CN111961699A - 一种绛红小单孢菌短周期发酵生产低杂质庆大霉素的方法 - Google Patents

一种绛红小单孢菌短周期发酵生产低杂质庆大霉素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种绛红小单孢菌短周期发酵生产低杂质庆大霉素的方法，包括孢子斜面培养基、一级种子培养基、二级种子培养基、三级种子培养基和发酵培养基，该方法发酵原辅料便宜，发酵周期短，产率高，杂质少，解决了下游工序纯化难、收率低的问题，满足制备符合2020年版《中国药典》要求的硫酸庆大霉素。

Description

一种绛红小单孢菌短周期发酵生产低杂质庆大霉素的方法
技术领域
本发明属于抗生素发酵领域，特别涉及一种绛红小单孢菌短周期发酵生产低杂质庆大霉素的方法。
背景技术
庆大霉素是由放线菌素属绛红小单孢菌、棘小单孢菌产生的一组结构相近的多组分的氨基糖苷类抗生素，以C族复合物(C1，C2，C1a，C2a)为主，还含有结构相似的西索米星、小诺霉素(C2b)、庆大霉素A、A1、A3、B、B1、X2等多种小组分，庆大霉素中各组分和小组分活性和毒性各不相同，对庆大霉素的质量控制不仅要进行组分测定，亦要严格控制其中的有关物质，减少毒副作用，保证用药安全。庆大霉素发酵培养基由淀粉、玉米粉、葡萄糖、黄豆饼粉、蛋白胨、硫酸铵、硝酸钾、氯化钴、碳酸钙等组成。硫酸庆大霉素的生产成本中，发酵部分占70％以上。
在庆大霉素生产过程中，由于庆大霉素是微生物的次级代谢产物，种子质量、温度、pH值、溶氧、培养基中碳源、氮源、无机盐等因素影响庆大霉素发酵，使得庆大霉素的发酵过程变得复杂而难以控制。庆大霉素发酵过程是微生物、化学和工程等学科的理论和技术的综合利用，其生化反应过程机理复杂,表现出的动态行为复杂多变，对庆大霉素质量特别是组分以及有关物质控制的必然困难，庆大霉素产品中各个组分的比例与生产菌种和发酵工艺有关，不同的发酵菌种、培养基配方、发酵工艺和后期提炼精制等因素对产品质量产生较大影响。目前国内发酵生产庆大霉素，存在的主要问题是：
1、庆大霉素发酵培养基和生产工艺传统单一，发酵单位基本在1200-1500μ/ml，发酵产率偏低，生产成本偏高。
2、庆大霉素发酵罐发酵周期较长，一般在110-160小时。
3、使用现有发酵培养基和传统生产工艺进行发酵生产庆大霉素，杂质偏高，极大降低了提取纯化收率，甚至很难持续稳定生产符合2020年版《中国药典》的硫酸庆大霉素。
发明内容
本发明的目的就是克服上述现有技术中的缺陷，提供一种有效提高庆大霉素发酵单位，缩短发酵周期，降低生产成本，同时解决庆大霉素发酵生产中杂质高的问题的庆大霉素的培养基和培养方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种绛红小单孢菌短周期发酵生产低杂质庆大霉素的方法，包括以下步骤：
1)用无菌接种棒挑取庆大霉素砂土孢子或成熟母瓶孢子于茄子瓶斜面培养基进行孢子培养，培养温度36.5-37.5℃，培养时间9-10天，培养好的孢子斜面，保存于冰箱2-8℃待用；
2)将步骤1)制备的庆大霉素孢子斜面严格按无菌操作，将50-60ml无菌水倒入单支斜面进行刮孢子，然后收集到经灭菌的三角瓶中，制得孢悬液；
3)将步骤2)制备的孢悬液在火焰保护下接种于灭菌后的一级种子培养基进行一级种子培养，孢悬液接种量按一级种子培养基体积的0.04％-0.08％接种，培养温度36-37℃，培养时间48-54小时，罐压0.04-0.06Mpa,空气流量1：1.2-2.0[V/(V·min)]，得到庆大霉素一级种子；
4)将步骤3)制备的庆大霉素一级种子接种于灭菌后的二级种子培养基进行二级种子培养，接种量按二级种子培养基体积的8％-15％接种，培养温度35-37℃，培养时间36-42小时，罐压0.03-0.05Mpa,空气流量1：1.0-1.5[V/(V·min)]，得到庆大霉素二级种子；
5)将步骤4)制备的庆大霉素二级种子接种于灭菌后的三级种子培养基进行三级种子培养，接种量按三级种子培养基体积的20％-30％接种，培养温度35-37℃，培养时间20-24小时，罐压0.03-0.05Mpa,空气流量1：1.0-1.2[V/(V·min)]，得到庆大霉素三级种子；
6)将步骤5)制备的庆大霉素三级种子接种于灭菌后的发酵培养基进行发酵培养，接种量按发酵培养基体积40％的接种，发酵时间70-90小时，罐压0.01-0.03Mpa,空气流量1：0.6-1.0[V/(V·min)]，0-30小时培养温度35-37℃，用无菌液碱控制pH6.5-7.2；25-35小时后培养温度34-35℃,用无菌液碱控制pH7.0-7.8，在25-35小时补加一次732树脂，在50-60小时再次补加732树脂，通过732树脂吸附得到庆大霉素发酵产物。
进一步的，所述步骤1)中，茄子瓶斜面培养基的配方组成按质量体积分数计为：玉米淀粉0.50％-0.80％，小麦麸皮溶磷小于5000PPM、淀粉含量小于15％的小麦麸皮1.5％-2.0％，琼脂1.5％-2.0％，天冬素0.001％-0.0013％，轻质碳酸钙0.08％-0.12％，硝酸钾0.08％-0.12％，氯化钠0.03％-0.08％，硫酸镁0.03％-0.08％，磷酸氢二钾0.02％-0.05％，余量为水；
进一步的，所述步骤1)具体包括如下步骤：
a、茄子瓶斜面培养基的配制：琼脂按配制总量称好后，放入烧杯内，加入定量的注射用水或蒸馏水煮沸溶解，除轻质碳酸钙外的其它成份均按配制量称好调匀后，倒入煮沸的琼脂水中，搅匀溶解，pH值消前调至7.2-8.0，然后加入称好轻质碳酸钙，搅拌均匀，分装于容量为250ml的茄子瓶中，每瓶60ml；
b、茄子瓶斜面培养基的灭菌：分装好的茄子瓶培养基用0.11±0.01Mpa、121℃的蒸汽灭菌30min，灭菌结束时，待温度降至70℃以下，取出培养基，摇匀即可摆成斜面，待用；
c、孢子接种与培养：将无菌操作用的无菌培养基及无菌操作的全部所用工器具解开包布放入传递窗，经紫外灯照射一小时后放入操作台，于超净台上，在火焰保护下用无菌接种棒挑取砂土孢子于茄子瓶斜面培养基内，先划中线，后从内到外往两边划线均匀铺开，塞好棉塞，用牛皮纸包好扎紧瓶口，置于36.5-37.5℃温度恒温间培养9-10天；
d、斜面孢子保存:2～8℃冰箱保存，待用。
进一步的，所述步骤2)中，将60ml纯化水倒入300ml的三角瓶中，扎口用0.11±0.01Mpa、121℃的蒸汽灭菌处理30min，冷却至室温，待用；将无菌操作用的无菌培养基及无菌操作的全部所用工器具解开包布放入传递窗，经紫外灯照射一小时后放入操作台；于超净台上，严格按无菌操作，将50-60ml无菌水倒入斜面进行刮孢子，然后收集到经灭菌的空三角瓶中，逐瓶操作。
进一步的，所述步骤3)中，一级种子培养基的配方组成按质量体积分数计为：葡萄糖0.05％-0.15％，玉米淀粉0.4％-1.0％，玉米粉1.0％-2.0％，蛋白胨0.3％-0.8％，冷榨的黄豆饼粉1.0％-2.0％，硝酸钾0.03％-0.08％，六水合氯化钴0.0005％-0.0010％，轻质碳酸钙0.40％-1.0％，消沫剂0.01％-0.02％,余量为水；一级种子培养基使用前，用0.11±0.01Mpa、121℃的蒸汽灭菌处理30min，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
进一步的，所述步骤4)中，二级种子培养基的配方组成按质量体积分数计为：玉米淀粉3.0％-4.0％，玉米粉1.0％-2.0％，蛋白胨0.3％-0.8％，冷榨的黄豆饼粉2.0％-4.0％，硝酸钾0.006-0.015％，硫酸铵0.06％-0.15％，六水合氯化钴0.0006％-0.0015％，轻质碳酸钙0.5％-1.0％，淀粉酶0.005％-0.010％，消沫剂0.015％-0.030％,余量为水；二级种子培养基使用前，用0.11±0.01Mpa、121℃的蒸汽灭菌处理30min，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
进一步的，所述步骤5)中，三级种子培养基的配方组成按质量体积分数计为：玉米淀粉3.0％-4.0％，玉米粉1.0％-2.0％，蛋白胨0.3％-0.8％，冷榨的黄豆饼粉2.0％-4.0％，硝酸钾0.006-0.015％，硫酸铵0.06％-0.15％，六水合氯化钴0.0006％-0.0015％，轻质碳酸钙0.5％-1.0％，淀粉酶0.005％-0.010％，消沫剂0.015％-0.030％,余量为水；三级种子培养基使用前，用0.11±0.01Mpa、121℃的蒸汽灭菌处理30min，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
