KR20180052936A - 미생물 발효 배양액으로부터 겐타마이신 b를 회수 또는 정제하는 방법 - Google Patents

미생물 발효 배양액으로부터 겐타마이신 b를 회수 또는 정제하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 일 예에 따른 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법은 겐타마이신 B 및 이의 유연물질을 함유하는 미생물 발효 배양액을 양이온 교환수지에 통과시켜 겐타마이신 B를 흡착하고, 용리제를 사용하여 겐타마이신 B를 용리시킨 후, 겐타마이신 B 함유 용리액을 음이온 교환수지에 통과시켜 탈색시키는 것을 기본 구성으로 한다. 본 발명에 따른 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법은 공정이 단순하고 겐타마이신 B의 회수 수율 또는 정제 순도가 높기 때문에 일반적으로 행하여지는 정제공정의 경제적 부담, 복잡한 공정 및 낮은 정제 수율을 극복할 수 있고, 원가 경쟁력을 가지며 대량생산에 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법을 이용하면 이세파마이신 등과 같은 항생제의 전구물질로 사용되는 고품질의 겐타마이신 B를 확보할 수 있다.

Description

미생물 발효 배양액으로부터 겐타마이신 B를 회수 또는 정제하는 방법{Method for recovering or purifying gentamicin B from fermented culture medium of microorganism}
본 발명은 미생물 발효 배양액으로부터 겐타마이신 B를 회수 또는 정제하는 방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 겐타마이신 B 및 이의 유연물질을 포함하는 미생물 발효 배양액으로부터 겐타마이신 B를 고수율로 회수하거나 고순도로 정제하는 방법에 관한 것이다.
겐타마이신은 마이크로모노스포라 푸르프레아(micromonospora purprea) 또는 마이크로모노스포라 에키노스포라(micromonospora echinospora)가 생산하는 아미노글리코사이드계 항생물질로서, 그람양성균 중 포도상구균과 그람음성균 중 대장균, 살모넬라균 및 이의 변형균, 그리고 녹농균 등에 효과가 있다. 또한, 겐타마이신은 페니실린이나 암피실린(ampicillin)과 함께 장내구균성 심내막염의 치료에도 사용된다.
겐타마이신은 유연물질로 불리는 수많은 성분이 존재한다. 겐타마이신을 구성하는 주요 성분은 겐타마이신 C 복합체이고, 겐타마이신 C 복합체는 겐타마이신 C1, 겐타마이신 C1a, 겐타마이신 C2 등을 포함한다. 겐타마이신 C 복합체는 겐타마이신의 약 80%를 구성하며 임상에서 주로 사용된다. 또한, 겐타마이신을 구성하는 마이너 성분으로는 겐타마이신 A, 겐타마이신 A1, 겐타마이신 X2, 겐타마이신 B, 겐타마이신 B1 등이 있고, 상기 마이너 성분은 겐타마이신의 약 20%를 구성한다. 하기 화학식 1 및 화학식 2는 다양한 겐타마이신 또는 이의 유도체의 기본 구조를 나타낸 것이고 표 1은 화학식 1 및 화학식 2의 구조에 해당하는 겐타마이신과 이의 유도체 종류를 구체적으로 나타낸 것이다.
Figure pat00001
Figure pat00002
겐타마이신 종류 R1 R2 R3 R4 R5 R6 화학식
A H OH NHCH3 OH H NH2 1
A1 OH H NHCH3 OH H NH2 1
X2 CH3 OH NHCH3 OH H NH2 1
B CH3 OH NHCH3 NH2 H OH 1
B1 CH3 OH NHCH3 NH2 CH3 OH 1
C1 CH3 OH NHCH3 NHCH3 CH3 NH2 2
C1a CH3 OH NHCH3 NH2 H NH2 2
C2 CH3 OH NHCH3 NH2 CH3 NH2 2
G-418 CH3 OH NHCH3 OH CH3 NH2 1
JI-20A CH3 OH NHCH3 NH2 H NH2 1
JI-208 CH3 OH NHCH3 CH2NH2 CH3 NH2 1
상기 겐타마이신의 제조와 관련하여 대한민국 등록특허 제10-0032788호에는 마이크로모노스포라(Micromonospora)속에 속하는 미생물 변이주(KFCC 10346)를 영양배지에서 호기적으로 배양할 때 무기염원으로 염화마그네슘 또는 염화망간을 0.2-0.4g/l로 첨가함을 특징으로 하는 겐타마이신의 제조방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허 제10-0029275호에는 마이크로모노스포라속에 속하며 고농도의 젠타마이신 첨가 배지에서 생육이 가능한 변이주 마이크로모노스포라 퍼퓨리아(KFCC-10346)를 영양 배지에서 호기적으로 배양하여 배지에 젠타마이신을 생성, 축적함을 특징으로 하는 발효에 의한 겐타마이신의 제조방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허 제10-2009-0005436호에는 겐타마이신을 생합성하지 않는 이종숙주에 유전자 gntB, gntA, gntP, gntZ, gntD, btrD, kacA 및 neo16를 재조합하여 구성되는 재조합 균주를 이용하여 겐타마이신, 파로마민(paromamine), 2’-N-아세틸 파로마민(2’-N-acetylparomamine) 및 2-데옥시스트렙타민(2-deoxystreptamine)으로 이루어진 그룹 중 선택된 1종 이상의 물질을 생산하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허 제10-0519142호에는 겐타마이신 B를 생산하는 마이크로모노스포라 푸르푸리아(Micromonospora purpurea) KCTC 10506BP 균주 및 이를 겐타마이신 B 생산배지에 배양하여 겐타마이신 B를 제조하는 방법이 개시되어 있다.
한편, 하기 화학식 3의 구조를 갖는 이세파마이신(isepamicin)은 겐타마이신(즉, 겐타마이신 C 복합체)에 비해 생체 독성이 훨씬 낮은 것으로 알려져 있으며, 겐타마이신 내성균주에 대해 탁월한 항생효과를 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 상기 이세파마이신은 미국 특허 제4,136,254호 및 제4,283,528호에서 개시한 바와 같이, 겐타마이신 B의 3,6' 아미노기를 벤질옥시카르보닐기로 보호하고 이를 N-(R-베타-벤질옥시카르보닐아미노-알파-히드록시프로피오닐옥시)숙신이미드와 반응시켜 겐타마이신 B의 1번 탄소 위치의 아민기에 알파-히드록시-베타-아미노프로피오닐기(α-hydroxy-β-aminopropionyl group)를 결합시킴으로써 제조할 수 있다. 따라서, 이세파마이신의 생산성을 높이기 위해서는 이세파마이신 제조에 필수적으로 사용되는 전구체인 겐타마이신 B의 생산성의 향상과 더불어 정제 순도를 높이는 것이 당업계에 요구되고 있다.
