CN112480214B - 一种达巴万星关键中间体a40926的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种达巴万星关键中间体A40926的制备方法，适用于工业化生产。首先对A40926发酵液进行脱酰化处理，经大孔碱性吸附上样后酸性解析；大孔解析合并液通过疏水的聚合物微球层析，大极性杂质优先被洗脱，结构差异杂质最后被洗脱，组分与杂质分离度好，保留组分的同时有效清除杂质、色素等，并通过收集、合并对A40926的各组分含量及组分间的比例进行有效控制，聚合物微球层析合并液通过浓缩、沉淀、干燥，获得有效组分(组分A0、A1、B0、B1、B2)HPLC纯度高于95％、含量高于85％的A40926产品，极大的满足了达巴万星对关键中间体A40926的质量要求。

Description

一种达巴万星关键中间体A40926的制备方法

技术领域

本发明属于生物药物分离技术领域，具体涉及达巴万星关键中间体多组分A40926的制备方法。

背景技术

达巴万星(Dalbavancin)，也称作道古霉素，是一种新型第二代半合成糖肽类抗生素，为A40926的衍生物，达巴万星最先由美国Vicuron Pharmaceuticals公司开发并进入临床实验，后来此公司被辉瑞公司收购，于2014年5月23日获得FDA批准在美国上市的多组分抗生素。

达巴万星作用机制与万古霉素和替考拉宁相同，抑制G+菌细胞壁的生物合成，被广泛用作治疗急性细菌性皮肤和皮肤结构感染(ABSSSI)。体内、外试验表明，达巴万星对于G+菌包括耐甲氧西林金葡球菌(MRSA)、甲氧西林敏感金葡球菌(MSSA)、凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)、链球菌等具有抗菌活性。对耐G+病原菌包括耐青霉素和头孢曲松肺炎链球菌、替考拉宁不敏感CoNS、非vanA型肠球菌具有活性；对G+厌氧菌也具有活性。达巴万星是首个也是唯一一个被批准用于ABSSSI治疗的双剂量方案的静脉注射用抗生素。

达巴万星关键中间体A40926是由野野村放线菌ATCC39727发酵生物合成获得的多组分产物，发酵产物包含有效组分A0、A1、B0、B1、B2，前体物质PA、PB及少量的C(C0、C1)、D(D0、D1)组分，也包含其他的杂质(工艺杂质、降解杂质、无机杂质、发酵残留物等)。组分和前体物质的结构式如下：

A40926经酯化、酰胺化、水解获得达巴万星，但A40926为多组分的发酵产物，其有效组分A0、A1、B0、B1、B2的结构和性质相似，且各有效组分的含量及组分间比例要求高，同时需要严格控制工艺杂质、降解杂质等的限度，故对高质量多组分A40926的分离带来了很大困难，已成为盐酸达巴万星制备工艺的关键所在。

美国专利US8143212、CN107365357A中公开了一种A40926的制备方法，其发酵液脱酰化后进行陶瓷膜过滤，目标产物截留率高，需使用大量的水顶洗，导致后续层析上样体积极大；分离使用的聚酰胺树脂(SC-6)溶胀系数高，柱床填料易发生形变，影响分离效果；聚酰胺树脂上样吸附量低，虽然对色素性杂质清除较好，但对工艺杂质和降解杂质清除弱，上样完成后使用4种pH缓冲溶液洗涤、解析，操作繁琐。

中国专利CN110940763A中公开了一种A40926的精分方法，其使用高压层析，填料、设备价格高昂，且使用了乙腈作为层析溶剂，价格高、毒性大，不适用于工业化生产；目前原研上市产品为多组分(A0、A1、B0、B1、B2)的盐酸达巴万星，该专利工艺制备高纯度的A40926单一B0组分对制备达巴万星意义不大。

中国专利CN110156876A中公开的A40926制备方法，其发酵液脱酰化后进行陶瓷膜过滤，目标产物截留率高，需使用大量的水顶洗透过，不利于工业化生产；使用了酸沉淀操作，酸沉淀对溶液体系有要求，且酸沉淀样品形态不好、颗粒絮、颗粒小，难过滤，需添加助滤剂；制备的是A40926为单一B0组分产品，作为目前已上市的多组分达巴万星关键中间体并不合适。