进一步的，所述步骤6)中，发酵培养基的配方组成按质量体积分数计为：玉米淀粉5.0％-7.0％，玉米粉0.50％-1.50％，蛋白胨0.50％-0.80％，冷榨的黄豆饼粉2.0％-4.0％，硝酸钾0.006-0.015％，硫酸铵0.06％-0.15％，六水合氯化钴0.0006％-0.0015％，轻质碳酸钙0.5％-1.0％，淀粉酶0.005％-0.010％，消沫剂0.02％-0.05％,余量为水；三发酵培养基使用前，用0.11±0.01Mpa、121℃的蒸汽灭菌处理30min，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
进一步的，所述步骤6)中：发酵罐培养条件为：
a、温度控制：0-30小时培养温度35-37℃，30小时后培养温度34-35℃；
b、pH控制：0-30小时通过补入无菌液碱控制pH6.5-7.2，30小时后通过补入无菌液碱控制pH7.2-7.8；
c、罐压控制：发酵全程控制罐压0.01-0.03Mpa；
d、空气流量：0-15小时空气流量1：0.8-1.0[V/(V·min)]，15-60小时空气流量1：1.0-1.2[V/(V·min)]，60小时-放罐空气流量1：0.6-0.8[V/(V·min)]；
e、搅拌转速：0-15小时变频控制搅拌转速80-100rpm，15-60小时变频控制搅拌转速120-150rpm，60小时-放罐变频控制搅拌转速90-120rpm；
f、溶解氧：通过调节搅拌转速和空气流量，全程控制溶解氧20％以上；
g、发酵周期：70-80小时；
h、在发酵过程中，25-35h补入消毒处理的732树脂，补入732树脂数量按发酵培养基体积的0.8％-1.2％,50-60h再次补入消毒处理的732树脂，补入732树脂数量按发酵培养基体积的1.2％-2.0％。
相对于现有技术，本发明所述的绛红小单孢菌短周期发酵生产低杂质庆大霉素的方法具有以下优势：
1、本发明在种子制备阶段直接采用斜面孢子悬液接种于一级种子罐，减少了斜面孢子培养制备摇瓶菌丝，进而摇瓶菌丝接种于一级种子罐的中间环节，优化了生产工艺流程，减少了种子制备中的染菌风险。
2、发酵过程中补入732树脂，可以吸附发酵培养物中的庆大霉素，减少绛红小单孢菌庆大霉素生物合成的反馈抑制作用，增加绛红小单孢菌的庆大霉素合成分泌，从而提高了发酵单位，采用该工艺发酵生产庆大霉素，发酵单位可以达到2300μ/ml以上。
3、发酵单位高，发酵成本低。首先，培养基中的黄豆饼粉(冷榨)产量较大，市场价格较低，增加黄豆饼粉(冷榨)用量，减少或替代部分动物性来源蛋白(蛋白胨、鱼粉)，可以降低发酵原材料成本8％。其次发酵单位由1200-1500μ/ml提高到1900-2300μ/ml，因发酵单位提高一项可直接降低40％以上的发酵生产成本。
4、发酵周期短。目前国内庆大霉素发酵平均周期在110-160小时，而采用本发明的培养基和培养方法，突出创新点是由传统三级发酵工艺革新为四级发酵工艺，缩短发酵罐发酵周期至70-80小时，不仅提高了设备利用率，并且同时大幅度提高发酵单位，极大的提高了平均生产能力，即使相同发酵水平，仅缩短发酵周期一项可增加单罐产量180％以上。
5、采用本发明提供的庆大霉素培养基和培养法能够明显降低庆大霉素中的杂质，有利于解决提取纯化难、收率低的问题，满足制备2020年版《中国药典》硫酸庆大霉素的要求。
具体验证数据如表1，表1为改进发酵工艺前后的发酵水平对比数据。
表1
Figure BDA0002655474800000051
表2
Figure BDA0002655474800000052
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为传统方法工艺与本发明的流程对比图；
图2为本发明对比例1的HPLC-ELSD检测数据图；
图3为本发明实施例1的HPLC-ELSD检测数据图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
实施例1
一种绛红小单孢菌短周期发酵生产低杂质庆大霉素的方法，包括以下步骤：
1)用无菌接种棒挑取庆大霉素砂土孢子(或成熟母瓶孢子)于茄子瓶斜面培养基进行孢子培养，培养温度36.5-37.5℃，培养时间10天。培养好的孢子斜面，保存于冰箱2-8℃待用。
庆大霉素茄子瓶斜面孢子制备方法为：
a、茄子瓶斜面培养基的配方组成为(W/V)：玉米淀粉0.75％，小麦麸皮1.8％(溶磷小于5000PPM，淀粉含量小于15％)，琼脂1.8％，天冬素0.002％，轻质碳酸钙0.10％，硝酸钾0.10％，氯化钠0.05％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.03％，余量为水[本实施例实施具体为玉米淀粉7.5g，小麦麸皮18.0g(溶磷小于5000PPM，淀粉含量小于15％)，琼脂18.0g，天冬素0.02g，轻质碳酸钙1.0g，硝酸钾1.0g，氯化钠0.5g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾0.3g,水1L]。
b、茄子瓶斜面培养基的配制：琼脂按配制总量称好后，放入烧杯内，加入定量的注射用水或蒸馏水煮沸溶解。其它成份(除轻质碳酸钙)均按配制量称好调匀后，倒入煮沸的琼脂水中，搅匀溶解，pH值消前调至7.2-8.0，然后加入称好轻质碳酸钙，搅拌均匀，分装于茄子瓶(容量250ml)中，每瓶60ml。
c、茄子瓶斜面培养基的灭菌：分装好的茄子瓶培养基进行湿热灭菌(0.11±0.01Mpa、121℃，30min)，灭菌结束时，待温度降至70℃以下，取出培养基，摇匀即可摆成斜面，待用。
d、孢子接种与培养：将无菌操作用的无菌培养基及无菌操作的全部所用工器具解开包布放入传递窗，经紫外灯照射一小时后放入操作台。于超净台上，在火焰保护下用无菌接种棒挑取砂土孢子于茄子瓶斜面培养基内，先划中线，后从内到外往两边划线均匀铺开，塞好棉塞，用牛皮纸包好扎紧瓶口，置于36.5-37.5℃温度恒温间培养10天。
e、斜面孢子保存:2～8℃冰箱保存，待用。
2)将步骤1)中制备的庆大霉素孢子斜面严格按无菌操作，将60ml纯化水倒入300ml三角瓶中，扎口于0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至室温，待用。将无菌操作用的无菌培养基及无菌操作的全部所用工器具解开包布放入传递窗，经紫外灯照射一小时后放入操作台。于超净台上，严格按无菌操作，将50-60ml无菌水倒入斜面进行刮孢子，然后收集到经灭菌的空三角瓶中，逐瓶操作。
3)将步骤2)制备的孢悬液在火焰保护下接种于灭菌后的一级种子培养基进行一级种子培养，接种量(孢悬液)按一级种子培养基的0.06％接种，培养温度36℃，培养时间48-54小时，罐压0.04-0.06Mpa,空气流量1：1.5[V/(V·min)]，得到庆大霉素一级种子(本实施例一级种子罐为1m3,一级种子罐培养基体积500L,孢悬液按0.06％接种，接种量为300mL(5支孢悬液合瓶),培养温度36-37℃，培养时间48-54小时，罐压0.04-0.06Mpa,空气流量1.5m3/min)。
一级种子培养基的配方组成为(W/V)：葡萄糖0.1％，玉米淀粉0.6％，玉米粉1.5％，蛋白胨0.4％，黄豆饼粉(冷榨)1.5％，硝酸钾0.05％，六水合氯化钴0.0006％，轻质碳酸钙0.60％，消沫剂0.01％,余量为水(本实施例葡萄糖0.50Kg，玉米淀粉3.0Kg，玉米粉7.5Kg，蛋白胨2.0Kg，黄豆饼粉(冷榨)7.5Kg，硝酸钾0.25Kg，六水合氯化钴3.0g，轻质碳酸钙3.0Kg，消沫剂50.0g，水500L)。用蒸汽0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
4)将步骤3)制备的庆大霉素一级种子接种于灭菌后的二级种子培养基进行二级种子培养，接种量按二级种子培养基的10％接种，培养温度35-37℃，培养时间36-42小时，罐压0.03-0.05Mpa,空气流量1：1.2[V/(V·min)]，得到庆大霉素二级种子(本实施例二级种子罐容积为10m3,二级种子罐培养基体积5m3,培养温度35-37℃，培养时间36-42小时，罐压0.03-0.05Mpa,空气流量12m3/min)。
二级种子培养基的配方组成为(W/V)：玉米淀粉3.5％，玉米粉1.5％，蛋白胨0.5％，黄豆饼粉(冷榨)3.0％，硝酸钾0.01％，硫酸铵0.1％，六水合氯化钴0.001％，轻质碳酸钙0.65％，淀粉酶0.005％，消沫剂0.015％,余量为水(本实施例玉米淀粉175Kg，玉米粉75Kg，蛋白胨25Kg，黄豆饼粉(冷榨)150Kg，硝酸钾0.5Kg，硫酸铵5Kg，六水合氯化钴50.0g，轻质碳酸钙32.5Kg，淀粉酶25.0g，消沫剂0.75Kg，水5m3)。用蒸汽0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
