CN102040638A - 一种高纯度那他霉素的非溶剂制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用那他霉素发酵液制备那他霉素的方法，包括使用助滤剂，经过提取、脱色、吸附、结晶等步骤，得到了那他霉素结晶。本发明的优点在于制备工艺绿色环保、获得的那他霉素纯度高。

Description

一种高纯度那他霉素的非溶剂制备方法

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及到一种从发酵培养物中不用有机溶剂直接分离纯化制备高纯度那他霉素粉末的绿色环保的制备方法。

背景技术

那他霉素是一种多烯大环内酯类抗真菌抗生素，是一种白色至乳白色几乎无臭无味的结晶粉末。分子式C₃₃H₄₇NO₁₃，分子量为665.73。化学结构式如下：

那他霉素是纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalenis)、恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoogensis)或褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosPoreus)等微生物的次级代谢产物，从发酵液中提取纯化后获得。那他霉素是一种高效、低毒的具有广谱的抗霉菌、酵母菌、某些原生动物和藻类剂，可以用于医疗、食品、饲料、粮储防霉，特别是在食品原料保鲜、食品防腐等方面具有良好的使用(陈冠群，季波.那他霉素的特性及应用.中国乳品工业，2002，30(4)，26-28)。由于那他霉素对酵母菌及霉菌等丝状真菌有极强的抑制或杀灭作用，美国FDA于1982年6月正式批准那他霉素可用作食品防腐剂(衰亦承.那他霉素[J].中国食品用化学，1997，1(3)：37-41)，是目前国际上批准使用的仅有的两种生物食品防腐剂之一。中国食品添加剂标准化技术委员会于1996年正式批准那他霉素可作为食品防腐剂(衰亦承.那他霉素[J].中国食品用化学，1997，1(3)：37-41)。

该产品在欧洲已经有35年的使用历史(FDA.Federal Register Rules andRegulations 21CFR 172.155，2001，66(46)，13846.)。现在在国际市场上还有多家公司在生产销售该产品作为人类用药，例如，5％那他霉素无菌溶液是世界上用于治疗角膜真菌炎症的首选抗生素(FDA.Natamycin approved-firstU.S.drug for fungal keratitis.FDA Drug Bulletin，1978，8(6)，37-38)，其商品名为NATACYN等。华北制药集团新药研究开发有限责任公司于2008年取得那他霉素医药级原料和眼用制剂的生产文号，成为国内首家高纯度医药级那他霉素原料药的生产企业。

由于那他霉素含有四个相连的双键结构，决定了那他霉素几乎不溶于水，在水中的溶解度仅为52mg/ml(Brik，H.Natamycin.Ch，In Analyt ical Profilesof Drug Substances，Vol.10.K.Florey(Ed.)，Academic Press，Inc.NewYork，1981，513-561)。那他霉素微溶于甲醇，溶于冰醋酸。由于那他霉素的溶解特性，很多用于那他霉素分离的工艺为溶媒提取结晶和物理分离。

英国专利GB846933报道了从发酵液中用混合性极性溶剂如甲醇、丁醇和丙酮，采用萃取法提取那他霉素。专利GB2106498报道了体积浓缩法和从滤液中用丁醇回收那他霉素，从而获得了一种抗真菌混合物原液，从中可分离那他霉素。世界专利WO92/10580报道了在低pH下用甲醇溶解那他霉素，然后除去固形物，提高pH以沉淀出那他霉素。美国专利US5942611报道了一种有效的提取高质量那他霉素的方法，该方法将错流过滤得到的发酵液浓缩，调节发酵液的pH在10-11，添加有机溶剂如乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮等溶解发酵液中的那他霉素。错流过滤除去不溶物，调节过滤液的pH在5.5-7.5范围内，过滤得到析出的晶体，产品纯度可以达到94-99％(无结晶水计算)，那他霉素回收率可达40-70％。这些提取过程一般要求多级纯化，操作费用比较昂贵，同时这些工艺均属于溶媒提取结晶工艺，使用的溶剂量，损耗大，造成那他霉素的生产成本较高。

WO97/29207公布了一种不加有机溶剂而直接从发酵液中回收那他霉素的物理分离方法。该方法在那他霉素发酵单位不低于7g/l时，首先将发酵液中的菌丝体破碎成远远小于那他霉素晶体的微小颗粒，然后利用重力梯度离心，将密度和颗粒大小相差很大的那他霉素品体和菌丝体碎片进行分离，从而获得那他霉素。由于该工艺对发酵液质量和分离设备要求严格，因此很难实现规模化生产。