中国专利CN110183519A中公开的A40926制备方法，发酵液水解后也采用了陶瓷膜过滤，使用了大量的水顶洗透过，目标产物依然有截留；XR910S树脂吸附上样后洗涤、解析操作复杂，且溶剂使用量大；XR3SP吸附上样，上样流出液有样品漏吸，会影响分离效果，使用高浓度的甲醇溶液洗涤、解析，工业化生产对人体伤害大，分离前后未介绍具体杂质的清除情况，A组分作为有效组分也被当做杂质进行清除，而目前已上市的多组分达巴万星对A40926的A、B组分均有严格要求，制备的A40926产品并未说明质量情况，若作为达巴万星关键中间体有待考量。

因此急需对A40926的制备工艺进行优化，保留有效组分，严格控制各有效组分的含量及组分间的比例；同时需要降低生产成本，简化工艺，保障产品质量及批间产品质量稳定。

发明内容

本发明克服了现有技术的不足，提供了一种达巴万星关键中间体A40926的制备方法，以期望可以简化达巴万星关键中间体A40926的工业化生产方法，获得高质量的A40926。

为达到上述目的，本发明提供了一种达巴万星关键中间体A40926的制备方法，它包括以下步骤：

步骤一、A40926发酵液经脱酰化、板框过滤，得到脱酰化滤液；

步骤二、所述的脱酰化滤液经大孔树脂碱性吸附上样，酸性洗涤、解析，得到大孔解析合并液；

步骤三、所述的大孔解析合并液加水稀释，加氯化钠，调pH，过滤后通入聚合物微球填料吸附上样，解析后得到聚合物微球层析合并液；

步骤四、所述的聚合物微球层析合并液回调pH，经纳滤浓缩、沉淀、干燥，得到达巴万星关键中间体A40926。

所述的达巴万星关键中间体A40926是高质量多组分的A40926，高质量是指有效组分HPLC纯度95％以上、含量85％以上，多组分是指包含有效组分A0、A1、B0、B1、B2。

步骤一所述的脱酰化是指向A40926发酵液中加入碱性溶液调节pH值为10.5～11.5，同时控制溶液温度为20～30℃，搅拌2～3h完成脱酰化。所述的碱性溶液是指2～20％氢氧化钠溶液、5～25％氨水和5～15％碳酸钠溶液中的任意一种。优选的，所用的脱酰化碱性溶液为4％氢氧化钠溶液，脱酰化pH为11.0～11.5，脱酰化温度为20～30℃，脱酰化时间为2～3h，脱酰化步骤需要使前体杂质PA、PB脱酰化完全，目标产物(A0、A1、B0、B1、B2)稳定，杂质IsoB0的含量不得超过2.0％。

步骤二所述的大孔树脂是HZ-818、XR901CS中的任意一种，树脂粒径为0.3～1.2mm，上样量为15～25g/L。选择的大孔树脂都具有对目标产物吸附选择性高而达到高载样量，树脂粒径使层析阻力小，对设备要求低，树脂价格相对低且耐用，便于产业化放大。

步骤二所述的酸性洗涤采用的洗涤剂为浓度0.05～0.5mol/L的硫酸水溶液或者0.1～1mol/L的盐酸水溶液，洗涤3～5BV；步骤二所述的解析采用的解析剂为60～80％乙醇溶液，水相含0.1～1mol/L硫酸或者0.2～2mol/L盐酸，解析2～4BV。采用酸性洗涤，流出液呈酸性，保障目标产物pH转换完全；在用乙醇溶液解析时，水相中加入一定浓度的盐酸或者硫酸，目标产物解析率高，且得到了高效富集，而吸附的色素性杂质、大分子有机杂质解析流出少。

步骤三所述的加水稀释是指向大孔解析合并液中加入3～5倍体积的水稀释作为层析上样液，加入所述的氯化钠后所述的层析上样液中氯化钠浓度为0.5～5％，步骤三所述的调pH是指用2～20％氢氧化钠溶液、5～25％氨水或者5～15％碳酸钠溶液调节所述的层析上样液的pH值为8～9。本步骤加入氯化钠的目的是保障高上样量，调节pH的目的是层析对杂质的有效清除。