5)将步骤4)制备的庆大霉素二级种子接种于灭菌后的三级种子培养基进行三级种子培养，接种量按三级种子培养基的25％接种，培养温度35-37℃，培养时间20-24小时，罐压0.03-0.05Mpa,空气流量1：1.0-1.2[V/(V·min)]，得到庆大霉素三级种子(本实施例三级种子罐容积为30m3,三级种子罐培养基体积20m3,培养温度35-37℃，培养时间20-24小时，罐压0.03-0.05Mpa,空气流量12m3/min)。用蒸汽0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
三级种子培养基的配方组成为(W/V)：玉米淀粉3.5％，玉米粉1.5％，蛋白胨0.5％，黄豆饼粉(冷榨)3.0％，硝酸钾0.01％，硫酸铵0.1％，六水合氯化钴0.001％，轻质碳酸钙0.65％，淀粉酶0.005％，消沫剂0.015％,余量为水(本实施例玉米淀粉525Kg，玉米粉225Kg，蛋白胨75Kg，黄豆饼粉(冷榨)450Kg，硝酸钾1.5Kg，硫酸铵15Kg，六水合氯化钴150.0g，轻质碳酸钙97.5Kg，淀粉酶75.0g，消沫剂2.25Kg，水15m3)。用蒸汽0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
6)将步骤5)制备的庆大霉素三级种子接种于灭菌后的发酵培养基进行发酵培养，接种量按发酵培养基的40％接种，发酵时间70-90小时，罐压0.01-0.03Mpa,空气流量1：0.6-1.0[V/(V·min)]，0-30小时培养温度35-37℃，用无菌液碱控制pH6.5-7.2；30小时后培养温度34-35℃,用无菌液碱控制pH7.0-7.8。在30小时补加一次732树脂，在60小时补加二次732树脂，通过732树脂吸附得到庆大霉素发酵产物(本实施例发酵罐容积为60m3,发酵罐培养基体积50m3)。
a、发酵培养基的配方组成为(W/V)：玉米淀粉5.5％，玉米粉1.0％，蛋白胨0.6％，黄豆饼粉(冷榨)3.5％，硝酸钾0.01％，硫酸铵0.1％，六水合氯化钴0.001％，轻质碳酸钙0.65％，淀粉酶0.005％，消沫剂0.02％,余量为水(本实施例玉米淀粉1375Kg，玉米粉250Kg，蛋白胨150Kg，黄豆饼粉(冷榨)875Kg，硝酸钾2.5Kg，硫酸铵25Kg，六水合氯化钴250.0g，轻质碳酸钙162.5Kg，淀粉酶125.0g，消沫剂5.0Kg，水25m3)。用蒸汽0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
b、发酵罐培养条件为：
c、温度控制：0-30小时培养温度35-37℃，30小时后培养温度34-35℃用；
d、pH控制：0-30小时通过补入无菌液碱控制pH6.5-7.2，30小时后通过补入无菌液碱控制pH7.0-7.8；
e、罐压控制：发酵全程控制罐压0.01-0.03Mpa；
f、空气流量：0-15小时空气流量48m3/min，15-60小时空气流量60m3/min)，60小时-放罐空气流量36m3/min；
g、搅拌转速：0-15小时变频控制搅拌转速80-100rpm，15-60小时变频控制搅拌转速120-150rpm，60小时-放罐变频控制搅拌转速90-120rpm；
h、溶解氧：通过调节搅拌转速和空气流量，全程控制溶解氧20％以上；
i、发酵周期：75小时；
j、在发酵过程中，30h补入消毒处理的732树脂，补入732树脂数量按发酵培养基体积的1.0％(本实施例补入732树脂500L)，60h再次补入消毒处理的732树脂，补入732树脂数量按发酵培养基体积的1.5％(本实施例补入732树脂750L)；
发酵培养75小时，发酵结束，放罐体积52.4吨，发酵单位2312μ/ml。
传统方法与本发明的工艺流程对比如图1所示，传统方法生产的庆大霉素质量指标数据如图2和表2所述，本发明具体发酵生产的庆大霉素质量指标数据如图3和表2所示。
实施例2
一种绛红小单孢菌短周期发酵生产低杂质庆大霉素的方法，包括以下步骤：
1)用无菌接种棒挑取庆大霉素砂土孢子(或成熟母瓶孢子)于茄子瓶斜面培养基进行孢子培养，培养温度36.5-37.5℃，培养时间10天。培养好的孢子斜面，保存于冰箱2-8℃待用。
庆大霉素茄子瓶斜面孢子制备方法为：
a、茄子瓶斜面培养基的配方组成为(W/V)：玉米淀粉0.75％，小麦麸皮1.8％(溶磷小于5000PPM，淀粉含量小于15％)，琼脂1.8％，天冬素0.002％，轻质碳酸钙0.10％，硝酸钾0.10％，氯化钠0.05％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.03％，余量为水[本实施例实施具体为玉米淀粉7.5g，小麦麸皮18.0g(溶磷小于5000PPM，淀粉含量小于15％)，琼脂18.0g，天冬素0.02g，轻质碳酸钙1.0g，硝酸钾1.0g，氯化钠0.5g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾0.3g,水1L]。
b、茄子瓶斜面培养基的配制：琼脂按配制总量称好后，放入烧杯内，加入定量的注射用水或蒸馏水煮沸溶解。其它成份(除轻质碳酸钙)均按配制量称好调匀后，倒入煮沸的琼脂水中，搅匀溶解，pH值消前调至7.2-8.0，然后加入称好轻质碳酸钙，搅拌均匀，分装于茄子瓶(容量250ml)中，每瓶60ml。
c、茄子瓶斜面培养基的灭菌：分装好的茄子瓶培养基进行湿热灭菌(0.11±0.01Mpa、121℃，30min)，灭菌结束时，待温度降至70℃以下，取出培养基，摇匀即可摆成斜面，待用。
d、孢子接种与培养：将无菌操作用的无菌培养基及无菌操作的全部所用工器具解开包布放入传递窗，经紫外灯照射一小时后放入操作台。于超净台上，在火焰保护下用无菌接种棒挑取砂土孢子于茄子瓶斜面培养基内，先划中线，后从内到外往两边划线均匀铺开，塞好棉塞，用牛皮纸包好扎紧瓶口，置于36.5-37.5℃温度恒温间培养10天。
e、斜面孢子保存:2～8℃冰箱保存，待用。
2)将步骤1)中制备的庆大霉素孢子斜面严格按无菌操作，将60ml纯化水倒入300ml三角瓶中，扎口于0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至室温，待用。将无菌操作用的无菌培养基及无菌操作的全部所用工器具解开包布放入传递窗，经紫外灯照射一小时后放入操作台。于超净台上，严格按无菌操作，将50-60ml无菌水倒入斜面进行刮孢子，然后收集到经灭菌的空三角瓶中，逐瓶操作。
3)将步骤2)制备的孢悬液在火焰保护下接种于灭菌后的一级种子培养基进行一级种子培养，接种量(孢悬液)按一级种子培养基的0.06％接种，培养温度36℃，培养时间48-54小时，罐压0.04-0.06Mpa,空气流量1：1.5[V/(V·min)]，得到庆大霉素一级种子(本实施例一级种子罐为1m3,一级种子罐培养基体积500L,孢悬液按0.06％接种，接种量为300mL(5支孢悬液合瓶),培养温度36-37℃，培养时间48-54小时，罐压0.04-0.06Mpa,空气流量1.5m3/min)。
一级种子培养基的配方组成为(W/V)：葡萄糖0.1％，玉米淀粉0.6％，玉米粉1.5％，蛋白胨0.4％，黄豆饼粉(冷榨)1.5％，硝酸钾0.05％，六水合氯化钴0.0006％，轻质碳酸钙0.60％，消沫剂0.01％,余量为水(本实施例葡萄糖0.50Kg，玉米淀粉3.0Kg，玉米粉7.5Kg，蛋白胨2.0Kg，黄豆饼粉(冷榨)7.5Kg，硝酸钾0.25Kg，六水合氯化钴3.0g，轻质碳酸钙3.0Kg，消沫剂50.0g，水500L)。用蒸汽0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
4)将步骤3)制备的庆大霉素一级种子接种于灭菌后的二级种子培养基进行二级种子培养，接种量按二级种子培养基的10％接种，培养温度35-37℃，培养时间36-42小时，罐压0.03-0.05Mpa,空气流量1：1.2[V/(V·min)]，得到庆大霉素二级种子(本实施例二级种子罐容积为10m3,二级种子罐培养基体积5m3,培养温度35-37℃，培养时间36-42小时，罐压0.03-0.05Mpa,空气流量12m3/min)。
二级种子培养基的配方组成为(W/V)：玉米淀粉3.5％，玉米粉1.5％，蛋白胨0.5％，黄豆饼粉(冷榨)3.0％，硝酸钾0.01％，硫酸铵0.1％，六水合氯化钴0.001％，轻质碳酸钙0.65％，淀粉酶0.005％，消沫剂0.015％,余量为水(本实施例玉米淀粉175Kg，玉米粉75Kg，蛋白胨25Kg，黄豆饼粉(冷榨)150Kg，硝酸钾0.5Kg，硫酸铵5Kg，六水合氯化钴50.0g，轻质碳酸钙32.5Kg，淀粉酶25.0g，消沫剂0.75Kg，水5m3)。用蒸汽0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