Figure pat00003
현재 겐타마이신 B 생산에 특화된 균주의 발효 역가는 800mg/ℓ 정도인 것으로 알려져 있으며, 균주의 개량 및 빌효 조건 최적화를 통해 짧은 시일 안에 1,000~1,500mg/ℓ 까지 도달할 수 있을 것으로 예상된다. 그러나 겐타마이신 B 생산 균주의 발효과정에서 겐타마이신 B와 구조가 유사한 여러 가지 다른 겐타마이신 유연성분이 함께 생성되기 때문에 발효 역가가 높아도 정제가 곤란하다는 문제점이 있다. 따라서, 높은 순도의 겐타마이신 B를 확보할 수 있는 정제방법의 연구가 필요하다. 겐타마이신 등과 같은 항생제의 분리 또는 정제방법과 관련하여 대한민국 등록특허 제10-1366216호에는 (a) 세프카펜 피복실(cefcapene pivoxil)의 염산염을 C1 내지 C3의 알코올의 1차 용매로 용해시키는 단계; (b) 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 벤젠, 헥산, 아세톤, 메틸이소부틸케톤 및 메틸에틸케톤으로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상을 포함하는 2차 용매를 첨가하여 희석시키는 단계; 및 (c) 염산 수용액을 추가로 첨가하는 단계를 포함하는 세프카펜 피복실 염산염의 정제방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허 제10-0430202호에는 지지 용액이 콜산의 술포베타인 쯔비터이온 유도체인 세제 및 우레아의 수성 혼합물임을 특징으로 하는, 고정 쯔비터 이온 막을 갖는 다격실 전해조 중에서의 등전성 집속을 사용하는, 달바헵티드 계 항생제 화합물의 정제 방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허 제10-2001-0024027호에는 -5 내지 20℃ 사이의 온도에서, FG가 용액내에 잔류하는 농도에서 혼합물의 pH가 3 내지 8 사이가 되도록 하고, 수득된 고체 β-락탐 항생제를 회수하고, 잔류 액체의 온도를 10 내지 60℃ 사이로 올리고, 고체 FG를 형성하고, FG를 고체로 분리하여 석출시키고, 모액을 적어도 부분적으로 재순환시키는 것으로 이루어진 용액내 β-락탐 항생제 및 D-페닐 글리신(FG)을 함유하는 혼합물로부터 β-락탐 항생제의 회수방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허 제10-2001-0024028호에는 FG가 용액내에 잔류하는 농도에서, β-락탐 항생제 및 D-페닐 글리신(FG)을 함유하는 혼합물의 pH가 pH 3 내지 8이 되도록 하고, 수득된 고체 β-락탐 항생제를 회수하고, 및 고체 β-락탐 항생제 및 고체 FG를 갖는 슬러리를 형성하고, 상기 슬러리의 pH를 β-락탐 항생제가 용해하는 pH로 되게 하고, FG를 고체로서 분리시키고, 모액내에 존재하는 β-락탐 항생제를 적어도 일부 사용하는 농축단계로 잔류 액체를 보내는, β-락탐 항생제와 D-페닐 글리신을 함유하는 혼합물로부터 β-락탐 항생제를 회수하는 방법이 개시되어 있다. 그러나 겐타마이신 B 및 겐타마이신 B와 유사한 구조를 가지는 다른 겐타마이신이 함유된 미생물 발효 배양액으로부터 겐타마이신 B를 고순도로 정제하는 방법에 대해서는 상기 선행기술들에 전혀 개시되어 있지 않다.
본 발명은 종래의 기술적 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 겐타마이신 B 및 이의 유연물질이 함유된 미생물 발효 배양액에서 겐타마이신을 고수율로 회수하거나 고순도로 정제하는 방법을 제공하는데에 있다.
상기 목적을 해결하기 위하여 본 발명의 일 예는 겐타마이신 B 및 겐타마이신 B의 유연물질을 함유하는 미생물 발효 배양액을 여과하여 겐타마이신 B 함유 여과액을 얻는 단계; 상기 겐타마이신 B 함유 여과액을 약산성 양이온 교환수지와 접촉시켜 겐타마이신 B를 흡착시키는 단계; 상기 양이온 교환수지에 흡착된 겐타마이신 B를 용리제로 용리시켜 겐타마이신 B 함유 용리액을 얻는 단계; 및 상기 겐타마이신 B 함유 용리액 또는 이의 농축액을 강염기성 음이온 교환수지와 접촉시켜 탈색하는 단계를 포함하는 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법을 제공한다.
본 발명의 일 예에 따른 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법에서 상기 겐타마이신 B의 유연물질은 미크로노마이신(micronomicin), 겐타마이신 A, 겐타마이신 A1, 겐타마이신 X2, 겐타마이신 B1, 겐타마이신 C1, 겐타마이신 C1a 또는 겐타마이신 C2에서 선택되는 1종 이상으로 구성될 수 있고, 바람직하게는 미크로노마이신(micronomicin) 및 겐타마이신 C1a의 조합으로 구성될 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법에서 상기 미생물은 겐타마이신 B 및 이의 유연물질을 생산하는 미생물이라면 그 종류가 크게 한정되지 않으며, 예를 들어 마이크로모노스포라 푸르푸리아(Micromonospora purpurea), 마이크로모노스포라 에키노스포라(Micromonospora echinospora) 또는 이들의 변이 균주에서 선택될 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 겐타마이신 B 및 이의 유연물질을 생산하는 미생물로 마이크로모노스포라 푸르푸리아(Micromonospora purpurea) ATCC 15835 균주, 마이크로모노스포라 푸르푸리아(Micromonospora purpurea) KCTC 10506BP 균주를 포함할 수 있다. 상기 마이크로모노스포라 푸르푸리아(Micromonospora purpurea) KCTC 10506BP 균주는 대한민국 등록특허 제10-0519142호에 개시되어 있다.
