CN113234637B

CN113234637B - 一种大规模高效生产细菌纤维素的发酵培养基及其发酵方法

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Publication number: CN113234637B
Application number: CN202110664873.2A
Authority: CN
Inventors: 马挺; 李国强; 高歌; 曹艺严; 廖梓彤; 张一博
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2021-06-16
Filing date: 2021-06-16
Publication date: 2022-10-04
Anticipated expiration: 2041-06-16
Also published as: CN113234637A

Abstract

本发明提供了一种大规模高效生产细菌纤维素的发酵培养基及其发酵生产方法，属于生物技术和生物材料技术领域。高效生产细菌纤维素的HS‑XGK发酵培养基在HS‑XG发酵培养基的基础上包含0.1～2g/L的电子受体硝酸盐。本发明还提供了大规模生产细菌纤维素的发酵培养基，在HS‑XGK发酵培养基基础上添加了农作物废弃物水解液。将该发酵培养基置于20L培养盘中，接种肠杆菌FY‑07菌株后发酵，得到大量细菌纤维素，这表明本发明成功构建了一种放大规模高效低成本生产细菌纤维素的发酵方法，在不影响细菌纤维素产品性能的基础上显著提升了肠杆菌FY‑07生产细菌纤维素的产率。

Description

一种大规模高效生产细菌纤维素的发酵培养基及其发酵方法

技术领域

本发明属于生物技术和生物材料技术领域，具体涉及一种大规模高效生产细菌纤维素的发酵培养基及其发酵生产方法。

背景技术

纤维素是地球上最丰富的生物资源之一。与植物纤维素相比，细菌纤维素（Bacterial cellulose，简称BC）具有纯度高、结晶度高、机械强度高、生物相容性好等优点。由于其优异的性能，细菌纤维素被广泛应用于食品、造纸、生物医学、石油工程等各个领域。因此，细菌纤维素拥有巨大的全球市场。

已发现多种细菌可以产生细菌纤维素，其中葡糖醋杆菌（Gluconacetobacter）因其较高的总产量而作为细菌纤维素研究的模式菌株。然而绝大多数细菌纤维素产生菌都是严格好氧菌，只能在培养基与气体表面产生细菌纤维素，这样的发酵生产特性导致发酵速度慢，生产周期长、生产成本高。尽管已经进行了大量的研究，高成本和低产率的问题仍然没有被解决，已然成为细菌纤维素大规模商业化生产的最大障碍。

使用廉价易得的酒厂废水、番茄汁等碳源代替葡萄糖、蔗糖等成本更高的碳源用于细菌纤维素的生产是目前最常用的降低细菌纤维素生产成本的方法。而筛选高产菌株、优化培养条件、改良发酵设备等措施是提高细菌纤维素产率的常用方式。但截至目前，尽管有一些研究取得了一定的效果，但细菌纤维素的单位成本仍然难以满足工业化生产需求。

放大规模生产是细菌纤维素产业化最关键的步骤，过去的国内外研究中进行过多种尝试，但效果都不尽如人意，一旦将生产规模放大，就会出现生产菌株不稳定、发酵条件不适宜等问题，最终导致放大效果差、细菌纤维素产量低。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高效生产细菌纤维素的发酵培养基，能够提高细菌纤维素的产量。