5)将步骤4)制备的庆大霉素二级种子接种于灭菌后的三级种子培养基进行三级种子培养，接种量按三级种子培养基的25％接种，培养温度35-37℃，培养时间20-24小时，罐压0.03-0.05Mpa,空气流量1：1.0-1.2[V/(V·min)]，得到庆大霉素三级种子(本实施例三级种子罐容积为30m3,三级种子罐培养基体积20m3,培养温度35-37℃，培养时间20-24小时，罐压0.03-0.05Mpa,空气流量12m3/min)。用蒸汽0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
三级种子培养基的配方组成为(W/V)：玉米淀粉3.5％，玉米粉1.5％，蛋白胨0.5％，黄豆饼粉(冷榨)3.0％，硝酸钾0.01％，硫酸铵0.1％，六水合氯化钴0.001％，轻质碳酸钙0.65％，淀粉酶0.005％，消沫剂0.015％,余量为水(本实施例玉米淀粉525Kg，玉米粉225Kg，蛋白胨75Kg，黄豆饼粉(冷榨)450Kg，硝酸钾1.5Kg，硫酸铵15Kg，六水合氯化钴150.0g，轻质碳酸钙97.5Kg，淀粉酶75.0g，消沫剂2.25Kg，水15m3)。用蒸汽0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
6)将步骤5)制备的庆大霉素三级种子接种于灭菌后的发酵培养基进行发酵培养，接种量按发酵培养基的40％接种，发酵时间70-90小时，罐压0.01-0.03Mpa,空气流量1：0.6-1.0[V/(V·min)]，0-30小时培养温度35-37℃，用无菌液碱控制pH6.5-7.2；30小时后培养温度34-35℃,用无菌液碱控制pH7.0-7.8。在30小时补加一次732树脂，在60小时补加二次732树脂，通过732树脂吸附得到庆大霉素发酵产物(本实施例发酵罐容积为60m3,发酵罐培养基体积50m3)。
a、发酵培养基的配方组成为(W/V)：玉米淀粉5.5％，玉米粉1.0％，蛋白胨0.6％，黄豆饼粉(冷榨)3.5％，硝酸钾0.01％，硫酸铵0.1％，六水合氯化钴0.001％，轻质碳酸钙0.65％，淀粉酶0.005％，消沫剂0.02％,余量为水(本实施例玉米淀粉1375Kg，玉米粉250Kg，蛋白胨150Kg，黄豆饼粉(冷榨)875Kg，硝酸钾2.5Kg，硫酸铵25Kg，六水合氯化钴250.0g，轻质碳酸钙162.5Kg，淀粉酶125.0g，消沫剂5.0Kg，水25m3)。用蒸汽0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
b、发酵罐培养条件为：
c、温度控制：0-30小时培养温度35-37℃，30小时后培养温度34-35℃；
d、pH控制：0-30小时通过补入无菌液碱控制pH6.5-7.2，30小时后通过补入无菌液碱控制pH7.0-7.8；
e、罐压控制：发酵全程控制罐压0.01-0.03Mpa；
f、空气流量：0-15小时空气流量48m3/min，15-60小时空气流量60m3/min)，60小时-放罐空气流量36m3/min；
g、搅拌转速：0-15小时变频控制搅拌转速80-100rpm，15-60小时变频控制搅拌转速120-150rpm，60小时-放罐变频控制搅拌转速90-120rpm；
h、溶解氧：通过调节搅拌转速和空气流量，全程控制溶解氧20％以上；
i、发酵周期：75小时；
j、在发酵过程中，30h补入消毒处理的732树脂，补入732树脂数量按发酵培养基体积的1.0％(本实施例补入732树脂500L)，60h再次补入消毒处理的732树脂，补入732树脂数量按发酵培养基体积的1.5％(本实施例补入732树脂750L)；
发酵培养72小时，发酵结束，放罐体积53.6吨，发酵单位1943μ/ml。
实施例3
一种绛红小单孢菌短周期发酵生产低杂质庆大霉素的方法，包括以下步骤：
1)用无菌接种棒挑取庆大霉素砂土孢子(或成熟母瓶孢子)于茄子瓶斜面培养基进行孢子培养，培养温度36.5-37.5℃，培养时间10天。培养好的孢子斜面，保存于冰箱2-8℃待用。
庆大霉素茄子瓶斜面孢子制备方法为：
a、茄子瓶斜面培养基的配方组成为(W/V)：玉米淀粉0.75％，小麦麸皮1.8％(溶磷小于5000PPM，淀粉含量小于15％)，琼脂1.8％，天冬素0.002％，轻质碳酸钙0.10％，硝酸钾0.10％，氯化钠0.05％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.03％，余量为水[本实施例实施具体为玉米淀粉7.5g，小麦麸皮18.0g(溶磷小于5000PPM，淀粉含量小于15％)，琼脂18.0g，天冬素0.02g，轻质碳酸钙1.0g，硝酸钾1.0g，氯化钠0.5g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾0.3g,水1L]。
b、茄子瓶斜面培养基的配制：琼脂按配制总量称好后，放入烧杯内，加入定量的注射用水或蒸馏水煮沸溶解。其它成份(除轻质碳酸钙)均按配制量称好调匀后，倒入煮沸的琼脂水中，搅匀溶解，pH值消前调至7.2-8.0，然后加入称好轻质碳酸钙，搅拌均匀，分装于茄子瓶(容量250ml)中，每瓶60ml。
c、茄子瓶斜面培养基的灭菌：分装好的茄子瓶培养基进行湿热灭菌(0.11±0.01Mpa、121℃，30min)，灭菌结束时，待温度降至70℃以下，取出培养基，摇匀即可摆成斜面，待用。
d、孢子接种与培养：将无菌操作用的无菌培养基及无菌操作的全部所用工器具解开包布放入传递窗，经紫外灯照射一小时后放入操作台。于超净台上，在火焰保护下用无菌接种棒挑取砂土孢子于茄子瓶斜面培养基内，先划中线，后从内到外往两边划线均匀铺开，塞好棉塞，用牛皮纸包好扎紧瓶口，置于36.5-37.5℃温度恒温间培养10天。
e、斜面孢子保存:2～8℃冰箱保存，待用。
2)将步骤1)中制备的庆大霉素孢子斜面严格按无菌操作，将60ml纯化水倒入300ml三角瓶中，扎口于0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至室温，待用。将无菌操作用的无菌培养基及无菌操作的全部所用工器具解开包布放入传递窗，经紫外灯照射一小时后放入操作台。于超净台上，严格按无菌操作，将50-60ml无菌水倒入斜面进行刮孢子，然后收集到经灭菌的空三角瓶中，逐瓶操作。
3)将步骤2)制备的孢悬液在火焰保护下接种于灭菌后的一级种子培养基进行一级种子培养，接种量(孢悬液)按一级种子培养基的0.06％接种，培养温度36℃，培养时间48-54小时，罐压0.04-0.06Mpa,空气流量1：1.5[V/(V·min)]，得到庆大霉素一级种子(本实施例一级种子罐为1m3,一级种子罐培养基体积500L,孢悬液按0.06％接种，接种量为300mL(5支孢悬液合瓶),培养温度36-37℃，培养时间48-54小时，罐压0.04-0.06Mpa,空气流量1.5m3/min)。
一级种子培养基的配方组成为(W/V)：葡萄糖0.1％，玉米淀粉0.6％，玉米粉1.5％，蛋白胨0.4％，黄豆饼粉(冷榨)1.5％，硝酸钾0.05％，六水合氯化钴0.0006％，轻质碳酸钙0.60％，消沫剂0.01％,余量为水(本实施例葡萄糖0.50Kg，玉米淀粉3.0Kg，玉米粉7.5Kg，蛋白胨2.0Kg，黄豆饼粉(冷榨)7.5Kg，硝酸钾0.25Kg，六水合氯化钴3.0g，轻质碳酸钙3.0Kg，消沫剂50.0g，水500L)。用蒸汽0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
4)将步骤3)制备的庆大霉素一级种子接种于灭菌后的二级种子培养基进行二级种子培养，接种量按二级种子培养基的10％接种，培养温度35-37℃，培养时间36-42小时，罐压0.03-0.05Mpa,空气流量1：1.2[V/(V·min)]，得到庆大霉素二级种子(本实施例二级种子罐容积为10m3,二级种子罐培养基体积5m3,培养温度35-37℃，培养时间36-42小时，罐压0.03-0.05Mpa,空气流量12m3/min)。
二级种子培养基的配方组成为(W/V)：玉米淀粉3.5％，玉米粉1.5％，蛋白胨0.5％，黄豆饼粉(冷榨)3.0％，硝酸钾0.01％，硫酸铵0.1％，六水合氯化钴0.001％，轻质碳酸钙0.65％，淀粉酶0.005％，消沫剂0.015％,余量为水(本实施例玉米淀粉175Kg，玉米粉75Kg，蛋白胨25Kg，黄豆饼粉(冷榨)150Kg，硝酸钾0.5Kg，硫酸铵5Kg，六水合氯化钴50.0g，轻质碳酸钙32.5Kg，淀粉酶25.0g，消沫剂0.75Kg，水5m3)。用蒸汽0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
