CN109721487B - 一种利用连续离子交换技术高效纯化莽草酸的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用连续离子交换技术高效纯化莽草酸的工艺，包括如下步骤：固液分离得到发酵滤液，发酵滤液再经过阳离子交换树脂预纯化得到预纯化液A；预纯化液A再经过连续离子交换系统进行预纯化得到预纯化液B；最后预纯化液B经过精纯和喷雾干燥得到莽草酸。本发明的优点在于：工艺简单稳定、可实现连续化、自动化生产，制得的莽草酸成品色谱纯度和含量均＞99％，树脂利用率大幅提高，树脂总使用量减少了约80％，预纯化过程不使用洗脱剂，废水大量减少，极大地降低了生产成本，增强了产品的市场竞争力，适合大规模工业化生产。

Description

一种利用连续离子交换技术高效纯化莽草酸的工艺

技术领域

本发明属于发酵产品分离纯化技术领域，具体涉及一种利用连续离子交换技术高效纯化莽草酸的工艺。

背景技术

莽草酸(Shikimic acid，式I)首次由Eykman于1885年从八角科植物的干燥成熟果实中提取得到，其化学名称为3,4,5-三羟基-1-环己烯-1-羧酸，分子式为C₇H₁₀O₅，分子量为174.15。

莽草酸能够通过影响花生四烯酸代谢，起到抑制血小板聚集、动静脉血栓及脑血栓形成的作用，同时还具有消炎、镇痛的功能，是许多抗癌药物的中间体，也是目前唯一能预防和治疗禽流感的药物达菲合成的关键中间体。近十年来，禽流感疫情不断在全球蔓延，莽草酸的供应压力一直较大。

目前莽草酸大多从八角提取获得，但八角仅在我国南方和越南地区盛产，产量受气候等自然环境影响较大，再加上提取工艺复杂、成品含量难以控制、成本高，严重限制了莽草酸的产量。随着莽草酸国际市场需求的持续增大，莽草酸原料的独一性和地域性决定了莽草酸的供应可能面临短缺的局面，因此，摆脱以八角为原料提取莽草酸的途径，而采用微生物发酵法来生产提取莽草酸已成为共识。

中国专利CN102584571A公开了一种从发酵液中提取莽草酸的工艺：包括发酵液通过陶瓷膜微滤、超滤膜超滤后，经阴离子交换树脂吸附洗脱，洗脱液再依次经浓缩、脱色、结晶、晶体洗涤和干燥后得到的莽草酸成品。该专利公开的工艺存在如下缺点：

1)采用活性炭脱色，产生大量固废，易造成脏乱的生产环境，不利于环保。

2)采用混合溶剂进行晶体洗涤，溶剂回收困难，增加了环保压力，并且引入了多种残留溶剂。

3)该专利在经过陶瓷膜、超滤膜处理后没有其它预纯化步骤，直接采用阴离子交换树脂进行吸附及洗脱纯化，存在阴离子交换树脂处理量低、得到的洗脱液色谱纯度低、批次间操作波动大等问题，不适合产业化生产。

4)3-脱氢莽草酸是莽草酸生物合成代谢途径中的固有杂质，其与莽草酸结构相近，在阴离子交换树脂上这两种物质分离度很低，并且在大量干扰杂质存在下，其与莽草酸的分离度更低。该专利公开的工艺中并没有提及3-脱氢莽草酸的去除情况。

王慧等人报道了(药物生物技术，2013，20(6)：528～531)发酵液中莽草酸分离纯化的工艺研究，该文献公开了从大肠杆菌发酵液中提取纯化莽草酸的工艺，包括下述步骤：发酵液离心、取上清液浓缩、离心、阴离子交换树脂吸附及洗脱纯化、大孔吸附树脂脱色、阳离子交换树脂脱盐、结晶、重结晶，制得的莽草酸晶体色谱纯度为98.6％。该工艺存在如下缺点：1、发酵液离心后直接对上清进行减压浓缩能耗大、成本高；2、离心后未采取任何其它预纯化步骤就直接进行阴离子交换树脂纯化，导致树脂处理量非常低；3、采用两次结晶，工艺总收率低，不具备产业化可行性。

现有技术公开的莽草酸提纯工艺，仅仅经过膜过滤或离心处理的莽草酸发酵滤液直接采用阴离子交换树脂进行吸附及洗脱纯化，存在阴离子交换树脂处理量非常低，导致树脂用量和洗脱剂用量都较多，阴离子交换树脂洗脱后得到的洗脱液收率低、色谱纯度低，不同批次的洗脱液收率和色谱纯度波动大等缺点。

莽草酸发酵液中含有大量的杂质阴离子，包括：强解离的负电色素、SO₄ ^2-、PO₄ ^3-、Cl^-、DHS^-(3-脱氢莽草酸根)等。在阴离子交换树脂纯化过程中，借助离子色谱、高效液相色谱，我们发现这些阴离子与树脂结合力大都强于带负电的莽草酸根离子，结合力强弱顺序如下：强解离的负电色素＞SO₄ ^2-＞PO₄ ^3-＞Cl^-＞DHS^-＞莽草酸根(SA^-)。因此阴离子交换树脂上的交换基团大部分被杂质阴离子结合，这就导致了阴离子交换树脂对莽草酸的有效吸附量非常低。并且，这些强结合力的杂质阴离子也降低了3-脱氢莽草酸与莽草酸在阴离子交换树脂上的分离度，导致洗脱液交叉严重、高色谱纯度莽草酸的洗脱收率低。洗脱液质量差，给后续纯化步骤带来更大的压力。