步骤三所述的聚合物微球填料是UniPMM40-500、PS30-300中的任意一种，优选的，聚合物微球填料是UniPMM40-500，填料材质为聚甲基丙乙酸酯，粒径为40μm，孔径为500A；步骤三所述的上样量为15～25g/L，选择疏水的聚合物微球填料具有对目标产物吸附选择性高，填料为均一粒径使层析阻力相对小、柱效高，可实现高流速的上样、解析，极大的提高了生产效率，便于产业化放大。

步骤三使用的解析剂为0.01～0.1mol/L磷酸氢二钠或者0.01～0.1mol/L碳酸氢钠溶液，且该解析剂用2～20％氢氧化钠溶液调pH10.5～11.5，调节解析剂pH的目的是解析率高、下样集中，且使大极性的MAG、D0、D1等杂质优先被洗脱流出，IsoB0、Demannosyl-A40926等杂质与有效组分之间的结构差异而最后被洗脱，解析5～10BV。优选的，解析剂为0.01～0.02mol/L碳酸氢钠溶液，且用10～20％氢氧化钠溶液调pH10.5～11.0，解析5～10BV。本步骤未使用有机溶剂，目标产物解析率高，杂质清除好，有效组分保留好，产品质量得到大幅提升。

步骤四用酸液回调聚合物微球层析合并液的pH至6.0～7.0，所述酸液为10～50％硫酸或者5～15％盐酸。优选的，调pH所用的酸为10～15％盐酸，调pH后形成一价盐，保障纳滤浓缩、顶洗对一价盐的有效清除(纳滤对二价及二价以上的盐清除能力有限，对一价盐清除能力更高)。

步骤四所述的纳滤浓缩采用的膜材质为聚醚砜，纳滤膜截留分子量为100～300Da，浓缩温度为10～30℃，浓缩压力为1.0～2.0MPa，所得浓缩液的浓度为100～200g/L，顶洗浓缩液等体积的水2～5次。优选的，浓缩温度为20～30℃，浓缩压力为1.5～2.0MPa，浓缩液浓度为100～200g/L，顶洗浓缩液等体积的水3～5次。纳滤浓缩对无机盐清除好，顶洗滤液电导率100us/cm以下。

步骤四所述的沉淀是指向纳滤浓缩得到的浓缩液中加入其体积4～6倍的丙酮沉淀，搅拌20～40min，静置120～180min，沉淀物的固体形态好，易过滤，无引湿吸潮现象。

步骤四所述的干燥采用鼓风干燥，鼓风干燥温度为30～40℃，干燥至减失重量≤1％/h。

本发明中涉及到的乙醇的浓度是指体积分数，其他溶液的浓度是指溶质的质量分数。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

本发明提供了达巴万星关键中间体A40926的制备方法，目前国内已报道的制备方法大多仅局限于单一组分A40926-B0的制备，工艺步骤多，单元操作繁琐，后续的放大生产及产业化生产困难；单一组分的A40926-B0产品已不满足目前已上市达巴万星的需求，本发明提供的制备工艺，工艺步骤简短，单元操作简单，对色素、有机杂质、无机杂质等清除好，通过收集、合并有效组分，对A40926的有效组分A0、A1、B0、B1、B2的含量及组分间比例进行了有效控制，得到了高质量(有效组分HPLC纯度高于95％、含量高于85％)、多组分的A40926产品，极大的满足了达巴万星对A40926的杂质、组分的质控要求，为达巴万星的工业化生产奠定了基础。