본 발명의 일 예에 따른 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법에서 상기 미생물 발효 배양액의 여과는 원심분리, 여과지, 여과포, 규조토, 파라셀(PARACELL) 또는 이들에서 선택되는 2가지 이상의 조합에 의해 수행될 수 있고, 원심분리 및 파라셀(PARACELL)의 조합에 의해 수행되는 것이 바람직하다. 이와 관련하여, 본 발명의 일 예에 따른 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법에서 상기 겐타마이신 B 함유 여과액을 얻는 단계는 a1) 겐타마이신 B 및 겐타마이신 B의 유연물질을 함유하는 미생물 발효 배양액의 pH를 1.5~4.5로 조정한 후 원심분리하여 겐타마이신 B 함유 상등액을 얻는 단계; 및 a2) 상기 겐타마이신 B 함유 상등액의 pH를 5.5~7.0으로 조정한 후 여과지, 여과포, 규조토 또는 파라셀(PARACELL)에서 선택되는 어느 하나로 여과하는 단계로 구성되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 a1) 단계는 겐타마이신 B 및 겐타마이신 B의 유연물질을 함유하는 미생물 발효 배양액의 pH를 2~3으로 조정하고 2~8℃에서 10시간 이상(예를 들어 12~24시간) 방치한 후 원심분리하여 원심분리하여 겐타마이신 B 함유 상등액을 얻는 것으로 구성되는 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 a2) 단계는 겐타마이신 B 함유 상등액의 pH를 6.0~6.8으로 조정하고 8~20시간 동안 방치한 후 파라셀(PARACELL)로 여과하는 것으로 구성되는 것이 더 바람직하다.
본 발명의 일 예에 따른 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법에서 상기 약산성 양이온 교환수지는 다공성 타입이고 입자 크기가 10~60 메쉬(mesh) 인 것이 바람직하다. 또한, 상기 약산성 양이온 교환수지는 입자 크기가 15~50 메쉬(mesh) 인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 약산성 양이온 교환수지는 카르복실산을 교환기로 사용하는 것이 더 바람직하다. 상기 약산성 양이온 교환수지는 상업적으로 입수가 가능하며, 상업적인 제품으로는 Amberite IRC-50, Amberite IRC-50S, Amberite IRP-64, Dowex CCR-3 등이 있다.
본 발명의 일 예에 따른 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법에서 상기 용리제는 0.1~0.5N 농도의 암모니아수인 것이 바람직하고, 0.1~0.3N 농도의 암모니아수인 것이 바람직하다. 이와 관련하여 본 발명의 일 예에 따른 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법에서 상기 겐타마이신 B 함유 용리액을 얻는 단계는 겐타마이신 B가 흡착된 양이온 교환수지를 물로 세척하고 용리제인 0.1~0.3N 농도의 암모니아수를 양이온 교환수지와 접촉시켜 양이온 교환수지에 흡착된 겐타마이신 B 및 겐타마이신 b의 유연물질을 용리시키는 것으로 구성되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 상기 겐타마이신 B 함유 용리액 내 겐타마이신 B의 함량은 겐타마이신 유연물질 전체 중량을 기준으로 90% 이상인 것이 바람직하고 95% 이상인 것이 더 바람직하다.
본 발명의 일 예에 따른 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법에서 상기 강염기성 음이온 교환수지는 겔(gel) 타입이고 입자 크기가 50~400 메쉬(mesh)인 것이 바람직하다. 또한, 상기 강염기성 음이온 교환수지는 입자 크기가 50~200 메쉬(mesh)인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 강염기성 음이온 교환수지는 4급 암모늄기를 교환기로 사용하는 것이 더 바람직하다. 상기 강염기성 음이온 교환수지는 상업적으로 입수가 가능하며, 상업적인 제품으로는 Dowex 1X2-200, Dowex 1X2-100, Dowex 1X2-400, Amberite IRA-743, DIAION SA10A, DIAION SA11A, DIAION SA12A, DIAION SA20A 등이 있다. 또한, 상기 겐타마이신 B 함유 용리액은 겐타마이신 B 농도가 소정의 값이 될 때까지 강염기성 음이온 교환수지와 접촉하기 전에 농축되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 겐타마이신 B 함유 용리액의 농축액 내 겐타마이신 B 농도는 8,000~30,000 ㎍/㎖인 것이 바람직하고, 8,000~15,000 ㎍/㎖인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 겐타마이신 B 함유 용리액 또는 이의 농축액은 강염기성 음이온 교환수지와 접촉하기 전에 pH가 5.5~7.5로 조정되는 것이 바람직하고, 5.5~6.5로 조정되는 것이 더 바람직하다.
본 발명의 일 예에 따른 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법은 바람직하게는 강염기성 음이온 교환수지에 의해 탈색된 겐타마이신 B 함유 용리액 또는 이의 농축액을 분말화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 분말화 방법으로는 스프레이 드라이, 동결건조 등을 사용할 수 있다. 또한, 강염기성 음이온 교환수지에 의해 탈색된 겐타마이신 B 함유 용리액 또는 이의 농축액은 분말화를 용이하게 하기 위해 추가로 더 농축될 수 있다.
상기 목적을 해결하기 위하여 본 발명의 다른 예는 겐타마이신 B 및 겐타마이신 B의 유연물질을 함유하는 미생물 발효 배양액을 여과하여 겐타마이신 B 함유 여과액을 얻는 단계; 상기 겐타마이신 B 함유 여과액을 약산성 양이온 교환수지와 접촉시켜 겐타마이신 B를 흡착시키고, 물로 양이온 교환수지를 세척하고, 양이온 교환수지에 흡착된 겐타마이신 B를 제1 용리제로 용리시켜 겐타마이신 B 함유 제1 용리액을 얻는 단계; 상기 겐타마이신 B 함유 제1 용리액을 약산성 양이온 교환수지와 접촉시켜 겐타마이신 B를 재흡착시키고, 물로 양이온 교환수지를 세척하고, 양이온 교환수지에 재흡착된 겐타마이신 B를 제2 용리제로 용리시켜 겐타마이신 B 함유 제2 용리액을 얻는 단계; 및 상기 겐타마이신 B 함유 제2 용리액 또는 이의 농축액을 강염기성 음이온 교환수지와 접촉시켜 탈색하는 단계를 포함하는 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법을 제공한다. 본 발명의 다른 예에 따른 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법은 겐타마이신 B를 약산성 양이온 교환수지에 흡착시키고 용리제로 용리하는 것을 2번 반복하는 재흡착 방법을 사용한다.