因此，开发出绿色环保、生产效率高、成品色谱纯度和含量高、极具成本优势、能够产业化的莽草酸提取工艺是将微生物发酵法生产莽草酸推向产业化的关键所在。

发明内容

本发明提供一种利用连续离子交换技术高效纯化莽草酸的工艺，该工艺简单稳定、生产效率高、可实现连续化自动化生产，制得的莽草酸成品色谱纯度和含量均＞99％，树脂利用率大幅度提高，树脂总使用量减少，废水排放大量减少，极大地降低了生产成本，增强了产品的市场竞争力，适合大规模工业化生产。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种利用连续离子交换技术高效纯化莽草酸的工艺，包括下述步骤：a)将莽草酸发酵液经过固液分离得到发酵滤液；b)将步骤a)所得的发酵滤液用阳离子交换树脂预纯化，得到预纯化液A；c)将步骤b)中的预纯化液A通过包含有若干根阴离子交换树脂柱的连续离子交换系统进行预纯化，得到预纯化液B；d)将步骤c)所得的预纯化液B经阴离子交换树脂精纯，得洗脱液；e)将步骤d)所得的洗脱液经过浓缩，得浓缩液，浓缩液再经喷雾干燥得莽草酸；

其中，所述步骤b)阳离子交换树脂为H⁺型阳离子交换树脂；

所述步骤c)中阴离子交换树脂柱所使用的阴离子交换树脂和步骤d)中阴离子交换树脂柱所使用的阴离子交换树脂为相同或不同的OH^-型阴离子交换树脂。

本发明的优选方案，所述步骤a)固液分离是采用陶瓷膜微滤或板框压滤，更优选陶瓷膜微滤，所述陶瓷膜的平均孔径为50-300nm。

通过采用上述技术方案，截留了发酵液中的菌丝体、不溶的颗粒物、蛋白质以及其它大分子量的杂质。

本发明的优选方案，所述步骤b)的具体步骤为：将步骤a)所得的发酵滤液上柱至阳离子交换树脂柱，阳离子交换树脂柱流出液端配有在线pH电极和在线电导率传感器，当流出液的pH值曲线的斜率＞1.5时停止上柱，然后用2BV去离子水顶洗柱内残余料液，收集流出液和顶洗液，合并得预纯化液A，发酵滤液上柱和去离子水顶洗的流速各自独立地为0.5～5BV/h，更优选1～2BV/h。

上述技术方案的原理为：阳离子交换树脂柱吸附了带正电荷的色素和仅在酸性条件下净电荷为正电荷的色素及其它阳离子，树脂中的H⁺被发酵滤液中的阳离子置换出来，H⁺与莽草酸、发酵滤液中的其它不带正电荷的物质流出阳离子交换树脂柱。当流出液的pH值急剧上升，说明此时树脂中的H⁺几乎被置换完全，树脂预纯化处理量接近饱和，此时pH值曲线的斜率＞1.5，停止上柱，再用2BV去离子水顶洗柱内残余物，顶洗液中含有莽草酸及其它不带正电荷的物质，收集柱流出液和顶洗液，合并柱流出液和顶洗液，为预纯化液A。

本发明的优选方案，所述步骤c)中连续离子交换系统包含2-4根阴离子交换树脂柱，每根阴离子交换树脂柱流出液端配有在线pH电极和在线电导率传感器。

本发明的优选方案，所述连续离子交换系统包含3根阴离子交换树脂柱，分别为I柱、II柱和III柱，I柱的柱流出液端与II柱上端的上柱管路连接，II柱的柱流出液端与III柱上端的上柱管路连接，III柱的柱流出液端与I柱上端的上柱管路连接，所述各阴离子交换树脂柱之间连接的管路上均设有串联阀门，将步骤b)所得的预纯化液A连续上柱至连续离子交换系统，从I柱开始连续上柱，当I柱流出液的pH值下降至pH值曲线的斜率＜-1.5时开始收集I柱流出液，当流出液电导率值λ曲线的斜率＞1.5时停止I柱的上柱和流出液的收集，随后，打开I柱和II柱之间的串联阀门，将I柱采用顶洗剂顶洗，顶洗结束后，关闭I柱和II柱之间的串联阀门，I柱开始再生，II柱用预纯化液A开始连续上柱，II柱的上柱、收集、顶洗、再生操作与I柱相同，所述连续离子交换系统按照I柱-II柱-III柱-I柱的顺序循环对预纯化液A进行预纯化。

上述技术方案的原理：利用连续离子交换系统对预纯化液A进行预纯化是基于预纯化液A中各组分与阴离子交换树脂结合力强弱的差异进行的，结合力强的组分置换出结合力弱的组分。强解离的负电色素、SO₄ ^2-、PO₄ ^3-结合力较强，可看作C组分；Cl^-结合力强于DHS^-，DHS^-结合力略强于SA^-，可将Cl^-、DHS^-看作D组分。

根据阴离子交换树脂柱流出液的pH值曲线斜率或者电导率λ值曲线斜率是否达到设定斜率值而自动切换或手动切换柱连接阀门，在不同的阴离子交换树脂柱上分别循环进行上柱、收集、顶洗、再生等不间断操作。当连续离子交换系统包含3根阴离子交换树脂柱时，连续离子交换系统具体运行过程为：

1、预纯化液A从I柱连续上柱，I柱内阴离子交换树脂上的OH^-被置换出来，柱流出液呈碱性，当阴离子交换树脂上的OH^-基本上被置换完全时，呈酸性的含有莽草酸的料液开始被置换出来，此时I柱流出液pH值急剧下降至pH值曲线的斜率＜-1.5，开始收集I柱流出液，当流出液λ值急剧上升至λ值曲线的斜率＞1.5时停止I柱上柱和流出液收集，λ值急剧上升是因为此时与树脂结合力略强的D组分(Cl^-和DHS^-)刚开始被置换出来，Cl^-被置换出来后在流出液中是以强解离的HCl形式存在的，流出液中解离状态的离子浓度迅速变大使电导率λ值急剧上升；

2、I柱停止上柱后，开始用顶洗剂进行顶洗，I柱顶洗流出液串联上柱至II柱，顶洗完毕后I柱内几乎无莽草酸残留，断开I柱和II柱的连接，I柱开始再生程序，II柱开始用预纯化液A连续上柱，重复I柱操作。当II柱流出液pH值急剧下降至pH值曲线的斜率＜-1.5时，开始收集II柱流出液；当II柱流出液λ值急剧上升至λ值曲线的斜率＞1.5时停止II柱上柱和流出液的收集；