5)将步骤4)制备的庆大霉素二级种子接种于灭菌后的三级种子培养基进行三级种子培养，接种量按三级种子培养基的25％接种，培养温度35-37℃，培养时间20-24小时，罐压0.03-0.05Mpa,空气流量1：1.0-1.2[V/(V·min)]，得到庆大霉素三级种子(本实施例三级种子罐容积为30m3,三级种子罐培养基体积20m3,培养温度35-37℃，培养时间20-24小时，罐压0.03-0.05Mpa,空气流量12m3/min)。用蒸汽0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
三级种子培养基的配方组成为(W/V)：玉米淀粉3.5％，玉米粉1.5％，蛋白胨0.5％，黄豆饼粉(冷榨)3.0％，硝酸钾0.01％，硫酸铵0.1％，六水合氯化钴0.001％，轻质碳酸钙0.65％，淀粉酶0.005％，消沫剂0.015％,余量为水(本实施例玉米淀粉525Kg，玉米粉225Kg，蛋白胨75Kg，黄豆饼粉(冷榨)450Kg，硝酸钾1.5Kg，硫酸铵15Kg，六水合氯化钴150.0g，轻质碳酸钙97.5Kg，淀粉酶75.0g，消沫剂2.25Kg，水15m3)。用蒸汽0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
6)将步骤5)制备的庆大霉素三级种子接种于灭菌后的发酵培养基进行发酵培养，接种量按发酵培养基的40％接种，发酵时间70-90小时，罐压0.01-0.03Mpa,空气流量1：0.6-1.0[V/(V·min)]，0-30小时培养温度35-37℃，用无菌液碱控制pH6.5-7.2；30小时后培养温度34-35℃,用无菌液碱控制pH7.0-7.8。在30小时补加一次732树脂，在60小时补加二次732树脂，通过732树脂吸附得到庆大霉素发酵产物(本实施例发酵罐容积为60m3,发酵罐培养基体积50m3)。
a、发酵培养基的配方组成为(W/V)：玉米淀粉5.5％，玉米粉1.0％，蛋白胨0.6％，黄豆饼粉(冷榨)3.5％，硝酸钾0.01％，硫酸铵0.1％，六水合氯化钴0.001％，轻质碳酸钙0.65％，淀粉酶0.005％，消沫剂0.02％,余量为水(本实施例玉米淀粉1375Kg，玉米粉250Kg，蛋白胨150Kg，黄豆饼粉(冷榨)875Kg，硝酸钾2.5Kg，硫酸铵25Kg，六水合氯化钴250.0g，轻质碳酸钙162.5Kg，淀粉酶125.0g，消沫剂5.0Kg，水25m3)。用蒸汽0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
b、发酵罐培养条件为：
c、温度控制：0-30小时培养温度35-37℃，30小时后培养温度34-35℃；
d、pH控制：0-30小时通过补入无菌液碱控制pH6.5-7.2，30小时后通过补入无菌液碱控制pH7.0-7.8；
e、罐压控制：发酵全程控制罐压0.01-0.03Mpa；
f、空气流量：0-15小时空气流量48m3/min，15-60小时空气流量60m3/min)，60小时-放罐空气流量36m3/min；
g、搅拌转速：0-15小时变频控制搅拌转速80-100rpm，15-60小时变频控制搅拌转速120-150rpm，60小时-放罐变频控制搅拌转速90-120rpm；
h、溶解氧：通过调节搅拌转速和空气流量，全程控制溶解氧20％以上；
i、发酵周期：75小时；
j、在发酵过程中，30h补入消毒处理的732树脂，补入732树脂数量按发酵培养基体积的1.0％(本实施例补入732树脂500L)，60h再次补入消毒处理的732树脂，补入732树脂数量按发酵培养基体积的1.5％(本实施例补入732树脂750L)；
发酵培养78小时，发酵结束，放罐体积53.6吨，发酵单位2117μ/ml。
对比例1
改进前庆大霉素的培养基及培养方法，包括以下步骤：
1)用无菌接种棒挑取庆大霉素砂土孢子(或成熟母瓶孢子)于茄子瓶斜面培养基进行孢子培养，培养温度36.5-37.5℃，培养时间10天。培养好的孢子斜面，保存于冰箱2-8℃待用。
庆大霉素茄子瓶斜面孢子制备方法为：
a、茄子瓶斜面培养基的配方组成为(W/V)：玉米淀粉0.75％，小麦麸皮1.8％(溶磷小于5000PPM，淀粉含量小于15％)，琼脂1.8％，天冬素0.002％，轻质碳酸钙0.10％，硝酸钾0.10％，氯化钠0.05％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.03％，余量为水[本对比例实施具体为玉米淀粉7.5g，小麦麸皮18.0g(溶磷小于5000PPM，淀粉含量小于15％)，琼脂18.0g，天冬素0.02g，轻质碳酸钙1.0g，硝酸钾1.0g，氯化钠0.5g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾0.3g,水1L]。
b、茄子瓶斜面培养基的配制：琼脂按配制总量称好后，放入烧杯内，加入定量的注射用水或蒸馏水煮沸溶解。其它成份(除轻质碳酸钙)均按配制量称好调匀后，倒入煮沸的琼脂水中，搅匀溶解，pH值消前调至7.2-8.0，然后加入称好轻质碳酸钙，搅拌均匀，分装于茄子瓶(容量250ml)中，每瓶60ml。
c、茄子瓶斜面培养基的灭菌：分装好的茄子瓶培养基进行湿热灭菌(0.11±0.01Mpa、121℃，30min)，灭菌结束时，待温度降至70℃以下，取出培养基，摇匀即可摆成斜面，待用。
d、孢子接种与培养：将无菌操作用的无菌培养基及无菌操作的全部所用工器具解开包布放入传递窗，经紫外灯照射一小时后放入操作台。于超净台上，在火焰保护下用无菌接种棒挑取砂土孢子于茄子瓶斜面培养基内，先划中线，后从内到外往两边划线均匀铺开，塞好棉塞，用牛皮纸包好扎紧瓶口，置于36.5-37.5℃温度恒温间培养10天。
e、斜面孢子保存:2～8℃冰箱保存，待用。
2)摇瓶菌丝制备：
a、摇瓶菌丝培养基的配方组成为(W/V)：葡萄糖0.1％，玉米淀粉1.0％，玉米粉1.5％，蛋白胨0.2％，黄豆饼粉(冷榨)1.0％，硝酸钾0.05％，六水合氯化钴0.0006％，轻质碳酸钙0.60％,余量为水(本对比例葡萄糖1.0g，玉米淀粉10.0g，玉米粉10.0g，蛋白胨2.0g，黄豆饼粉(冷榨)10.0g，硝酸钾0.25Kg，六水合氯化钴6.0mg，轻质碳酸钙6.0g，水1000mL)。pH值自然，搅拌均匀，分装于三角瓶(容量250ml)中，每瓶60ml。
b、摇瓶培养基的灭菌：分装好的摇瓶培养基置入湿热灭菌柜中进行湿热灭菌(0.11±0.01Mpa、121℃，30min)，灭菌结束时，冷却至室温，待用。
c、摇瓶菌丝的接种与培养：步骤1)中制备的庆大霉素孢子斜面严格按无菌操作，于超净台上，在火焰保护下用无菌接种棒挑取茄子瓶斜面孢子于摇瓶培养基内，塞好棉塞，用牛皮纸包好扎紧瓶口，置于恒温间摇瓶机上培养，温度36-37℃，培养24～40小时，并瓶备用。
3)将步骤2)制备的摇瓶菌丝在火焰保护下接种于灭菌后的一级种子培养基进行一级种子培养，接种量(摇瓶菌丝)按一级种子培养基的0.06％接种，培养温度36℃，培养时间48-54小时，罐压0.04-0.06Mpa,空气流量1：1.5[V/(V·min)]，得到庆大霉素一级种子(本对比例一级种子罐为1m3,一级种子罐培养基体积500L,摇瓶菌丝培养物按0.06％接种，接种量为300mL(5瓶摇瓶菌丝合瓶),培养温度36-37℃，培养时间36-48小时，罐压0.04-0.06Mpa,空气流量1.5m3/min)。
一级种子培养基的配方组成为(W/V)：葡萄糖0.1％，玉米淀粉0.6％，玉米粉1.5％，蛋白胨0.4％，黄豆饼粉(冷榨)1.5％，硝酸钾0.05％，六水合氯化钴0.0006％，轻质碳酸钙0.60％，消沫剂0.01％,余量为水(本对比例葡萄糖0.75Kg，玉米淀粉4.5Kg，玉米粉11.25Kg，蛋白胨3.0Kg，黄豆饼粉(冷榨)11.25Kg，硝酸钾0.375Kg，六水合氯化钴4.5g，轻质碳酸钙4.5Kg，消沫剂75.0g，水750L)。用蒸汽0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
4)将步骤3)制备的庆大霉素一级种子接种于灭菌后的二级种子培养基进行二级种子培养，接种量按二级种子培养基的6-8％接种，培养温度35-37℃，培养时间30-36小时，罐压0.03-0.05Mpa,空气流量1：1.2[V/(V·min)]，得到庆大霉素二级种子(本对比例二级种子罐容积为20m3,二级种子罐培养基体积12m3,培养温度35-37℃，培养时间30-36小时，罐压0.03-0.05Mpa,空气流量15m3/min)。