본 발명의 다른 예에 따른 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법에서 상기 약산성 양이온 교환수지는 다공성 타입이고 입자 크기가 10~60 메쉬(mesh)이고 카르복실산을 교환기로 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 예에 따른 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법에서 상기 제1 용리제는 0.1~0.3N 농도의 암모니아수이고 제2 용리제는 0.4~0.6N 농도의 암모니아수인 것이 바람직하다. 이와 관련하여, 상기 겐타마이신 B 함유 제1 용리액을 얻는 단계는 상기 겐타마이신 B 함유 여과액을 약산성 양이온 교환수지와 접촉시켜 겐타마이신 B를 흡착시키고, 물로 양이온 교환수지를 세척하고, 양이온 교환수지에 흡착된 겐타마이신 B를 제1 용리제인 0.15~0.25N 농도의 암모니아수로 용리시키는 것으로 구성될 수 있다. 또한, 상기 겐타마이신 B 함유 제2 용리액을 얻는 단계는 겐타마이신 B 함유 제1 용리액을 약산성 양이온 교환수지와 접촉시켜 겐타마이신 B를 재흡착시키고, 물로 양이온 교환수지를 세척하고, 0.1~0.2N 농도의 암모니아수를 이용하여 예비적으로 용리한 후, 양이온 교환수지에 재흡착된 겐타마이신 B를 제2 용리제인 0.4~0.6N 농도의 용리제로 용리시키는 것으로 구성될 수 있다. 또한, 상기 겐타마이신 B 함유 제2 용리액은 강산성 음이온 교환수지와 접촉하기 전에 겐타마이신 B 농도가 8,000~30,000 ㎍/㎖(바람직하게는 8,000~15,000 ㎍/㎖)가 되도록 농축되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 겐타마이신 B 함유 제2 용리액 또는 이의 농축액은 강산성 음이온 교환수지와 접촉하기 전에 pH가 5.5~7.5(바람직하게는 6.0~6.8)로 조정되는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 예에 따른 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법에서 상기 강염기성 음이온 교환수지는 겔(gel) 타입이고 입자 크기가 50~200 메쉬(mesh)이고 4급 암모늄기를 교환기로 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 예에 따른 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법에서 상기 겐타마이신 B 함유 여과액을 얻는 단계는 a1) 겐타마이신 B 및 겐타마이신 B의 유연물질을 함유하는 미생물 발효 배양액의 pH를 1.5~4.5로 조정한 후 원심분리하여 겐타마이신 B 함유 상등액을 얻는 단계; 및 a2) 상기 겐타마이신 B 함유 상등액의 pH를 5.5~7.0으로 조정한 후 여과지, 여과포, 규조토 또는 파라셀(PARACELL)에서 선택되는 어느 하나로 여과하는 단계로 구성되는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 예에 따른 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법은 본 발명의 일 예에 따른 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법의 용리액을 얻는 단계가 제1 용리액을 얻는 단계 및 제2 용리액을 얻는 단계로 구성되는 점에서 차이가 있는바 나머지 구성의 특징에 대해서는 본 발명의 일 예에 따른 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법에서 설명한 내용을 참조한다.
본 발명에 따른 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법은 공정이 단순하고 겐타마이신 B의 회수 수율 또는 정제 순도가 높기 때문에 일반적으로 행하여지는 정제공정의 경제적 부담, 복잡한 공정 및 낮은 정제 수율을 극복할 수 있고, 원가 경쟁력을 가지며 대량생산에 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법을 이용하면 이세파마이신 등과 같은 항생제의 전구물질로 사용되는 고품질의 겐타마이신 B를 확보할 수 있다.
도 1은 실시예 12의 방법으로 얻은 정제된 겐타마이신 B 분말을 HPLC로 분석한 결과이고, 도 2는 실시예 12의 방법으로 얻은 정제된 겐타마이신 B 분말을 HPLC-ELSD로 분석한 결과이다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "겐타마이신 유연물질"은 겐타마이신을 구성하는 성분인 겐타마이신 A, A1, X2, B, B1, C1, C1a, C2 뿐만 아니라 미크로노마이신(micronomicin), G-418, JI-20A, X2, JI-20B 등과 같은 다양한 유도체를 포함하는 개념이다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "겐타마이신 B의 유연물질"은 겐타마이신을 구성하는 성분들 중 겐타마이신 B를 제외한 나머지 성분들과 미크로노마이신(micronomicin), G-418, JI-20A, X2, JI-20B 등과 같은 다양한 유도체를 포함하는 개념이다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "RV"는 반응기 부피(Reactor Volume)의 약어이며 이온 교환수지 충전 칼럼 시스템에서는 충전된 이온 교환수지의 부피를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "SV"는 공간속도(Space Velocity)의 약어이며 충전층을 통과하는 유체의 유속을 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1 : 겐타마이신 B를 함유하는 미생물 발효 배양액의 제조
겐타마이신 생산 균주인 마이크로모노스포라 에키노스포라(micromonospora echinospora) ATCC 15835 균주를 덱스트린 45 g/ℓ, 옥수수 분말 15 g/ℓ, 탈지 대부분 35 g/ℓ, 펩톤 5 g/ℓ, 탄산칼슘 3 g/ℓ, 황산암모늄 0.3 g/ℓ, 질산칼슘 0.1 g/ℓ, 염화코발트 0.008 g/ℓ의 조성을 가진 배지에 접종하고 약 30℃에서 약 8일 동안 배양하여 겐타마이신 B 및 겐타마이신 B의 유연물질을 함유하는 미생물 발효 배양액을 제조하였다.
실시예 2 : 겐타마이신 B 흡착 수지의 선정
실시예 1에서 제조한 발효 배양액의 pH를 50 중량% 농도의 황산 수용액을 사용하여 2.5로 조정하고 4℃에서 12시간 이상 방치한 후 원심분리하여 발효 상등액을 수득하였다. 이후, 발효 상등액 50㎖를 활성화된 양이온 교환수지(732, Amberlite IR-120) 비드 0.5㎖와 혼합하고 25℃에서 100 rpm의 속도로 2시간 30분 동안 교반하여 겐타마이신 B를 양이온 교환수지 비드에 흡착시켰다. 또한, 발효 상등액 100㎖를 활성화된 다른 양이온 교환수지(Amberlite IRC-50) 비드 0.5㎖와 혼합하고 25℃에서 100 rpm의 속도로 2시간 30분 동안 교반하여 겐타마이신 B를 양이온 교환수지 비드에 흡착시켰다. 또한, 발효 상등액 100㎖를 합성 흡착 수지인 Diaion HP-20 0.5㎖와 혼합하고 25℃에서 100 rpm의 속도로 2시간 30분 동안 교반하여 겐타마이신 B를 합성 흡착 수지에 흡착시켰다. 하기 표 2에 사용한 흡착 수지의 종류에 따른 겐타마이신 B 등의 흡착량을 나타내었다.
흡착 수지 종류 겐타마이신 B 흡착량(㎎/㎖) 미크로노마이신 흡착량(㎎/㎖) 겐타마이신 C1a 흡착량(㎎/㎖)
732 8.70 3.50 2.12
Amberlite IR-120 12.13 5.27 3.13
Amberlite IRC-50 73.65 42.85 21.06
Diaion HP-20 27.35 11.44 5.04
* 732 : 겔 타입의 폴리스티렌 설포네이트로 이루어진 강산성 양이온 교환수지이고, 고분자 골격은 가교된 스티렌-다이비닐벤젠 공중합체임
* Amberlite IR-120 : 겔 타입의 폴리스티렌 설포네이트로 이루어진 강산성 양이온 교환수지임
* Amberlite IRC-50 : 다공성 타입의 약산성 양이온 교환수지이고, 16~50 메쉬(mesh)의 입자 크기를 가지며, 카르복실산을 교환기로 사용함
* Diaion HP-20 : 스티렌과 다이비닐벤젠의 공중합체로 이루어진 합성 흡착 수지로서, 다수의 큰 기공을 가짐
상기 표 2에서 보이는 바와 같이 다공성 약산성 양이온 교환수지인 Amberlite IRC-50은 겐타마이신 B 및 겐타마이신 B의 유연물질을 상대적으로 많이 흡착시켰다.
