CN112724182B - G418发酵液的精制纯化工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种G418发酵液的精制纯化工艺,用草酸调节G418发酵液pH至2.0‑3.0,然后加入助滤剂,充分搅拌,再经板框过滤、得到G418溶液;然后将G418溶液依次经陶瓷膜过滤、阳离子交换树脂吸附、阴离子交换树脂脱色、大孔吸附树脂吸附、真空浓缩、活性炭脱色和干燥即得G418纯品。本工艺操作步骤简单,产品纯度高,可实现G418稳定、安全高效地生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工领域,具体地说,涉及G418发酵液的精制纯化工艺。
背景技术
G418(Geneticin,遗传霉素)是由棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)、绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea)或红橙小单孢菌(Micromonosporarhodorangea)发酵产生的一种氨基糖苷类抗生素,其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似,在分子遗传试验中,是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。它通过抑制转座子Tn601,Tn5的基因而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫。当Neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后,则能启动Neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达,使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。G418的这一选择特性已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得到广泛应用。G418有杀菌作用,本身有很好的杀菌效果,在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。
棘孢小单孢菌、绛红色小单孢菌或红橙小单孢菌发酵液中主要产物是G418,但还含有多种氨基糖苷类杂质成分,包括庆大霉素B、西索米星、小诺霉素和庆大霉素C等系列组分。这些杂质的理化性质与G418近似,都是水溶性很强的氨基糖苷类抗生素,因此制备高纯度G418极其困难,US3997403中采用两步阴阳离子树脂交换,得到G418产品,但纯度仅90%左右。WO/2012/079039中采用硅胶层析,得到G418纯度达到95%以上的产品,生产成本较高。随着对氨基糖苷类产品提纯方法的不断研究,涌现出许多新的纯化技术,如泡沫分离法、反胶束萃取法、沉淀法和膜分离法等,但上述方法目前仅限于实验室研究,难以实现对G418发酵液的大规模纯化制备。此外,由于缺少G418成品的质量标准,国内厂家生产的成品中G418有效含量较低,一般在90-92%;杂质含量较高,严重影响了G418产品的质量。因此,亟需提供一种新的G418发酵液的精制纯化工艺。
发明内容
本发明的目的是提供一种G418发酵液的精制纯化工艺。
为了实现本发明目的,本发明提供的G418发酵液的精制纯化工艺包括:用草酸调节G418发酵液pH至2.0-3.0,然后加入助滤剂,充分搅拌,再经板框过滤、得到G418溶液;然后将G418溶液依次经陶瓷膜过滤、阳离子交换树脂吸附、阴离子交换树脂脱色、大孔吸附树脂吸附、真空浓缩和活性炭脱色。
前述的方法,用草酸调节G418发酵液pH至2.0-3.0,搅拌2-3h后加入助滤剂。加入草酸使菌体破壁,同时使发酵液中的金属离子和一些蛋白沉淀,增加上清液产品质量。
前述的方法,加入助滤剂搅拌20-40min后再经板框过滤。加入助滤剂有利于增加滤液流速。
所述助滤剂可以是硅藻土或珍珠岩,目数为40-100目,助滤剂的用量为G418发酵液体积的2-4%。