二级种子培养基的配方组成为(W/V)：玉米淀粉3.5％，玉米粉1.5％，蛋白胨0.5％，黄豆饼粉(冷榨)3.0％，硝酸钾0.01％，硫酸铵0.1％，六水合氯化钴0.001％，轻质碳酸钙0.65％，淀粉酶0.005％，消沫剂0.015％,余量为水(本对比例玉米淀粉420Kg，玉米粉180Kg，蛋白胨60Kg，黄豆饼粉(冷榨)360Kg，硝酸钾1.2Kg，硫酸铵12Kg，六水合氯化钴120.0g，轻质碳酸钙78Kg，淀粉酶60.0g，消沫剂1.8Kg，水12m3)。用蒸汽0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
6)将步骤5)制备的庆大霉素二级种子接种于灭菌后的发酵培养基进行发酵培养，接种量按发酵培养基的25-30％接种，发酵时间110-160小时，罐压0.01-0.03Mpa,空气流量1：0.8-1.0[V/(V·min)]，培养温度全程35-37℃，0-50小时用无菌液碱控制pH6.5-7.2，,50小时用无菌液碱控制pH7.0-7.8。(本对比例发酵罐容积为60m3,发酵罐培养基体积50m3)。
a、发酵培养基的配方组成为(W/V)：玉米淀粉4.5％，玉米粉1.0％，蛋白胨1.5％，鱼粉0.5％，黄豆饼粉(冷榨)2.0％，硝酸钾0.01％，硫酸铵0.1％，六水合氯化钴0.001％，轻质碳酸钙0.80％，淀粉酶0.005％，消沫剂0.02％,余量为水(本对比例玉米淀粉1710Kg，玉米粉380Kg，蛋白胨570Kg，鱼粉190Kg，黄豆饼粉(冷榨)640Kg，硝酸钾3.8Kg，硫酸铵38Kg，六水合氯化钴380.0g，轻质碳酸钙304Kg，淀粉酶190.0g，消沫剂7.6Kg，水38m3)。用蒸汽0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
b、发酵罐培养条件为：
c、温度控制：全程培养温度35-37℃
d、pH控制：0-50小时通过补入无菌液碱控制pH6.5-7.2，50小时后通过补入无菌液碱控制pH7.0-7.8；
e、罐压控制：发酵全程控制罐压0.01-0.03Mpa；
f、空气流量：0-30小时空气流量48m3/min，30-90小时空气流量60m3/min)，90小时-放罐空气流量48m3/min；
g、搅拌转速：0-30小时变频控制搅拌转速80-100rpm，30-90小时变频控制搅拌转速120-150rpm，90小时-放罐变频控制搅拌转速90-120rpm；
h、溶解氧：通过调节搅拌转速和空气流量，全程控制溶解氧20％以上；
i、发酵周期：1112小时；
发酵培养112小时，发酵结束，放罐体积53.3吨，发酵单位1337μ/ml。
对比例2
改进前庆大霉素的培养基及培养方法，包括以下步骤：
1)用无菌接种棒挑取庆大霉素砂土孢子(或成熟母瓶孢子)于茄子瓶斜面培养基进行孢子培养，培养温度36.5-37.5℃，培养时间10天。培养好的孢子斜面，保存于冰箱2-8℃待用。
庆大霉素茄子瓶斜面孢子制备方法为：
a、茄子瓶斜面培养基的配方组成为(W/V)：玉米淀粉0.75％，小麦麸皮1.8％(溶磷小于5000PPM，淀粉含量小于15％)，琼脂1.8％，天冬素0.002％，轻质碳酸钙0.10％，硝酸钾0.10％，氯化钠0.05％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.03％，余量为水[本对比例实施具体为玉米淀粉7.5g，小麦麸皮18.0g(溶磷小于5000PPM，淀粉含量小于15％)，琼脂18.0g，天冬素0.02g，轻质碳酸钙1.0g，硝酸钾1.0g，氯化钠0.5g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾0.3g,水1L]。
b、茄子瓶斜面培养基的配制：琼脂按配制总量称好后，放入烧杯内，加入定量的注射用水或蒸馏水煮沸溶解。其它成份(除轻质碳酸钙)均按配制量称好调匀后，倒入煮沸的琼脂水中，搅匀溶解，pH值消前调至7.2-8.0，然后加入称好轻质碳酸钙，搅拌均匀，分装于茄子瓶(容量250ml)中，每瓶60ml。
c、茄子瓶斜面培养基的灭菌：分装好的茄子瓶培养基进行湿热灭菌(0.11±0.01Mpa、121℃，30min)，灭菌结束时，待温度降至70℃以下，取出培养基，摇匀即可摆成斜面，待用。
d、孢子接种与培养：将无菌操作用的无菌培养基及无菌操作的全部所用工器具解开包布放入传递窗，经紫外灯照射一小时后放入操作台。于超净台上，在火焰保护下用无菌接种棒挑取砂土孢子于茄子瓶斜面培养基内，先划中线，后从内到外往两边划线均匀铺开，塞好棉塞，用牛皮纸包好扎紧瓶口，置于36.5-37.5℃温度恒温间培养10天。
e、斜面孢子保存:2～8℃冰箱保存，待用。
2)摇瓶菌丝制备：
a、摇瓶菌丝培养基的配方组成为(W/V)：葡萄糖0.1％，玉米淀粉1.0％，玉米粉1.5％，蛋白胨0.2％，黄豆饼粉(冷榨)1.0％，硝酸钾0.05％，六水合氯化钴0.0006％，轻质碳酸钙0.60％,余量为水(本对比例葡萄糖1.0g，玉米淀粉10.0g，玉米粉10.0g，蛋白胨2.0g，黄豆饼粉(冷榨)10.0g，硝酸钾0.25Kg，六水合氯化钴6.0mg，轻质碳酸钙6.0g，水1000mL)。pH值自然，搅拌均匀，分装于三角瓶(容量250ml)中，每瓶60ml。
b、摇瓶培养基的灭菌：分装好的摇瓶培养基置入湿热灭菌柜中进行湿热灭菌(0.11±0.01Mpa、121℃，30min)，灭菌结束时，冷却至室温，待用。
c、摇瓶菌丝的接种与培养：步骤1)中制备的庆大霉素孢子斜面严格按无菌操作，于超净台上，在火焰保护下用无菌接种棒挑取茄子瓶斜面孢子于摇瓶培养基内，塞好棉塞，用牛皮纸包好扎紧瓶口，置于恒温间摇瓶机上培养，温度36-37℃，培养24～40小时，并瓶备用。
3)将步骤2)制备的摇瓶菌丝在火焰保护下接种于灭菌后的一级种子培养基进行一级种子培养，接种量(摇瓶菌丝)按一级种子培养基的0.06％接种，培养温度36℃，培养时间48-54小时，罐压0.04-0.06Mpa,空气流量1：1.5[V/(V·min)]，得到庆大霉素一级种子(本对比例一级种子罐为1m3,一级种子罐培养基体积500L,摇瓶菌丝培养物按0.06％接种，接种量为300mL(5瓶摇瓶菌丝合瓶),培养温度36-37℃，培养时间36-48小时，罐压0.04-0.06Mpa,空气流量1.5m3/min)。
一级种子培养基的配方组成为(W/V)：葡萄糖0.1％，玉米淀粉0.6％，玉米粉1.5％，蛋白胨0.4％，黄豆饼粉(冷榨)1.5％，硝酸钾0.05％，六水合氯化钴0.0006％，轻质碳酸钙0.60％，消沫剂0.01％,余量为水(本对比例葡萄糖0.75Kg，玉米淀粉4.5Kg，玉米粉11.25Kg，蛋白胨3.0Kg，黄豆饼粉(冷榨)11.25Kg，硝酸钾0.375Kg，六水合氯化钴4.5g，轻质碳酸钙4.5Kg，消沫剂75.0g，水750L)。用蒸汽0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
4)将步骤3)制备的庆大霉素一级种子接种于灭菌后的二级种子培养基进行二级种子培养，接种量按二级种子培养基的6-8％接种，培养温度35-37℃，培养时间30-36小时，罐压0.03-0.05Mpa,空气流量1：1.2[V/(V·min)]，得到庆大霉素二级种子(本对比例二级种子罐容积为20m3,二级种子罐培养基体积12m3,培养温度35-37℃，培养时间30-36小时，罐压0.03-0.05Mpa,空气流量15m3/min)。
二级种子培养基的配方组成为(W/V)：玉米淀粉3.5％，玉米粉1.5％，蛋白胨0.5％，黄豆饼粉(冷榨)3.0％，硝酸钾0.01％，硫酸铵0.1％，六水合氯化钴0.001％，轻质碳酸钙0.65％，淀粉酶0.005％，消沫剂0.015％,余量为水(本对比例玉米淀粉420Kg，玉米粉180Kg，蛋白胨60Kg，黄豆饼粉(冷榨)360Kg，硝酸钾1.2Kg，硫酸铵12Kg，六水合氯化钴120.0g，轻质碳酸钙78Kg，淀粉酶60.0g，消沫剂1.8Kg，水12m3)。用蒸汽0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
6)将步骤5)制备的庆大霉素二级种子接种于灭菌后的发酵培养基进行发酵培养，接种量按发酵培养基的25-30％接种，发酵时间110-160小时，罐压0.01-0.03Mpa,空气流量1：0.8-1.0[V/(V·min)]，培养温度全程35-37℃，0-50小时用无菌液碱控制pH6.5-7.2，,50小时用无菌液碱控制pH7.0-7.8。(本对比例发酵罐容积为60m3,发酵罐培养基体积50m3)。