附图说明

图1是本发明的制备工艺流程图。

图2是本发明实施例1的脱酰化滤液的HPLC图谱。

图3是本发明实施例2的解析合并液的HPLC图谱。

图4是本发明实施例3的解析合并液的HPLC图谱。

图5是本发明实施例4 A40926产品的HPLC图谱。

图6是本发明实施例5的解析合并液的HPLC图谱。

图7是本发明实施例6 A40926产品的HPLC图谱。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

A40926发酵液10000L，A40926-B0单位为1880ug/mL，用4％氢氧化钠溶液调pH11.2，控制物料温度约25℃，搅拌脱酰化。搅拌2h后取样检测A40926含量及组分前体物质PA、PB的残留量；检测结果如图2和表1所示。从表1可以看出，A40926有效组分HPLC纯度为78.09％，碱降解杂质IsoB0为0.84％，有效控制在限度内，图2显示PA、PB已无残留，表示脱酰化已经完成。接着加入2％珍珠岩(提升过滤效率)，板框压滤，2h压滤完成得到脱酰化滤液，顶洗2500L饮用水，合并脱酰化滤液和顶洗液，共9500L。脱酰化滤液呈红棕色透明液体，经检测，脱酰化滤液的A40926-B0单位为1811ug/mL，A40926-B0的收率为91.51％。

表1实施例1脱酰化滤液的HPLC图谱结果

实施例2

将实施例1合并脱酰化滤液和顶洗液得到的9500L合并液通入1000L大孔树脂HZ-818(树脂粒径为0.3～1.2mm)中，上样量为17.20g A40926-B0/L树脂，流速为500～1500L/h，流出液颜色深且有固形物析出，上样完成后洗涤4000L0.1mol/L盐酸水溶液，流出液呈淡黄色液体、显酸性，解析2500L 70％乙醇溶液(水相含0.3mol/L盐酸)，合并A40926-B0500ug/mL以上的解析液，得到1500L解析合并液①，HPLC检测结果如图3和表2所示，有效组分保留好，HPLC图谱0～5min杂质清除明显。解析合并液①呈褐色透明液体，解析合并液①的A40926-B0单位为11038ug/mL，可见层析后目标产物得到了高效富集，收率96.24％。

表2解析合并液①的HPLC图谱结果

实施例3

取实施例2的解析合并液①150L，加水稀释至600L，加入6kg氯化钠(层析上样液中加入1％氯化钠)，用10％碳酸钠溶液调层析上样液的pH8.5，1m²板框过滤，滤液以流速200～400L/h通入100L UniPMM40-500填料中上样，上样量16.56g A40926-B0/L填料，以流速300～500L/h解析900L pH10.7缓冲盐溶液(0.02mol/L的碳酸氢钠溶液，用20％氢氧化钠溶液调pH)，取解析液进行HPLC检测，HPLC检测后合并解析液520L，HPLC检测结果如图4和表3所示，即解析合并液②，其A40926-B0单位为2880ug/mL，呈淡黄色透明液体，层析后目标产物有效组分保留好、HPLC纯度大幅提升，对MAG、D0、D1、IsoB0、Demannosyl-A40926等杂质清除好，且色素性杂质清除明显，收率90.45％。

表3解析合并液②的HPLC图谱结果

实施例4

将实施例3的520L解析合并液②用10％盐酸调pH6.5，入料2540纳滤浓缩设备(聚醚砜膜，截留分子量为100Da)，入料压力1.7MPa，温度22～28℃，浓缩至10L，水顶洗4次(10L/次)，顶洗滤液电导率44us/cm，收集浓缩液10L，所得浓缩液A40926-B0浓度为131g/L；向浓缩液中加入50L丙酮沉淀，搅拌30min，静置145min，过滤盅过滤，收集沉淀湿品；将沉淀湿品置于鼓风干燥箱中，35℃，鼓风干燥至减失重量≤1％/h以下，得A40926产品1.72Kg，其中A40926-B0含量75.68％，有效组分(A0、A1、B0、B1、B2)含量89.11％，产品外观呈类白色固体粉末，水分6.77％，收率86.92％。A40926产品的HPLC图谱如图5所示，HPLC图谱结果如表4所示。发酵液至A40926产品总收率69.24％。