中国专利CN 101062934A公开了一种那他霉素的非溶剂提取方法，他们用碱将发酵液的pH值调节至10.0-14.0后，固液分离得到那他霉素水提液。将那他霉素水提液酸化调pH值至5.0-9.0，析出82-86％左右那他霉素产品。该方法得到的那他霉素产品纯度较低(含量在82-86％左右)，不符合国家药用标准(含量大于90％，单杂小于0.5％)。目前尚没有关于药用级高纯度那他霉素制备工艺的报道，如何得到符合国家药用标准的高纯度那他霉素是技术人员着力解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，得到符合国家药用标准的高纯度那他霉素粉。本发明首次采用大孔树脂从发酵液中将目的产物分别进行脱色、除杂和富集，根据那他霉素的溶解特性筛选到合适的解析剂，有效地去除了发酵次级代谢产物中的杂蛋白、色素和其他大极性杂质，得到高质量的那他霉素解析液，从而使得到的那他霉素精粉含量大于95％，质量超过国家药用标准(类白色粉末，重量含量大于90％，单杂小于0.5％，甲酯峰小于2.0％)，适于工业化规模生产高纯度那他霉素的制备方法。

下面对本发明进行具体描述：

在本发明方法中，通过加入助滤剂，提高发酵液滤速，通过固液分离去除杂质含量高的滤液，得到菌丝体。在菌丝体中加入碱水溶解那他霉素，收集那他霉素的碱水提取液并通过大孔脱色树脂脱色除杂后，得到淡黄色脱色液。然后将脱色液导入大孔吸附树脂进行富集，极性较大的杂质和小分子蛋白由于不被吸附而流出，饱和树脂用碱水-乙醇溶液解析后，在解析液中加入酸水得到那他霉素沉淀，将沉淀洗涤干燥后得到高纯度那他霉素固体。

具体地，本发明涉及一种高纯度那他霉素的非溶剂绿色环保制备方法，包括下述步骤：

1)在常温条件下在那他霉素发酵液中加入助滤剂搅拌30分钟-2小时至助滤剂分散均匀；

2)固液分离得到那他霉素菌丝体；

3)5-30℃条件下在那他霉素菌丝体中加入pH值为9.0-12.0的碱水；

4)固液分离得到那他霉素提取液；

5)将那他霉素提取液通过大孔脱色树脂脱色得到脱色液；

6)将脱色液导入大孔吸附树脂进行富集后，用解析剂进行解析，得到那他霉素解析液；

7)常温下调节解析液pH值至4.5-7.0，析出那他霉素结晶；

8)固液分离那他霉素结晶液得到那他霉素粉末。

其中，步骤1)中的助滤剂为珍珠岩或硅藻土，优选为硅藻土。助滤剂用量为发酵液体积的2％-10％(克/升)，优选为5％-7％(克/升)。搅拌时间为30分钟-2小时，优选为1-1.5小时。

步骤2)中的那他霉素发酵菌丝体为通过传统的固液分离过程如离心、板框压滤等方式得到那他霉素干燥的菌丝体。水溶性蛋白、发酵过程中产生的水溶性强的其他次级代谢产物等杂质位于发酵液中，随着固液分离过程被舍弃。

步骤3)中的向那他霉素菌丝体中加入碱水的量为菌丝重的2-6倍(升/千克)，优选为4-6倍。碱水为氢氧化钾、氢氧化钠或有机碱的水溶液，优选为氢氧化钠的水溶液。碱水的pH值为9.0-12.0，优选为11.0-12.0。碱水提取时的温度为5-30℃，优选为10-20℃。

步骤5)中的大孔脱色树脂为D290、HZ801或D303树脂，优选为D290树脂。脱色树脂的用量为那他霉素提取液的0.03-0.1倍(毫升/升)，优选为0.04-0.06倍(毫升/升)。树脂柱高径比为2∶1-5∶1，脱色流速为1-6BV/h，优选为1.5-2.5BV/h。