本发明的目的在于提供一种大规模高效生产细菌纤维素的发酵方法，不仅具有发酵工艺稳定的特点，而且能极大提高细菌纤维素的产量，大大降低了生产成本。

本发明提供了一种大规模高效生产细菌纤维素的HS-XGK发酵培养基，以HS-XG发酵培养基为基础培养基，还包括0.1~2 g/L的硝酸盐。

优选的，所述HS-XGK发酵培养基中碳源替换为农作物废弃物水解液；

在所述发酵培养基中，所述农作物废弃物水解液的终体积百分含量为8%~12%。

优选的，所述农作物废弃物水解液的制备方法，包括以下步骤：

1）将农作物废弃物粉经酸解后，用纤维素酶和β-葡糖苷酶进行酶解，得到水解液；

2）将所述水解液依次去除不溶性固体和杂质，得到农作物废弃物水解液。

本发明提供了所述HS-XGK发酵培养基在生产细菌纤维素中的应用。

本发明提供了一种大规模高效生产细菌纤维素的发酵方法，包括以下步骤：

将产纤维素的细菌种子液接种至所述HS-XGK发酵培养基中，在20 L培养盘中发酵，得到细菌纤维素。

优选的，所述培养盘包括不锈钢深盘；

所述不锈钢深盘的规格为长50cm、宽35 cm、高15 cm。

优选的，所述产纤维素的细菌为保藏编号为CGMCC No.6103的肠杆菌FY-07菌株。

优选的，产纤维素的细菌种子液接种的接种量为1 %~2 %。

优选的，所述发酵的温度为28~32℃；

所述发酵的时间为22~26 h。

优选的，所述发酵包括培养盘堆叠发酵。

本发明提供了一种高效生产细菌纤维素的HS-XGK发酵培养基，以HS-XG发酵培养基为基础培养基，还包括0.1~2 g/L的硝酸盐。本发明在HS-XG发酵培养基的基础上进一步优化，通过向发酵培养中添加硝酸盐来达到大幅度提高细菌纤维素产量的目的。具体的硝酸盐中NO₃ ^-作为电子受体提高发酵微生物在厌氧状态下的电子传递，从而加速细菌纤维素的代谢，最终提高细菌纤维素的产量。实验证明，肠杆菌FY-07在所述发酵培养基可正常生产细菌纤维素，细菌纤维素的产率为17.13 g/L/d以上，与采用HS-XG发酵培养基发酵生产细菌纤维素产量（2.08 g/L/d）相比提高了约8.24倍，因此，所述发酵培养的改进配方能大大促进细菌纤维素的生产，为大规模工厂化生产提供新方向。

同时本发明提供的发酵培养基还提供了糖转化率，结果表明采用本发明提供的发酵培养基发酵糖转化率为70%以上，与采用HS-XG发酵培养基发酵生产细菌纤维素产量（9.78%）相比提高了约7.2倍。因此，所述发酵培养能有效提高原料的利用率，同时大大降低生产成本。

本发明还提供了一种大规模高效生产细菌纤维素的发酵方法，包括以下步骤：将产纤维素的细菌种子液接种至所述发酵培养基中，在培养盘中发酵，得到细菌纤维素。实验证明，将肠杆菌FY-07接种至上述发酵培养基中，在20L培养盘中进行发酵，能够有效提高细菌纤维素的产量，同时具有较高的发酵稳定性。

进一步的，本发明具体限定了以农作物废弃物水解液为碳源的发酵培养基进行大规模发酵。实验结果表明肠杆菌FY-07接种至所述发酵培养基中，可正常生产细菌纤维素，产率和糖转化率分别为13.96~14.35 g/L/d和 85.00%~85.5%。

附图说明

图1为本发明对比例1中用HS和HS-XG培养基对FY-07发酵的产物状态（A）、产率（B）和糖转化率（C）的比较结果；

图2A为本发明实施例中用HS-XG和HS-XGK培养基对FY-07发酵的产物状态比较；图2B为使用不同浓度的硝酸钾的发酵培养基生产细菌纤维素的产率结果，图2C为使用不同浓度的硝酸钾的发酵培养基生产细菌纤维素的糖转化率结果；

