CN115181703B - 一种西索米星生产用小单孢菌快速生长的固体培养基 - Google Patents
一种西索米星生产用小单孢菌快速生长的固体培养基 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种西索米星生产用小单孢菌快速生长的固体培养基，所述的培养基成分包括特定的微生物多糖(黄原胶、结冷胶、胶质芽孢杆菌多糖、环状糊精等)、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、DL‑天冬素、钾盐(磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸三钾)、镁离子(硫酸镁、氯化镁)、碳酸钙和琼脂。本发明所述的固体培养基可供小单孢菌快速生长，并产生高活力小单孢菌种子。本发明的培养基与常用的培养基相比，成分更加简单，且培养时间大大缩短了。该培养基大大缩短了小单孢菌种子的培养时间，降低了西索米星发酵生产的时间成本，对西索米星的生产具有极其显著的经济意义。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种西索米星生产用小单孢菌快速生长的固体培养基。
背景技术
西索米星(Sisomicin)，中文别名为西梭霉素、西苏霉素、紫苏霉素等，是一种天然的氨基糖苷类抗生素，其生产菌株多为小单孢菌属。西索米星的抗菌谱、药代动力学和毒性类似于庆大霉素。但与庆大霉素相比，西索米星具有较好的保护动物免受致命假单胞菌感染的能力。西索米星对假单胞菌的体外活性是庆大霉素或阿米卡星的2-8倍，与妥布霉素相似。在治疗动物感染假单孢菌上，西索米星的剂量平均比妥布霉素低5倍，比庆大霉素低3倍。西索米星的最低抑制浓度通常为10pg·ml-1。西索米星与多种青霉素具有协同作用，对许多假单胞菌具有抗菌作用，包括对庆大霉素耐药的菌株。西索米星和其他氨基糖苷类药物之间的交叉抗性程度取决于不同的机制。虽然许多具有灭活酶的菌株对西索米星、庆大霉素和妥布霉素都有抗性，但由于西索米星的高固有效价，它对许多因其不渗透性而对其他氨基糖苷类产生耐药性的菌株具有活性。西索米星对约66％的对庆大霉素、妥布霉素或阿米卡星耐药的菌株有活性。西索米星的人体药理作用与庆大霉素相似，在临床试验上一样有效，在某些情况下甚至更有效，但西索米星的不良反应率与庆大霉素或妥布霉素的不良反应率相当。在低于庆大霉素的剂量下，庆大霉素耐药的假单胞菌对西索米星有反应。此外，一些对庆大霉素或妥布霉素无效的感染病已经成功地使用西索米星治疗。由于西索米星在体内外均有很高的内在效力，且具有化学性质稳定、价格低和抗菌领域广范等优势，可能成为治疗敏感菌株引起的严重假单胞菌感染的首选药物。
小单孢菌属分类上属于放线菌，为革兰氏阳性菌。小单孢菌广泛分布于自然界中，尤其在富营养的土壤中大量存在。其形态为纤细的菌丝体，不存在气生菌丝，菌丝的孢子梗上不存在多个孢子。小单孢菌的次级代谢产物种类丰富且价值较大，如氨基糖苷类和大环酰胺类等多种抗生素以及生物碱等具有抗肿瘤活性的化合物。小单孢菌除了可以产生新霉素等抗生素，还可以产生庆大霉素和西索米星等抗生素。小单孢菌已经成为新发现的抗生素的菌种第一位，其产生的抗生素已经超过了一百种。
目前，小单孢菌已经在工业上被用于发酵生产西索米星，常规技术上小单孢菌斜面生长过程中所使用的培养基主要成分非常复杂，其主要成分为：玉米淀粉、麦芽糖、酵母粉、KNO3、KH2PO4、DL-天冬素、CaCO3、MgCl2、琼脂粉、麸皮。但由于其生长比较缓慢且发酵单位较低，所以其生产成本相对较高，因此缩短小单孢菌发酵周期和提高其发酵单位是降低生产成本最有效的手段。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种西索米星生产用小单孢菌快速生长的固体培养基，使用添加微生物多糖的固体培养基替代传统斜面培养基作为小单孢菌菌丝体生长的固体培养基，极大的缩短了发酵过程中种子培养的时间。
技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明的第一个目的是，提供一种西索米星生产用依尼奥小单孢菌快速生长的固体培养基，所述培养基包括微生物多糖，所述微生物多糖包括黄原胶、结冷胶、胶质芽孢杆菌多糖、环状糊精其中任意至少一种。
