CN105238841B

CN105238841B - 头孢菌素c吸附废液中dcpc的回收与转化方法

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Publication number: CN105238841B
Application number: CN201510708981.XA
Authority: CN
Inventors: 白延峰; 刘君臣; 李树有; 王雁; 安琪; 侯瑞峰
Original assignee: WEIQIDA PHARMACEUTICAL Co Ltd OF CHINA NATIONAL PHARMACEUTICAL INDUSTRY Corp Ltd
Current assignee: WEIQIDA PHARMACEUTICAL Co Ltd OF CHINA NATIONAL PHARMACEUTICAL INDUSTRY Corp Ltd
Priority date: 2015-10-27
Filing date: 2015-10-27
Publication date: 2018-12-21
Anticipated expiration: 2035-10-27
Also published as: CN105238841A

Abstract

本发明属于制药技术领域，涉及头孢菌素C吸附废液中去乙酰头孢菌素C的回收与转化方法。该方法包括如下步骤：(1)采用电渗析法对头孢菌素C吸附废液进行脱盐处理，得到除盐液；然后纳滤浓缩该除盐液，得到浓缩的除盐液；(2)将浓缩的除盐液通过非极性大孔吸附树脂，DCPC被吸附在树脂上，然后进行解析，得到DCPC解析液；将该解析液通过阴离子交换树脂进行脱色，得到DCPC脱色液；(3)将DCPC脱色液纳滤浓缩后，在固定化头孢菌素C酰化酶的存在下裂解转化为D‑7‑ACA。本发明的去乙酰头孢菌素C的回收与转化方法，工艺设计合理，成本低，回收和转化效果好，产品质量优异且适合于产业化推广。

Description

头孢菌素C吸附废液中DCPC的回收与转化方法

技术领域

本发明属于制药技术领域，更具体而言，涉及一种在头孢菌素C发酵生产中所产生的吸附废液中去乙酰头孢菌素C(下文简称DCPC)的回收与转化方法，即从头孢菌素C吸附废液中回收DCPC，并通过酶裂解的方式将DCPC转化为羟甲基-7-氨基头孢烷酸(下文简称D-7-ACA)加以回收利用。

背景技术

7-氨基头孢烷酸(简称7-ACA)是生产多种半合成头孢菌素类抗生素的重要中间体。生产7-ACA的方法主要是通过酶法裂解由发酵生产的头孢菌素C(下文简称CPC)而得到。在CPC发酵生物合成过程中，去乙酰头孢菌素C是不可避免的副产物，在以发酵生产CPC为目标产物的生物合成反应达到终点时，DCPC浓度的高低主要与发酵使用的菌种及工艺有关。

一般目前CPC发酵工业生产中，DCPC在发酵液中的含量约占4％～5％。在下游CPC分离提取过程中，发酵液经酸化、固-液分离等处理后，得到澄清发酵液，该澄清发酵液通过非极性大孔吸附树脂，CPC和部分DCPC被吸附在树脂上，收集流过吸附树脂的液体即得到树脂吸附余液；由于相对于CPC，DCPC极性较强，CPC与树脂的吸附更强而DCPC与树脂的吸附较弱，因此先用水洗非极性大孔吸附树脂，得到DCPC解析液，再用弱酸盐溶液洗非极性大孔吸附树脂，得到CPC解析液，实现了CPC和DCPC的分离；所得到的CPC解析液用于酶法裂解制备7-ACA。上述树脂吸附余液和DCPC解析液通常合并在一起，称为头孢菌素C吸附废液，作为废弃液排放。这部分吸附废液中DCPC的排放不仅造成资源的浪费，同时对环境造成了一定的压力。因此，结合目前的CPC生产工艺，在不影响CPC生产的同时，研究开发DCPC回收并将其转化为羟甲基-7-氨基头孢烷酸(D-7-ACA)的方法，具有较为重要的现实意义。

