低聚糖制造领域，具体涉及一种以蔗果三糖为主要成分的碳水化合物组合物及其制备方法。
背景技术
低聚果糖又称蔗果低聚糖，是由1～3个果糖基通过β(2-1)糖苷键与蔗糖中的果糖基结合生成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等的混合物。低聚果糖是一种天然活性物质。甜度为蔗糖的0.3-0.6倍。既保持了蔗糖的纯正甜味性质，又比蔗糖甜味清爽。是具有调节肠道菌群，增殖双歧杆菌，促进钙的吸收，调节血脂，免疫调节，抗龋齿等保健功能的新型甜味剂，被誉为继抗生素时代后最具潜力的新一代添加剂——促生物质；在法国被称为原生素(PPE)，已在乳制品、乳酸菌饮料、固体饮料、糖果、饼干、面包、果冻、冷饮等多种食品中应用。低聚果糖中蔗果三糖由于聚合度小，水活低，进入结肠部位后更容易被利用而起到调节肠道微生态的作用，因此提高低聚果糖中蔗果三糖的含量具有重要意义，当前生产技术制备的低聚果糖中具有很高的蔗果四糖甚至蔗果五糖，蔗果三糖含量较低，影响了低聚果糖的功能活性。
为了提高蔗果三糖含量，目前的方法主要采用酶转化法进行。例如：CN104781414A、JP2007289128A等。但是这些方法采用的酶大都是基因重组酶，需要复杂的基因重组技术得到适合的酶。此外，KR1020180122987A公开了含量高1-蔗果三糖的低聚果糖的制备方法，通过处理具有高反应性活性的酶来生产低聚半乳糖-低聚半乳糖，开发了一种精制的突变体，该突变体提高了分枝杆菌的生产率，而不需要重组细菌来生产对消费者友好的，安全的食品，并且提高了分枝杆菌的效率。该方法提供了不需要基因重组技术得到的突变体发酵生产蔗果三糖，该突变体发酵液产生的蔗果三糖粗液中蔗果三糖的含量在38-45％，经过精制可得到纯度和含量很高的蔗果三糖。因此，发酵液产生的蔗果三糖粗液中蔗果三糖的含量越高越有利于后续精制过程。事实上，通过菌发酵产生的酶生产的粗液中蔗果三糖质量含量的理论极限在75％左右。尽最大努力提高蔗果三糖粗液中蔗果三糖的含量，也成为本领域技术人员一直努力的方向。为此，提出本发明。
发明内容
针对现有技术的不足，尤其是现有技术中高产率的果糖基转移酶多为通过复杂的基因重组技术得到，以及自然突变得到的菌株发酵产生的蔗果三糖粗液中蔗果三糖的质量含量还需要进一步提高的不足；本发明提供一株全新米曲霉菌株，其发酵产生的蔗果三糖粗液中蔗果三糖的质量含量高达55％以上。
本发明的技术方案如下：
一株米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)BLCY-009，2019年08月28日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC No.18128，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明的发明人在山东百龙创园生物科技股份有限公司低聚果糖车间周围土壤中筛选得到一株米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)BLCY-008，发明人惊奇的发现利用该菌株的发酵产物可以有效地提高蔗糖转化为蔗果三糖的能力，较现有技术提高4％左右。发明人以BLCY-008为出发菌株，采用紫外线诱变、离子注入诱变等方式进行诱变、筛选处理最终得到BLCY-009，经实验发现该菌株蔗糖转化为蔗果三糖的能力，较现有技术提高20％以上。发明人将该米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)BLCY-009于2019年08月28日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.18128，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
根据本发明，上述米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)BLCY-009的培养方法，包括步骤如下：
(1)取米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)BLCY-009接种于种子培养基中在30～35℃的条件下，增殖培养30～50h，制得种子液；
(2)取步骤(1)制得的种子液，按体积比0.2‰～1％的比例接种于发酵培养基中，在30～35℃，扩大培养20～30h，即得菌体发酵液。
根据本发明优选的，步骤(1)中的种子培养基组分如下，均为重量百分比：