图3为本发明实施例中以农作物废弃物水解液为碳源用HS-XGK培养基对FY-07发酵的产物状态（A）、产率（B）和糖转化率（C）；

图4为以农作物废弃物水解液为碳源用HS-XGK培养基在20L深盘中对FY-07放大发酵的产物状态及正面、背面和侧面的形态；

图5为以农作物废弃物水解液为碳源用HS-XGK培养基对FY-07在锥形瓶（A）和20L深盘（B）中发酵产物的微观结构；

图6为本发明实施例中以农作物废弃物水解液为碳源用HS-XGK培养基对FY-07在锥形瓶（CSTH）和20L深盘（S12）中发酵产物的X射线衍射图谱；

图7为以农作物废弃物水解液为碳源用HS-XGK培养基对FY-07在锥形瓶（CSTH）和20L深盘（S12）中发酵产物的TGA曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种高效生产细菌纤维素的HS-XGK发酵培养基，以HS-XG发酵培养基为基础培养基，还包括0.1~2 g/L的硝酸盐。

在本发明中，所述HS-XG发酵培养基以1L计，包括以下原料：黄原胶0.05～0.15 g、葡萄糖23~28 g、酵母粉7～8 g、蛋白胨8～12 g、Na₂HPO₄ 8～12 g和余量的水，所述HS-XG发酵培养基以1 L计，包括以下原料：黄原胶0.1 g、酵母粉7.5 g、蛋白胨10 g、Na₂HPO₄ 10 g和余量的水。所述HS-XG发酵培养基在公开号为CN 111321184 A的专利中公开。本发明对所述HS-XG发酵培养基的配制方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的发酵培养基即可。

在本发明中，所述发酵培养基中添加硝酸盐，形成的发酵培养基记为HS-XGK发酵培养基。硝酸盐的浓度优选为0.5~1 g/L，更优选为0.8 g/L。硝酸盐作为电子受体提高发酵微生物的电子传递，从而加速细菌纤维素的代谢，最终提高细菌纤维素的产量。本发明对所述硝酸盐的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的硝酸盐的种类即可，例如硝酸钾，硝酸钠，硝酸铵、硝酸钙等。本发明以硝酸钾为例加以说明，但不能理解对本发明保护范围的限制。在本发明中，所述HS-XGK发酵培养基的碳源（葡萄糖）优选替换为农作物废弃物水解液。在所述HS-XGK发酵培养基中，所述农作物废弃物水解液的终体积百分含量优选为8 %~12%，更优选为10 %。

在本发明中，所述农作物废弃物水解液的制备方法，优选包括以下步骤：

在本发明中，所述农作物废弃物粉的粒径优选为40~50目。本发明对所述农作物废弃物的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的农作物秸秆、枝条、根等即可，例如玉米秸秆、小麦秸秆、花生秧、水稻秸秆、果树枝条等。本发明实施例中，以玉米秸秆为例加以说明农作物废弃物的处理方法。

在本发明中，所述酸解用试剂优选为体积浓度2 %的H₂SO₄溶液。所述酸解时，所述农作物废弃物粉与试剂的料液比为（9~11）：1，更优选为10:1。所述酸解的时间95~100℃，更优选为100℃。所述酸解的时间优选为1~2 h，更优选为1.5 h。

在本发明中，所述酸解后，优选进行调节体系pH值至4.6~5.0，更优选为4.8。所述酶解包括纤维素酶和β-葡糖苷酶分步酶解和同时酶解。所述纤维素酶的添加酶活力优选为20 PUF。所述β-葡糖苷酶的添加酶活力为30 IU。所述酶解的温度优选为48~52℃，更优选为50℃。

在本发明中，所述水解液去除不溶性固体的方法优选为离心。所述离心的离心力优选为8000~10000 g，更优选为9000 g。所述离心的时间为8~12 min，更优选为10 min。

在本发明中，去除杂质的方法优选为采用活性炭进行去除。所述活性炭的添加量优选为0.5 %(w/v)。所述活性炭的孔径为90~110目，更优选为100目。所述去除过程优选伴随振荡。所述振荡的转速优选为120~180 rpm，更优选为150 rpm。所述去除过程的温度优选为42~48℃，更优选为45℃。所述杂质优选包括蛋白质、酚类等杂质。