吸附废液中成分较为复杂，极性和溶解性相近的物质混合为一体，其中有氨基酸、糖类、蛋白质、无机盐类及多种未知杂质，所以DCPC分离较为困难。中国专利文献CN101875660A公开了一种从头孢菌素C发酵液中分离纯化去乙酰头孢菌素C的方法，采用苯乙烯型非极性大孔吸附树脂吸附CPC，而后采用凝胶型强碱II型阴离子交换树脂吸附DCPC，经解析、解析液结晶，得到DCPC晶体，该方法存在树脂交换容量小、脱色效果差、回收产品质量不能保证等缺陷。中国专利文献CN104673872A公开了一种从头孢菌素C树脂吸附废液中回收DCPC的方法，采用阴离子交换树脂1脱除无机阴离子，之后采用大孔吸附树脂吸附DCPC和解析液经过阴离子交换树脂2脱色，脱色液在浓缩后采用去乙酰酯酶将DCPC转化为D-7-ACA，该工艺方法亦存在诸多缺陷：(1)阴离子交换树脂1仅能吸附废液中的无机阴离子，对废液中的无机阳离子没有吸附作用，除盐不彻底；(2)非极性大孔吸附树脂对低浓度的DCPC选择吸附作用差、交换容量低，产业化推广中需要使用大量树脂，后期树脂再生用水成本、废液处理成本非常高；(3)DCPC转化为D-7-ACA过程中选用的去乙酰酯酶选择性不强，转化率低，进而导致D-7-ACA产品质量差。因此，现有技术中关于DCPC回收和转化的方法均不适用于在工业化生产中的推广和应用。

发明内容

技术问题

因此，本发明的目的在于提供一种工艺设计合理、回收和转化效果好、产品质量优异且适合于产业化推广的从头孢菌素C吸附废液中回收DCPC并转化DCPC的方法。

技术方案

为了实现本发明目的，本发明所采用的技术方案为：采用电渗析法去除头孢菌素C吸附废液中大部分的盐类物质，得到除盐液，然后纳滤浓缩该除盐液；之后使用非极性大孔吸附树脂吸附DCPC，解析液经过阴离子交换树脂脱色，得到DCPC脱色液；DCPC脱色液经过纳滤浓缩、酶裂解、结晶和干燥等步骤后，即可以达到回收DCPC并将其转化为D-7-ACA的目的。

根据本发明，本发明提供的头孢菌素C吸附废液中去乙酰头孢菌素C的回收与转化方法，包括如下步骤：

(1)吸附废液的除盐与浓缩

采用电渗析法对头孢菌素C吸附废液进行脱盐处理，得到除盐液；然后纳滤浓缩该除盐液，得到浓缩的除盐液；

(2)DCPC的分离纯化

将步骤(1)中得到的浓缩的除盐液通过非极性大孔吸附树脂，DCPC被吸附在树脂上，然后进行解析，得到DCPC解析液；将该解析液通过阴离子交换树脂进行脱色，得到DCPC脱色液；

(3)DCPC脱色液的浓缩与转化

将步骤(2)中得到的DCPC脱色液纳滤浓缩后，在固定化头孢菌素C酰化酶的存在下裂解转化为D-7-ACA；然后裂解液经结晶、过滤、干燥，得到D-7-ACA晶体。

有益效果

与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)使用电渗析法去除了头孢菌素C吸附废液中的大部分盐类物质(包括无机阴离子和无机阳离子)和部分杂质，对料液起到了很好的纯化作用，同时对纳滤过程中DCPC浓缩倍数的提高起到了至关重要的作用；(2)由于盐类的大量去除和DCPC的高度浓缩富集，非极性大孔吸附树脂吸附容量成倍提升，DCPC吸附量增加，相应树脂使用量大幅降低，再生用水量及废液产出均大幅下降；(3)在DCPC转化为D-7-ACA过程中使用固定化头孢菌素C酰化酶，该酶对DCPC选择性强，转化率高，所制备的D-7-ACA产品质量优异。综合以上优点，本发明的去乙酰头孢菌素C的回收与转化方法非常适用于工业化生产中的推广和应用。

具体实施方式

下面，更具体地说明本发明的头孢菌素C吸附废液中去乙酰头孢菌素C的回收与转化方法。

在所述步骤(1)吸附废液的除盐与浓缩中，采用电渗析法对头孢菌素C吸附废液进行脱盐处理，得到除盐液；然后纳滤浓缩该除盐液，得到浓缩的除盐液。

其中，头孢菌素C吸附废液是在发酵法生产CPC的过程中树脂吸附余液和DCPC解析液的合并液，通常作为废弃液排放掉，该吸附废液一般pH为2.5～3.0，DCPC浓度为0.3～0.7g/L，DCPC液相纯度(液相色谱峰面积百分比)为50～60％，电导率为8～12ms/cm，此外还含有糖类、蛋白质、无机盐及各种未知杂质。

