CN104418774A - 栝楼瓤微生物发酵提取l-瓜氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一种栝楼瓤提取L-瓜氨酸的方法,属于中药化学技术领域。该方法包括接入乳酸菌发酵、过滤、吸附交换、浓缩、结晶得到L-瓜氨酸。本方法结合了发酵法和酶法,使栝楼瓤中的L-精氨酸在乳酸杆菌产生的脱亚氨酶的作用下转化为L-瓜氨酸,使收率有很大程度的提高,整个分离过程中不加入任何有害溶剂,所得产品天然安全,有利于展开保健品及药品方面的开发研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取L-瓜氨酸的方法,特别涉及一种栝楼瓤提取L-瓜氨酸的方法,属于中药化学技术领域。
背景技术
瓜氨酸最早发现于野西瓜叶子中,是一种非必需氨基酸。L-瓜氨酸具有较强的抗氧化作用,能有效清除人体内的自由基。西瓜中的L-瓜氨酸被誉为“绿色伟哥”,可有效提高男性性欲,促进男性生殖生育能力,维护男性正常的生殖健康。瓜氨酸还具血管扩张作用,对心血管系统具有良好的保健作用。此外,瓜氨酸能有效的改善人体的抗疲劳能力,增强人体的肌肉强度,提高体能,在运动保健方面具有良好的作用。目前国外已经利用西瓜中提取的L-瓜氨酸或者其它方法生产者的L-瓜氨酸相继开发出了诸如美国天然维他命公司的Stimulin产品和HERBALIFE公司的夜宁新等产品,分别用于男性性功能和心血管系统保健。目前生产瓜氨酸的方法主要是发酵法、酶法、合成法和提取法。发酵法和酶法生产的L-瓜氨酸目前是市场上L-瓜氨酸的主要生产方式,这些方法均存在着瓤中L-精氨酸转化率不高、工艺复杂、环境不友好等缺陷。
发明内容
本发明为提供一种栝楼瓤微生物发酵提取L-瓜氨酸的方法。
本发明所提供的一种栝楼瓤微生物发酵提取L-瓜氨酸的方法,以鲜栝楼瓤为原料,包括以下步骤:
(a)将鲜栝楼瓤接入乳酸杆菌,在温度18—35℃发酵15-40天生物转化后灭菌,过滤后得到滤液;
(b)将滤液微滤、超滤、脱水、纳滤,得到纳滤透过液;
(c)将纳滤透过液调节PH值至5.0—3.0后通入大孔型强酸性阳离子交换树脂柱交换吸附氨基酸;
(d)交换吸附完毕后,用氨水对离子交换柱进行等度洗脱,,洗脱终点为洗出液茚三酮反应为阴性;
(e)将洗脱液浓缩、脱氨、脱色;
(f)浓缩液用低分子有机醇或低分子有机酸结晶,过滤干燥后得到瓜氨酸。进一步的,步骤(b)中 将步骤(a)所得滤液先用微滤膜,再用超滤膜分别进行错流膜过滤,得到超滤清液,其中微滤膜的孔径为0.1—1.0微米,超滤膜的孔径为10000—4000分子量,将所得超滤清液先用截留分子量为50—80反渗透膜浓缩脱水,然后用截留分子量为1000—500纳滤膜过滤,得到纳滤透过液,进一步的,步骤(d)中 交换吸附完毕后,用0.1—1.0N氨水对离子交换柱进行等度洗脱,洗脱流速为0.5—1.0BV/h,进一步的,将步骤f中所得的瓜氨酸用水溶解后,再用低分子有机醇或低分子有机酸重结晶,得到纯天然瓜氨酸,进一步的,微滤膜孔径为0.2微米的管式膜,超滤膜孔径为5000分子量的卷式膜,进一步的,所述反渗透膜的截留分子量为60,纳滤膜截留分子量为600,纳滤膜过滤流量为45升/分,压力1.5MPa,得到纳滤透过液,进一步的,所述的低分子有机醇为甲醇或乙醇或丙醇或丁醇,所述的低分子有机酸为甲酸或乙酸或丙酸或丁酸。
本发明所使用的方法,结合了发酵法和酶法,使栝楼瓤中的L-精氨酸在乳酸杆菌产生的脱亚氨酶的作用下转化为L-瓜氨酸使收率有很大程度的提高,本方法以栝楼瓤发酵液为提取原料,通过发酵、灭菌过滤、膜澄清、膜分离和离子交换树脂分离等清洁的生产方式,在原料和生产工艺的安全性收率上都有明显的优势,分离过程中采用了微滤、超滤、反渗透、纳滤联用的技术,显著降低了工艺的能耗与时间并有效的提高了终端产品的产品质量,所得瓜氨酸纯度高。一次分离可使瓜氨酸的纯度达到80%以上,经纯化后纯度可达到98.5%—99.9%。产品性状好:整个分离过程中不加入任何有害溶剂,所得产品天然安全;得到的L-瓜氨酸在食品、保健品和药品开发上,具有明显的安全性优势,有利于展开保健品及药品方面的开发研究。
附图说明
图1是本发明的工艺流程图。
具体实施方式