本发明提供了所述HS-XGK发酵培养基在工厂化生产细菌纤维素中的应用。

在本发明中，所述工厂化生产细菌纤维素的微生物优选包括保藏编号为CGMCCNo.6103的肠杆菌FY-07菌株。所述工厂化生产细菌纤维素的条件优选为在28~32℃条件下发酵22~26h，更优选为30℃条件下发酵24 h。

本发明提供了一种大规模高效生产细菌纤维素的发酵方法，包括以下步骤：将产纤维素的细菌种子液接种至所述发酵培养基中，在20 L培养盘中发酵，得到细菌纤维素。

在本发明中，所述培养盘优选包括不锈钢深盘。所述不锈钢深盘的规格优选为长50 cm、宽35 cm、高15 cm。本发明对所述不锈钢深盘的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的20 L不锈钢深盘即可。

在本发明中，所述发酵培养基优选为含农作物废弃物水解液为碳源的发酵培养基

在本发明中，产纤维素的细菌种子液接种的接种量优选为1 %~2 %，更优选为1.5%。所述产纤维素的细菌为保藏编号优选为CGMCC No.6103的肠杆菌FY-07菌株。所述肠杆菌FY-07菌株已在公开号CN 111321184 A的专利中公开。

在本发明中，所述发酵的温度优选为28~32℃，更优选为30℃。所述发酵的时间优选为22~26 h，更优选为24 h。所述发酵优选包括培养盘堆叠发酵，有利于减少发酵占地面积，提高空间利用率。

在本发明中，所述发酵生产的细菌纤维素经水和碱液处理，去除杂质和菌体以及残留的培养基，浸泡至pH值为中性，得到细菌纤维素。经X射线衍射分析表明大规模生产不会影响细菌纤维素的结晶度，同时经过热重分析，结果表明，放大规模生产不会影响细菌纤维素的热降解行为。可见，采用本发明提供的发酵方法生产的细菌纤维素不仅产量高，而且品质佳，符合工业生产要求。

下面结合实施例对本发明提供的一种大规模高效生产细菌纤维素的发酵培养基及其发酵生产方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

对比例1

用HS发酵培养基培养肠杆菌FY-07生产细菌纤维素的方法

（1）将肠杆菌FY-07菌液划线于含有0.1 %刚果红的LB固体培养基平板，30℃培养24小时；所述LB固体培养基包括酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，pH值7.45；

（2）挑取红色且较大的单菌落密集划线于LB斜面培养基，30℃培养24小时；

（3）用提前灭菌好的100 ml蒸馏水冲洗步骤（2）得到的斜面培养基，反复冲洗直至斜面培养基上的包含大量细菌的细菌纤维素膜脱离，置于该蒸馏水中混匀作为种子液；

（4）将步骤（3）得到的种子液以1 %的接种量接种于装有90 ml HS发酵培养基的锥形瓶中，同时向发酵培养基中加入10 mL灭菌的25 g/L葡萄糖碳源；其中HS发酵培养基包括葡萄糖25 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉 7.5 g/L，无水磷酸氢二钠10 g/L；

（5）将步骤（4）得到的培养基放置于培养箱中，30℃培养发酵24小时；

（6）将步骤（5）发酵产生的细菌纤维素膜捞出，用水冲洗以去除大部分菌体及杂质；

（7）再用的0.5 M NaOH溶液于100℃条件下处理0.5小时，除去纤维素水合物中的菌体和残留培养基；

（8）之后多次水洗和浸泡直至pH为中性从而得到细菌纤维素湿膜。

使用高效液相色谱检测发酵完成后发酵液中剩余葡萄糖含量以计算糖转化率。

使用配有折射率检测器和6.5×300 mm Waters Sugar Pak I柱（Waters，Milford，MA，USA）的高压液相色谱（HPLC，安捷伦1100，美国）测量CSTH或发酵液中葡萄糖和木糖的量。洗脱液为 50 mg/L EDTA 钙二钠，流速为 0.5 mL/min。色谱柱保持在 85 ℃