3、II柱停止上柱后，开始用顶洗剂进行顶洗，II柱顶洗流出液串联上柱至III柱，顶洗完毕后，断开II柱和III柱的连接，II柱开始再生程序，III柱开始用预纯化液A连续上柱。当III柱流出液pH值急剧下降至pH值曲线的斜率＜-1.5时，开始收集III柱流出液；当III柱流出液λ值急剧上升至λ值曲线的斜率＞1.5时停止III柱上柱和流出液的收集；

4、III柱停止上柱后，开始用顶洗剂进行顶洗，III柱顶洗流出液串联上柱至已再生好的I柱，顶洗完毕后，断开III柱和I柱的连接，III柱开始再生程序，I柱开始用预纯化液A连续上柱，如此循环。

当连续离子交换系统包含树脂柱为2根或4根时，也可以按上述操作方式对连续离子交换系统中的阴离子交换树脂柱进行不间断的上柱，收集、顶洗和再生。再生程序即“水-碱-水”方式再生，先用去离子水洗至柱流出液pH值＞5，再采用5BV的1mol/L NaOH溶液淋洗，再静置2小时，最后用去离子水洗至柱流出液pH值＜8。

采用上述技术方案得到的预纯化液B几乎不含C组分，仅存在极少量的D组分，莽草酸色谱纯度可达96.5％以上，与预纯化液A相比，预纯化液B中莽草酸浓度提高2倍以上，电导率降低至1/3以下。

本发明的优选方案，所述步骤c)中预纯化液A的上柱流速为0.5-2BV/h；顶洗剂的流速为0.5-2BV/h，顶洗剂体积为2-5BV，更优选2BV；顶洗剂为甲酸水溶液或乙酸水溶液，更优选乙酸水溶液；顶洗剂的浓度为0.2-2mol/L，更优选0.5-1mol/L。

本发明的优选方案，所述步骤b)中阳离子交换树脂的基体为聚苯乙烯-二乙烯基苯、丙烯酸系、琼脂糖或葡聚糖。

本发明的优选方案，所述步骤c)和步骤d)中阴离子交换树脂的基体各自独立地为聚苯乙烯-二乙烯基苯、丙烯酸系、琼脂糖或葡聚糖。

本发明的优选方案，所述步骤d)还包括：将步骤c)所得的预纯化液B上柱结束后，先用去离子水顶洗2BV，再用洗脱剂进行洗脱，洗脱剂为甲酸水溶液或乙酸水溶液，更优选乙酸水溶液，乙酸水溶液浓度为0.2-2mol/L，洗脱剂体积为3-10BV，预纯化液B上柱的流速、去离子水顶洗的流速和洗脱剂的流速各自独立地为0.5-2BV/h。

本发明的优选方案，所述步骤e)中的浓缩采用反渗透膜浓缩或者真空浓缩，所得浓缩液中莽草酸的浓度为100-400g/L，所述喷雾干燥的进风温度为150-190℃，出风温度为80-130℃。

本发明较现有技术的有益效果在于：

1、本发明工艺绿色环保，不产生活性炭固废，；

2、本发明中经过步骤b)和步骤c)的两步预纯化后，大幅提高了料液质量、能持续供给稳定均一的高质量预纯化料液，预纯化液莽草酸色谱纯度＞96.5％。再经过步骤d)精纯后，洗脱液中莽草酸色谱纯度＞99％；

3、本发明采用连续离子交换技术，显著提高了树脂利用率，树脂总使用量减少了约80％；

4、本发明使用的有机溶剂种类少，使用量也较少，产生的废液少，不仅极大地降低了生产成本，而且对环境友好；

5、本发明通过连续离子交换系统可实现预纯化过程全程自动化、连续化，生产效率高，极大增强了产品市场竞争力，并且连续化生产技术也是ICH Q13大力推广运用的技术；

6、本发明的阴离子交换树脂精纯后的洗脱液，经浓缩后可直接喷雾干燥获得莽草酸成品，无需进行脱色、结晶等操作步骤，操作更简单，收率更高；

7、本发明制得的莽草酸成品中莽草酸的色谱纯度和含量都达到了99％以上，提取总收率达到80％以上；

8、本发明工艺对杂质3-脱氢莽草酸去除较彻底，成品中3-脱氢莽草酸色谱纯度低于0.5％。

本发明的详细说明

本发明中的pH值曲线是指：从阳离子交换树脂柱或阴离子交换树脂柱的柱流出液开始流出时采集pH值，并在每流出2BV体积时采集一次pH值，以流出液的体积数值为横坐标，采集的pH值为纵坐标拟合成的曲线。

本发明中的电导率λ值曲线是指：从阳离子交换树脂柱或阴离子交换树脂柱的柱流出液开始流出时采集电导率λ值，并在每流出2BV体积时采集一次λ值，以流出液的体积数值为横坐标，采集的λ值为纵坐标拟合成的曲线。

本发明中阳离子交换树脂再生程序：先采用5BV常用的无机酸水溶液或者有机酸水溶液进行淋洗，如盐酸、硫酸、乙酸、柠檬酸等，酸的浓度为0.5-2mol/L，再静置2小时，最后用去离子水洗至pH值＞6，再生结束后阳离子交换树脂即被转为H⁺型阳离子交换树脂。

本发明中阴离子交换树脂再生程序：采用“水-碱-水”的方式进行再生，即先用去离子水洗至柱流出液pH值＞5，再采用5BV浓度为0.5-2mol/L的NaOH或氨水进行淋洗，再静置2小时，最后用去离子水洗至pH值＜8，再生结束后阴离子交换树脂即被转型为OH^-型阴离子交换树脂。