a、发酵培养基的配方组成为(W/V)：玉米淀粉4.5％，玉米粉1.0％，蛋白胨1.5％，鱼粉0.5％，黄豆饼粉(冷榨)2.0％，硝酸钾0.01％，硫酸铵0.1％，六水合氯化钴0.001％，轻质碳酸钙0.80％，淀粉酶0.005％，消沫剂0.02％,余量为水(本对比例玉米淀粉1710Kg，玉米粉380Kg，蛋白胨570Kg，鱼粉190Kg，黄豆饼粉(冷榨)640Kg，硝酸钾3.8Kg，硫酸铵38Kg，六水合氯化钴380.0g，轻质碳酸钙304Kg，淀粉酶190.0g，消沫剂7.6Kg，水38m3)。用蒸汽0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
b、发酵罐培养条件为：
c、温度控制：全程培养温度35-37℃
d、pH控制：0-50小时通过补入无菌液碱控制pH6.5-7.2，50小时后通过补入无菌液碱控制pH7.0-7.8；
e、罐压控制：发酵全程控制罐压0.01-0.03Mpa；
f、空气流量：0-30小时空气流量48m3/min，30-90小时空气流量60m3/min)，90小时-放罐空气流量48m3/min；
g、搅拌转速：0-30小时变频控制搅拌转速80-100rpm，30-90小时变频控制搅拌转速120-150rpm，90小时-放罐变频控制搅拌转速90-120rpm；
h、溶解氧：通过调节搅拌转速和空气流量，全程控制溶解氧20％以上；
i、发酵周期：110-160小时；
发酵培养121小时，发酵结束，放罐体积53.7吨，发酵单位1491μ/ml。
对比例3
改进前庆大霉素的培养基及培养方法，包括以下步骤：
1)用无菌接种棒挑取庆大霉素砂土孢子(或成熟母瓶孢子)于茄子瓶斜面培养基进行孢子培养，培养温度36.5-37.5℃，培养时间10天。培养好的孢子斜面，保存于冰箱2-8℃待用。
庆大霉素茄子瓶斜面孢子制备方法为：
a、茄子瓶斜面培养基的配方组成为(W/V)：玉米淀粉0.75％，小麦麸皮1.8％(溶磷小于5000PPM，淀粉含量小于15％)，琼脂1.8％，天冬素0.002％，轻质碳酸钙0.10％，硝酸钾0.10％，氯化钠0.05％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.03％，余量为水[本对比例实施具体为玉米淀粉7.5g，小麦麸皮18.0g(溶磷小于5000PPM，淀粉含量小于15％)，琼脂18.0g，天冬素0.02g，轻质碳酸钙1.0g，硝酸钾1.0g，氯化钠0.5g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾0.3g,水1L]。
b、茄子瓶斜面培养基的配制：琼脂按配制总量称好后，放入烧杯内，加入定量的注射用水或蒸馏水煮沸溶解。其它成份(除轻质碳酸钙)均按配制量称好调匀后，倒入煮沸的琼脂水中，搅匀溶解，pH值消前调至7.2-8.0，然后加入称好轻质碳酸钙，搅拌均匀，分装于茄子瓶(容量250ml)中，每瓶60ml。
c、茄子瓶斜面培养基的灭菌：分装好的茄子瓶培养基进行湿热灭菌(0.11±0.01Mpa、121℃，30min)，灭菌结束时，待温度降至70℃以下，取出培养基，摇匀即可摆成斜面，待用。
d、孢子接种与培养：将无菌操作用的无菌培养基及无菌操作的全部所用工器具解开包布放入传递窗，经紫外灯照射一小时后放入操作台。于超净台上，在火焰保护下用无菌接种棒挑取砂土孢子于茄子瓶斜面培养基内，先划中线，后从内到外往两边划线均匀铺开，塞好棉塞，用牛皮纸包好扎紧瓶口，置于36.5-37.5℃温度恒温间培养10天。
e、斜面孢子保存:2～8℃冰箱保存，待用。
2)摇瓶菌丝制备：
a、摇瓶菌丝培养基的配方组成为(W/V)：葡萄糖0.1％，玉米淀粉1.0％，玉米粉1.5％，蛋白胨0.2％，黄豆饼粉(冷榨)1.0％，硝酸钾0.05％，六水合氯化钴0.0006％，轻质碳酸钙0.60％,余量为水(本对比例葡萄糖1.0g，玉米淀粉10.0g，玉米粉10.0g，蛋白胨2.0g，黄豆饼粉(冷榨)10.0g，硝酸钾0.25Kg，六水合氯化钴6.0mg，轻质碳酸钙6.0g，水1000mL)。pH值自然，搅拌均匀，分装于三角瓶(容量250ml)中，每瓶60ml。
b、摇瓶培养基的灭菌：分装好的摇瓶培养基置入湿热灭菌柜中进行湿热灭菌(0.11±0.01Mpa、121℃，30min)，灭菌结束时，冷却至室温，待用。
c、摇瓶菌丝的接种与培养：步骤1)中制备的庆大霉素孢子斜面严格按无菌操作，于超净台上，在火焰保护下用无菌接种棒挑取茄子瓶斜面孢子于摇瓶培养基内，塞好棉塞，用牛皮纸包好扎紧瓶口，置于恒温间摇瓶机上培养，温度36-37℃，培养24～40小时，并瓶备用。
3)将步骤2)制备的摇瓶菌丝在火焰保护下接种于灭菌后的一级种子培养基进行一级种子培养，接种量(摇瓶菌丝)按一级种子培养基的0.06％接种，培养温度36℃，培养时间48-54小时，罐压0.04-0.06Mpa,空气流量1：1.5[V/(V·min)]，得到庆大霉素一级种子(本对比例一级种子罐为1m3,一级种子罐培养基体积500L,摇瓶菌丝培养物按0.06％接种，接种量为300mL(5瓶摇瓶菌丝合瓶),培养温度36-37℃，培养时间36-48小时，罐压0.04-0.06Mpa,空气流量1.5m3/min)。
一级种子培养基的配方组成为(W/V)：葡萄糖0.1％，玉米淀粉0.6％，玉米粉1.5％，蛋白胨0.4％，黄豆饼粉(冷榨)1.5％，硝酸钾0.05％，六水合氯化钴0.0006％，轻质碳酸钙0.60％，消沫剂0.01％,余量为水(本对比例葡萄糖0.75Kg，玉米淀粉4.5Kg，玉米粉11.25Kg，蛋白胨3.0Kg，黄豆饼粉(冷榨)11.25Kg，硝酸钾0.375Kg，六水合氯化钴4.5g，轻质碳酸钙4.5Kg，消沫剂75.0g，水750L)。用蒸汽0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
4)将步骤3)制备的庆大霉素一级种子接种于灭菌后的二级种子培养基进行二级种子培养，接种量按二级种子培养基的6-8％接种，培养温度35-37℃，培养时间30-36小时，罐压0.03-0.05Mpa,空气流量1：1.2[V/(V·min)]，得到庆大霉素二级种子(本对比例二级种子罐容积为20m3,二级种子罐培养基体积12m3,培养温度35-37℃，培养时间30-36小时，罐压0.03-0.05Mpa,空气流量15m3/min)。
二级种子培养基的配方组成为(W/V)：玉米淀粉3.5％，玉米粉1.5％，蛋白胨0.5％，黄豆饼粉(冷榨)3.0％，硝酸钾0.01％，硫酸铵0.1％，六水合氯化钴0.001％，轻质碳酸钙0.65％，淀粉酶0.005％，消沫剂0.015％,余量为水(本对比例玉米淀粉420Kg，玉米粉180Kg，蛋白胨60Kg，黄豆饼粉(冷榨)360Kg，硝酸钾1.2Kg，硫酸铵12Kg，六水合氯化钴120.0g，轻质碳酸钙78Kg，淀粉酶60.0g，消沫剂1.8Kg，水12m3)。用蒸汽0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
6)将步骤5)制备的庆大霉素二级种子接种于灭菌后的发酵培养基进行发酵培养，接种量按发酵培养基的25-30％接种，发酵时间110-160小时，罐压0.01-0.03Mpa,空气流量1：0.8-1.0[V/(V·min)]，培养温度全程35-37℃，0-50小时用无菌液碱控制pH6.5-7.2，,50小时用无菌液碱控制pH7.0-7.8。(本对比例发酵罐容积为60m3,发酵罐培养基体积50m3)。
a、发酵培养基的配方组成为(W/V)：玉米淀粉4.5％，玉米粉1.0％，蛋白胨1.5％，鱼粉0.5％，黄豆饼粉(冷榨)2.0％，硝酸钾0.01％，硫酸铵0.1％，六水合氯化钴0.001％，轻质碳酸钙0.80％，淀粉酶0.005％，消沫剂0.02％,余量为水(本对比例玉米淀粉1710Kg，玉米粉380Kg，蛋白胨570Kg，鱼粉190Kg，黄豆饼粉(冷榨)640Kg，硝酸钾3.8Kg，硫酸铵38Kg，六水合氯化钴380.0g，轻质碳酸钙304Kg，淀粉酶190.0g，消沫剂7.6Kg，水38m3)。用蒸汽0.11±0.01Mpa、121℃、30min灭菌处理，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
b、发酵罐培养条件为：
c、温度控制：全程培养温度35-37℃
d、pH控制：0-50小时通过补入无菌液碱控制pH6.5-7.2，50小时后通过补入无菌液碱控制pH7.0-7.8；
e、罐压控制：发酵全程控制罐压0.01-0.03Mpa；
f、空气流量：0-30小时空气流量48m3/min，30-90小时空气流量60m3/min)，90小时-放罐空气流量48m3/min；
g、搅拌转速：0-30小时变频控制搅拌转速80-100rpm，30-90小时变频控制搅拌转速120-150rpm，90小时-放罐变频控制搅拌转速90-120rpm；
h、溶解氧：通过调节搅拌转速和空气流量，全程控制溶解氧20％以上；