실시예 3 : 흡착 온도에 따른 겐타마이신 B의 흡착량
실시예 1에서 제조한 발효 배양액의 pH를 50 중량% 농도의 황산 수용액을 사용하여 2.5로 조정하고 4℃에서 12시간 이상 방치한 후 원심분리하여 발효 상등액을 수득하였다. 이후, 상기 발효 상등액의 pH를 30 중량% 농도의 수산화나트륨 수용액을 사용하여 6.5로 조정하고, 발효 상등액 70㎖를 활성화된 Amberlite IRC-50(NH4+) 비드 0.5㎖와 혼합하고 다양한 온도(14, 24, 34℃)에서 100 rpm의 속도로 2시간 30분 동안 교반하여 겐타마이신 B를 양이온 교환수지 비드에 흡착시켰다. 하기 표 3에 흡착 온도별 겐타마이신 B 등의 Amberlite IRC-50 비드로의 흡착량을 나타내었다.
흡착 온도 겐타마이신 B 흡착량(㎎/㎖) 미크로노마이신 흡착량(㎎/㎖) 겐타마이신 C1a 흡착량(㎎/㎖)
14℃ 14.12 15.22 9.10
24℃ 16.37 21.95 10.21
34℃ 18.60 19.94 10.75
상기 표 3에서 보이는 바와 같이 Amberlite IRC-50은 흡착 온도가 높을수록 겐타마이신 B 및 겐타마이신 B의 유연물질을 더 많이 흡착시켰으나 그 차이는 크지 않았다. 따라서, Amberlite IRC-50에 대한 겐타마이신 B 등의 흡착은 상온에서 진행하여도 무방한 것으로 평가된다.
실시예 4 : 발효 상등액의 pH에 따른 겐타마이신 B의 흡착량
실시예 1에서 제조한 발효 배양액의 pH를 50 중량% 농도의 황산 수용액을 사용하여 2.5로 조정하고 4℃에서 12시간 이상 방치한 후 원심분리하여 발효 상등액을 수득하였다. 이후, 상기 발효 상등액의 pH를 30 중량% 농도의 수산화나트륨 수용액을 사용하여 다양한 값(5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0)으로 조정하고, 발효 상등액 70㎖를 활성화된 Amberlite IRC-50(NH4+) 비드 0.5㎖와 혼합하고 25℃에서 100 rpm의 속도로 2시간 30분 동안 교반하여 겐타마이신 B를 양이온 교환수지 비드에 흡착시켰다. 하기 표 4에 발효 상등액의 pH별 겐타마이신 B 등의 Amberlite IRC-50 비드로의 흡착량을 나타내었다.
발효 상등액의 pH 겐타마이신 B 흡착량(㎎/㎖) 미크로노마이신 흡착량(㎎/㎖) 겐타마이신 C1a 흡착량(㎎/㎖)
5.0 20.53 19.67 5.47
5.5 30.13 27.11 8.65
6.0 32.80 29.65 9.47
6.5 39.86 36.23 11.76
7.0 36.57 31.94 11.91
상기 표 4에서 보이는 바와 같이 발효 상등액의 pH가 6일 때 Amberlite IRC-50에 대한 겐타마이신 B 등의 흡착량이 가장 높았다.
실시예 5 : 양이온 교환수지 칼럼 시스템에서 용리제 농도별 흡착물의 용리 특성
실시예 1에서 제조한 발효 배양액의 pH를 50 중량% 농도의 황산 수용액을 사용하여 2.5로 조정하고 4℃에서 12시간 이상 방치한 후 원심분리하여 발효 상등액을 수득하였다. 이후, 상기 발효 상등액의 pH를 30 중량% 농도의 수산화나트륨 수용액을 사용하여 6.5로 조정하고 12시간 동안 방치한 후 여과조제(Filter-Aid)인 파라셀(PARACELL)로 여과하여 발효 여과액을 수득하였다. 이후, 활성화된 Amberlite IRC-50(NH4+) 비드가 충전된 칼럼에 발효 여과액을 3 RV/hr의 속도로 통과시켜 겐타마이신 B 등을 흡착시켰다. 이후, 6 RV의 용량에 해당하는 증류수로 칼럼을 세척한 후, 용리제로 서로 다른 농도(0.15N, 0.2N)의 암모니아수를 각각 0.5 SV의 유속으로 칼럼에 통과시켜 흡착물을 용리하였다. 하기 표 5에 용리액에 포함된 겐타마이신 유연물질 전체 중량을 기준으로 겐타마이신 B가 차지하는 비율이 95% 정도 되었을 때의 겐타마이신 B 회수율을 사용한 용리제별로 나타내었다.
용리제 95% 이상 순도의 겐타마이신 B 회수율(%)
0.15N 암모니아수 21.8
0.2N 암모니아수 68.5
실시예 6 : 겐타마이신 B 함유 용리액 탈색용 활성탄의 선정
상기 실시예 7에서 얻은, 겐타마이신 유연물질 전체 중량을 기준으로 겐타마이신 B가 차지하는 비율이 95% 정도인 용리액을 겐타마이신 B의 농도가 약 100,000~120,000 ㎍/㎖가 될 때까지 농축하였다. 이후, 겐타마이신 B 함유 농축액의 pH를 6M 농도의 황산 수용액을 사용하여 6.0으로 조정하였다. 이후, 활성탄 0.1g을 겐타마이신 B 함유 농축액 0.5㎖와 혼합하고 상온에서 1시간 동안 탈색 반응을 진행시켰다. 하기 표 6은 사용한 활성탄별 겐타마이신 B 회수율과 겐타마이신 B 함유 농축액의 탈색도를 나타낸 것이다.
측정 항목 활성탄 종류(Norit사 제품)
CA1 CN1 CGSP SX-PLUS
겐타마이신 B 회수율(%) 98.0 90.0 75.5 86.0
농축액 탈색도(%) 13.6 30.8 46.2 1.0
상기 표 6에서 보이는 바와 같이 Norit사의 CN1 활성탄을 사용하는 경우 탈색 효과가 상대적으로 우수하였고, 겐타마이신 B의 회수율도 90%를 보였다. 이후의 활성탄 탈색조건 최적화 실험은 Norit사의 CN1 활성탄을 사용하여 수행하였다.