在采用电渗析法对吸附废液进行脱盐处理中，使用的电渗析装置，例如由上海凯鑫分离技术有限公司提供电渗析装置，该电渗析装置使用的膜堆由20对均相阴离子交换膜和均相阳离子交换膜组成，膜的基材为聚偏氟乙烯，离子交换膜长×宽×高为400mm×200mm×0.2mm。将吸附废液导入电渗析装置的淡室中，采用批量循环式脱盐流程，在5～10A/cm²恒定电流密度条件下电渗析脱盐处理至电压稳定为20V，在20V稳压条件下电渗析脱盐一般处理至电导率为0.5～2.0ms/cm，优选0.8～1.3ms/cm，即得到除盐液。

然后，在5～8℃低温条件下，采用截留分子量为100～300道尔顿的纳滤膜，更优选截留分子量为150～200道尔顿的纳滤膜，将该除盐液浓缩，得到浓缩的除盐液。在所得到的浓缩的除盐液中，一般DCPC的浓度为4.5～14.0g/L。

在所述步骤(2)DCPC的分离纯化中，将步骤(1)中得到的浓缩的除盐液通过非极性大孔吸附树脂，DCPC被吸附在树脂上，然后进行解析，得到DCPC解析液；将该解析液通过阴离子交换树脂进行脱色，得到DCPC脱色液。

其中，将步骤(1)中得到的浓缩的除盐液通过非极性大孔吸附树脂，利用非极性大孔吸附树脂对DCPC的吸附作用，将浓缩的除盐液中的DCPC吸附在树脂上。所述非极性大孔吸附树脂可选用Resindion SRL公司生产的W42007和W42008型号中的任意一种，或者是山东鲁抗立科药业有限公司生产的DM700型树脂。所述非极性大孔吸附树脂通过湿法装柱以圆形树脂柱床的形式应用，将上述步骤(1)得到的浓缩的除盐液以一定的流速通过非极性大孔吸附树脂，该浓缩的除盐液以每小时0.5～2.0倍树脂总体积的流速经过树脂柱床，优选每小时0.8～1.2倍树脂总体积的流速经过树脂柱床；圆形树脂柱床的高度与直径比(即高径比)为2或更大，优选大于等于4，更优选大于等于8，最优选大于等于16，这意味着，树脂的装柱高径比越大，DCPC与其他各杂质在树脂上的分离度就越高，最终DCPC解析液的纯度和品质就越高。

非极性大孔吸附树脂的DCPC吸附量与浓缩的除盐液中DCPC浓度及树脂特性相关，在实际操作中以柱床下端出口DCPC检出为依据，检出时即停止浓缩的除盐液的上柱。

浓缩的除盐液中的DCPC被吸附在树脂上，使用解析剂对吸附在树脂上的DCPC解析，所用解析剂可以为纯化水或弱酸盐溶液，优选弱酸盐溶液，诸如醋酸钠、碳酸钠或碳酸氢钠溶液，最优选碳酸氢钠溶液，且碳酸氢钠溶液浓度优选介于2.0～3.0wt％之间，更优选介于2.0～2.5wt％之间，最优选为约2.4wt％；解析剂的流速为每小时为0.5～1.0倍树脂总体积，优选每小时0.75倍树脂总体积；解析开始即收集流出液，当收集到出口流出液中DCPC浓度低于0.5g/L时停止收集，该部分收集液即为DCPC解析液，一般DCPC浓度为2.8～8.8g/L，DCPC液相纯度为75～85％。

然后，将上述得到的DCPC解析液以一定的流速通过阴离子交换树脂进行脱色，收集透光率大于95％(420nm)的柱出口流出液，即为DCPC脱色液。

其中所述阴离子交换树脂为弱碱性阴离子交换树脂，可以选择罗门哈斯生产的FPA-53型号的阴离子交换树脂、Resindion SRL生产的DA400型号的阴离子交换树脂和山东鲁抗立科药业有限公司生产的LK-53型号的阴离子交换树脂中的任意一种。所述阴离子交换树脂通过湿法装柱以圆形树脂柱床的形式应用，将上述得到的DCPC解析液以一定的流速通过阴离子交换树脂柱床，该解析液以每小时30.0～60.0倍树脂总体积的流速经过树脂柱床，优选每小时30.0～45.0倍树脂总体积的流速经过树脂柱床。所收集的脱色液中，一般DCPC浓度为2.6～8.5g/L，DCPC液相纯度为90～95％。