前述的方法,陶瓷膜过滤中选用多通道陶瓷膜,通道数控制在10-12。
优选地,膜材质为玻璃膜,孔径为0.20μm。
陶瓷膜过滤时,将流速控制在5-10m/s,压力控制在0.1-0.2MPa,滤液温度控制在40-50℃。陶瓷膜能够进一步去除滤液中的不溶物,使上清液更加清澈透明。
前述的方法,阳离子交换树脂可以去除绝大部分的蛋白、无机盐、糖类和脂类等成分,阳离子交换树脂吸附的方法如下:
A1、阳离子交换树脂上样:将阳离子树脂装入阳性柱内,G418溶液由上至下进入树脂柱内,流速控制在2.0-4.0BV/h;
A2、阳离子交换树脂淋洗:先用纯化水自上而下洗涤2.0-4.0个柱体积,流速控制在2.0BV/h,漂洗至洗出液无粉色;然后用0.2mol/L盐酸自上而下淋洗6-8个柱体积,流速控制在2.0-4.0BV/h,最后用纯化水淋洗至洗出液的pH4.0-5.0。
A3、阳离子交换树脂洗脱:淋洗结束后,用0.5mol/L氨水由上至下进入树脂柱内,流速控制在2.0-4.0BV/h,收集氨水解析液,至流出的氨水解析液中G418效价低于5.0mg/L时,停止洗脱。
前述的方法,阴离子交换树脂脱色包括:将氨水解析液进入阴离子交换树脂,流速控制在1.5-3.0BV/h,进行脱色,收集脱色液;脱色液颜色为清澈透明或淡黄色,若颜色深,呈现棕色或深黄色,则需重复阴离子交换树脂脱色。
所述阳离子交换树脂和阴离子交换树脂,其树脂材料的母体结构可以是苯乙烯-二乙烯苯共聚物,其中二乙烯苯在共聚物中的摩尔百分含量为4%-7%。
优选地,树脂材料的用量为G418质量的30-50倍,树脂柱的径高比为1:8-10。
前述的方法,大孔吸附树脂主要是除去残留在解析液中的小分子蛋白、粘性多糖、脂类和G418的类似物等杂质,大孔吸附树脂吸附的方法如下:
B1、大孔吸附树脂上样:将阴离子交换树脂脱色液以2.0-4.0BV/h的流速由上至下进入到大孔树脂柱中,直至树脂柱饱和,停止吸附,静置4.0-6.0h;
B2、大孔吸附树脂淋洗:先用纯化水自上而下洗涤2.0-4.0个柱体积,流速控制在2.0-4.0BV/h;
B3、大孔吸附树脂洗脱:淋洗结束后,用10%甲醇水溶液由上至下进入树脂柱内,流速控制在2.0-4.0BV/h,洗脱5.0-6.0个柱体积,收集含有G418的甲醇液,然后用0.03mol/L硫酸溶液洗脱,洗脱2.0-4.0个柱体积,收集硫酸解析液,至流出的硫酸解析液中G418效价低于5.0mg/L时,停止洗脱。
所述大孔吸附树脂,其树脂材料的母体结构可以是聚苯乙烯,如Amberlite公司生产的XAD-16。
优选地,树脂材料的用量为G418质量含量的10-20倍,树脂柱的径高比为1:8-10。
前述的方法,真空浓缩的条件为:50-70℃,真空度-0.06~-0.09MPa,浓缩至原收集液体积的1/8-1/10。
前述的方法,经真空浓缩后,向浓缩液中加入活性炭搅拌0.5-1h;静置0.5-1h,整个过程温度控制在55-60℃。
优选地,活性炭的目数为80-200目,用量为G418质量含量的1/50-1/20。
经活性炭脱色后,进行冷冻干燥,即得G418纯品。
冷冻干燥方法为:采用冷冻干燥机,干燥条件为-45~-5℃。真空度20~25Pa,掺入空气条件:1~3s/1min,干燥时间72~84h。
本发明中,所述G418发酵液可以是棘孢小单孢菌、绛红色小单孢菌或红橙小单孢菌发酵液。
与现有技术相比,本发明至少具有以下优点:
(一)本发明通过阴阳离子交换树脂,有效而准确地去除发酵液中无机盐,绝大部分蛋白、多糖、脂类和色素等,再通过大孔吸附树脂吸附,进一步除去残余的小分子蛋白、多糖、脂类、色素和G418的类似物。
(二)采用本发明的精制纯化工艺生产的成品中G418有效含量高,达到98.5%以上,远高于国内水平。
(三)本发明避免了常规提纯工艺中有机溶媒的污染问题。
(四)操作步骤简单,可控性高,提纯工艺总成本低,可实现对G418发酵液的大规模纯化制备。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用原料均为市售商品。
本发明中涉及到的百分号“%”,若未特别说明,是指质量百分比;但溶液的百分比,除另有规定外,是指100mL溶液中含有溶质的克数。