실시예 7 : 탈색 반응 온도별 겐타마이신 B 회수율 및 탈색 효과
상기 실시예 7에서 얻은, 겐타마이신 유연물질 전체 중량을 기준으로 겐타마이신 B가 차지하는 비율이 95% 정도인 용리액을 겐타마이신 B의 농도가 약 100,000~120,000 ㎍/㎖가 될 때까지 농축하였다. 이후, 겐타마이신 B 함유 농축액의 pH를 6M 농도의 황산 수용액을 사용하여 6.0으로 조정하였다. 이후, Norit사의 CN1 활성탄 0.1g을 겐타마이신 B 함유 농축액 0.5㎖와 혼합하고 다양한 온도 조건(20, 40, 60℃)에서 1시간 동안 탈색 반응을 진행시켰다. 하기 표 7은 Norit사의 CN1 활성탄을 사용한 탈색 시험에서 탈색 반응 온도별 겐타마이신 B 회수율과 겐타마이신 B 함유 농축액의 탈색도를 나타낸 것이다.
측정 항목 탈색 반응 온도
20℃ 40℃ 60℃
겐타마이신 B 회수율(%) 97.1 92.2 91.0
농축액 탈색도(%) 9.2 30.5 36.8
Norit사의 CN1 활성탄을 사용한 탈색 효과는 탈색 반응 온도가 높을수록 우수하였으나, 겐타마이시 B의 회수율은 탈색 반응 온도가 높을수록 떨어지는 경향을 보였다. 다만, 탈색 반응 온도가 60℃인 경우에도 겐타마이신 B의 회수율은 90% 이상으로 나타났다.
실시예 8 : 겐타마이신 B 함유 농축액의 pH별 활성탄의 탈색 효과
상기 실시예 7에서 얻은, 겐타마이신 유연물질 전체 중량을 기준으로 겐타마이신 B가 차지하는 비율이 95% 정도인 용리액을 겐타마이신 B의 농도가 약 100,000~120,000 ㎍/㎖가 될 때까지 농축하였다. 이후, 겐타마이신 B 함유 농축액의 pH를 6M 농도의 황산 수용액을 사용하여 다양한 값(5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 8.0)으로 조정하였다. 이후, Norit사의 CN1 활성탄 0.1g을 pH가 조정된 겐타마이신 B 함유 농축액 0.5㎖와 혼합하고 60℃에서 1시간 동안 탈색 반응을 진행시켰다. 하기 표 8은 Norit사의 CN1 활성탄을 사용한 탈색 시험에서 겐타마이신 B 함유 농축액의 pH별 겐타마이신 B 회수율과 겐타마이신 B 함유 농축액의 탈색도를 나타낸 것이다.
측정 항목 겐타마이신 B 함유 농축액의 pH
5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 8.0
겐타마이신 B 회수율(%) 77.7 72.3 67.4 63.4 71.9 68.2
농축액 탈색도(%) 90.4 90.1 90.0 84.5 84.3 72.6
실시예 9 : 음이온 교환수지를 이용한 탈색 실험
상기 실시예 7에서 얻은, 겐타마이신 유연물질 전체 중량을 기준으로 겐타마이신 B가 차지하는 비율이 95% 정도인 용리액을 겐타마이신 B의 농도가 약 10,000~13,000 ㎍/㎖가 될 때까지 농축하였다. 이후, 겐타마이신 B 함유 농축액의 pH를 6M 농도의 황산 수용액을 사용하여 다양한 값(6.0, 7.0, 8.0, 9.0)으로 조정하였다. 이후, 활성화된 음이온 교환수지(Dowex 1X2-200, 삼양사의 SAR10MB) 0.5㎖를 pH가 조정된 겐타마이신 B 함유 농축액 0.5㎖와 혼합하고 상온에서 25분 동안 탈색 반응을 진행시켰다. 하기 표 9는 탈색 실험에 사용한 음이온 교환수지 종류 및 겐타마이신 B 함유 농축액의 pH별 겐타마이신 B 회수율을 나타낸 것이고, 하기 표 10은 탈색 실험에 사용한 음이온 교환수지 종류 및 겐타마이신 B 함유 농축액의 pH별 겐타마이신 B 함유 농축액의 탈색도를 나타낸 것이다.
겐타마이신 B 함유 농축액의 pH 겐타마이신 B 회수율(%)
Dowex 1X2-200 SAR10MB
6 59.8 61.8
7 55.2 64.3
8 40.6 42.9
9 52.1 54.8
겐타마이신 B 함유 농축액의 pH 농축액 탈색도(%)
Dowex 1X2-200 SAR10MB
6 96.8 89.4
7 95.9 90.5
8 98.8 93.2
9 98.0 92.9
* Dowex 1X2-200 : 다공성 타입의 강염기성 음이온 교환수지로서, 100~200 메쉬(mesh)의 입자 크기를 가지고, 다공성 Styrene-Divinylbenzene 공중합체를 기본 모체로 하고, 4급 암모늄기를 교환기로 사용함
* SAR10MB : 겔 타입의 강염기성 음이온 교환수지로서, Styrene-Divinylbenzene 공중합체를 기본 모체로 하고, 4급 암모늄기를 교환기로 사용함
상기 표 9 및 표 10에서 보이는 바와 같이 Dowex 1X2-200 음이온 교환수지가 삼양사의 SAR10MB 음이온 교환수지보다 우수한 탈색 효과를 보였으며, 겐타마이신 농축액의 pH별 탈색도 차이는 크지 않았다. 또한, Dowex 1X2-200 음이온 교환수지와 삼양사의 SAR10MB 음이온 교환수지의 겐타마이신 회수율 차이도 크지 않았다. 음이온 교환수지로 Dowex 1X2-200을 사용하고 겐타마이신 농축액의 pH를 6으로 하였을 때 겐타마이신 B의 회수율과 겐타마이신 B 함유 농축액의 탈색도가 모두 우수하였다.
실시예 10 : 음이온 교환수지를 사용한 탈색 과정에서 겐타마이신 B 함유 농축액의 겐타마이신 B 농도별 탈색 효과
상기 실시예 7에서 얻은, 겐타마이신 유연물질 전체 중량을 기준으로 겐타마이신 B가 차지하는 비율이 95% 정도인 용리액을 겐타마이신 B의 농도가 각각 200,000 ㎍/㎖; 100,000 ㎍/㎖; 50,000 ㎍/㎖; 10,000 ㎍/㎖가 될때가지 농축하였다. 이후, 겐타마이신 B의 농도가 다른 겐타마이신 B 함유 농축액의 pH를 6M 농도의 황산 수용액을 사용하여 6.0으로 조정하였다. 이후, 활성화된 Dowex 1X2-200 음이온 교환수지 0.5㎖를 겐타마이신 B 함유 농축액 0.5㎖와 혼합하고 상온에서 25분 동안 탈색 반응을 진행시켰다. 하기 표 11은 Dowex 1X2-200 음이온 교환수지를 사용하여 겐타마이신 B 함유 농축액을 탈색할 때 겐타마이신 B 함유 농축액의 겐타마이신 B 농도에 따른 겐타마이신 B 회수율과 겐타마이신 B 함유 농축액의 탈색도를 나타낸 것이다.