微生物多糖，也称作微生物发酵多糖，是由细菌和真菌(包括霉菌和酵母菌)合成的食用胶，已经在食品工业中应用的有红曲霉多糖、黄杆菌胶、茁霉胶α-葡聚糖和环状糊精。本发明使用微生物多糖替代了传统培养基中的可溶性淀粉和麦芽糖，一方面可以作为培养基中的碳源，以保证小单孢菌菌丝体的生长，另一方面微生物多糖胶质的状态更利于菌丝体的形成。属于微生物在碳源极度匮乏的环境下，缺乏可迅速利用的碳源，从而调动了一些环境适应因子，促进了胞外微生物多糖水解酶以及菌丝体生长分裂过程中关键酶的表达，从而使其生长速度相对于传统培养基的得到了明显提升。
可选的，在本发明的一种实施方式中，所述微生物多糖在配置培养基时，提前2-3h溶于水中使其充分的溶解于水中。
可选的，在本发明的一种实施方式中，所述微生物多糖的浓度为5-10g/L。
可选的，在本发明的一种实施方式中，所述微生物多糖的浓度为6-9g/L。
可选的，在本发明的一种实施方式中，所述微生物多糖的浓度为7-8g/L。
可选的，在本发明的一种实施方式中，所述微生物多糖的浓度为7.5g/L。
可选的，在本发明的一种实施方式中，所述微生物多糖的分子量为1500-2000kDa。
可选的，在本发明的一种实施方式中，所述培养基还包括DL-天冬素、蛋白胨、酵母粉。
可选的，在本发明的一种实施方式中，所述培养基还包括0.1-0.3g/L DL-天冬素、3-10g/L蛋白胨、3-10g/L酵母粉。
可选的，在本发明的一种实施方式中，所述培养基还包括磷酸盐、镁离子盐、碳酸钙及琼脂。
可选的，在本发明的一种实施方式中，所述培养基还包括1-3g/L磷酸盐、1-3g/L镁离子盐、1-3g/L碳酸钙及20g/L琼脂。
可选的，在本发明的一种实施方式中，所述培养基还包括1g/L磷酸盐、1g/L镁离子盐、3g/L碳酸钙及20g/L琼脂。
可选的，在本发明的一种实施方式中，所述磷酸盐包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸三钾其中任意至少一种。在传统的一般培养基中，通常使用KNO3作为钾盐来源，但其对菌株的生长并没有明显的促进作用，且为危化品，所以本发明将其替换成了常用的磷酸钾盐类，如磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸三钾等，更加安全。
可选的，在本发明的一种实施方式中，所述镁离子盐包括硫酸镁、氯化镁其中任意至少一种。
可选的，在本发明的一种实施方式中，固体培养基的组成如下：微生物多糖(胶质芽孢杆菌多糖、黄原胶、结冷胶)、DL-天冬素、蛋白胨、酵母粉、磷酸盐(磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸三钾)、镁离子盐(氯化镁、硫酸镁)、碳酸钙、琼脂。
本发明的第二个目的是，提供一种小单孢菌代谢生产西索米星的方法，该方法的固体培养基采用如上述的培养基。
可选的，在本发明的一种实施方式中，所述小单孢菌代谢生产西索米星的方法包括以下步骤：
S1、将实验室保藏菌株西索米星产生菌涂布于上述的包含有微生物多糖的固体培养基，34-35℃培养2-3d；
S2、接入一级种子培养基中，34-35℃、250-260rpm摇床培养40-48h；
S3、10％接种量接种到二级种子培养基中，34-35℃、250-260rpm摇床培养40-48h得高活力种子液；
S4、10％接种量接种到发酵培养基中，34-35℃、250-260rpm培养得发酵产物，即为西索米星。
可选的，在本发明的一种实施方式中，所述小单孢菌代谢生产西索米星的方法包括以下步骤：
S1、将西实验室保藏菌株索米星产生菌涂布于上述的包含有微生物多糖的固体培养基，34℃培养2-3d；
S2、接入一级种子培养基中，34℃、260rpm摇床培养48h；
S3、10％接种量接种到二级种子培养基中，34℃、260rpm摇床培养48h得高活力种子液；
S4、10％接种量接种到发酵培养基中，34℃、260rpm培养得发酵产物，即为西索米星。
本发明的第三个目的是，提供一种西索米星，根据上述的方法制备得到。
有益效果：本发明提供的西索米星生产用小单孢菌快速生长的固体培养基，与现有技术相比，具有以下优势：
1、与传统的斜面培养基相比成分更加简单，且无易制爆成分KNO3；
2、将菌丝体培养的时间由12-15天缩短到了2-3天，极大的缩短了发酵过程中种子培养的时间；
3、可得到高活力的小单孢菌种子。
附图说明
图1为西索米星标品的HPLC色谱图。
图2为本发明实施例1所得发酵样品的HPLC色谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
下述实施例中所用的培养基成分均可从市场上购买得到。
实施例1西索米星产生菌高活力种子的微生物多糖培养基快速培养