本发明中的强解离的负电色素是指：在溶液中为解离状态，所带净电荷为负电荷的色素。

本发明中的仅在酸性条件下净电荷为正电荷的色素是指：当溶液呈酸性时所带净电荷为正电荷的色素，当溶液呈中性或碱性时，这些色素不带电荷或者所带净电荷为负电荷。

本发明中的DHS^-是指3-脱氢莽草酸根。

本发明中的SA^-是指莽草酸根。

本发明中的BV和BV/h的含义是：树脂柱内装载树脂的体积称为床容积(bedvolume)，简写为BV。BV为树脂柱的基本单位，树脂柱运行时的各种物料量都以BV为单位。例如溶液通过树脂柱的流量速度为2-4BV/h，即每小时通过的溶液体积为树脂床容积的2-4倍。

本发明中的溶液如无特殊说明，均是指以水为溶剂的溶液。

附图说明：

图1为含有3根阴离子交换树脂柱的连续离子交换系统示意图；

图2为实施例2中I柱柱流出液各参数随上柱液体积变化图；

附图标记：V表示上柱液体积，以BV来度量；pH是指流出液的pH值；λ是指流出液的电导率；T430nm表示流出液在430nm处的透光率；C是指流出液中莽草酸的浓度。

具体实施方式：

下面通过具体实施例对本发明工艺做进一步解释说明，但是，它们并不构成对本发明保护范围的限制和限定。

本发明所使用的溶剂没有特别的限制，可采用商购的常规溶剂。应当强调的是，本发明技术方案中所涉及的数值或数值端点，其含义或意义的保护范围并不局限于该数字本身，本领域技术人员能够理解，它们包含了那些已被本领域广为接受的可允许误差范围，例如实验误差、测量误差、统计误差和随机误差等等，而这些误差范围均包含在本发明的范围之内。

本发明中所涉及的莽草酸的色谱纯度和杂质3-脱氢莽草酸的色谱纯度均是通过高效液相色谱(HPLC)检测的，仪器及色谱条件如下：液相色谱仪型号为Agilent 1260，色谱柱为C18柱，4.6mm×250mm，5μm；流动相为0.1％(m/m)H₃PO₄：乙腈＝98：2(v:v)；流速为1mL/min；紫外检测波长为220nm；进样量为10μL。色谱纯度指在HPLC图谱中目标物的色谱峰面积占总峰面积的百分比。比如，杂质3-脱氢莽草酸色谱纯度指样品HPLC图谱中3-脱氢莽草酸的峰面积所占的百分比。

莽草酸浓度和莽草酸含量是采用HPLC外标法根据标准品含量计算得出的，标准品购自sigma公司，含量为98.5％。

本发明中所用的莽草酸产生菌为E.coli HZ09-11，是参考Louise Johansson等人的论文Shikimic Acid Production by a Modified Strain of E.coli(W3110.shik 1)Under Phosphate-Limited and Carbon-Limited Conditions.(Biotechnology andBioengineering,2005,92(5),541-552.)所披露的菌种构建方法，对宿主菌(菌株编号：CCTCC AB 209414，来源于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的大肠杆菌)进行基因改造得到的。

本发明实施例中种子培养及发酵培养方法均参考陶海明硕士论文《大肠杆菌基因工程菌发酵生产莽草酸的工艺研究》。

本发明中的HZ001阳离子交换树脂、HZ016阳离子交换树脂以及HZ010阳离子交换树脂的基体都是凝胶型聚苯乙烯-二乙烯基苯；HZ201阴离子交换树脂基体是凝胶型聚苯乙烯-二乙烯基苯，D261阴离子交换树脂和D293阴离子交换树脂的基体都是大孔型聚苯乙烯-二乙烯基苯。上述树脂均购自上海华震科技有限公司。

本发明中的在线pH电极型号为HA405-DPA-SC-S8，购自Mettler-Toledo；电导率传感器型号为2/4电极电导率传感器，购自Mettler-Toledo。

实施例1：产莽草酸的基因工程菌E.coli HZ09-11的构建和莽草酸发酵液的制备

产莽草酸的基因工程菌E.coli HZ09-11的构建及保藏：

参考Louise Johansson等人的论文Shikimic Acid Production by a ModifiedStrain of E.coli(W3110.shik 1)Under Phosphate-Limited and Carbon-LimitedConditions.(Biotechnology and Bioengineering,2005,92(5),541-552.)所披露的菌种构建方法，对宿主菌(菌株编号：CCTCC AB 209414，来源于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的大肠杆菌)进行基因改造得到产莽草酸的基因工程菌E.coli HZ09-11。将菌悬液与40％甘油按1：1混合，于-20℃保藏，即得到工作菌种甘油管。

莽草酸发酵液的制备：

1.斜面培养：由工作菌种甘油管经平板分离纯化后取单菌落转接于茄子瓶斜面，于37±1℃、湿度40±1％恒温培养箱培养17-18小时。

斜面培养基配方(g/L)：酵母抽提物10、胰蛋白胨10、氯化钠5、琼脂20、pH值7.0。

2.种子培养：取一支培养好的斜面培养基，倒入无菌水，用接种环将菌苔刮下，得到菌悬液，接种于装有10L种子培养基的15L种子罐中，37±1℃，通气量1vvm，罐压0.04-0.05Mpa,搅拌300rpm，培养6-8小时，得到种子液备用。

种子培养基配方(g/L)：酵母抽提物10、胰蛋白胨10、氯化钠5、pH值7.0。

3.发酵罐发酵培养：在装有70L发酵培养基的100L发酵罐中，以5％的接种量接入步骤2中制备的种子液开始发酵；

1)发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖20、酵母抽提物10、胰蛋白胨10、磷酸氢二钠5、磷酸氢二钾3、硫酸镁0.5、氯化铵1、氯化钠0.5、L-苯丙氨酸0.75、L-酪氨酸0.75、L-色氨酸0.75、微量元素2L、pH值7-7.5。

其中，微量元素配比(g/L)：钼酸铵4、硫酸锰3、硫酸锌2.5、硼酸2.5、硫酸铜2、氯化钴1.8、氯化钙3、碘化钾2、硫酸亚铁5。

2)发酵工艺

通气量：1vvm，发酵温度：37±1℃，搅拌转速200rpm，罐压0.04-0.05Mpa，发酵培养72小时，得到莽草酸发酵液。经HPLC检测，莽草酸浓度为30g/L，杂质3-脱氢莽草酸的色谱纯度为13.7％。