측정 항목 겐타마이신 함유 농축액의 겐타마이신 농도
200,000 ㎍/㎖ 10,000 ㎍/㎖ 50,000 ㎍/㎖ 10,000 ㎍/㎖
겐타마이신 B 회수율(%) 80.5 98.0 93.4 92.1
농축액 탈색도(%) 28.9 20.2 41.4 97.1
상기 표 11에서 보이는 바와 같이 겐타마이신 B의 농도가 상대적으로 낮은 겐타마이신 B 함유 농축액을 Dowex 1X2-200 음이온 교환수지를 사용하여 탈색할 때 겐타마이신 회수율과 겐타마이신 B 함유 농축액의 탈색도가 더 높게 나타났다.
실시예 11 : 음이온 교환수지 칼럼 시스템에서 겐타마이신 B 함유 농축액의 탈색
오픈 칼럼에 Dowex 1X2-200 음이온 교환수지를 충전하고 활성화 시켰다.
상기 실시예 7에서 얻은, 겐타마이신 유연물질 전체 중량을 기준으로 겐타마이신 B가 차지하는 비율이 95% 정도인 용리액(겐마타이신 B의 농도는 약 6,000 ㎍/㎖임)을 농축하지 않고 바로 활성화된 Dowex 1X2-200 음이온 교환수지가 충전된 칼럼에 통과시켜 탈색시켰다. 또한, 실시예 7에서 얻은, 겐타마이신 유연물질 전체 중량을 기준으로 겐타마이신 B가 차지하는 비율이 95% 정도인 용리액의 겐타마이신 B의 농도가 약 10,000 ㎍/㎖가 될때까지 농축하였다. 이후, 겐타마이신 B 함유 농축액을 활성화된 Dowex 1X2-200 음이온 교환수지가 충전된 칼럼에 통과시켜 탈색시켰다. 상기 칼럼을 통과하는 통액의 유속은 4 SV 이고 통액량은 1 RV 이었다. 하기 표 12에 음이온 교환수지 칼럼 시스템에서 겐타마이신 B 함유 농축액의 탈색 실험 결과를 나타내었다.
측정 항목 음이온 교환수지 칼럼에 공급되는 겐타마이신 B 함유 용리액 또는 겐타마이신 B 함유 농축액의 겐타마이신 B 농도
6,000 ㎍/㎖ 10,000 ㎍/㎖
겐타마이신 B 회수율(%) 78.2 95.0
탈색도(%) 99.9 99.6
상기 표 12에서 보이는 바와 같이 Dowex 1X2-200 음이온 교환수지가 충전된 칼럼에 겐타마이신 B 농도가 10,000 ㎍/㎖ 보다 낮은 겐타마이신 B 함유 용리액을 통과시키면 탈색도는 우수하나 겐타마이신 B의 회수율이 크게 떨어지는 것으로 나타났다.
실시예 12 : 재흡착법(Re-adsorption)을 이용한 겐타마이신 B 회수/분리 공정의 최적 설계
실시예 1 내지 실시예 11의 결과로부터 겐타마이신 B의 회수/분리 공정을 최적으로 설계하여 실험을 진행하였고, 구체적인 단위 공정의 조합은 아래와 같다.
1) 겐타마이신 B 및 이의 유연물질을 함유하는 미생물 발효 배양액의 pH를 50 중량% 농도의 황산 수용액을 사용하여 2.5로 조정하고 4℃에서 12시간 이상 방치한 후, 원심분리하여 발효 상등액을 얻는다.
2) 상기 발효 상등액의 pH를 30 중량% 농도의 수산화나트륨 수용액을 사용하여 6.5로 조정하고 12시간 동안 방치한 후, 여과조제(Filter-Aid)인 파라셀(PARACELL)로 여과하여 발효 여과액을 얻는다.
3) 상기 발효 여과액을 활성화된 Amberlite IRC-50(NH4+) 양이온 교환수지가 충전된 칼럼에 3 RV/hr의 속도로 통과시켜 겐타마이신 B 등을 흡착시킨다.
4) 6 RV의 용량에 해당하는 증류수로 겐타마이신 B 등이 흡착된 양이온 교환수지 충전 칼럼을 세척하고, 용리제인 0.2N 농도의 암모니아수를 양이온 교환수지 충전 칼럼에 0.5 SV의 속도로 통과시켜 겐타마이신 B 및 이의 유연물질을 포함하는 1차 용리액을 회수한다.
5) 1차 용리액의 pH를 다시 6.5로 조정하고 활성화된 Amberlite IRC-50(NH4+) 양이온 교환수지가 충전된 칼럼에 3 RV/hr의 속도로 통과시켜 겐타마이신 B 등을 재흡착시킨다.
6) 6 RV의 용량에 해당하는 증류수로 겐타마이신 B 등이 재흡착된 양이온 교환수지 충전 칼럼을 세척하고, 용리제인 0.15N 농도의 암모니아수를 양이온 교환수지 충전 칼럼에 0.5 SV의 속도로 약 7 RV에 해당하는 양만큼 통과시켜 예비적으로 용리하고, 계속해서 용리제인 0.5N 농도의 암모니아수를 양이온 교환수지 충전 칼럼에 0.5 SV의 속도로 통과시켜 겐타마이신 B를 함유하는 2차 용리액을 회수한다. 이때 겐타마이신 B의 회수율은 약 80.5%이다.
7) 겐타마이신 B를 함유하는 2차 용리액을 겐타마이신 B의 농도가 10,000 ㎍/㎖가 될 때까지 농축하여 겐타마이신 B 함유 농축액을 제조하고, 겐타마이신 B 함유 농축액의 pH를 6.0으로 조절한 후 활성화된 Dowex 1X2-200 음이온 교환수지가 충전된 칼럼에 통과시켜 1차 탈색된 겐타마이신 B 함유 농축액을 얻는다.
8) 1차 탈색된 겐타마이신 B 함유 농축액의 pH를 5.5로 조정하고 겐타마이신 B 중량 기준으로 30%에 해당하는 CN1 활성탄을 첨가하고 교반하여 2차 탈색된 겐타마이신 B 함유 농축액을 얻는다.