i、发酵周期：115小时；
发酵培养115小时，发酵结束，放罐体积55.2吨，发酵单位1275μ/ml。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种绛红小单孢菌短周期发酵生产低杂质庆大霉素的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)用无菌接种棒挑取庆大霉素砂土孢子或成熟母瓶孢子于茄子瓶斜面培养基进行孢子培养，培养温度36.5-37.5℃，培养时间9-10天，培养好的孢子斜面，保存于冰箱2-8℃待用；
2)将步骤1)制备的庆大霉素孢子斜面严格按无菌操作，将50-60ml无菌水倒入单支斜面进行刮孢子，然后收集到经灭菌的三角瓶中，制得孢悬液；
3)将步骤2)制备的孢悬液在火焰保护下接种于灭菌后的一级种子培养基进行一级种子培养，孢悬液接种量按一级种子培养基体积的0.04％-0.08％接种，培养温度36-37℃，培养时间48-54小时，罐压0.04-0.06Mpa,空气流量1：1.2-2.0[V/(V·min)]，得到庆大霉素一级种子；
4)将步骤3)制备的庆大霉素一级种子接种于灭菌后的二级种子培养基进行二级种子培养，接种量按二级种子培养基体积的8％-15％接种，培养温度35-37℃，培养时间36-42小时，罐压0.03-0.05Mpa,空气流量1：1.0-1.5[V/(V·min)]，得到庆大霉素二级种子；
5)将步骤4)制备的庆大霉素二级种子接种于灭菌后的三级种子培养基进行三级种子培养，接种量按三级种子培养基体积的20％-30％接种，培养温度35-37℃，培养时间20-24小时，罐压0.03-0.05Mpa,空气流量1：1.0-1.2[V/(V·min)]，得到庆大霉素三级种子；
6)将步骤5)制备的庆大霉素三级种子接种于灭菌后的发酵培养基进行发酵培养，接种量按发酵培养基体积40％的接种，发酵时间70-90小时，罐压0.01-0.03Mpa,空气流量1：0.6-1.0[V/(V·min)]，0-30小时培养温度35-37℃，用无菌液碱控制pH6.5-7.2；25-35小时后培养温度34-35℃,用无菌液碱控制pH7.0-7.8，在25-35小时补加一次732树脂，在50-60小时再次补加732树脂，通过732树脂吸附得到庆大霉素发酵产物。
2.根据权利要求1所述的绛红小单孢菌短周期发酵生产低杂质庆大霉素的方法，其特征在于：所述步骤1)中，茄子瓶斜面培养基的配方组成按质量体积分数计为：玉米淀粉0.50％-0.80％，小麦麸皮溶磷小于5000PPM、淀粉含量小于15％的小麦麸皮1.5％-2.0％，琼脂1.5％-2.0％，天冬素0.001％-0.0013％，轻质碳酸钙0.08％-0.12％，硝酸钾0.08％-0.12％，氯化钠0.03％-0.08％，硫酸镁0.03％-0.08％，磷酸氢二钾0.02％-0.05％，余量为水。
3.根据权利要求2所述的绛红小单孢菌短周期发酵生产低杂质庆大霉素的方法，其特征在于：所述步骤1)具体包括如下步骤：
a、茄子瓶斜面培养基的配制：琼脂按配制总量称好后，放入烧杯内，加入定量的注射用水或蒸馏水煮沸溶解，除轻质碳酸钙外的其它成份均按配制量称好调匀后，倒入煮沸的琼脂水中，搅匀溶解，pH值消前调至7.2-8.0，然后加入称好轻质碳酸钙，搅拌均匀，分装于容量为250ml的茄子瓶中，每瓶60ml；
b、茄子瓶斜面培养基的灭菌：分装好的茄子瓶培养基用0.11±0.01Mpa、121℃的蒸汽灭菌30min，灭菌结束时，待温度降至70℃以下，取出培养基，摇匀即可摆成斜面，待用；
c、孢子接种与培养：将无菌操作用的无菌培养基及无菌操作的全部所用工器具解开包布放入传递窗，经紫外灯照射一小时后放入操作台，于超净台上，在火焰保护下用无菌接种棒挑取砂土孢子于茄子瓶斜面培养基内，先划中线，后从内到外往两边划线均匀铺开，塞好棉塞，用牛皮纸包好扎紧瓶口，置于36.5-37.5℃温度恒温间培养9-10天；
d、斜面孢子保存:2～8℃冰箱保存，待用。
4.根据权利要求1所述的绛红小单孢菌短周期发酵生产低杂质庆大霉素的方法，其特征在于：所述步骤2)中，将60ml纯化水倒入300ml的三角瓶中，扎口用0.11±0.01Mpa、121℃的蒸汽灭菌处理30min，冷却至室温，待用；将无菌操作用的无菌培养基及无菌操作的全部所用工器具解开包布放入传递窗，经紫外灯照射一小时后放入操作台；于超净台上，严格按无菌操作，将50-60ml无菌水倒入斜面进行刮孢子，然后收集到经灭菌的空三角瓶中，逐瓶操作。
5.根据权利要求1所述的绛红小单孢菌短周期发酵生产低杂质庆大霉素的方法，其特征在于：所述步骤3)中，一级种子培养基的配方组成按质量体积分数计为：葡萄糖0.05％-0.15％，玉米淀粉0.4％-1.0％，玉米粉1.0％-2.0％，蛋白胨0.3％-0.8％，冷榨的黄豆饼粉1.0％-2.0％，硝酸钾0.03％-0.08％，六水合氯化钴0.0005％-0.0010％，轻质碳酸钙0.40％-1.0％，消沫剂0.01％-0.02％,余量为水；一级种子培养基使用前，用0.11±0.01Mpa、121℃的蒸汽灭菌处理30min，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
6.根据权利要求1所述的绛红小单孢菌短周期发酵生产低杂质庆大霉素的方法，其特征在于：所述步骤4)中，二级种子培养基的配方组成按质量体积分数计为：玉米淀粉3.0％-4.0％，玉米粉1.0％-2.0％，蛋白胨0.3％-0.8％，冷榨的黄豆饼粉2.0％-4.0％，硝酸钾0.006-0.015％，硫酸铵0.06％-0.15％，六水合氯化钴0.0006％-0.0015％，轻质碳酸钙0.5％-1.0％，淀粉酶0.005％-0.010％，消沫剂0.015％-0.030％,余量为水；二级种子培养基使用前，用0.11±0.01Mpa、121℃的蒸汽灭菌处理30min，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
7.根据权利要求1所述的绛红小单孢菌短周期发酵生产低杂质庆大霉素的方法，其特征在于：所述步骤5)中，三级种子培养基的配方组成按质量体积分数计为：玉米淀粉3.0％-4.0％，玉米粉1.0％-2.0％，蛋白胨0.3％-0.8％，冷榨的黄豆饼粉2.0％-4.0％，硝酸钾0.006-0.015％，硫酸铵0.06％-0.15％，六水合氯化钴0.0006％-0.0015％，轻质碳酸钙0.5％-1.0％，淀粉酶0.005％-0.010％，消沫剂0.015％-0.030％,余量为水；三级种子培养基使用前，用0.11±0.01Mpa、121℃的蒸汽灭菌处理30min，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
8.根据权利要求1所述的绛红小单孢菌短周期发酵生产低杂质庆大霉素的方法，其特征在于：所述步骤6)中，发酵培养基的配方组成按质量体积分数计为：玉米淀粉5.0％-7.0％，玉米粉0.50％-1.50％，蛋白胨0.50％-0.80％，冷榨的黄豆饼粉2.0％-4.0％，硝酸钾0.006-0.015％，硫酸铵0.06％-0.15％，六水合氯化钴0.0006％-0.0015％，轻质碳酸钙0.5％-1.0％，淀粉酶0.005％-0.010％，消沫剂0.02％-0.05％,余量为水；三发酵培养基使用前，用0.11±0.01Mpa、121℃的蒸汽灭菌处理30min，冷却至37℃，用无菌空气保压待用。
9.根据权利要求1所述的绛红小单孢菌短周期发酵生产低杂质庆大霉素的方法，其特征在于：所述步骤6)中：发酵罐培养条件为：
a、温度控制：0-30小时培养温度35-37℃，30小时后培养温度34-35℃；
b、pH控制：0-30小时通过补入无菌液碱控制pH6.5-7.2，30小时后通过补入无菌液碱控制pH7.2-7.8；
c、罐压控制：发酵全程控制罐压0.01-0.03Mpa；
d、空气流量：0-15小时空气流量1：0.8-1.0[V/(V·min)]，15-60小时空气流量1：1.0-1.2[V/(V·min)]，60小时-放罐空气流量1：0.6-0.8[V/(V·min)]；
e、搅拌转速：0-15小时变频控制搅拌转速80-100rpm，15-60小时变频控制搅拌转速120-150rpm，60小时-放罐变频控制搅拌转速90-120rpm；
f、溶解氧：通过调节搅拌转速和空气流量，全程控制溶解氧20％以上；
g、发酵周期：70-80小时；
h、在发酵过程中，25-35h补入消毒处理的732树脂，补入732树脂数量按发酵培养基体积的0.8％-1.2％,50-60h再次补入消毒处理的732树脂，补入732树脂数量按发酵培养基体积的1.2％-2.0％。
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