CN103073622B - 一种高纯度肺囊康定b0的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用丝状真菌Glarea？lozoyensis发酵培养物制备肺囊康定B₀的方法。该方法包括使用助滤剂，经过浸提、脱色、吸附、结晶等步骤，得到肺囊康定B₀粗提物，再借助聚合物微球对粗提物进行层析分离，得到高纯度的肺囊康定B₀产品。本发明的优点在于采用大孔树脂提取分离肺囊康定B₀，工艺简单易行，适宜于工业化生产；并首次将聚合物微球用于该产品的层析分离，可以制备高纯度的肺囊康定B₀产品。

Description

一种高纯度肺囊康定B0的制备方法

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一种高纯度肺囊康定B₀的制备方法。

背景技术

棘白霉素是一类新型的抗真菌药，对于念珠菌属以及曲霉菌属均有效，而且安全性较高。目前已经有3个品种上市，即默克公司的卡泊芬净，藤泽药业的米卡芬净，以及辉瑞公司的阿尼芬净。其中卡泊芬净是美国FDA最早批准上市的一种棘白菌素，由默克公司研制开发，2001年2月首先在美国上市，用于白色念珠菌和烟曲霉菌的感染。

卡泊芬净(Caspofungin)，是第一个被批准用于治疗由于不能耐受其它抗真菌药物，或者其它抗真菌药物疗效不佳的侵袭性曲霉病的棘白菌素类抗真菌药物(GrollAH，PiscitelliSC，WalshTJ.AdvPharmacol，1998，44：343-500)。卡泊芬净对于念珠菌、曲霉菌等有良好的抑制活性(GeorgopapadakouNH.ExpertOpinInvestigDrugs，2001，10：269-280)，对于一些双相真菌如组织胞浆菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌等也有抑制作用。与其它棘白菌素类抗真菌药物相似，该药有良好的药代动力学特性。因此，卡泊芬净的研究开发具有重要意义。

肺囊康定(Pneumocandin)是丝状真菌Glarealozoyensis的发酵代谢产物，分为肺囊康定B₀与肺囊康定A₀，其中肺囊康定B₀是合成卡泊芬净(caspofungin)的主要原料。肺囊康定B₀经BH₃、Me₂S还原酰胺基后，与胺乙基硫醇在对甲苯磺酸作用下脱去1分子水，在分子中引入胺乙基硫基，用臭氧对硫氧化后，与乙二胺作用引入乙二胺基，再与2分子醋酸成盐制得卡泊芬净。

肺囊康定B₀的结构式如下：

目前，关于肺囊康定B₀提取分离的文献报道较少，且已有的制备方法具有工艺复杂，所得产品纯度不高、收率低等缺点，难于实现工业化生产。默克公司的科研人员对其进行过系统研究，但在分离纯化工艺方面仅仅是实验室工艺的研究，尚没有成熟的能够直接应用于规模化生产的方法介绍。中国专利CN101659693A公开了一种制备肺囊康定B₀的方法，该方法用两种溶剂反复提取肺囊康定B₀，工艺比较繁琐，收率偏低，提取总收率小于50％；且该方法用酸性氧化铝对提取液进行脱色处理，成本较高，不适宜工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于克服已有技术的不足之处，开发一种操作简便，所用溶剂毒性低，收率高，适于规模化生产肺囊康定B₀的方法。本发明采用大孔吸附树脂提取分离肺囊康定B₀，工艺简单易行，适宜于工业化生产；并首次将聚合物微球用于该产品的层析分离，可以制备高纯度的肺囊康定B₀产品。

下面对本发明进行具体描述：

在本发明方法中，通过加入助滤剂，提高发酵液固液分离效果，同时有效去除杂质含量高的滤液，得到固形发酵培养物。在固形发酵培养物中加入极性溶剂溶解肺囊康定B₀。收集极性溶剂提取液，导入大孔脱色树脂脱色，得到淡黄色脱色液。脱色液调低溶剂浓度后导入大孔吸附树脂进行吸附，极性较大的杂质和小分子蛋白由于不被吸附而流出。吸附完毕先用低浓度的极性溶剂净化洗涤吸附树脂，再用解吸剂解吸。解吸液浓缩、萃取、结晶，得到肺囊康定B₀粗提物。粗提物经聚合物微球层析分离，得到高纯度的肺囊康定B₀产品。