在所述步骤(3)DCPC脱色液的浓缩与转化中，将步骤(2)中得到的DCPC脱色液纳滤浓缩后，在固定化头孢菌素C酰化酶的存在下裂解转化为D-7-ACA；然后裂解液经结晶、过滤、干燥，得到D-7-ACA晶体。

在5～8℃低温条件下，采用截留分子量为100～300道尔顿的纳滤膜，优选截留分子量为150～200道尔顿的纳滤膜，将上述步骤(2)得到的DCPC脱色液浓缩，得到浓缩液，该浓缩液中DCPC浓度一般为24.3～32.4g/L。

然后，向该浓缩液中加入固定化头孢菌素C酰化酶，在pH8.00～8.60、温度5～30℃条件下，浓缩液中的DCPC发生裂解转化为D-7-ACA；裂解结束后，过滤除酶，用酸调节去除酶的滤液pH至3.00～5.50，D-7-ACA结晶析出，得到D-7-ACA晶体。

所述固定化头孢菌素C酰化酶可市购得到，例如山东鲁抗立科药业有限公司、湖南福莱格生物技术有限公司等可以购买得到。在DCPC的转化中，每升浓缩液所对应的投酶量为8000～12000U，反应过程中pH需维持在8.00～8.60，优选8.20～8.40；反应温度5～30℃，优选8～20℃，最优选10～15℃，反应时间约需30～60分钟。

在DCPC彻底转化为D-7-ACA后，过滤除酶，分离得到含有D-7-ACA的母液，向该母液中缓慢滴加10～15％(v/v)盐酸，待溶液中有晶体析出后停止加酸，养晶20～30分钟；继续滴加前述盐酸至pH3.00～5.50，优选pH3.50～4.50，最优选pH3.80，养晶120～240分钟；养晶结束后经过滤、洗涤、干燥等步骤可以分离得到D-7-ACA晶体。

下面通过实施例更具体地说明本发明，但本发明的保护范围不局限于这些实施例中。

实施例1

取头孢菌素C吸附废液50L，其中pH为2.67，DCPC浓度0.5g/L，DCPC液相纯度53％，电导率9.0ms/cm，将其导入电渗析器(购自上海凯鑫分离技术有限公司)淡室中，在10A/cm²恒定电流密度条件下电渗析脱盐处理至电压稳定为20V，脱盐至电导率为0.8ms/cm，得到除盐液；在5～8℃条件下，采用截留分子量为200道尔顿的纳滤膜浓缩除盐液，浓缩后DCPC浓度为10.4g/L。

将浓缩的除盐液以每小时1.0L的流速通过大孔吸附树脂(型号为W42007，湿法装柱，装量1.0L，高径比为8.0)，当检测柱出口流出液检出有DCPC时即停止吸附并开始进行解析；使用2.0wt％的碳酸氢钠溶液，以每小时0.8L流速通过树脂柱床，当柱下端出口流出液中DCPC浓度低于0.5g/L时停止收集，所收集解析液中DCPC浓度为5.9g/L，液相纯度为82％。之后，将DCPC解析液以每小时1.5L的流速通过阴离子交换树脂(型号为FPA-53，湿法装柱，装量50ml，高径比为4.0)，收集透光率大于95％(420nm)的柱出口流出液，所得DCPC脱色液浓度为5.6g/L，液相纯度为93％。

在5～8℃低温条件下，采用截留分子量为200道尔顿的纳滤膜将脱色液中DCPC浓缩至29.0g/L，体积为0.77L，向其中投入87.5g固定化头孢菌素C酰化酶(80U/g)，在pH8.30、温度12℃条件下，DCPC裂解至残留0.5g/L以下后停止裂解；然后，过滤除酶，向去除酶后的反应液中缓慢滴加15％(v/v)盐酸，待溶液中略微有晶体析出后停止加酸，养晶20分钟，再继续滴加上述盐酸至pH4.20，养晶120分钟，养晶结束后经过滤、洗涤、干燥后得到D-7-ACA晶体产品13.1g，其中水分为0.46％，纯度为99.1％，色级小于YG2，产品得率为52.4％。