实施例2：发酵液中提取莽草酸的工艺

a)固液分离：将实施例1中制得的莽草酸发酵液70L，进行陶瓷膜微滤，陶瓷膜孔径50nm，微滤过程采用冷冻盐水进行降温，维持料液温度30～35℃。收集发酵滤液，发酵滤液透出36L时，开始往陶瓷膜原料罐中连续补加去离子水，去离子水的补加流速与发酵滤液透出流速大致相同(即维持原料罐中料液体积大致不变)，最后共收集发酵滤液174L。

b)将步骤a)得到的174L发酵滤液上柱至装填有10L的HZ001阳离子交换树脂的树脂柱，柱流出液端配有在线pH电极和电导率传感器，上柱流速1BV/h，当柱流出液pH值急剧上升，直到pH值曲线的斜率＞1.5时停止上柱，然后用2BV去离子水顶洗，顶洗流速1BV/h，合并柱流出液和顶洗液，得到190L预纯化液A。HZ001阳离子交换树脂进行再生，先用5BV的1mol/L盐酸淋洗，再静置2小时，最后用去离子水洗至柱流出液的pH值＞6，再生结束后树脂转型为H⁺型阳离子交换树脂。

c)参见附图1，连续离子交换系统包含3根阴离子交换树脂柱，每根阴离子交换树脂柱装有500mL的HZ201阴离子交换树脂，每根阴离子交换树脂柱柱流出液端配有在线pH电极和电导率传感器，将步骤b)中的预纯化液A上柱到I柱，上柱流速1BV/h，当I柱流出液pH值由最初的10.69下降至8.39时，pH值曲线斜率＜-1.5，莽草酸开始流出，收集I柱流出液，直到流出液的λ值上升至1029us/cm时，此时λ值曲线斜率＞1.5，停止I柱上柱和停止收集I柱流出液，打开I柱和II柱的串联阀门，I柱用2BV的0.5mol/L乙酸水溶液顶洗，顶洗流速1BV/h，将I柱内残留的莽草酸顶洗至II柱，顶洗完后，关闭I柱和II柱的串联阀门，I柱进行再生：先用去离子水洗至流出液的pH值>5，再用5BV的1mol/L的NaOH溶液淋洗，再静置2小时，最后用去离子水洗至流出液pH值＜8，此时I柱中的阴离子交换树脂转型为OH^-型阴离子交换树脂，I柱再生的同时，II柱用预纯化液A开始连续上柱，参照I柱收集柱流出液和顶洗的操作过程，当II柱流出液pH值下降至9.26时pH值曲线斜率＜-1.5，开始收集柱流出液；当柱流出液的λ值上升至957us/cm时，λ值曲线斜率＞1.5，停止II柱上柱和停止收集II柱流出液，用2BV的0.5mol/L的乙酸水溶液将II柱残留的莽草酸顶洗至III柱，然后II柱参照I柱的再生程序进行再生。II柱再生的同时，III柱用预纯化液A开始连续上柱，参照I柱收集柱流出液和顶洗的操作过程。当III柱流出液pH值下降至9.20时，pH值曲线斜率＜-1.5，开始收集柱流出液，当流出液的λ值上升至900us/cm时，λ值曲线斜率＞1.5，停止III柱上柱和停止收集III柱流出液，用2BV的0.5mol/L乙酸水溶液将III柱残留的莽草酸顶洗至I柱，然后III柱参照I柱的再生程序进行再生。上述3根阴离子交换树脂柱收集的柱流出液合并，共得120L预纯化液B，含莽草酸1956g，莽草酸色谱纯度97.0％。

图2为本实施例中I柱流出液各参数随上柱液体积变化图，其中V表示上柱液体积；pH是指：流出液的pH值；λ是指：流出液的电导率；T430nm表示流出液在430nm处的透光率，可以反应流出液颜色的深浅；C是指：流出液中莽草酸的浓度。

发酵滤液的T430nm＝18％，预纯化液A的T430nm＝55％，预纯化液B的T430nm＝85.7％，可见两步预纯化脱色效果明显。

d)阴离子交换树脂精纯：将步骤c)所得的预纯化液B通过阴离子交换树脂柱精纯，柱内装有19.6L的HZ201阴离子交换树脂，上柱量相当于1L树脂吸附100g莽草酸。上柱结束后先用2BV去离子水顶洗，再用8BV的1.5mol/L乙酸水溶液洗脱，去离子水顶洗、乙酸水溶液洗脱的流速均为0.5BV/h。乙酸水溶液洗脱过程中通过HPLC监控洗脱液中莽草酸的色谱纯度，收集色谱纯度＞98％的部分，收集的洗脱液体积为94L，莽草酸色谱纯度为99.8％。

e)喷雾干燥：将步骤d)中的洗脱液采用真空浓缩，压力为-0.1Mpa，温度50-60℃，浓缩至4.6L，莽草酸浓度为400g/L，再进行喷雾干燥，喷雾干燥器进风温度为190℃，出风温度为125℃，进料流量为2.8L/h。喷雾干燥后得到莽草酸成品1712g，色谱纯度为99.5％，含量为99.4％，3-脱氢莽草酸色谱纯度为0.2％，莽草酸提取总收率为81.5％。