S1、将实验室保藏菌株西索米星产生菌Micromonospora inyoensis I4-10涂布于固体培养基，培养基成分为：1800kDa分子量的5g/L结冷胶、0.1g DL-天冬素、3g/L蛋白胨、3g/L酵母粉、1g/L磷酸氢二钾、1g/L氯化镁、3g/L碳酸钙、20g/L琼脂，34℃培养3d；结冷胶在配置培养基时，提前3h溶于水中使其充分的溶解于水中；
S2、接入一级种子培养基中，34℃、260rpm摇床培养48h；
S3、10％接种量接种到二级种子培养基中，34℃、260rpm摇床培养48h可得到高活力种子液；
S4、10％接种量接种到发酵培养基中，34℃、260rpm培养144h可得到发酵产物，所得发酵产物经高效液相色谱检测鉴定为西索米星，如图1、2所示。
实施例2西索米星产生菌高活力种子的微生物多糖培养基快速培养
S1、将实验室保藏菌株西索米星产生菌Micromonospora inyoensis I4-10涂布于固体培养基，培养基成分为：1800kDa分子量的7.5g/L结冷胶、0.1g DL-天冬素、5g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、1g/L磷酸三钾、1g/L硫酸镁、3g/L碳酸钙、20g/L琼脂，34℃培养3d；结冷胶在配置培养基时，提前3h溶于水中使其充分的溶解于水中；
S2、接入一级种子培养基中，34℃、260rpm摇床培养48h；
S3、10％接种量接种到二级种子培养基中，34℃、260rpm摇床培养48h可得到高活力种子液；
S4、10％接种量接种到发酵培养基中，34℃、260rpm培养144h可得到发酵产物，同实施例1，经鉴定，该发酵产物为西索米星。
实施例3西索米星产生菌高活力种子的微生物多糖培养基快速培养
S1、将实验室保藏菌株西索米星产生菌Micromonospora inyoensis I4-10涂布于固体培养基，培养基成分为：1800kDa分子量的10g/L结冷胶、0.1g DL-天冬素、8g/L蛋白胨、8g/L酵母粉、1g/L磷酸二氢钾、1g/L硫酸镁、3g/L碳酸钙、20g/L琼脂，34℃培养3d；结冷胶在配置培养基时，提前2h溶于水中使其充分的溶解于水中；
S2、接入一级种子培养基中，34℃、260rpm摇床培养48h；
S3、10％接种量接种到二级种子培养基中，34℃、260rpm摇床培养48h可得到高活力种子液；
S4、10％接种量接种到发酵培养基中，34℃、260rpm培养144h可得到发酵产物，同实施例1，经鉴定，该发酵产物为西索米星。
实施例4西索米星产生菌高活力种子的微生物多糖培养基快速培养
S1、将实验室保藏菌株西索米星产生菌Micromonospora inyoensis I4-10涂布于固体培养基，培养基成分为：1500kDa分子量的7.5g/L黄原胶、0.1g DL-天冬素、8g/L蛋白胨、8g/L酵母粉、1g/L磷酸二氢钾、1g/L硫酸镁、3g/L碳酸钙、20g/L琼脂，34℃培养3d。
S2、接入一级种子培养基中，34℃、260rpm摇床培养48h；
S3、10％接种量接种到二级种子培养基中，34℃、260rpm摇床培养48h可得到高活力种子液；
S4、10％接种量接种到发酵培养基中，34℃、260rpm培养144h可得到发酵产物，同实施例1，经鉴定，该发酵产物为西索米星。
实施例5西索米星产生菌高活力种子的微生物多糖培养基快速培养
S1、将实验室保藏菌株西索米星产生菌Micromonospora inyoensis I4-10涂布于固体培养基，培养基成分为：2000kDa分子量的7.5g/L胶质芽孢杆菌多糖、0.1g DL-天冬素、8g/L蛋白胨、8g/L酵母粉、1g/L磷酸二氢钾、1g/L硫酸镁、3g/L碳酸钙、20g/L琼脂，35℃培养3d；胶质芽孢杆菌多糖在配置培养基时，提前3h溶于水中使其充分的溶解于水中；
S2、接入一级种子培养基中，35℃、260rpm摇床培养48h；
S3、10％接种量接种到二级种子培养基中，35℃、260rpm摇床培养48h可得到高活力种子液；
S4、10％接种量接种到发酵培养基中，35℃、260rpm培养144h可得到发酵产物，同实施例1，经鉴定，该发酵产物为西索米星。
实施例6西索米星产生菌高活力种子的微生物多糖培养基快速培养
S1、将实验室保藏菌株西索米星产生菌Micromonospora inyoensis I4-10涂布于固体培养基，培养基成分为：2000kDa分子量的10g/L环状糊精、0.1g DL-天冬素、8g/L蛋白胨、8g/L酵母粉、1g/L磷酸二氢钾、1g/L硫酸镁、3g/L碳酸钙、20g/L琼脂，35℃培养3d；环状糊精在配置培养基时，提前2.5h溶于水中使其充分的溶解于水中；