蔗糖1％；麸皮50％，余量水，pH为5.0～6.5。
根据本发明优选的，步骤(2)中的发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
蔗糖1％，麸皮1％，酵母膏1％，余量水，pH自然。
根据本发明优选的，步骤(2)中发酵过程在控制转速250rpm，通风比2:1，pH＝4.0-5.5的环境下进行。
根据本发明，利用上述米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)BLCY-009发酵制备蔗果三糖的方法，包括步骤如下：
(a)配制质量浓度为35-70％的蔗糖溶液；
(b)取上述制备的菌体发酵液经过滤处理得到粗酶液；
(c)将得到的粗酶液加入步骤(a)配置好的蔗糖溶液中，40～60℃保温反应4～15h后得到富含蔗果三糖的粗溶液；
(d)富含蔗果三糖的粗溶液经脱色、过滤、离子交换、色谱分离、浓缩、干燥制得蔗果三糖产品。
根据本发明优选的，步骤(b)中，过滤采用板框式压滤机过滤，工作压力为0.3～0.5MPa，流速为5～10m3/h。
根据本发明优选的，步骤(c)中粗酶液的添加比例为蔗糖重量百分比的1％-5％。
根据本发明优选的，步骤(d)中，脱色采用活性炭脱色，活性炭添加量为1.5-2wt％，脱色时间为30-40min；
优选的，色谱分离过程运行压力0.2-0.35MPa，温度60-70℃，水耗比1:1.5～1:1.8，每小时进料1.5～1.8m3。
本发明得到的蔗果三糖的粗溶液中蔗果三糖的质量含量达到55％以上，再进行精制过后可得到不同质量含量的蔗果三糖产品，比如：蔗果三糖质量含量≥70％、蔗果三糖质量含量≥80％、蔗果三糖质量含量≥98％的产品。
本发明未详尽说明的，均按本领域现有技术。
本发明的有益效果：
1、本发明从土壤中分离出米曲霉菌株，在经过紫外诱变、离子注入诱变处理等诱变处理技术，最后获得高产菌株命名为BLCY-009，该菌株能够显著地提高蔗糖转化为蔗果三糖的能力，较现有技术提高20％以上。
2、本发明得到的蔗果三糖的粗溶液中蔗果三糖的质量含量达到55％以上，大大提高了原始发酵液中蔗果三糖的浓度，更有利于后续蔗果三糖产品的生产。蔗果三糖醋溶液再进行精制过后可得到蔗果三糖质量含量≥70％、蔗果三糖质量含量≥80％、蔗果三糖质量含量≥98％等不同质量含量的蔗果三糖产品。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1
一株米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)BLCY-009，2019年08月28日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC No.18128，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
上述米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)BLCY-009的筛选过程如下：
(1)富集培养
选取山东百龙创园生物科技股份有限公司低聚果糖生产车间附近的土壤，用小铲子除去表土，取离地面5～10cm处的土壤约20g，用无菌水稀释10倍，加入PDA培养基进行富集培养，PDA培养基成分：
马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15～20克、去离子水1000毫升、硝酸铵0.2％；硫酸铵0.1％；磷酸氢二钾0.1％；pH＝6.5～7.0。
制作方法如下
200g马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加热，再据实际实验需要加1～10g琼脂，硝酸铵0.2％；硫酸铵0.1％；磷酸氢二钾0.1％继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足去离子水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，(121℃)灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用。
(2)纯种分离