实施例3：发酵液中提取莽草酸的工艺

a)固液分离：将实施例1制得莽草酸发酵液70L，进行陶瓷膜微滤，陶瓷膜孔径100nm，微滤过程采用冷冻盐水进行降温，维持料液温度30～35℃。收集发酵滤液，发酵滤液透出35L时，开始往陶瓷膜原料罐中连续补加去离子水，补加流速与透出流速大致相同(即维持原料罐中料液体积大致不变)，最后共收集陶瓷膜透出液160L。

b)将步骤a)得到的160L发酵滤液上柱至装填有13L的HZ016阳离子交换树脂的树脂柱，柱流出液端配有在线pH电极和电导率传感器，上柱流速1.5BV/h，当柱流出液pH值急剧上升，直至pH值曲线的斜率＞1.5时停止上柱，然后用2BV去离子水顶洗，顶洗流速1.5BV/h，合并柱流出液和顶洗液，得到175L的预纯化液A。HZ016阳离子交换树脂再生方法同实施例2的HZ001阳离子交换树脂的再生方法。

c)参见附图1，连续离子交换系统包含3根阴离子交换树脂柱，每根阴离子交换树脂柱装有500mL的D261阴离子交换树脂，每根阴离子交换树脂柱柱流出液端配有在线pH电极和电导率传感器。将步骤b)中的预纯化液A连续上柱到I柱，上柱流速1.5BV/h，当I柱流出液pH值由最初的11.63下降至10.85时，pH值曲线斜率＜-1.5，莽草酸开始流出，收集I柱流出液，直到流出液的λ值上升至830us/cm时，λ值曲线斜率＞1.5，停止I柱上柱和停止收集I柱流出液。打开I柱和II柱的串联阀门，I柱用2BV的0.5mol/L乙酸水溶液顶洗，顶洗流速1.5BV/h，将I柱内残留的莽草酸顶洗至II柱，顶洗完后，关闭I柱和II柱的串联阀门，I柱进行再生：先用去离子水洗至流出液pH值>5，再用5BV的1mol/L的NaOH溶液淋洗，静置2小时，最后用去离子水洗至流出液pH值＜8，此时I柱中的阴离子交换树脂转型为OH^-型阴离子交换树脂。I柱再生的同时，II柱开始用预纯化液A连续上柱，参照I柱进行收集和顶洗，当II柱流出液pH值下降至10.73时pH值曲线斜率＜-1.5，开始收集柱流出液，当流出液的λ值上升至743us/cm时，λ值曲线斜率＞1.5，停止II柱上柱和停止收集II柱流出液，用2BV的0.5mol/L的乙酸水溶液将II柱残留的莽草酸顶洗至III柱，然后II柱参照I柱的再生程序进行再生。II柱再生的同时，III柱用预纯化液A开始连续上柱，参照I柱进行收集和顶洗。当III柱流出液pH值下降至10.53时，pH值曲线斜率＜-1.5，开始收集柱流出液，当流出液的λ值上升至738us/cm时，λ值曲线斜率＞1.5，停止III柱上柱和停止收集III柱流出液，用2BV的0.5mol/L乙酸水溶液将III柱残留的莽草酸顶洗至I柱，然后III柱参照I柱的再生程序进行再生。上述3根阴离子交换树脂柱收集的柱流出液合并，共得116L预纯化液B，含莽草酸1937g，莽草酸色谱纯度96.70％。

d)阴离子交换树脂精纯：将步骤c)所得的预纯化液B通过阴离子交换树脂柱精纯，柱内装有23L的D261阴离子交换树脂，上柱量相当于1L树脂吸附84.2g莽草酸。上柱结束后先用2BV去离子水顶洗，再用8BV的0.5mol/L乙酸水溶液洗脱，顶洗、洗脱流速均为1BV/h。乙酸水溶液洗脱过程中通过HPLC监控洗脱液中莽草酸的色谱纯度，收集色谱纯度＞98％的部分，收集的洗脱液体积为114L，莽草酸色谱纯度为99.7％。

e)喷雾干燥：将步骤d)中的洗脱液采用真空浓缩，压力为-0.1Mpa，温度50-60℃，浓缩至9.2L，莽草酸浓度为200g/L，再进行喷雾干燥，喷雾干燥器进风温度为170℃，出风温度为100℃，进料流量为3.5L/h。喷雾干燥后得到莽草酸成品1694g，色谱纯度为99.7％，含量为99.5％，3-脱氢莽草酸色谱纯度为0.4％，莽草酸提取总收率为80.7％。

实施例4：发酵液中提取莽草酸的工艺

a)固液分离：通过实施例1制得莽草酸发酵液70L，进行陶瓷膜微滤，陶瓷膜孔径300nm，微滤过程采用冷冻盐水进行降温，维持料液温度30～35℃。收集陶瓷膜透出液，透出34L时，开始往陶瓷膜原料罐中连续补加去离子水，补加流速与透出流速大致相同(即维持原料罐中料液体积大致不变)，最后共收集陶瓷膜透出液150L。

b)将步骤a)得到的150L发酵滤液上柱至15L的HZ010阳离子交换树脂的树脂柱，柱流出液端配有在线pH电极和电导率传感器，上柱流速2BV/h，当柱流出液pH值急剧上升，直至pH值曲线的斜率＞1.5时停止上柱，然后用2BV去离子水顶洗，顶洗流速2BV/h，合并柱流出液和顶洗液，得到165L的预纯化液A。HZ010阳离子交换树脂再生方法同实施例2的HZ001阳离子交换树脂的再生方法。

c)参见附图1，连续离子交换系统包含3根阴离子交换树脂柱，每根阴离子交换树脂柱装有500mL的D293阴离子交换树脂，每根阴离子交换树脂柱流出液端配有在线pH电极和电导率传感器。将步骤b)中的预纯化液A连续上柱到I柱，上柱流速2BV/h，当I柱流出液pH值由最初的11.58下降至10.05时，pH值曲线斜率＜-1.5，莽草酸开始流出，收集I柱流出液，直到流出液的λ值上升至1000us/cm时，λ值曲线斜率＞1.5，停止I上柱和停止收集I柱流出液。打开I柱和II柱的串联阀门，I柱用2BV的0.5mol/L乙酸水溶液顶洗，顶洗流速2BV/h，将I柱内残留的莽草酸顶洗至II柱，顶洗完后，关闭I柱和II柱的串联阀门，I柱进行再生：先水洗至流出液pH值>5，再用5BV的1mol/L的NaOH溶液再生，最后用去离子水洗至流出液pH值＜8，此时I柱中的阴离子交换树脂转型为OH^-型阴离子交换树脂。I柱再生的同时，II柱开始用预纯化液A连续上柱，参照I柱进行收集和顶洗，当II柱流出液pH值下降至10.50时，pH值曲线斜率＜-1.5，开始收集柱流出液，当流出液的λ值上升至984us/cm时，λ值曲线斜率＞1.5，停止II柱上柱和停止收集II柱流出液，用2BV的0.5mol/L的乙酸水溶液将II柱残留的莽草酸顶洗至III柱，然后II柱参照I柱的再生程序进行再生。II柱再生的同时，III柱用预纯化液A开始连续上柱，参照I柱进行收集和顶洗，当III柱流出液pH值下降至10.25时，pH值曲线斜率＜-1.5，开始收集柱流出液，当流出液的λ值上升至1050us/cm时，λ值曲线斜率＞1.5，停止III柱上柱和停止收集III柱流出液，用2BV的0.5mol/L乙酸水溶液将III柱残留的莽草酸顶洗至I柱，然后III柱参照I柱的再生程序进行再生。上述3根阴离子交换树脂柱收集的柱流出液合并，共得98L预纯化液B，含莽草酸1927g，莽草酸色谱纯度96.5％。