实施例2

取头孢菌素C吸附废液50L，其中pH为2.83，DCPC浓度0.6g/L，DCPC液相纯度58％，电导率8.3ms/cm，将其导入电渗析器(购自上海凯鑫分离技术有限公司)淡室中，在5A/cm²恒定电流密度条件下电渗析脱盐处理至电压稳定为20V，脱盐至电导率为1.0ms/cm，得到除盐液；在5～8℃条件下，采用截留分子量为300道尔顿的纳滤膜浓缩除盐液，浓缩后DCPC浓度为12.4g/L。

将浓缩的除盐液以每小时0.5L的流速通过大孔吸附树脂(型号为W42007，湿法装柱，装量1.0L，高径比为4.0)，当检测柱出口流出液检出有DCPC时即停止吸附并开始进行解析；使用2.4wt％的碳酸氢钠溶液，以每小时0.8L流速通过树脂柱床，当柱下端出口流出液中DCPC浓度低于0.5g/L时停止收集，所收集解析液中DCPC浓度为8.7g/L，液相纯度为79％。之后，将DCPC解析液以每小时2.2L的流速通过阴离子交换树脂(型号为FPA-53，湿法装柱，装量50ml，高径比为4.0)，收集透光率大于95％(420nm)的柱出口流出液，所得DCPC脱色液浓度为8.3g/L，纯度为92％。

在5～8℃低温条件下，采用截留分子量为300道尔顿的纳滤膜将脱色液中DCPC浓缩至26.7g/L，体积为0.99L，向其中投入112.5g固定化头孢菌素C酰化酶(80U/g)，在pH8.20、温度15℃条件下，DCPC裂解至残留0.5g/L以下后停止裂解；然后，过滤除酶，向去除酶后的反应液中缓慢滴加15％(v/v)盐酸，待溶液中略微有晶体析出后停止加酸，养晶20分钟，再继续滴加上述盐酸至pH3.80，养晶120分钟，养晶结束后经过滤、洗涤、干燥后得到D-7-ACA晶体产品15.2g，其中水分为0.39％，纯度为99.3％，色级小于YG2，产品得率为50.7％。

实施例3

取头孢菌素C发酵液吸附废液50L，其中pH为2.80，DCPC浓度0.4g/L，DCPC液相纯度51％，电导率8.9ms/cm，将其导入电渗析器(购自上海凯鑫分离技术有限公司)淡室中，在10A/cm²恒定电流密度条件下电渗析脱盐处理至电压稳定为20V，脱盐至电导率为1.2ms/cm，得到除盐液；在5～8℃条件下，采用截留分子量为200道尔顿的纳滤膜浓缩除盐液，浓缩后DCPC浓度为8.4g/L。

将浓缩的除盐液液以每小时1.0L的流速通过大孔吸附树脂(型号为W42008，湿法装柱，装量1.0L，高径比为8.0)，当检测柱出口流出液检出有DCPC时即停止吸附并开始进行解析；使用3.0wt％的碳酸氢钠溶液，以每小时1.0L流速通过树脂柱床，当柱下端出口流出液中DCPC浓度低于0.5g/L时停止收集，所收集解析液中DCPC浓度为6.8g/L，液相纯度为76％。之后，将DCPC解析液以每小时3.0L的流速通过阴离子交换树脂(型号为LK-53，湿法装柱，装量50ml，高径比为4.0)，收集透光率大于95％(420nm)的柱出口流出液，所得DCPC脱色液浓度为6.4g/L，纯度为90％。

在5～8℃低温条件下，采用截留分子量为200道尔顿的纳滤膜将脱色液中DCPC浓缩至31.0g/L，体积为0.58L，向其中投入62.5g固定化头孢菌素C酰化酶(80U/g)，在pH8.40、温度10℃条件下，DCPC裂解至残留0.5g/L以下后停止裂解；然后，过滤除酶，向去除酶后的反应液中缓慢滴加15％(v/v)盐酸，待溶液中略微有晶体析出后停止加酸，养晶20分钟，再继续滴加上述盐酸至pH3.80，养晶120分钟，养晶结束后经过滤、洗涤、干燥后得到D-7-ACA晶体产品10.4g，其中水分为0.52％，纯度为99.0％，色级小于YG2，产品得率为52.0％。