采用划线分离法，取一支盛有5ml无菌水的大试管，取步骤(1)中富集培养后的菌液2ml放入其中稀释，充分振荡分散，用接种环以无菌操作挑取稀释液一环先在平板培养基一边做第一次平行划线3～4条，再转动培养皿约60度角，将接种环上剩余物烧掉，待冷却后同一次划线方法做第二次划线，同法依次做第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，将培养皿倒置，28～35℃培养30h后，挑取单个菌落接种于10个斜面培养基上，分别编号01～10。
将01～10斜面种子接种于摇瓶培养基中培养28～35℃培养30h后进行处理得到粗酶液；然后将处理得到的粗酶液安2％比例加入质量分数为50％的蔗糖溶液中，40-60℃保温反应4～15h后得到富含蔗果三糖的粗溶液，对其中的蔗果三糖含量进行测定，02号摇瓶对应的蔗果三糖含量最高。
平板培养基成分：
马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15～20克、去离子水1000毫升；磷酸氢二钾0.1％；pH＝6.5～7.0。
摇瓶培养基成分：
100ml豆饼浸出汁中加入可溶性淀粉2克，磷酸二氢钾0.1克，琼脂2克，自然pH。
所述豆饼浸出汁制作方法：100克豆饼，加水500ml，浸泡4小时，煮沸3～4小时，纱布自然过滤，取液，调整至5波美度。
(3)诱变筛选
对02号菌种进行紫外线诱变，紫外线诱变采用20W紫外线灯15cm照射，照射时间为150s，得到的高产菌种再进行离子注入诱变处理，最终得到能够显著地提高蔗糖转化为蔗果三糖的能力的高产菌株命名为BLCY-009。
实施例2
实施例1所述的米曲霉(Aspergillus oryzae)BLCY-009的培养方法，包括步骤如下：
(1)取米曲霉(Aspergillus oryzae)BLCY-009接种于PDA培养基中，在32℃的条件下，活化培养35h，制得活化菌株；
PDA培养基成分：
马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15～20克、去离子水1000毫升、硝酸铵0.2％；硫酸铵0.1％；磷酸氢二钾0.1％；pH＝6.5～7.0。
(2)取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在30℃的条件下，增殖培养40h，制得种子液；
所述种子培养基组分如下，均为重量百分比：
蔗糖1％；麸皮50％，余量水，pH为5.0；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积比1％的比例接种于发酵培养基中，在30℃，扩大培养35h，即得菌体发酵液；
发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
蔗糖1％，麸皮1％，酵母膏1％，余量水，pH自然。
实施例3
利用实施例2得到的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)BLCY-009菌体发酵液制备蔗果三糖的方法，包括步骤如下：
(a)配制质量浓度为50％的蔗糖溶液；
(b)取实施例2制备的菌体发酵液经过过滤处理得到粗酶液；过滤采用板框式压滤机过滤，工作压力为0.3MPa，流速为10m3/h；
(c)将处理得到的粗酶液加入步骤(a)配置好的蔗糖溶液中，粗酶液的添加比例为蔗糖重量百分比的2％；40℃保温反应10h后得到富含蔗果三糖的粗溶液；
经检测，蔗果三糖的质量含量达到55.4％；
(d)富含蔗果三糖的粗溶液经脱色、过滤、离子交换、色谱分离、浓缩、干燥制得产品；
脱色采用活性炭脱色，活性炭添加量为1.5wt％，脱色时间为30min；色谱分离，运行压力0.2MPa，温度70℃，水耗比1:1.5，每小时进料1.8m3。
经检测，蔗果三糖的含量达到99％，
实施例4
利用实施例2得到的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)BLCY-009菌体发酵液制备蔗果三糖的方法，包括步骤如下：
(a)配制质量浓度为40％的蔗糖溶液；
(b)取实施例2制备的菌体发酵液经过过滤处理得到粗酶液；过滤采用板框式压滤机过滤，工作压力为0.4MPa，流速为8m3/h；
(c)将处理得到的粗酶液加入步骤(a)配置好的蔗糖溶液中，粗酶液的添加比例为蔗糖重量百分比的1％；40℃保温反应10h后得到富含蔗果三糖的粗溶液；
经检测，蔗果三糖的质量含量达到55％；
(d)富含蔗果三糖的粗溶液经脱色、过滤、离子交换、色谱分离、浓缩、干燥制得产品；
脱色采用活性炭脱色，活性炭添加量为1.5wt％，脱色时间为30min；色谱分离，运行压力0.3MPa，温度65℃，水耗比1:1.6，每小时进料1.8m3。