d)阴离子交换树脂精纯：将步骤c)所得的预纯化液B通过阴离子交换树脂柱精纯，柱内装有29L的D293阴离子交换树脂，上柱量相当于1L树脂吸附66g莽草酸。上柱结束后先用2BV去离子水顶洗，再用9BV的0.2mol/L乙酸水溶液洗脱，顶洗、洗脱流速均为2BV/h。乙酸水溶液洗脱过程中通过HPLC监控洗脱液中莽草酸的色谱纯度，收集色谱纯度＞98％的部分，收集的洗脱液体积为170L，莽草酸色谱纯度为99.7％。

e)喷雾干燥：将步骤d)中的洗脱液采用真空浓缩，压力为-0.1Mpa，温度50-60℃，浓缩至18.4L，莽草酸浓度为100g/L，再进行喷雾干燥，喷雾干燥器进风温度为155℃，出风温度为85℃，进料流量为4.5L/h。喷雾干燥后得到莽草酸成品1686g，色谱纯度为99.7％，含量为99.6％，3-脱氢莽草酸色谱纯度为0.4％，莽草酸提取总收率为80.3％。

对比实施例1：

以本发明实施例1制得的发酵液为原料，参考中国专利CN102584571A的实施例4从发酵液中提取莽草酸，具体过程如下：

(1)发酵液70L通过Al₂O₃质量百分含量为99％的陶瓷膜进行微滤，陶瓷膜孔径为0.5um，微滤通量为35L/m²·h，最后得到160L陶瓷膜滤液；

(2)微滤后所得滤液用卷式超滤膜进行超滤，超滤膜材质为聚偏氟乙烯，所用超滤膜截留分子量为5000道尔顿，超滤通量为37L/m²·h，最后得到超滤液200L；

(3)超滤后所得清液上柱至装有270L的717阴离子交换树脂的树脂柱交换吸附，上柱流量0.5BV/h。上柱至197L时，树脂柱流出液中有莽草酸开始穿透，停止上柱，上柱量相当于1L的717树脂吸附7.5g莽草酸。再用1.5mol/L乙酸水溶液进行洗脱，洗脱流量为0.5BV/h，共洗脱6BV，洗脱液体积1620L；

(4)洗脱液用浓缩锅于60℃减压浓缩(压强为-0.09MPa)至莽草酸浓度约450g/L，在浓缩液中加入5g/L粉末活性炭，60℃搅拌脱色约1小时，过滤除去活性炭。所得浓缩液的滤液在3～5℃搅拌条件下添加与浓缩液的滤液等体积的95％乙醇，添加后以60rpm的转速搅拌96小时，然后离心得湿晶体。湿晶体用3～5℃的乙醇和乙酸乙酯混合液(V:V＝1:1)进行洗涤(洗涤液添加量为400mL/kg)。洗涤后晶体于80℃干燥24小时得1358g白色粉末状莽草酸晶体，即为莽草酸成品(色谱纯度为96.80％，总收率为64.37％)，杂质3-脱氢莽草酸色谱纯度3.2％。

对比实施例2：

以本发明实施例1制得的发酵液为原料，参考专利CN102584571A的实施例4从发酵液中提取莽草酸，其中，将717阴离子交换树脂替换为本发明实施例2中的HZ201阴离子交换树脂，具体过程如下：

(1)发酵液70L通过Al₂O₃质量百分含量为99％的陶瓷膜进行微滤，陶瓷膜孔径为0.5um的陶瓷膜进行微滤，微滤通量为34L/m²·h，最后得到160L陶瓷膜透出液；

(2)微滤后所得滤液用卷式超滤膜进行超滤，超滤膜材质为聚偏氟乙烯，所用超滤膜截留分子量为5000道尔顿，超滤通量为35L/m²·h，最后得到超滤液200L；

(3)超滤后所得清液上柱至装有200L的HZ201阴离子交换树脂的树脂柱，上柱流量0.5BV/h。上柱至195L时，树脂柱流出液中有莽草酸开始穿透，停止上柱，上柱量相当于1L的HZ201树脂吸附10g莽草酸。再用1.5mol/L乙酸水溶液进行洗脱，洗脱流量为0.5BV/h，共洗脱6BV，洗脱液体积1200L；

(4)洗脱液用浓缩锅于60℃减压浓缩(压强为-0.09MPa)至莽草酸浓度约450g/L，在浓缩液中加入5g/L粉末活性炭，60℃搅拌脱色1小时，过滤除去活性炭。所得浓缩液的滤液在3～5℃搅拌条件下添加与浓缩液的滤液等体积的95％乙醇，添加后以60rpm的转速搅拌96小时，然后离心得湿晶体。湿晶体用3～5℃的乙醇和乙酸乙酯混合液(V:V＝1:1)进行洗涤(洗涤液添加量为400mL/kg)。洗涤后晶体于80℃干燥24小时得1620g白色粉末状莽草酸晶体，即为莽草酸成品(色谱纯度为97.4％，总收率为67.47％)，杂质3-脱氢莽草酸色谱纯度为2.4％。