步骤6)中的大孔吸附树脂为D312、HZ816或HZ818树脂，优选为D312树脂。吸附树脂的用量为那他霉素提取液的0.05-0.3倍(毫升/升)，优选为0.08-0.2倍(毫升/升)。树脂柱高径比为2∶1-5∶1，吸附流速为1-3BV/h，优选为1.5-2.5BV/h。

步骤6)中的解析剂为乙醇-碱水溶液。其中乙醇的重量百分比为60-90％，优选为70％-80％。碱水为氢氧化钾、氢氧化钠或有机碱的水溶液，优选为氢氧化钠的水溶液。碱水的pH值为9.0-12.0，优选为11.0-12.0。解析流速为0.5-3BV/h，优选为1.0-1.5BV/h。

步骤7)中调节pH值所用的酸类为盐酸、磷酸或有机酸，优选为盐酸。调节脱色液pH值至4.5-7.0，优选pH值为5.5-6.5。

步骤8)中经传统的固液分离过程如离心、板框压滤等方式得到那他霉素粉末后，用去离子水洗涤滤饼1-3次。再用真空干燥的方式在30-60℃条件下干燥，得到类白色或乳白色，产品水分介于6.0-9.0％，含量大于95％的高纯度那他霉素产品。

本发明所得产品可供药品或食品使用，那他霉素重量含量可达95％以上，面积归一百分含量达到99％以上，甲酯峰小于2.0％，单杂小于0.5％，符合药用标准，样品回收率大于80％。

本发明有如下优点：1.固液分离过程中加入了助滤剂，提高了过滤速度，缩短了工艺周期。同时经过固液分离舍弃了含色素和蛋白质及其他极性大的杂质，提高了提取液的质量。2.大孔脱色树脂的应用，去除了大部分色素和极性大的杂质，提高了脱色液的澄清度和质量。3.目的产物的富集和纯化采用大孔吸附树脂，进一步摒弃了发酵次级代谢产物的杂质，提高了目的产物的质量。4.所得产品颜色为类白色，纯度高。那他霉素重量含量可达98％以上，面积归一百分含量达到99％以上，甲酯峰小于2.0％，单杂小于0.5％，符合药用标准。5.工艺简单，样品收率高，全程总收率达到80％以上。6.工艺简洁，对那他霉素纯化行之有效，提高了产品纯度，有效降低了色素比值，为生产药用级原料提供了更加安全的技术保障。

附图说明

图1实施例1那他霉素滤液HPLC图谱

图2实施例1那他霉素脱色液HPLC图谱

图3实施例1那他霉素精粉HPLC图谱

图4实施例2那他霉素精粉HPLC图谱

图5实施例3那他霉素精粉HPLC图谱

具体实施方式

下述实施例仅用于阐述实现本发明的方法，不应理解为对本发明的限制。

本发明所使用的那他霉素发酵液均为华药新药研发有限责任公司用微生物培养手段，得到的那他霉素发酵液。大孔脱色树脂为华东华震公司生产，盐酸、氢氧化钠等试剂均为市售。本发明使用的高效液相色谱仪为996型检测器，515泵(Waters公司)。

实施例1

取那他霉素发酵液10.0L，发酵单位5.2g/L。在发酵液(见附图1)中加入500g珍珠岩，搅拌30分钟后真空抽滤，得到2.08kg菌丝体。在菌丝体中加入8L用NaOH调节pH值至11.5的碱水，温度维持在20℃搅拌1小时后真空抽滤，收集滤液(见附图1)。将滤液通过高50cm，直径为10cm，D290树脂装量为500ml的树脂柱进行脱色，流速为1000mL/h。收集脱色液(见附图2)，导入高50cm，直径为10cm的D312树脂柱吸附，D312树脂装量为500ml，饱和树脂用水洗涤净化，然后用pH值为11.0的质量百分比浓度为80％的乙醇-碱水溶液进行解析，解析流速为500mL/h。解析液用乙酸调节pH值至6.0-6.5使那他霉素沉淀析出。离心分离结晶液得到那他霉素湿粉，用去离子水洗涤2次后，将那他霉素湿粉在45℃下真空干燥，直至水分小于9％。最后得到42.3g类白色那他霉素精粉，收率为81.3％。精粉HPLC含量为99.1％，其中最大单杂＜0.5％，甲酯峰＜2.0％，总杂＜1.0％，重量含量为96.8％，符合中国药用标准(见附图3)。