经检测，蔗果三糖的含量达到98.7％，
实施例5
利用实施例2得到的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)BLCY-009菌体发酵液制备蔗果三糖的方法，包括步骤如下：
(a)配制质量浓度为70％的蔗糖溶液；
(b)取实施例2制备的菌体发酵液经过过滤处理得到粗酶液；过滤采用板框式压滤机过滤，工作压力为0.3MPa，流速为10m3/h；
(c)将处理得到的粗酶液加入步骤(a)配置好的蔗糖溶液中，粗酶液的添加比例为蔗糖重量百分比的2％；60℃保温反应10h后得到富含蔗果三糖的粗溶液；
经检测，蔗果三糖的质量含量达到55.2％；
(d)富含蔗果三糖的粗溶液经脱色、过滤、离子交换、色谱分离、浓缩、干燥制得产品；
脱色采用活性炭脱色，活性炭添加量为1.5wt％，脱色时间为30min；色谱分离，运行压力0.2MPa，温度70℃，水耗比1:1.5，每小时进料1.8m3。
经检测，蔗果三糖的含量达到99.2％。
对比例1
其他条件同实施例3，所不同的是使用采购商品果糖基转移酶，对步骤(c)得到富含蔗果三糖的粗溶液进行检测，蔗果三糖的质量含量达到43.5％。
对比例2
其他条件同实施例3，所不同的是使用的菌株为米曲霉(Aspergillus oryzae)BLCY-008，对步骤(c)得到富含蔗果三糖的粗溶液进行检测，蔗果三糖的含量达到47.8％。

Claims (10)

1.一株米曲霉菌株（Aspergillus oryzae）BLCY-009，2019年08月28日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号CGMCC No. 18128，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.权利要求1所述的米曲霉菌株（Aspergillus oryzae）BLCY-009的培养方法，包括步骤如下：
（1）取米曲霉菌株（Aspergillus oryzae）BLCY-009接种于种子培养基中在30～35℃的条件下，增殖培养30～50h，制得种子液；
（2）取步骤（1）制得的种子液，按体积比0.2‰～1%的比例接种于发酵培养基中，在30～35℃，扩大培养20～30h，即得菌体发酵液。
3.根据权利要求2所述的米曲霉菌株（Aspergillus oryzae）BLCY-009的培养方法，其特征在于，步骤（1）中的种子培养基组分如下，均为重量百分比：
蔗糖1%；麸皮50%，余量水，pH 为5.0～6.5。
4. 根据权利要求2所述的米曲霉菌株（Aspergillus oryzae）BLCY-009的培养方法，其特征在于，步骤（2）中的发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
蔗糖1%，麸皮1%，酵母膏1%，余量水，pH自然。
5. 根据权利要求2所述的米曲霉菌株（Aspergillus oryzae）BLCY-009的培养方法，其特征在于，步骤（2）中发酵过程在控制转速250rpm，通风比2:1，pH=4.0-5.5的环境下进行。
6.一种制备蔗果三糖的方法，包括使用权利要求1所述的米曲霉菌株（Aspergillusoryzae）BLCY-009，包括步骤如下：
（a）配制质量浓度为35-70%的蔗糖溶液；
（b）取权利要求2制备的菌体发酵液经过滤处理得到粗酶液；
（c）将得到的粗酶液加入步骤（a）配置好的蔗糖溶液中，40～60℃保温反应4～15h后得到富含蔗果三糖的粗溶液；
（d）富含蔗果三糖的粗溶液经脱色、过滤、离子交换、色谱分离、浓缩、干燥制得蔗果三糖产品。
7.根据权利要求6所述的制备蔗果三糖的方法，其特征在于，步骤（b）中，过滤采用板框式压滤机过滤，工作压力为0.3～0.5MPa，流速为5～10m3/h。
8.根据权利要求6所述的制备蔗果三糖的方法，其特征在于，步骤（c）中粗酶液的添加比例为蔗糖重量百分比的1%-5%。
9.根据权利要求6所述的制备蔗果三糖的方法，其特征在于，步骤（d）中，脱色采用活性炭脱色，活性炭添加量为1.5-2wt%，脱色时间为30-40min。
10.根据权利要求6所述的制备蔗果三糖的方法，其特征在于，步骤（d）中，色谱分离过程运行压力0.2-0.35MPa，温度60-70℃，水耗比1:1.5～1:1.8，每小时进料1.5～1.8m3。
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