Claims

1.一种头孢菌素C吸附废液中去乙酰头孢菌素C的回收与转化方法，包括如下步骤：

(1)吸附废液的除盐与浓缩

采用电渗析法对头孢菌素C吸附废液进行脱盐处理，得到除盐液；然后纳滤浓缩该除盐液，得到浓缩的除盐液，在该浓缩的除盐液中DCPC的浓度为4.5～14.0g/L；

其中，所述头孢菌素C吸附废液pH为2.5～3.0，DCPC浓度为0.3～0.7g/L，DCPC液相纯度为50～60％，电导率为8～12ms/cm；

在脱盐处理中，将吸附废液导入电渗析装置的淡室中，采用批量循环式脱盐流程，在5～10A/cm²恒定电流密度条件下电渗析脱盐处理至电压稳定为20V，电导率为0.5～2.0ms/cm；

(2)DCPC的分离纯化

将步骤(1)中得到的浓缩的除盐液通过非极性大孔吸附树脂，DCPC被吸附在树脂上，然后进行解析，得到DCPC解析液，在该DCPC解析液中DCPC浓度为5.9～8.8g/L，DCPC液相纯度为75～85％；将该解析液通过阴离子交换树脂进行脱色，得到DCPC脱色液，在该DCPC脱色液中，DCPC浓度为5.6～8.5g/L，DCPC液相纯度为90～95％；

(3)DCPC脱色液的浓缩与转化

将步骤(2)中得到的DCPC脱色液纳滤浓缩后，在固定化头孢菌素C酰化酶的存在下裂解转化为D-7-ACA；然后裂解液经结晶、过滤、干燥，得到D-7-ACA晶体，

在所述步骤(2)DCPC的分离纯化中，所述非极性大孔吸附树脂选自Resindion SRL公司生产的W42007和W42008型号中的任意一种；所述非极性大孔吸附树脂通过湿法装柱以圆形树脂柱床的形式应用，圆形树脂柱床的高度与直径比为4或更大；

在所述步骤(3)DCPC脱色液的浓缩与转化中，在5～8℃低温条件下，采用截留分子量为100～300道尔顿的纳滤膜，将步骤(2)得到的DCPC脱色液浓缩，得到浓缩液，该浓缩液中DCPC浓度为24.3～32.4g/L。

2.根据权利要求1所述的回收与转化方法，其特征是，在所述步骤(1)吸附废液的除盐与浓缩中，在5～8℃低温条件下，采用截留分子量为100～300道尔顿的纳滤膜，将所述除盐液浓缩，得到浓缩的除盐液。

3.根据权利要求1所述的回收与转化方法，其特征是，在所述步骤(2)DCPC的分离纯化中，将浓缩的除盐液以每小时0.5～2.0倍树脂总体积的流速经过树脂柱床。

4.根据权利要求1所述的回收与转化方法，其特征是，在所述步骤(2)DCPC的分离纯化中，使用解析剂对吸附在树脂上的DCPC解析，所用解析剂为纯化水、醋酸钠溶液、碳酸钠溶液或碳酸氢钠溶液。

5.根据权利要求1所述的回收与转化方法，其特征是，在所述步骤(2)DCPC的分离纯化中，将所述DCPC解析液通过阴离子交换树脂进行脱色，收集透光率大于95％的柱出口流出液，即为DCPC脱色液；所述阴离子交换树脂为弱碱性阴离子交换树脂，选自罗门哈斯生产的FPA-53型号的阴离子交换树脂和Resindion SRL生产的DA400型号的阴离子交换树脂中的任意一种。

6.根据权利要求1所述的回收与转化方法，其特征是，在所述步骤(3)DCPC脱色液的浓缩与转化中，所述浓缩液在固定化头孢菌素C酰化酶存在下，在pH8.00～8.60、温度5～30℃条件下，浓缩液中的DCPC发生裂解转化为D-7-ACA；裂解结束后，过滤除酶，用酸调节去除酶的滤液pH至3.00～5.50，D-7-ACA结晶析出，得到D-7-ACA晶体。