以下实施例中使用的陶瓷膜(多通道陶瓷膜)购自三达膜科技(厦门)有限公司,通道数控制在10-12,其膜材质为玻璃膜,孔径为0.2微米。阳离子交换树脂、阴离子交换树脂和大孔吸附树脂由Amberlite公司提供,树脂型号分别为IR-120、IRA-402和XAD-16型。
真空浓缩采用的双效蒸发器购自常州市华天药化设备有限公司,商品型号为FWZ2-2000。
以下实施例1和2中使用的G418发酵液,使用编号为ATCC27932的棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)进行G418发酵生产。菌株ATCC27932参见Wagman GH,etal.Antibiotic G-418,a new Micromonospora-produced aminoglycoside withactivity against protozoa and helminths:Fermentation,isolation,andpreliminary characterization.Antimicrob.Agents Chemother.6:144-149,1974。
具体地,采用三级发酵模式生产G418,各级配方和工艺控制条件如下:
一级种子配方:可溶性淀粉1.0%,葡萄糖0.15%,中温黄豆饼粉1.5%,硝酸铵0.15%,硫酸镁0.05%,碳酸钙0.3%。培养条件:34℃,培养周期:48hrs。向二级种子罐移种条件:镜检网枝无杂菌,菌体浓度:10%-12%。移种量:1.0%。
二级种子配方:玉米淀粉2.0%,麦芽糖1.0%,中温黄豆饼粉2.0%,硫酸镁0.05%,磷酸二氢钾0.02%,碳酸钙0.5%。培养条件:34℃,培养周期:36hrs。向三级发酵罐移种条件:镜检网枝无杂菌,菌体浓度:15%-20%。移种量:5.0%。
三级发酵配方:玉米淀粉6.0%,麦芽糖0.5%,中温黄豆饼粉2.0%,豆粕粉1.5%硫酸镁0.05%,硫酸亚铁0.02%,磷酸二氢钾0.15%,硫酸锌0.01%,碳酸钙0.6%。培养条件:30℃,培养周期:7-9天,20吨发酵罐检测发酵单位不低于900mg/L。
实施例1 G418发酵液的精制纯化工艺
1、发酵液预处理:G418发酵液5000L,发酵单位为910mg/L。
加入草酸调节G418发酵液pH至2.0,草酸用量为20kg,搅拌2h。加入助滤剂珍珠岩,用量为100kg,目数40目,搅拌20min。经板框过滤,得到G418溶液3600L。经检测,发酵单位是1245mg/L。发酵液预处理的收率为98.5%。
2、陶瓷膜过滤
采用循环式过滤,流速控制在5m/s,压力控制0.1-0.2MPa,滤液温度控制在40℃。过滤结束,G418水溶液3400L,发酵单位是1299mg/L,收率为98.6%。
3、树脂吸附
树脂吸附是指依次用阳离子交换树脂、阴离子交换树脂和大孔吸附树脂得到G418溶液。具体如下:
阳离子交换树脂上样:将阳离子树脂装入阳性柱内,G418溶液由上至下进入树脂柱内,流速控制在2.0BV/h,吸附材料的母体结构为苯乙烯-二乙烯苯共聚物(其中二乙烯苯在共聚物中的摩尔百分含量为7%),其用量为150KG。
阳离子交换树脂淋洗:先用纯化水自上而下洗涤2个柱体积,流速控制在2BV/h,漂洗至洗出液无粉色。然后用配置0.2mol/L的盐酸溶液,自上而下淋洗7个柱体积,流速控制在3BV/h,最后用纯化水淋洗至洗出液的pH4.5。
阳离子交换树脂洗脱:淋洗结束,使用0.5mol/L的氨水溶液由上至下进入树脂柱内,流速控制在2BV/h,至流出的溶液中G418效价低于5mg/L时,停止洗脱。收集G418洗脱液约1050L,发酵单位3995mg/L,收率为95.0%。
阴离子交换树脂:将氨水解析液进入阴离子交换树脂,进行脱色,流速为2.0BV/h,吸附材料的母体结构为苯乙烯-二乙烯苯共聚物,用量为150KG。收集G418洗脱液约1100L,发酵单位3776mg/L,收率为99.0%。
大孔吸附树脂上样:将阴离子交换树脂脱色液以2.0BV/h流速由上至下进入到大孔树脂柱中,吸附结束静止6h。大孔树脂其母体结构聚苯乙烯,其用量为83KG。
大孔吸附树脂淋洗:先用纯化水自上而下洗涤2个柱体积,流速控制在2BV/h。