使用以下公式I和公式II计算产率和糖转化率：

产率 (g/L/d)=

公式I

其中，重量(g)为冻干后的细菌纤维素膜的重量，体积 (L)为发酵培养基体积，时间 (d)为发酵时间（天）。

糖转化率 (%)=

公式II

其中，产量(g)为冻干后的细菌纤维素膜的重量，S0 (g)和Sf (g)分别代表初始糖含量和发酵最终糖含量。

结果表明，用肠杆菌FY-07可正常生产细菌纤维素，产率和糖转化率为1.62 g/L/d和7.57 %（参见图1）。

对比例2

用HS-XG发酵培养基培养肠杆菌FY-07生产细菌纤维素的方法

（1）将肠杆菌FY-07菌液划线于含有0.1 %刚果红的LB固体培养基平板，30℃培养24小时；

（3）用提前灭菌好的100ml蒸馏水冲洗步骤（2）得到的斜面培养基，反复冲洗直至斜面培养基上的包含大量细菌的细菌纤维素膜脱离，置于该蒸馏水中混匀作为种子液；

（4）将步骤（3）得到的种子液以1%的接种量接种于装有90ml HS-XG发酵培养基的锥形瓶中，同时向发酵培养基中加入10 mL灭菌的25g/L葡萄糖碳源；其中，HS-XG发酵培养基：黄原胶0.1 g/L，葡萄糖25 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉7.5 g/L，无水磷酸氢二钠10 g/L；黄原胶需最后添加，添加时应缓慢并伴随搅拌，添加完成后置于30℃振荡混匀直至完全溶解；

结果表明，采用该方法发酵，肠杆菌FY-07可正常生产细菌纤维素，产率和糖转化率为2.08 g/L/d和9.78%，参见图1、图2。

实施例1

用HS-XGK发酵培养基培养肠杆菌FY-07生产细菌纤维素的方法

（4）将步骤（3）得到的种子液以1 %的接种量接种于装有90ml含不同浓度硝酸钾的HS-XGK发酵培养基的锥形瓶中，同时向发酵培养基中加入10 mL灭菌的25 g/L葡萄糖碳源；其中，HS-XGK发酵培养基：硝酸钾，黄原胶0.1 g/L，葡萄糖25 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉7.5 g/L，无水磷酸氢二钠10 g/L；黄原胶需最后添加，添加时应缓慢并伴随搅拌，添加完成后置于30℃振荡混匀直至完全溶解；其中硝酸钾的浓度分别为0.1 g/L、0.5 g/L、1 g/L和2g/L；

（7）再用的0.5 M NaOH 溶液于100℃条件下处理0.5小时，除去纤维素水合物中的菌体和残留培养基；

结果见图2A~图2C。实验结果表明，使用添加0.1 g/L、0.5 g/L、1 g/L、2 g/L KNO₃的HS-XGK培养基在锥形瓶中分别进行发酵，细菌纤维素的产率分别为6.19 g/L/d、13.43g/L/d、17.13 g/L/d、15.92 g/L/d，糖转化率依次为40.69%、56.80%、70.31%、66.29%。

实施例2

1.碳源秸秆水解液的制备方法

（1）收集玉米秸秆于室温干燥，研磨玉米秸秆，使其颗粒大小不高于 0.425mm（40目）；

（2取玉米秸秆放置250 mL的摇瓶中，加入浓度为2 %的 H₂SO₄ 溶液，液固比为10：1(w/w)，在100℃进行玉米秸秆酸解1 h；

（3）待水解液冷却至室温后，用Ca(OH)₂ 溶液后调节水解液pH值至 4.8；将上述经过预处理后的水解液加入20 PUF的维素酶和30 IU 的β-葡糖苷酶，在50℃，150 rpm的条件下酶解72 h；