表4A40926产品的HPLC图谱结果

实施例5

向1350L实施例2的解析合并液①中加水稀释至5000L，加入50kg氯化钠(所得液体中加入1％氯化钠)，用10％碳酸钠溶液调pH8.5，板框过滤，收集滤液5000L；取250L滤液通入DAC450层析柱(装填UniPMM40-500填料40L)中上样，上样量18.63g A40926-B0/L填料，流速240～360L/h，解析350L pH10.7缓冲盐溶液(0.02mol/L的碳酸氢钠溶液，用20％氢氧化钠溶液调pH10.7)，HPLC检测后合并解析液240L；按照首针DAC450层析条件和收集合并方式，再进行DAC450柱层析19次(无需取样检测)，合并20针柱层析解析液得解析合并液4750L，A40926-B0单位为2864ug/mL，HPLC检测结果如图6和表5所示，解析合并液呈淡黄色透明液体，层析后目标产物有效组分保留好、HPLC纯度大幅提升，对MAG、D0、D1、IsoB0、Demannosyl-A40926等杂质清除好，且色素性杂质清除明显，收率91.29％。解析未使用有机溶剂，安全、环保，使用少量的填料也可以大批量生产，极大地降低了生产成本，为工业化生产奠定了坚实的基础。

表5实施例5中A40926的HPLC图谱结果

实施例6

将实施例5的解析合并液4750L用10％盐酸调pH6.5，入料4040纳滤浓缩设备，入料压力1.7MPa，温度22～26℃，浓缩至90L，水顶洗4次(90L/次)，顶洗滤液电导率36us/cm，收集浓缩液90L，浓缩液A40926-B0浓度为130g/L；向浓缩液中加入450L丙酮沉淀，搅拌31min，静置150min，离心机过滤，收集沉淀湿品；将沉淀湿品置于鼓风干燥箱中，35℃，鼓风干燥至减失重量≤1％/h以下，得A40926产品15.20Kg，其中A40926-B0含量76.33％，有效组分(A0、A1、B0、B1、B2)含量89.85％，产品外观呈类白色固体粉末，水分6.06％，收率85.28％。A40926产品的HPLC图谱如图7所示，HPLC图谱结果如表6所示。发酵液至A40926产品总收率68.57％。

表6实施例6中A40926的HPLC图谱结果

实施例7

A40926发酵液1000L，A40926-B0单位为2028ug/mL，用4％氢氧化钠溶液调pH11.5，控制物料温度约25℃，搅拌脱酰化2h，加入2％珍珠岩，板框压滤，0.5h压滤完成后顶洗300L饮用水，合并脱酰化滤液和顶洗液，共1050L。脱酰化滤液呈红棕色透明液体，经HPLC检测，脱酰化滤液的A40926-B0单位为1780ug/mL，A40926-B0的收率为92.16％，HPLC检测结果如表7所示。

表7实施例7脱酰化滤液的HPLC图谱结果

实施例8

将实施例7脱酰化滤液100L通入10L大孔树脂HZ-818中上样(上样量为17.80gA40926-B0/L树脂)，流速为5～15L/h，流出液颜色深且有固形物析出，上样完成后洗涤3L0.5mol/L硫酸水溶液，流出液呈淡黄色液体、显酸性，解析20L 80％乙醇溶液(水相含1mol/L硫酸)，合并A40926-B0 500ug/mL以上的解析液，得到解析合并液11L，解析合并液呈褐色透明液体，解析合并液A40926-B0单位为15449ug/mL，收率95.47％。

将解析合并液11L，加水稀释至50L，加入2.5kg氯化钠，用25％氨水调pH9.0，过滤，滤液以流速50～100L/h通入10L UniPMM40-500填料中上样，上样量16.99g A40926-B0/L填料，以流速50～100L/h解析50L pH11.0缓冲盐溶液(0.1mol/L的碳酸氢钠溶液，用20％氢氧化钠溶液调pH)，解析流出液经HPLC检测后得合并解析液35L，其A40926-B0单位为4100ug/mL，呈淡黄色透明液体，色素性杂质清除明显，收率84.44％。

将UniPMM40-500解析合并液35L用15％盐酸调pH7.0，入料1812纳滤浓缩设备(聚醚砜膜，截留分子量为100Da)，入料压力1.5MPa，温度23～28℃，浓缩至0.8L，水顶洗3次(0.8L/次)，顶洗滤液电导率75us/cm，收集浓缩液0.8L，所得浓缩液A40926-B0浓度为155g/L；向浓缩液中加入3.2L丙酮沉淀，搅拌20min，静置120min，过滤盅过滤，收集沉淀湿品；将沉淀湿品置于鼓风干燥箱中，35℃，鼓风干燥至减失重量≤1％/h以下，得A40926产品160g，经HPLC检测其中A40926-B0含量72.93％，有效组分(A0、A1、B0、B1、B2)含量85.85％，产品外观呈类白色固体粉末，水分6.88％，收率81.32％。A40926产品的HPLC图谱结果如表8所示。发酵液至A40926产品总收率60.42％。