为了更充分的解释本发明的实施,提供本发明的实施实例,这些实施实例仅仅是对本发明的阐述,不限制本发明的范围。本发明中的栝楼瓤,采用河南、河北、山东等地区的栝楼瓤均可适用于本工艺。
栝楼瓤微生物发酵提取L-瓜氨酸的方法,以鲜栝楼瓤为原料,包括以下步骤:
(a)将鲜栝楼瓤接入乳酸杆菌,在温度18—35℃发酵15-40天生物转化后灭菌,过滤后得到滤液;
(b)将滤液微滤、超滤、脱水、纳滤,得到纳滤透过液;
(c)将纳滤透过液调节PH值至5.0—3.0后通入大孔型强酸性阳离子交换树脂柱交换吸附氨基酸;
(d)交换吸附完毕后,用氨水对离子交换柱进行等度洗脱,,洗脱终点为洗出液茚三酮反应为阴性;
(e)将洗脱液浓缩、脱氨、脱色;
(f)浓缩液用低分子有机醇或低分子有机酸结晶,过滤干燥后得到瓜氨酸。
进一步的,步骤(b)中 将步骤(a)所得滤液先用微滤膜,再用超滤膜分别进行错流膜过滤,得到超滤清液,其中微滤膜的孔径为0.1—1.0微米,超滤膜的孔径为10000—4000分子量,将所得超滤清液先用截留分子量为50—80反渗透膜浓缩脱水,然后用截留分子量为1000—500纳滤膜过滤,得到纳滤透过液。
进一步的,步骤(d)中 交换吸附完毕后,用0.1—1.0N氨水对离子交换柱进行等度洗脱,洗脱流速为0.5—1.0BV/h,进一步的,将步骤f中所得的瓜氨酸用水溶解后,再用低分子有机醇或低分子有机酸重结晶,得到纯天然瓜氨酸。
进一步的,微滤膜孔径为0.2微米的管式膜,超滤膜孔径为5000分子量的卷式膜。进一步的,所述反渗透膜的截留分子量为60,纳滤膜截留分子量为600,纳滤膜过滤流量为45升/分,压力1.5MPa,得到纳滤透过液。
进一步的,所述的低分子有机醇为甲醇或乙醇或丙醇或丁醇,所述的低分子有机酸为甲酸或乙酸或丙酸或丁酸。
进一步的,所述强酸性阳离子交换树脂为苯乙烯系大孔型或凝胶型树脂。
进一步的,步骤(c)中,上柱流速为1-2BV/h,树脂预处理成氢型,PH值为5,柱床的长径比为4—2:1。
进一步的,在上述步骤(e)中,减压浓缩的温度为40℃—80℃,优选50℃。
进一步的所述低分子有机醇或低分子有机酸的浓度为90-100%,为与水的溶液。
实施例:
1、切分:将2公斤鲜栝楼用水清洗干净后,再用切碎机切碎;
2、皮瓤籽分离:用胶棒软分离机和两道分离机组进行一次和二次分离,使皮和瓤和籽彻底分开;
3、发酵:栝楼瓤中接入0.2%—0.3%的乳酸杆菌,密闭发酵18天;
4、分离:发酵结束升温至70℃,灭菌1.5小时,过滤;
5、澄清:将滤液合并,依次过0.2微米的微滤膜和5000分子量超滤膜澄清,微滤膜可采用KOCH公司生产的4.3’SuperCorHFM180管式膜元件,超滤膜可采用8338卷式膜元件,进料的流量为100升/分,过滤压力为1.5MPa,先后除去固形不溶物和大分子类杂质,得到超滤清液;
6、纳滤:超滤清液先用截留分子量为60的反渗透膜脱水,再用截留分子量为600的纳滤膜浓缩,流量为45毫升/分,压力1.5MPa,得到纳滤透过液;
7、PH值调节:纳滤透过用氨水调节PH值至3.5;
8、上柱:将D61大孔型强酸性阳离子交换树脂预处理成氢型,PH为5,柱床的长径比为4:1,将调节好的PH为3.5的滤液以2BV/h流速上柱,使之全部通过2升阳离子交换树脂后,用2升水洗树脂柱,BV/h指单位时间水或液体中一个质点移动的距离;
9、洗脱:用1.0N氨水等度洗脱,洗脱剂流速1BV/h,洗脱终点为洗出液茚三酮反应为阴性,收集茚三酮反应阳性部分约2升;
10、浓缩:将洗脱液用单效降膜蒸发器减压浓缩至1/3体积,浓缩温度采用60℃;
11、脱色:将浓缩液用活性炭脱色,使浓缩液无色;
12、结晶:在脱色液中加入质量浓度为90%的乙醇析晶,经高效液相检测,得到L-瓜氨酸白色结晶产品,过滤干燥后得到瓜氨酸含量为85.5%的产品,产率为栝楼瓤重量的1.5%;
13、精制:将上述85.5%瓜氨酸产品用水溶解后,再用95%乙醇重结晶,得到98.5%的纯度瓜氨酸。
鉴别所得产品是瓜氨酸的方法如下 :
取白色结晶产品0.1克加水定溶到100毫升;
1、取上述溶液5ml,加入1ml,1%茚三酮溶液,水浴加热3分钟,产生紫红色;
2、取上述溶液2ml,加入4ml浓盐酸和0.5ml,3%二乙酰一肟加热,产生桔黄色;
3、取上述溶液2ml,加入10ml于100ml乙醇中含有2%的对二甲替基苯甲醛混合溶液,和10ml浓盐酸,产生黄绿色;