（4）将水解液转移至50 mL离心管中，9000 g离心10 min，去除不溶性固体，收集上清，用Ca(OH)₂溶液调整上清pH值至7.0；

（5）将上清中加入0.5 %(w/v)活性炭(100目)，使得悬浮液在150 rpm，45℃下搅拌60 min，然后通过离心或过滤系统将活性炭除去，从而去除玉米秸秆水解液中的蛋白质、酚类等杂质。由此得到的水解产物进行糖含量的测定，放置4℃下保存；

2.含碳源秸秆水解液的HS-XGK发酵培养基的制备方法

HS-XGK发酵培养基的配制：硝酸钾0.1g/L，黄原胶0.1 g/L，葡萄糖25 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉7.5 g/L，无水磷酸氢二钠10 g/L；准确称量上述质量的药品，溶解于水中，黄原胶最后添加，添加时应缓慢并伴随搅拌，添加完成后置于30℃振荡混匀直至完全溶解。将上述制备的5 L玉米秸秆水解液添加至45 L HS-XGK发酵培养中，搅拌充分，得到含碳源秸秆水解液的HS-XGK发酵培养基。

实施例3

采用肠杆菌FY-07小规模生产细菌纤维素的方法

（4）将步骤（3）得到的种子液以1%的接种量接种于100 ml含碳源秸秆水解液的HS-XGK发酵培养基的锥形瓶（溶积250 ml）中；

（8）之后多次水洗和浸泡直至pH为中性从而得到细菌纤维素湿膜。根据需要进行冷冻干燥，得到干燥的细菌纤维素膜。

使用高效液相色谱检测发酵完成后发酵液中剩余葡萄糖和木糖含量以计算糖转化率。

本发明采用以此方法发酵，肠杆菌FY-07可正常生产细菌纤维素，产率和糖转化率为14.35 g/L/d和 85.00%，参见图3。

实施例4

以秸秆水解液为碳源用HS-XGK发酵培养基在20L不锈钢深盘中培养肠杆菌FY-07以生产细菌纤维素

（3）从步骤（2）得到的斜面培养基上挑取部分含有大量活性细菌的薄细菌纤维素膜密集划线于LB斜面培养基，30℃培养24小时；

（4）用提前灭菌好的100ml蒸馏水冲洗步骤（3）得到的斜面培养基，反复冲洗直至斜面培养基上的包含大量细菌的细菌纤维素膜脱离，置于该蒸馏水中混匀作为种子液；

（5）将容积约为20 L、长宽高分别为50 cm、35 cm、15 cm的不锈钢带盖深盘置于紫外灯下12 h以进行灭菌；

（6）将步骤（4）得到的种子液以1 %的接种量接种于装有20L 含碳源玉米秸秆水解液的HS-XGK发酵培养基的不锈钢深盘中；

（7）将步骤（6）得到的深盘置于培养箱中，30℃培养发酵24 h；

（8）将步骤（7）发酵产生的细菌纤维素膜捞出，用水冲洗以去除大部分菌体及杂质；

（9）再用的0.5 M NaOH溶液于100℃条件下处理0.5小时，除去纤维素水合物中的菌体和残留培养基；

（10）之后多次水洗和浸泡直至pH为中性从而得到细菌纤维素，根据需要进行冷冻干燥处理，得到细菌纤维素。

以此方法进行发酵，肠杆菌FY-07可正常生产细菌纤维素，产率和糖转化率为13.96 g/L/d和85.50%，参见图4。

实施例5

对实施例4生产的细菌纤维素进行扫描电子显微镜（scanning electronmicroscopy，SEM）分析

将实施例4制备的细菌纤维素产品制备样品，以实施例3制备的在锥形瓶中生产得到的细菌纤维素为对照，使用QUANTA200扫描电子显微镜（FEI，俄勒冈州，美国）对试样进行了观察。