大孔吸附树脂洗脱:淋洗结束,使用10%的甲醇水溶液由上至下进入树脂柱内,流速控制在2BV/h,收集含有G418的甲醇液,然后使用0.03mol/L硫酸溶液洗脱,至流出的溶液中G418效价低于5mg/L时,停止洗脱。
收集G418甲醇硫酸解析液约640L,发酵单位6152mg/L,收率为94.8%。
4、真空浓缩和活性炭脱色
采用双效蒸发器,操作条件:温度60℃,真空度为-0.09MPa,G418浓缩液约71.0L,然后加入200g,80目的活性炭后搅拌1h;静止1h,温度60℃。
过滤得到G418滤液71.0L,发酵单位53236mg/L,收率为96.0%。
5、干燥
使用冷冻燥机器干燥,每个托盘装量约1.5L,干燥条件:温度-45~-5℃;真空度:20~25Pa;掺入空气条件:1~3s/1min,干燥时间72h。
所得成品重量为3.77kg,G418含量为98.8%,总收率为82.8%。
实施例2 G418发酵液的精制纯化工艺
1、发酵液预处理:G418发酵液15m3,发酵单位为915mg/L。
加入草酸调节G418发酵液pH至3.0,草酸用量为60kg,搅拌3h。加入助滤剂硅藻土,用量为600kg,目数100目,搅拌40min。经板框过滤,得到G418溶液11.0m3。经检测,发酵单位是1226mg/L,发酵液预处理的收率为98.3%。
2、陶瓷膜过滤
采用循环式过滤,流速控制在10m/s,压力控制0.1-0.2MPa,滤液温度控制在50℃。过滤结束,G418水溶液10.4m3,发酵单位是1277mg/L,收率为98.5%。
3、树脂吸附
树脂吸附是指依次用阳离子交换树脂、阴离子交换树脂和大孔吸附树脂得到G418溶液。具体如下:
阳离子交换树脂上样:将阳离子树脂装入阳性柱内,G418溶液由上至下进入树脂柱内,流速控制在4.0BV/h,吸附材料的母体结构为苯乙烯-二乙烯苯共聚物(其中二乙烯苯在共聚物中的摩尔百分含量为7%),其用量为665KG。
阳离子交换树脂淋洗:先用纯化水自上而下洗涤2个柱体积,流速控制在4.0BV/h,漂洗至洗出液无粉色。然后用配置0.2mol/L的盐酸溶液,自上而下淋洗7个柱体积,流速控制在3.0BV/h,最后用纯化水淋洗至洗出液的pH4.5。
阳离子交换树脂洗脱:淋洗结束,使用0.5mol/L的氨水溶液由上至下进入树脂柱内,流速控制在4.0BV/h,至流出的溶液中G418效价低于5mg/L时,停止洗脱。收集G418洗脱液约5320L,发酵单位2354mg/L,收率为94.3%。
阴离子交换树脂:将氨水解析液进入阴离子交换树脂,进行脱色,流速为2.0BV/h,吸附材料的母体结构为苯乙烯-二乙烯苯共聚物,用量为665KG。收集G418洗脱液约5500L,发酵单位2247mg/L,收率为98.7%。
大孔吸附树脂上样:将阴离子交换树脂脱色液以2.0BV/h流速由上至下进入到大孔树脂柱中,其母体结构聚苯乙烯,其用量为247KG,静止6h。
大孔吸附树脂淋洗:先用纯化水自上而下洗涤2个柱体积,流速控制在2.0BV/h。
大孔吸附树脂洗脱:淋洗结束,使用10%的甲醇溶液由上至下进入树脂柱内,流速控制在4.0BV/h,收集含有G418甲醇液,然后使用0.03mol/L硫酸溶液洗脱,至流出的溶液中G418效价低于5.0mg/L时,停止洗脱。收集G418甲醇硫酸解析液约2500L,发酵单位4661mg/L,收率为94.3%。
4、真空浓缩和活性炭脱色
采用双效蒸发器,操作条件:温度60℃,真空度为-0.09MPa,G418浓缩液约250.0L,然后加入580g,200目的活性炭后搅拌1h;静止1h,温度60℃。过滤得到G418滤液249.0L,发酵单位44784mg/L,收率为95.7%。
5、干燥
使用冷冻燥机器干燥,每个托盘装量约2.0L,干燥条件:温度-45~-5℃;真空度:20~25Pa;掺入空气条件:1~3s/1min,干燥时间72h。
所得成品重量为11.0kg,G418含量为98.6%,总收率为80.1%。
实施例3 G418发酵液的精制纯化工艺(绛红色小单孢菌)