9) 2차 탈색된 겐타마이신 B 함유 농축액을 바로 동결건조하여 정제된 겐타마이신 B 분말을 얻거나 2차 탈색된 겐타마이신 B 함유 농축액을 추가로 농축하고 동결건조하여 정제된 겐타마이신 B 분말을 얻는다.
도 1은 실시예 12의 방법으로 얻은 정제된 겐타마이신 B 분말을 HPLC로 분석한 결과이고, 도 2는 실시예 12의 방법으로 얻은 정제된 겐타마이신 B 분말을 HPLC-ELSD로 분석한 결과이다. 도 1 및 도 2에서 보이는 바와 같이 실시예 12의 방법으로 얻은 정제된 겐타마이신 B 분말은 매우 높은 순도(80% 이상)를 나타냈다.
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (20)

  1. 겐타마이신 B 및 겐타마이신 B의 유연물질을 함유하는 미생물 발효 배양액을 여과하여 겐타마이신 B 함유 여과액을 얻는 단계;
    상기 겐타마이신 B 함유 여과액을 약산성 양이온 교환수지와 접촉시켜 겐타마이신 B를 흡착시키는 단계;
    상기 양이온 교환수지에 흡착된 겐타마이신 B를 용리제로 용리시켜 겐타마이신 B 함유 용리액을 얻는 단계; 및
    상기 겐타마이신 B 함유 용리액 또는 이의 농축액을 강염기성 음이온 교환수지와 접촉시켜 탈색하는 단계를 포함하는 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 겐타마이신 B의 유연물질은 미크로노마이신(micronomicin), 겐타마이신 A, 겐타마이신 A1, 겐타마이신 X2, 겐타마이신 B1, 겐타마이신 C1, 겐타마이신 C1a 또는 겐타마이신 C2에서 선택되는 1종 이상으로 구성되는 것을 특징으로 하는 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 마이크로모노스포라 푸르푸리아(Micromonospora purpurea), 마이크로모노스포라 에키노스포라(micromonospora echinospora) 또는 이들의 변이 균주에서 선택되는 것을 특징으로 하는 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 미생물 발효 배양액의 여과는 원심분리, 여과지, 여과포, 규조토, 파라셀(PARACELL) 또는 이들에서 선택되는 2가지 이상의 조합에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 약산성 양이온 교환수지는 다공성 타입이고 입자 크기가 10~60 메쉬(mesh)인 것을 특징으로 하는 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 약산성 양이온 교환수지는 카르복실산을 교환기로 사용하는 것을 특징으로 하는 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 용리제는 0.1~0.5N 농도의 암모니아수인 것을 특징으로 하는 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 강염기성 음이온 교환수지는 겔(gel) 타입이고 입자 크기가 50~400 메쉬(mesh)인 것을 특징으로 하는 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 강염기성 음이온 교환수지는 4급 암모늄기를 교환기로 사용하는 것을 특징으로 하는 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 겐타마이신 B 함유 여과액을 얻는 단계는
    a1) 겐타마이신 B 및 겐타마이신 B의 유연물질을 함유하는 미생물 발효 배양액의 pH를 1.5~4.5로 조정한 후 원심분리하여 겐타마이신 B 함유 상등액을 얻는 단계; 및
    a2) 상기 겐타마이신 B 함유 상등액의 pH를 5.5~7.0으로 조정한 후 여과지, 여과포, 규조토 또는 파라셀(PARACELL)에서 선택되는 어느 하나로 여과하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온 교환수지에 흡착된 겐타마이신 B를 용리제로 용리시키기 전에 양이온 교환수지를 물로 세척하는 것을 특징으로 하는 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 겐타마이신 B 함유 용리액 내 겐타마이신 B의 함량은 겐타마이신 유연물질 전체 중량을 기준으로 90% 이상인 것을 특징으로 하는 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 겐타마이신 B 함유 용리액의 농축액 내 겐타마이신 B 농도는 8,000~30,000 ㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 겐타마이신 B 함유 용리액 또는 이의 농축액의 pH를 강염기성 음이온 교환수지와 접촉하기 전에 5.5~7.5로 조정하는 것을 특징으로 하는 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법.
  15. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 강염기성 음이온 교환수지에 의해 탈색된 겐타마이신 B 함유 용리액 또는 이의 농축액을 분말화하는 단계를 더 포함하는 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법.
  16. 겐타마이신 B 및 겐타마이신 B의 유연물질을 함유하는 미생물 발효 배양액을 여과하여 겐타마이신 B 함유 여과액을 얻는 단계;
    상기 겐타마이신 B 함유 여과액을 약산성 양이온 교환수지와 접촉시켜 겐타마이신 B를 흡착시키고, 물로 양이온 교환수지를 세척하고, 양이온 교환수지에 흡착된 겐타마이신 B를 제1 용리제로 용리시켜 겐타마이신 B 함유 제1 용리액을 얻는 단계;
    상기 겐타마이신 B 함유 제1 용리액을 약산성 양이온 교환수지와 접촉시켜 겐타마이신 B를 재흡착시키고, 물로 양이온 교환수지를 세척하고, 양이온 교환수지에 재흡착된 겐타마이신 B를 제2 용리제로 용리시켜 겐타마이신 B 함유 제2 용리액을 얻는 단계; 및
    상기 겐타마이신 B 함유 제2 용리액 또는 이의 농축액을 강염기성 음이온 교환수지와 접촉시켜 탈색하는 단계를 포함하는 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 약산성 양이온 교환수지는 다공성 타입이고 입자 크기가 10~60 메쉬(mesh)이고 카르복실산을 교환기로 사용하는 것을 특징으로 하는 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 제1 용리제는 0.1~0.3N 농도의 암모니아수이고 제2 용리제는 0.4~0.6N 농도의 암모니아수인 것을 특징으로 하는 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법.
  19. 제16항에 있어서, 상기 강염기성 음이온 교환수지는 겔(gel) 타입이고 입자 크기가 50~400 메쉬(mesh)이고 4급 암모늄기를 교환기로 사용하는 것을 특징으로 하는 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 겐타마이신 B 함유 여과액을 얻는 단계는
    a1) 겐타마이신 B 및 겐타마이신 B의 유연물질을 함유하는 미생물 발효 배양액의 pH를 1.5~4.5로 조정한 후 원심분리하여 겐타마이신 B 함유 상등액을 얻는 단계; 및
    a2) 상기 겐타마이신 B 함유 상등액의 pH를 5.5~7.0으로 조정한 후 여과지, 여과포, 규조토 또는 파라셀(PARACELL)에서 선택되는 어느 하나로 여과하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 겐타마이신 B의 회수 또는 정제방법.
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