将本发明实施例2、3、4，对比实施例1和对比实施例2中树脂使用量及纯化莽草酸的效果数据进行对比，如下表所示：

*阴离子交换树脂总体积(L)是指步骤b和步骤c中阴离子交换树脂体积之和。

由上表可知：相同体积发酵液中提纯莽草酸，本发明树脂总使用量相对于对比实施例1和对比实施例2减少了80％以上，从而废水产生量也大量减少，树脂的成本和三废处理成本大幅下降，生产总成本大大降低；本发明获得的莽草酸成品中莽草酸的色谱纯度在99.5％以上，高于对比实施例1和对比实施例2的莽草酸色谱纯度；本发明成品中的杂质3-脱氢莽草酸色谱纯度可降低到0.2％，远远小于对比实施例1的3.2％，对比实施例2的2.4％；本发明莽草酸总收率可达81.5％，比对比实施例高出14～17％；本发明没有使用活性炭脱色，不产生固体废弃物，相较于对比实施例，本发明提取莽草酸的工艺对环境较为友好；本发明工艺不使用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等溶剂，得到的莽草酸成品没有以上溶剂的残留。综上所述本发明的提取莽草酸工艺较专利CN102584571A公开的莽草酸提取工艺具有显著的优势。

Claims (14)

1.一种利用连续离子交换技术高效纯化莽草酸的工艺，包括下述步骤：

a)将莽草酸发酵液经过固液分离得到发酵滤液；

b)将步骤a)所得的发酵滤液用阳离子交换树脂预纯化，得到预纯化液A；

c)将步骤b)中的预纯化液A通过包含有若干根阴离子交换树脂柱的连续离子交换系统进行预纯化，得到预纯化液B；

d)将步骤c)所得的预纯化液B经阴离子交换树脂精纯，得洗脱液；

e)将步骤d)所得的洗脱液经过浓缩，得浓缩液，浓缩液再经喷雾干燥得莽草酸；

其中：所述步骤b)中阳离子交换树脂为H⁺型阳离子交换树脂；

所述步骤c)中阴离子交换树脂柱所使用的阴离子交换树脂和步骤d)中阴离子交换树脂柱所使用的阴离子交换树脂为相同或不同的OH^-型阴离子交换树脂；

所述步骤c)中阴离子交换树脂为HZ201、D261、D293阴离子交换树脂；

所述步骤c)中连续离子交换系统包含3根阴离子交换树脂柱，分别为I柱、II柱和III柱，I柱的柱流出液端与II柱上端的上柱管路连接，II柱的柱流出液端与III柱上端的上柱管路连接，III柱的柱流出液端与I柱上端的上柱管路连接，所述各阴离子交换树脂柱之间连接的管路上均设有串联阀门，将步骤b）所得的预纯化液A连续上柱至连续离子交换系统，从I柱开始连续上柱，当I柱流出液的pH值下降至pH值曲线的斜率＜-1.5时开始收集I柱流出液，当流出液电导率值λ曲线的斜率＞1.5时停止I柱的上柱和流出液的收集，随后，打开I柱和II柱之间的串联阀门，将I柱采用顶洗剂顶洗，顶洗结束后，关闭I柱和II柱之间的串联阀门，I柱开始再生，II柱用预纯化液A开始连续上柱，II柱的上柱、收集、顶洗、再生操作与I柱相同，所述连续离子交换系统按照I柱-II柱-III柱-I柱的顺序循环对预纯化液A进行预纯化。

2.如权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤a)固液分离是采用陶瓷膜微滤或板框压滤，所述陶瓷膜的平均孔径为50-300nm。

3.如权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述步骤a)固液分离是采用陶瓷膜微滤。

4. 如权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤b)的具体步骤为：将步骤a)所得的发酵滤液上柱至阳离子交换树脂柱，阳离子交换树脂柱流出液端配有在线pH电极和在线电导率传感器，当流出液的pH值曲线的斜率＞1.5时停止上柱，然后用2BV去离子水顶洗柱内残余料液，收集流出液和顶洗液，合并得预纯化液A，发酵滤液上柱和去离子水顶洗的流速各自独立地为0.5-5 BV/h。

5. 如权利要求4所述的工艺，其特征在于，所述发酵滤液上柱和去离子水顶洗的流速各自独立地为1-2 BV/h。

6.如权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤c)中预纯化液A的上柱流速为0.5-2BV/h；顶洗剂的流速为0.5-2BV/h，顶洗剂体积为2-5BV；顶洗剂为甲酸水溶液或乙酸水溶液；顶洗剂的浓度为0.2-2mol/L。

7.如权利要求6所述的工艺，其特征在于，所述步骤c)中顶洗剂体积为2BV。

8.如权利要求6所述的工艺，其特征在于，所述步骤c)中顶洗剂为乙酸水溶液。

9.如权利要求6所述的工艺，其特征在于，所述步骤c)中顶洗剂的浓度为0.5-1mol/L。

10.如权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤b)中阳离子交换树脂的基体为聚苯乙烯-二乙烯基苯、丙烯酸系、琼脂糖或葡聚糖。

11.如权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤c)和步骤d)中阴离子交换树脂的基体各自独立地为聚苯乙烯-二乙烯基苯、丙烯酸系、琼脂糖或葡聚糖。

12.如权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤d)还包括：将步骤c)所得的预纯化液B上柱结束后，先用去离子水顶洗2BV，再用洗脱剂进行洗脱，洗脱剂为甲酸水溶液或乙酸水溶液，乙酸水溶液浓度为0.2-2mol/L，洗脱剂体积为3-10BV，预纯化液B上柱的流速、去离子水顶洗的流速和洗脱剂的流速各自独立地为0.5-2BV/h。

13.如权利要求12所述的工艺，其特征在于，所述洗脱剂为乙酸水溶液。

14.如权利要求1-13任一项所述的工艺，其特征在于，所述步骤e）中的浓缩采用反渗透膜浓缩或者真空浓缩，所得浓缩液中莽草酸浓度为100-400g/L，喷雾干燥的进风温度为150-190℃，出风温度为80-130℃。

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