使用编号为ATCC15835的绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea)进行G418发酵生产。菌株ATCC15835参见Testa RT,Tilley BC.Biotransformation,a new approachto aminoglycoside biosynthesis:Ⅱgentamicin,J Antibiot(Tokyo),1976,29(2):140-146。
具体地,采用三级发酵模式生产G418,各级配方和工艺控制条件如下:
一级种子配方:葡萄糖0.5%,玉米淀粉1.5%,中温黄豆饼粉1.5%,蛋白胨0.2,硫酸铵0.2%,碳酸钙0.2%。培养条件:37℃,培养周期:48-56hrs。向二级种子罐移种条件:镜检网枝无杂菌,菌体浓度:10%-12%。移种量:0.5%。
二级种子配方:玉米淀粉2.0%,玉米粉0.5%,中温黄豆饼粉2.0%,氯化钾0.05%,磷酸氢二钾0.02%,碳酸钙0.3%。培养条件:37℃,培养周期:36-48hrs。向三级发酵罐移种条件:镜检网枝无杂菌,菌体浓度15%-20%。移种量:10.0%。
三级发酵配方:玉米淀粉4.5%,玉米粉1.0%,中温黄豆饼粉4.0%,鱼粉0.5%,磷酸二氢钾0.1%,氯化钴0.0001%,大豆油0.5%,碳酸钙0.5%。此外,在发酵第3天和第6天分别补入3%左右的玉米淀粉。培养条件:34℃,培养周期:9-12天,60吨发酵罐检测发酵单位不低于750mg/L。
1、发酵液预处理:G418发酵液45m3,发酵单位为790mg/L。
加入草酸调节G418发酵液pH至2.5,草酸用量为190kg,搅拌3h。加入助滤剂珍珠岩,用量为1350kg,目数100目,搅拌30min。经板框过滤,得到G418溶液32.0m3。经检测,发酵单位是1088mg/L,发酵液预处理的收率为98.0%。
2、陶瓷膜过滤
采用循环式过滤,流速控制在10m/s,压力控制0.1-0.2MPa,滤液温度控制在50℃。过滤结束,G418水溶液30.3m3,发酵单位是1133mg/L,收率为98.6%。
3、树脂吸附
树脂吸附是指依次用阳离子交换树脂、阴离子交换树脂和大孔吸附树脂得到G418溶液。具体如下:
阳离子交换树脂上样:将阳离子树脂装入阳性柱内,G418溶液由上至下进入树脂柱内,流速控制在4.0BV/h,吸附材料的母体结构为苯乙烯-二乙烯苯共聚物(其中二乙烯苯在共聚物中的摩尔百分含量为7%),其用量为1650KG。
阳离子交换树脂淋洗:先用纯化水自上而下洗涤2个柱体积,流速控制在4.0BV/h,漂洗至洗出液无粉色。然后用配置0.2mol/L的盐酸溶液,自上而下淋洗7个柱体积,流速控制在3.0BV/h,最后用纯化水淋洗至洗出液的pH4.5。
阳离子交换树脂洗脱:淋洗结束,使用0.5mol/L的氨水溶液由上至下进入树脂柱内,流速控制在4.0BV/h,至流出的溶液中G418效价低于5mg/L时,停止洗脱。收集G418洗脱液约14.8m3,发酵单位2178mg/L,收率为93.9%。
阴离子交换树脂:将氨水解析液进入阴离子交换树脂,进行脱色,流速为2.0BV/h,吸附材料的母体结构为苯乙烯-二乙烯苯共聚物,用量为1650KG。收集G418洗脱液约15.5m3,发酵单位2056mg/L,收率为98.9%。
大孔吸附树脂上样:将阴离子交换树脂脱色液以2.0BV/h流速由上至下进入到大孔树脂柱中,其母体结构聚苯乙烯,其用量为550KG,静止6h。
大孔吸附树脂淋洗:先用纯化水自上而下洗涤2个柱体积,流速控制在2.0BV/h。
大孔吸附树脂洗脱:淋洗结束,使用10%的甲醇溶液由上至下进入树脂柱内,流速控制在4.0BV/h,收集含有G418甲醇液,然后使用0.03mol/L硫酸溶液洗脱,至流出的溶液中G418效价低于5.0mg/L时,停止洗脱。收集G418甲醇硫酸解析液约5.5m3,发酵单位5452mg/L,收率为94.1%。
4、真空浓缩和活性炭脱色
采用双效蒸发器,操作条件:温度60℃,真空度为-0.09MPa,G418浓缩液约680.0L,然后加入1.0Kg,200目的活性炭后搅拌1h;静止1h,温度60℃。过滤得到G418滤液678.0L,发酵单位42192mg/L,收率为95.4%。
5、干燥
使用冷冻燥机器干燥,每个托盘装量约2.0L,干燥条件:温度-45~-5℃;真空度:20~25Pa;掺入空气条件:1~3s/1min,干燥时间72h。