具体地，本发明涉及一种高纯度肺囊康定B₀的制备方法，包括下述步骤：

1)在肺囊康定B₀发酵液中加入助滤剂，机械搅拌均匀；

2)发酵液固液分离，得到固形发酵培养物；

3)在固形发酵培养物中加入极性溶剂搅拌浸提；

4)浸提液固液分离，得到肺囊康定B₀提取液；

5)将提取液导入大孔脱色树脂脱色，得到脱色液；

6)调整脱色液中极性溶剂浓度后将其导入大孔吸附树脂进行吸附，吸附完毕用解吸剂进行解吸，得到解吸液；

7)将解吸液依次浓缩、萃取、结晶，得到肺囊康定B₀粗提物；

8)粗提物依次经聚合物微球层析分离、洗脱溶剂洗脱后，得到洗脱液；

9)将步骤8)中的洗脱液分段浓缩、萃取、结晶、干燥，得到高纯度的肺囊康定B₀产品。

其中，步骤1)中的助滤剂为珍珠岩或硅藻土，优选为珍珠岩。助滤剂用量为发酵液体积的0.5％-5％(千克/升)，优选为1％-3％(千克/升)。机械搅拌时间为0.5-2小时，优选为0.5-1小时。

步骤2)中的固形发酵培养物为通过传统的固液分离方式如真空抽滤、板框压滤得到干燥的肺囊康定B₀发酵培养物。水溶性蛋白、发酵过程中产生的水溶性强的其他次级代谢产物等杂质存在于发酵液中，随着固液分离过程被舍弃。

步骤3)中的极性溶剂为甲醇、乙醇或丙酮之一，优选为乙醇。极性溶剂的加入量为发酵培养物重量的2-6倍(升/千克)，优选为4-6倍(升/千克)。提取时间为1-3小时，优选为1-2小时。

步骤5)中的大孔脱色树脂为D303、D290、S-8或XDA-7树脂之一，优选为D303树脂。该树脂用量为提取液体积的0.02-0.1倍(体积比)，优选为0.04-0.06倍(体积比)。脱色流速为每小时树脂体积的1-3倍，优选为1.5-2.5倍。

步骤6)中脱色液的极性溶剂浓度应调整至30-40％(体积百分比)。

步骤6)中的大孔吸附树脂为HZ816、HZ830、AB-8或D312树脂之一，优选为HZ830树脂。该树脂用量为为脱色液体积的0.03-0.1倍(体积比)，优选为0.04-0.06倍(体积比)；吸附流速为每小时树脂体积的1-3倍(体积比)，优选为1.5-2.5倍(体积比)。

步骤6)中的解吸剂为甲醇、乙醇或丙酮之一，优选为乙醇。解吸剂浓度为70-95％(体积百分比)，优选为80％-90％(体积百分比)。解吸流速为每小时树脂体积的0.5-3倍(体积比)，优选为0.5-1倍(体积比)。

步骤7)、9)中的萃取剂为乙酸乙酯、正丁醇或二氯甲烷之一，优选为乙酸乙酯。结晶溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、异丙醇或石油醚之一，优选为丙酮或异丙醇。

步骤8)中的聚合物微球是采用聚苯乙烯、聚苯乙烯衍生物、聚丙烯酸酯、聚丙烯酸酯衍生物之一制备，优选为聚苯乙烯聚合物微球。

步骤8)中的洗脱溶剂为甲醇-水、乙醇-水或丙酮-水中的一组，优选为甲醇-水或丙酮-水。

步骤9)中干燥方式为真空干燥，干燥温度为40-50℃，干燥时间为24小时。

本发明所得肺囊康定B₀产品是合成卡泊芬净的重要合成前体，其HPLC含量达到98％以上，样品回收率大于70％。

本发明有如下优点：1.固液分离过程中加入了助滤剂，提高了过滤速度，缩短了工艺周期。同时经过固液分离舍弃了含色素、蛋白质及其他大极性杂质的滤液，提高了提取液的质量。2.大孔脱色树脂的应用，有效去除了提取液中大部分色素和极性大的杂质，提高了脱色液的质量。3.采用大孔吸附树脂对目的产物进行富集和纯化，进一步摒弃了发酵次级代谢产物的干扰，提高了目的产物的质量。4.聚合物微球的应用，可以得到高纯度的肺囊康定B₀产品，最终产品HPLC含量达到98％以上。5.工艺简洁，样品回收率高，全程总收率达到70％以上。6.全程所用溶剂均为常规溶剂，毒性小，适宜于工业化生产。