实施例2

取那他霉素发酵液100L，发酵单位6.7g/L。在发酵液中加入6kg硅藻土，搅拌40分钟后真空抽滤，得到22.6kg菌丝体。在菌丝体中加入65L用氨水调节pH值至11.0的碱水，温度维持在15℃搅拌1小时后板框压滤，收集滤液。将滤液通过高1.2m，直径为12cm，D303树脂装量为4000mL的树脂柱进行脱色，脱色流速为6L/h。脱色液导入高为1.2m，直径为12cm，树脂装量为4000mL的HZ816树脂柱吸附，饱和树脂用水洗涤净化，然后用pH值为11.5的质量百分比浓度为70％的乙醇-碱水溶液进行解析，解析流速为3L/h。收集脱色液，用HCL调节pH值至6.0-6.5使那他霉素沉淀析出。抽滤结晶液得到那他霉素滤饼，用去离子水洗涤2次后，将那他霉素湿粉在45℃下真空干燥，直至水分小于9％。最后得到550.6g类白色那他霉素精粉，收率为82.2％。精粉HPLC含量为99.2％，其中最大单杂＜0.5％，甲酯峰＜2.0％，总杂＜1.0％，重量含量为97.2％，符合中国药用标准(见附图4)。

实施例3

取那他霉素发酵液1000L，发酵单位7.3g/L。在发酵液中加入45kg硅藻土，搅拌50分钟后真空抽滤，得到172kg菌丝体。在菌丝体中加入700L用KOH调节pH值至11.5的碱水，温度维持在20℃搅拌1小时后板框压滤，收集滤液。将滤液通过高2.4m，直径为50cm，D290树脂装量为50L的树脂柱进行脱色，流速为80L/h。收集脱色液，导入高为2.4m，直径为50cm的树脂柱吸附，HZ818树脂装量为50L，饱和树脂用水洗涤净化，然后用pH值为11.0的质量百分比浓度为90％的乙醇-碱水溶液进行解析，解析流速为40L/h。用HCL调节pH值至6.0-6.5使那他霉素沉淀析出。抽滤结晶液得到那他霉素滤饼，用去离子水洗涤2次后，将那他霉素湿粉在45℃下真空干燥，直至水分小于9％。最后得到5854.5g类白色那他霉素精粉，收率为80.2％。精粉HPLC含量为99.0％，其中最大单杂＜0.5％，甲酯峰＜2.0％，总杂＜1.0％，重量含量为96.9％，符合中国药用标准(见附图5)。

Claims (10)

1.一种那他霉素的制备方法，包括下述步骤：

1)常温下，在那他霉素发酵液中加入助滤剂搅拌30分钟-2小时至助滤剂分散均匀；

2)固液分离，得到那他霉素菌丝体；

3)5-30℃条件下，在那他霉素菌丝体中加入pH值为9.0-12.0的碱水；

4)固液分离，得到那他霉素提取液；

5)将那他霉素提取液通过大孔脱色树脂脱色，得到脱色液；

6)将脱色液导入大孔吸附树脂进行富集后，用解析剂进行解析，得到那他霉素解析液；

7)常温下，调节解析液pH值至4.5-7.0，析出那他霉素结晶；

8)固液分离那他霉素结晶液，得到那他霉素粉末。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1)中的助滤剂为珍珠岩或硅藻土，其用量为2-10％(克/升)。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤3)中的碱水的加入量为菌丝重的2-6倍(升/千克)。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤5)中的大孔脱色树脂为D303、D290或HZ801树脂。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤5)中的大孔脱色树脂的用量为那他霉素提取液的0.03-0.1倍(毫升/升)，树脂柱高径比为2∶1-5∶1，流速为1-3BV/h。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤6)中的大孔吸附树脂为D312、HZ816或HZ818树脂。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤6)中的大孔吸附树脂用量为那他霉素提取液的0.05-0.3倍(毫升/升)，树脂柱高径比为2∶1-5∶1，吸附流速为1-3BV/h。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤6)中的解析剂为乙醇-碱水溶液，其中乙醇的重量百分比为60-90％，碱水为氢氧化钾、氢氧化钠或有机碱的水溶液，碱水的pH值为9.0-12.0。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤7)中调节所述解析液pH值所用的酸类为盐酸、磷酸或有机酸。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤8)所述的经固液分离得到那他霉素粉末后，真空干燥至水分介于6.0-9.0％，得到那他霉素产品。

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