S2、接入一级种子培养基中，35℃、250rpm摇床培养48h；
S3、10％接种量接种到二级种子培养基中，35℃、250rpm摇床培养48h可得到高活力种子液；
S4、10％接种量接种到发酵培养基中，35℃、250rpm培养144h可得到发酵产物，同实施例1，经鉴定，该发酵产物为西索米星。
对比例西索米星产生菌高活力种子的传统斜面培养基培养
S1、将实验室保藏菌株西索米星产生菌Micromonospora inyoensis I4-10涂布于传统斜面培养基，培养基成分为：10g麦芽糖、0.1g DL-天冬素、8g/L蛋白胨、8g/L酵母粉、1g/L磷酸二氢钾、1g/L氯化镁、3g/L碳酸钙、20g/L琼脂，34℃培养12d。
S2、接入一级种子培养基中，34℃、260rpm摇床培养48h；
S3、10％接种量接种到二级种子培养基中34℃、260rpm摇床培养48h可得到高活力种子液；
S4、10％接种量接种到发酵培养基中34℃、260rpm培养可得到发酵产物同实施例1，经鉴定，该发酵产物为西索米星。
对以上实施例采用微生物多糖培养基与对比例采用传统斜面培养基的种子菌浓以及发酵产量分别进行测定。
菌浓的测定方法为：取15mL菌液离心，弃尽上清，测量湿重即为菌浓。
发酵产量的测定方法为：采用98％的浓硫酸调节发酵液pH至1.5～2之间，静置20min后过滤取滤液，参照《中国药典》的方法，采用管碟法测定西索米星的生物效价。
以实施例1-3为例，其与对比例的对比结果如下表1所示。
表1微生物多糖培养基相比与传统斜面培养基的种子培养以及发酵产量的对比
| 传统斜面培养基 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | |
| 菌株生长时间(天) | 12 | 3 | 3 | 3 |
| 48h种子培养基菌浓 | 100 | 91 | 105 | 96 |
| 发酵产量 | 100 | 86 | 108 | 93 |
(注：设定传统斜面培养基菌浓和产量为100，实施例中皆为相对值。)
从表1的结果可以看出，与对比例的传统斜面培养基相比，本发明实施例1-3的培养方法得到的种子液的菌浓以及发酵液的发酵产量都与传统种子培养方法相比并无明显的变化，但发酵周期缩短了10天左右，大大降低了时间成本。尤其是实施例2获得了相较于传统种子培养方法更高的种子活力及发酵产量。
经检测，实施例4-6得到的种子液的菌浓以及发酵液的发酵产量均与实施例1-3相似，说明本发明的技术方案可大大缩短发酵周期，并能获得更高的种子活力及发酵产量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种西索米星生产用小单孢菌快速生长的固体培养基，其特征在于，所述培养基的组分由微生物多糖、DL-天冬素、蛋白胨、酵母粉、磷酸盐、镁离子盐、碳酸钙、琼脂及水组成，所述微生物多糖选自1500kDa分子量的黄原胶、1800kDa分子量的结冷胶、2000kDa分子量的环状糊精其中任意一种，所述磷酸盐选自磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸三钾其中任意一种，所述镁离子盐选自硫酸镁、氯化镁其中任意一种，所述微生物多糖在配置培养基时，提前2-3h溶于水中使其充分溶解，所述培养基中，所述黄原胶或结冷胶或环状糊精的浓度分别为7.5g/L，5g/L或7.5g/L或10g/L，10g/L。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基中，DL-天冬素的浓度为0.1-0.3g/L，蛋白胨的浓度为3-10g/L，酵母粉的浓度为3-10g/L。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基中，磷酸盐的浓度为1-3g/L，镁离子盐的浓度为1-3g/L，碳酸钙的浓度为1-3g/L，琼脂的浓度为20g/L。
4.一种小单孢菌发酵生产西索米星的方法，其特征在于，该方法将西索米星产生菌涂布于如权利要求1～3任一所述的固体培养基上，再依次接入一级种子培养基、二级种子培养基及发酵培养基中，以获得发酵产物西索米星。
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| GR01 | Patent grant | ||
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