依次通过上述三种方法,可鉴别得到所制得的产品为瓜氨酸。经检测:产品的熔点为201.2—202.0;旋光率24.9°,而L-瓜氨酸的熔点为201-203℃;旋光率[a]D 20+24.5—+26.5°(8克/100毫升6NHCL),因此,通过本发明方法制得的产品是L-瓜氨酸。
瓜氨酸含量测定方法:
由于L-瓜氨酸无紫外吸收和荧光发射特性,因此要提高L-瓜氨酸分析检测的灵敏度和分离选择特性,通常将L-瓜氨酸衍生后进行定量分析。本发明中采用的就是上述方法测定从天然西瓜中提取制得的L-瓜氨酸含量,采用2,4-二硝基氟苯(DNFB)柱前衍生化法J,将L-瓜氨酸衍生后用HPLC进行定量分析。具体方法如下:
衍生化方法:精密称取瓜氨酸标准品0.0500g,用去离子水溶解并定容(定容到25ml)。准确吸取配好的标准品1ml,放入10ml棕色容量瓶中,加入配制好的NaCO3-NaHCO3缓冲液1ml( 0.5mol/l、PH为9.0),再加入1ml的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液后摇匀,60℃水浴加热1h后,用K2HPO4-KH2PO4缓冲液定容至10ml(0.1mol/l、PH为7.0),样品溶液的衍生化方法与标准品基本相同,只是将1ml的标准品换为1ml的样品溶液。
分析方法:使用大连依利特公司C-18色谱柱(250mm*4.6mm),流动相A为乙腈水B为含N,N-二甲基甲酰胺的0.05mol/1NaAC-HAC缓冲溶液,进样量5ul.A:B=25%:75%,流速1ml/min。
在详细说明本发明的实施方式之后,熟悉该项技术的人士可清楚地了解,在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改,凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均属于本发明技术方案的范围,且本发明亦不受限于说明书中所举实例的实施方式。
Claims (7)
1.栝楼瓤微生物发酵提取L-瓜氨酸的方法,以鲜栝楼瓤为原料,其特征在于:包括以下步骤:
(a)将鲜栝楼瓤接入乳酸杆菌,在温度18—35℃发酵15-40天生物转化后灭菌,过滤后得到滤液;
(b)将滤液微滤、超滤、脱水、纳滤,得到纳滤透过液;
(c)将纳滤透过液调节PH值至5.0—3.0后通入大孔型强酸性阳离子交换树脂柱交换吸附氨基酸;
(d)交换吸附完毕后,用氨水对离子交换柱进行等度洗脱,洗脱终点为洗出液茚三酮反应为阴性;
(e)将洗脱液浓缩、脱氨、脱色;
(f)浓缩液用低分子有机醇或低分子有机酸结晶,过滤干燥后得到瓜氨酸。
2.根据权利要求1所述的栝楼瓤微生物发酵提取L-瓜氨酸的方法,其特征在于:步骤(b)中将步骤(a)所得滤液先用微滤膜,再用超滤膜分别进行错流膜过滤,得到超滤清液,其中微滤膜的孔径为0.1—1.0微米,超滤膜的孔径为10000—4000分子量,将所得超滤清液先用截留分子量为50—80反渗透膜浓缩脱水,然后用截留分子量为500—1000纳滤膜过滤,得到纳滤透过液。
3.根据权利要求1所述的栝楼瓤微生物发酵提取L-瓜氨酸的方法,其特征在于:步骤(d)中交换吸附完毕后,用0.1—1.0N氨水对离子交换柱进行等度洗脱,洗脱流速为0.5—1.0BV/h。
4.根据权利要求1所述的栝楼瓤微生物发酵提取L-瓜氨酸的方法,其特征在于:将步骤f中所得的瓜氨酸用水溶解后,再用低分子有机醇或低分子有机酸重结晶,得到纯天然瓜氨酸。
5.根据权利要求2所述的从植物组织发酵液中提取L-瓜氨酸的工业方法,其特征在于:所述的微滤膜孔径为0.2微米的管式膜,所述的超滤膜孔径为5000分子量的卷式膜。
6.根据权利要求2所述的从发酵液中提取L-瓜氨酸的工业方法,其特征在于:所述反渗透膜的截留分子量为60,纳滤膜截留分子量为600,纳滤膜过滤流量为45升/分,压力1.5MPa,得到纳滤透过液。
7.根据权利要求1所述的栝楼瓤微生物发酵提取L-瓜氨酸的方法,其特征在于:所述的低分子有机醇为甲醇或乙醇或丙醇或丁醇,所述的低分子有机酸为甲酸或乙酸或丙酸或丁酸。
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