检测结果如图5所示。结果表明放大规模生产的细菌纤维素的微观结构与在锥形瓶中的一致，表明放大规模生产不会影响细菌纤维素的微观结构。

实施例6

对实施例4和实施例3生产的细菌纤维素进行X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）分析

用D/max-2500 X射线衍射仪（日本东京秋岛日谷公司）测定了冻冷干燥的放大规模生产得到的细菌纤维素产品的微晶指数（CrI），以在锥形瓶中生产得到的细菌纤维素为对照。工作电压和电流分别为40kv和30ma。从5°–60°2θ以每分钟2°的速度扫描样品。利用衍射数据带入公式III中计算CrI。

CrI（%）=[1-（IAM/I200）]×100% 公式III

其中，I200是2θ（约22.8°）峰值的整体强度，IAM是基线在2θ（18°）时的强度。

检测结果如图6所示。结果表明，实施例4和实施例3生产的细菌纤维素的结晶度分别为55.2%和50.6%，差异不大（差异低于5%），表明放大规模生产几乎不会影响细菌纤维素的结晶度。

实施例7

对实施例4和实施例3生产的细菌纤维素的热重分析（thermogravimetricanalysis，TGA）分析

用Q500型热重分析仪（TA仪器，Water LLC，New Castle，DE）对样品的热降解行为进行了评价。分析前，在流动氮气（20毫升/分钟）下冲洗TGA装置。以10℃/min的速率将每个样品（10 mg冻干样品）从室温加热至800℃。

检测结果如图7所示。结果表明放大规模生产几乎不会影响细菌纤维素的热降解行为。

由上述实施例结果可知，本发明通过向HS-XG发酵培养基中添加电子受体KNO₃，得到HS-XGK培养基有利于提高肠杆菌FY-07菌株的发酵效果，大大提高细菌纤维素的产率和糖转化率。同时本发明以20L不锈钢深盘为发酵容器，进一步向所述HS-XGK中添加碳源农作物废弃物水解液，向得到含水解液的HS-XGK培养基中接种肠杆菌FY-07菌株，能够实现放大规模的生产细菌纤维素的目的。本发明提供的发酵方法，与现有技术相比，不仅大大提高细菌纤维素的产量，而且提高了糖转化率，提高原料率同时降低生产成本。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种大规模高效生产细菌纤维素的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

将产纤维素的细菌种子液接种至HS-XGK发酵培养基中，在20L培养盘中发酵，得到细菌纤维素；

所述HS-XGK发酵培养基以HS-XG发酵培养基为基础培养基，还包括1g/L的硝酸钾；所述HS-XG发酵培养基以1L计，包括以下原料：黄原胶0.1 g、葡萄糖25g/L、酵母粉7.5 g、蛋白胨10 g、Na₂HPO₄ 10 g和余量的水；

所述HS-XGK发酵培养基中碳源替换为农作物废弃物水解液；

在所述HS-XGK发酵培养基中，所述农作物废弃物水解液的终体积百分含量为8％～12％；

所述培养盘为不锈钢深盘；

所述不锈钢深盘的规格为长50cm、宽35cm、高15cm；

所述产纤维素的细菌为保藏编号为CGMCC No.6103的肠杆菌FY-07菌株。

2.根据权利要求1所述发酵方法，其特征在于，所述农作物废弃物水解液的制备方法，包括以下步骤：

1)将农作物废弃物粉经酸解后，用纤维素酶和β-葡糖苷酶进行酶解，得到水解液；

2)将所述水解液依次去除不溶性固体和杂质，得到农作物废弃物水解液。

3.根据权利要求1所述发酵方法，其特征在于，产纤维素的细菌种子液接种的接种量为1％～2％。

4.根据权利要求1所述发酵方法，其特征在于，所述发酵的温度为28～32℃；

所述发酵的时间为22～26h。

5.根据权利要求1所述发酵方法，其特征在于，所述发酵包括培养盘堆叠发酵。