所得成品重量为28.6kg,G418含量为98.5%,总收率为80.4%。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之做一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.G418发酵液的精制纯化工艺,其特征在于,包括:用草酸调节G418发酵液pH至2.0-3.0,然后加入助滤剂,充分搅拌,再经板框过滤、得到G418溶液;然后将G418溶液依次经陶瓷膜过滤、阳离子交换树脂吸附、阴离子交换树脂脱色、大孔吸附树脂吸附、真空浓缩和活性炭脱色;
所述助滤剂为硅藻土或珍珠岩,目数为40-100目,助滤剂的用量为G418发酵液体积的2-4%;
陶瓷膜过滤中选用多通道陶瓷膜,通道数控制在10-12;
膜材质为玻璃膜,孔径为0.20μm;
流速控制在5-10m/s,压力控制在0.1-0.2MPa,滤液温度控制在40-50℃;
阳离子交换树脂吸附的方法如下:
A1、阳离子交换树脂上样:将阳离子树脂装入阳性柱内,G418溶液由上至下进入树脂柱内,流速控制在2.0-4.0BV/h;
A2、阳离子交换树脂淋洗:先用纯化水自上而下洗涤2.0-4.0个柱体积,流速控制在2.0BV/h,漂洗至洗出液无粉色;然后用0.2mol/L盐酸自上而下淋洗6-8个柱体积,流速控制在2.0-4.0BV/h,最后用纯化水淋洗至洗出液的pH4.0-5.0;
A3、阳离子交换树脂洗脱:淋洗结束后,用0.5mol/L氨水由上至下进入树脂柱内,流速控制在2.0-4.0BV/h,收集氨水解析液,至流出的氨水解析液中G418效价低于5.0mg/L时,停止洗脱;
阴离子交换树脂脱色包括:将氨水解析液进入阴离子交换树脂,流速控制在1.5-3.0BV/h,进行脱色,收集脱色液;脱色液颜色为清澈透明或淡黄色,若颜色深,呈现棕色或深黄色,则需重复阴离子交换树脂脱色;
所述阳离子交换树脂和阴离子交换树脂,其树脂材料的母体结构为苯乙烯-二乙烯苯共聚物,其中二乙烯苯在共聚物中的摩尔百分含量为4%-7%,树脂材料的用量为G418质量的30-50倍;树脂柱的径高比为1:8-10;
大孔吸附树脂吸附的方法如下:
B1、大孔吸附树脂上样:将阴离子交换树脂脱色液以2.0-4.0BV/h的流速由上至下进入到大孔树脂柱中,直至树脂柱饱和,停止吸附,静置4.0-6.0h;
B2、大孔吸附树脂淋洗:先用纯化水自上而下洗涤2.0-4.0个柱体积,流速控制在2.0-4.0BV/h;
B3、大孔吸附树脂洗脱:淋洗结束后,用10%甲醇水溶液由上至下进入树脂柱内,流速控制在2.0-4.0BV/h,洗脱5.0-6.0个柱体积,收集含有G418的甲醇液,然后用0.03mol/L硫酸溶液洗脱,洗脱2.0-4.0个柱体积,收集硫酸解析液,至流出的硫酸解析液中G418效价低于5.0mg/L时,停止洗脱;
所述大孔吸附树脂,其树脂材料的母体结构为聚苯乙烯,树脂材料的用量为G418质量的10-20倍;树脂柱的径高比为1:8-10。
2.根据权利要求1所述的工艺,其特征在于,用草酸调节G418发酵液pH至2.0-3.0,搅拌2-3h后加入助滤剂。
3.根据权利要求1所述的工艺,其特征在于,加入助滤剂搅拌20-40min后再经板框过滤。
4.根据权利要求1所述的工艺,其特征在于,真空浓缩的条件为:50-70℃,真空度-0.06~-0.09MPa,浓缩至原收集液体积的1/8-1/10。
5.根据权利要求1所述的工艺,其特征在于,经真空浓缩后,向浓缩液中加入活性炭搅拌0.5-1.0h;静置0.5-1.0h,整个过程温度控制在55-60℃;
活性炭的目数为80-200目,用量为G418质量的1/50-1/20。
6.根据权利要求1-5任一项所述的工艺,其特征在于,所述G418发酵液为棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)、绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea)或红橙小单孢菌(Micromonospora rhodorangea)发酵液。
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