表8A40926产品的HPLC图谱结果

实施例9

将实施例7脱酰化滤液100L通入10L大孔树脂HZ-818中上样(上样量为17.80gA40926-B0/L树脂)，流速为5～15L/h，流出液颜色深且有固形物析出，上样完成后洗涤3L1mol/L盐酸水溶液，流出液呈淡黄色液体、显酸性，解析20L 80％乙醇溶液(水相含2mol/L盐酸)，合并A40926-B0 500ug/mL以上的解析液，得到解析合并液11L，解析合并液呈褐色透明液体，解析合并液A40926-B0单位为15502ug/mL，收率95.80％。

将解析合并液11L，加水稀释至50L，加入250g氯化钠，用2％氢氧化钠调pH8.0，过滤，滤液以流速50～100L/h通入10L UniPMM40-500填料中上样，上样量17.05g A40926-B0/L填料，以流速50～100L/h解析100L pH10.5缓冲盐溶液(0.01mol/L的碳酸氢钠溶液，用20％氢氧化钠溶液调pH)，解析流出液经HPLC检测后得合并解析液65L，其A40926-B0单位为2361ug/mL，呈淡黄色透明液体，色素性杂质清除明显，收率90.00％。

将UniPMM40-500解析合并液65L用5％盐酸调pH6.0，入料1812纳滤浓缩设备(聚醚砜膜，截留分子量为100Da)，入料压力1.5MPa，温度23～27℃，浓缩至0.8L，水顶洗5次(0.8L/次)，顶洗滤液电导率38us/cm，收集浓缩液0.8L，所得浓缩液A40926-B0浓度为169g/L；向浓缩液中加入4.8L丙酮沉淀，搅拌40min，静置180min，过滤盅过滤，收集沉淀湿品；将沉淀湿品置于鼓风干燥箱中，35℃，鼓风干燥至减失重量≤1％/h以下，得A40926产品176g，经HPLC检测其中A40926-B0含量75.51％，有效组分(A0、A1、B0、B1、B2)含量88.79％，产品外观呈类白色固体粉末，水分6.03％，收率86.60％。A40926产品的HPLC图谱结果如表9所示。发酵液至A40926产品总收率68.81％。

表9A40926产品的HPLC图谱结果

实施例10

将实施例7脱酰化滤液100L通入10L大孔树脂XR901CS中上样(上样量为17.80gA40926-B0/L树脂)，流速为5～15L/h，流出液颜色深且有固形物析出，上样完成后洗涤40L0.1mol/L盐酸水溶液，流出液呈淡黄色液体、显酸性，解析30L 70％乙醇溶液(水相含0.3mol/L盐酸)，合并A40926-B0 500ug/mL以上的解析液，得到解析合并液18L，解析合并液呈褐色透明液体，解析合并液A40926-B0单位为9493ug/mL，收率96.00％。

将大孔解析合并液18L，加水稀释至70L，加入700g氯化钠，用10％碳酸钠溶液调pH8.5，过滤，滤液以流速50～100L/h通入10L UniPMM40-500填料中上样，上样量17.09gA40926-B0/L填料，以流速50～100L/h解析90L pH10.7缓冲盐溶液(0.02mol/L的碳酸氢钠溶液，用20％氢氧化钠溶液调pH)，解析流出液经HPLC检测后得合并解析液50L，其A40926-B0单位为2972ug/mL，呈淡黄色透明液体，色素性杂质清除明显，收率86.96％。