附图说明

附图1：实施例1肺囊康定B₀粗提物HPLC图谱

附图2：实施例1肺囊康定B₀精粉HPLC图谱

具体实施例

下述实施例仅用于阐述实现本发明的方法，不应理解为对本发明的限制。

本发明所使用的肺囊康定B₀发酵液均为华药股份公司研发中心用微生物培养手段得到的发酵液。大孔树脂D303、D290、HZ816、HZ830、D312，上海华震科技有限公司生产；大孔树脂XDA-7，西安电力树脂厂生产；大孔树脂AB-8、S-8，天星树脂厂生产；聚合物微球，苏州纳微科技公司生产。甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、正丁醇、乙酸乙酯、异丙醇、石油醚等试剂均为市售。本发明使用的高效液相色谱仪为996型检测器，515泵(Waters公司)。

实施例1

取肺囊康定B₀发酵液10.0L，发酵液单位832μg/mL。在发酵液中加入100g珍珠岩，搅拌30分钟后真空抽滤，得到2.0kg发酵培养物。在发酵培养物中加入8L工业乙醇，机械搅拌1小时后真空抽滤，收集提取液。将提取液通过径高比为1∶6的D303树脂柱进行脱色，树脂装量为500mL，流速为1000mL/h。收集脱色液，调溶剂浓度至30％，导入径高比为1∶6的HZ830树脂柱吸附，树脂装量为400mL，流速为800mL/h。饱和树脂用40％的乙醇净化洗涤，然后用80％的乙醇解吸，流速为200mL/h。解吸液浓缩，用乙酸乙酯萃取，丙酮结晶，得到肺囊康定B₀粗提物8.6g(见附图1)。粗提物用聚合物微球层析分离，甲醇-水梯度洗脱。洗脱液浓缩、萃取、结晶、干燥，得到肺囊康定B₀精粉6.0g(见附图2)。提取总收率为70.7％，精粉HPLC含量为98.1％。

实施例2

取肺囊康定B₀发酵液10.0L，发酵液单位762μg/mL。在发酵液中加入300g珍珠岩，搅拌1小时后真空抽滤，得到2.2kg发酵培养物。在发酵培养物中加入13.2L工业乙醇，机械搅拌2小时后真空抽滤，收集提取液。将提取液通过径高比为1∶6的D303树脂柱进行脱色，树脂装量为500mL，流速为1000mL/h。收集脱色液，调溶剂浓度至40％，导入径高比为1∶6的HZ830树脂柱吸附，树脂装量为400mL，流速为800mL/h。饱和树脂用50％的乙醇净化洗涤，然后用90％的乙醇解吸，流速为200mL/h。解吸液浓缩，用乙酸乙酯萃取，丙酮结晶，得到肺囊康定B₀粗提物8.4g。粗提物用聚合物微球层析分离，甲醇-水梯度洗脱。洗脱液浓缩、萃取、结晶、干燥，得到肺囊康定B₀精粉5.5g。提取总收率为71.2％，精粉HPLC含量为98.6％。

实施例3

取肺囊康定B₀发酵液20.0L，发酵液单位973μg/mL。在发酵液中加入500g珍珠岩，搅拌1小时后真空抽滤，得到4.5kg发酵培养物。在发酵培养物中加入19L工业乙醇，机械搅拌1小时后真空抽滤，收集提取液。将提取液通过径高比为1∶6的D303树脂柱进行脱色，树脂装量为1000mL，流速为2000mL/h。收集脱色液，调溶剂浓度至30％，导入径高比为1∶6的HZ830树脂柱吸附，树脂装量为1000mL，流速为2000mL/h。饱和树脂用40％的乙醇净化洗涤，然后用90％的乙醇解吸，解吸流速为500mL/h。解吸液浓缩，用乙酸乙酯萃取，异丙醇结晶，得到肺囊康定B₀粗提物21.5g。粗提物用聚合物微球层析分离，丙酮-水梯度洗脱。洗脱液分段浓缩、萃取、结晶、干燥，最后得到肺囊康定B₀精粉14.3g。提取总收率为72.2％，精粉HPLC含量为98.3％。