将UniPMM40-500解析合并液50L用10％盐酸调pH6.5，入料1812纳滤浓缩设备(聚醚砜膜，截留分子量为100Da)，入料压力1.7MPa，温度23～27℃，浓缩至0.8L，水顶洗4次(0.8L/次)，顶洗滤液电导率36us/cm，收集浓缩液0.8L，所得浓缩液A40926-B0浓度为166g/L；向浓缩液中加入4L丙酮沉淀，搅拌30min，静置150min，过滤盅过滤，收集沉淀湿品；将沉淀湿品置于鼓风干燥箱中，35℃，鼓风干燥至减失重量≤1％/h以下，得A40926产品173g，经HPLC检测其中A40926-B0含量75.15％，有效组分(A0、A1、B0、B1、B2)含量88.29％，产品外观呈类白色固体粉末，水分6.37％，收率87.49％。A40926产品的HPLC图谱结果如表10所示。发酵液至A40926产品总收率67.31％。

表10A40926产品的HPLC图谱结果

尽管这里参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。

Claims (8)

1.一种达巴万星关键中间体A40926的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：

步骤一、A40926发酵液经脱酰化、板框过滤，得到脱酰化滤液；

步骤二、所述的脱酰化滤液经大孔树脂碱性吸附上样，酸性洗涤、解析，得到大孔解析合并液；所述的酸性洗涤采用的洗涤剂为0.05～0.5mol/L的硫酸水溶液或者0.1～1mol/L的盐酸水溶液，洗涤3～5BV；所述的解析采用的解析剂为60～80％乙醇溶液，水相含0.1～1mol/L硫酸或者0.2～2mol/L盐酸，解析2～4BV；

步骤三、所述的大孔解析合并液加水稀释，加氯化钠，调pH，过滤后通入聚合物微球填料吸附上样，解析后得到聚合物微球层析合并液；所述的加水稀释是指向大孔解析合并液中加入3～5倍体积的水稀释作为层析上样液，加入所述的氯化钠后所述的层析上样液中氯化钠浓度为0.5～5％，所述的调pH是指调节所述的层析上样液的pH值为8～9；所述的聚合物微球填料是UniPMM40-500、PS30-300中的任意一种，使用的解析剂为0.01～0.1mol/L磷酸氢二钠或者0.01～0.1mol/L碳酸氢钠溶液，该解析剂用2～20％氢氧化钠溶液调pH10.5～11.5，解析5～10BV；

步骤四、所述的聚合物微球层析合并液用酸液回调pH至6.0～7.0，经纳滤浓缩、沉淀、干燥，得到达巴万星关键中间体A40926。

2.根据权利要求1所述的达巴万星关键中间体A40926的制备方法，其特征在于步骤一所述的脱酰化是指向A40926发酵液中加入碱性溶液调节pH值为10.5～11.5，同时控制溶液温度为20～30℃，搅拌2～3h完成脱酰化。

3.根据权利要求2所述的达巴万星关键中间体A40926的制备方法，其特征在于所述的碱性溶液是指2～20％氢氧化钠溶液、5～25％氨水和5～15％碳酸钠溶液中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的达巴万星关键中间体A40926的制备方法，其特征在于步骤二所述的大孔树脂是HZ-818、XR901CS中的任意一种，树脂粒径为0.3～1.2mm，上样量为15～25g/L。

5.根据权利要求1所述的达巴万星关键中间体A40926的制备方法，其特征在于步骤三调pH使用的溶液是2～20％氢氧化钠溶液、5～25％氨水和5～15％碳酸钠溶液中的任意一种。

6.根据权利要求1所述的达巴万星关键中间体A40926的制备方法，其特征在于步骤四所述酸液为10～50％硫酸或者5～15％盐酸。

7.根据权利要求1所述的达巴万星关键中间体A40926的制备方法，其特征在于步骤四所述的纳滤浓缩采用的膜材质为聚醚砜，纳滤膜截留分子量为100～300Da，浓缩温度为10～30℃，浓缩压力为1.0～2.0MPa，所得浓缩液的浓度为100～200g/L，顶洗浓缩液等体积的水2～5次。

8.根据权利要求1所述的达巴万星关键中间体A40926的制备方法，其特征在于步骤四所述的沉淀是指向纳滤浓缩得到的浓缩液中加入其体积4～6倍的丙酮，搅拌20～40min，静置120～180min。

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