实施例4

取肺囊康定B₀发酵液100.0L，发酵液单位863μg/mL。在发酵液中加入2kg珍珠岩，搅拌30分钟后真空抽滤，得到23kg发酵培养物。在发酵培养物中加入100L工业乙醇，机械搅拌1小时后真空抽滤，收集提取液。将提取液通过径高比为1∶5的D303树脂柱进行脱色，树脂装量为5L，流速为10L/h。收集脱色液，调溶剂浓度至30％，导入径高比为1∶5的HZ830树脂柱吸附，树脂装量为5L，流速为10L/h。饱和树脂用50％的乙醇净化洗涤，然后用80-90％的乙醇解吸，流速为2.5L/h。解吸液浓缩，用乙酸乙酯萃取，丙酮结晶，得到肺囊康定B₀粗提物85g。粗提物用聚合物微球层析分离，甲醇-水梯度洗脱。洗脱液分段浓缩、萃取、结晶、干燥，最后得到肺囊康定B₀精粉65.1g。提取总收率为74.3％，精粉HPLC含量为98.5％。

Claims (21)

1.一种高纯度肺囊康定B₀的制备方法，包括下述步骤：

1)在肺囊康定B₀发酵液中加入助滤剂，机械搅拌均匀；

2)发酵液固液分离，得到固形发酵培养物；

3)在固形发酵培养物中加入极性溶剂搅拌浸提；

4)浸提液固液分离，得到肺囊康定B₀提取液；

5)将提取液导入大孔脱色树脂脱色，得到脱色液；

6)调整脱色液中极性溶剂浓度后将其导入大孔吸附树脂进行吸附，吸附完毕用解吸剂进行解吸，得到解吸液；

7)将解吸液依次浓缩、萃取、结晶，得到肺囊康定B₀粗提物；

8)粗提物依次经聚合物微球层析分离、洗脱溶剂洗脱后，得到洗脱液；

9)将步骤8)中的洗脱液分段浓缩、萃取、结晶、干燥，得到高纯度的肺囊康定B₀产品。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1)中的助滤剂为珍珠岩或硅藻土，其用量为每升发酵液5-50克。

3.根据权利要求2所述的方法，其中步骤1)中的助滤剂为珍珠岩。

4.根据权利要求2所述的方法，其中步骤1)中的助滤剂用量为每升发酵液10-30克。

5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤2)、4)中的固液分离方式为真空抽滤或板框压滤。

6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤3)中的极性溶剂为甲醇、乙醇或丙酮之一，其加入量为每千克发酵培养物2-6升。

7.根据权利要求6所述的方法，其中步骤3)中的极性溶剂为乙醇。

8.根据权利要求6所述的方法，其中步骤3)中的极性溶剂的加入量为每千克发酵培养物4-6升。

9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤5)中的大孔脱色树脂为D303、D290、S-8或XDA-7树脂之一。

10.根据权利要求9所述的方法，其中步骤5)中的大孔脱色树脂为D303树脂。

11.根据权利要求1所述的方法，其中步骤6)调整脱色液中极性溶剂浓度至30-40％(体积百分比)；大孔吸附树脂为HZ816、HZ830、AB-8或D312树脂之一；解吸剂为甲醇、乙醇或丙酮之一；解吸剂浓度为70-95％(体积百分比)。

12.根据权利要求11所述的方法，其中步骤6)中大孔吸附树脂为HZ830树脂。

13.根据权利要求11所述的方法，其中步骤6)中解吸剂为乙醇。

14.根据权利要求11所述的方法，其中步骤6)解吸剂浓度为80-90％(体积百分比)。

15.根据权利要求1所述的方法，其中步骤7)、9)中萃取剂为乙酸乙酯、正丁醇或二氯甲烷之一；结晶溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、异丙醇或石油醚之一。

16.根据权利要求15所述的方法，其中步骤7)、9)中萃取剂为乙酸乙酯。

17.根据权利要求15所述的方法，其中步骤7)、9)中结晶溶剂为丙酮或异丙醇。

18.根据权利要求1所述的方法，其中步骤8)中的聚合物微球是采用聚苯乙烯、聚丙烯酸酯之一制备；洗脱溶剂为甲醇-水、乙醇-水或丙酮-水之一。

19.根据权利要求18所述的方法，其中步骤8)中的聚合物微球是采用聚苯乙烯聚合物微球制备。

20.根据权利要求18所述的方法，其中步骤8)中的洗脱溶剂为甲醇-水或丙酮-水。

21.根据权利要求1所述的方法，其中步骤9)的干燥方式为真空干燥，干燥温度为40-50℃，干燥时间为24小时。