CN103130875B - 一种从发酵液中提取多粘菌素b的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从多粘菌素B发酵液中提取多粘菌素B的方法，包括以下步骤：a.将多粘菌素B的发酵液经固液分离，取滤液；b.滤液用极性有机溶剂萃取，萃取液在pH1.0～2.0用水反萃；c.将步骤b所得的反萃液中加入反萃液体积3～8％(w/v)的无机盐，并调整至pH 9.0～10.0，从而析出沉淀，即为多粘菌素B。优选的还包括d：将多粘菌素B和硫酸反应成盐，然后溶析，即得多粘菌素B硫酸盐。通过本发明制备的多粘菌素B或其硫酸盐的收率和纯度都较高，产品纯度为85％以上，效价为8100IU/g以上，收率为60％以上。本发明工艺方法操作简便、耗时短、对设备要求低、有机溶剂可回收利用，可用于大规模的工业化生产。

Description

一种从发酵液中提取多粘菌素B的方法

技术领域

本发明属从生物中提取物质方法领域，特别涉及一种从多粘菌素B发酵液中提取多粘菌素B的方法。

背景技术

多粘菌素B是由多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)在代谢过程中合成和分泌的具有良好抗菌活性的碱性环状多肽，分子量约为1200Da；多粘菌素B在药物上常用其硫酸盐，分子量约为1300Da。目前在已知的抗生素中，多粘菌素对革兰氏阴性菌的作用最强，特别是它能抑制由绿脓杆菌和大肠杆菌引起的各种感染，如脑膜炎、痢疾、呼吸系统感染、腹膜炎、胆管感染、尿路感染、烧伤感染、眼角膜感染及败血症等，且不易产生耐药性。

多粘菌素B可由多粘芽孢杆菌经发酵生产所获得的发酵液，经分离、提取、纯化、干燥而得。在大规模生产过程中其分离、提取、纯化制备一直是一个棘手的问题。至今，国内多粘菌素B的生产水平相对较低，还没有企业正式投产，其原料药基本从国外进口。多粘菌素B纯品的效价为10000IU/g，市场上进口分装的多粘菌素B效价≥6500IU/g，纯度为60～80％左右。

目前多粘菌素B制备工艺主要为吸附分离法和树脂分离法。

美国专利2695261^[1]公布了一种用吸附法从多粘芽孢杆菌的发酵液中提取多粘菌素A、B和E的方法。具体地公布了采用酸化、活性炭吸附、解吸以及干燥的方法，从发酵液中提取多粘菌素A、B和E。WIPO专利058427^[2]同样采用吸附法，具体地公布了采用活性炭吸附、透析、有机溶剂沉降以及冷冻干燥的方法，从发酵液中提取多粘菌素B。这两种工艺采用活性炭吸附，单步损失较大，且发酵液中的杂质容易造成活性炭的不可逆吸附，使活性炭难以再生重复使用；透析、冻干等操作对设备要求高，较萃取法耗时长，成本高，不适合工业化生产放大。

美国专利3132994^[3]公布了一种用树脂分离法从多粘芽孢杆菌的发酵液中提取多粘菌素的方法。具体地公布了用离子交换树脂吸附、洗脱以及调pH沉淀的方法从发酵液中提取多粘菌素。WIPO专利142611^[4]同样用到了树脂分离法，具体地公布了用活性炭脱色、树脂吸附、洗脱以及沉淀的方法，从多粘芽孢杆菌的发酵液中提取多粘菌素B。这两种工艺一次性投入较大，而且树脂容易污染，需要再生处理。因此，树脂分离法较萃取法操作更为繁琐，而且制备的多粘菌素B纯度较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从多粘菌素B的发酵液中提取多粘菌素B的方法，以较高的收率制备得到高纯度硫酸多粘菌素B。该方法操作简便、耗时短、对设备要求低。

本发明的技术方案是：一种从多粘菌素B的发酵液中提取多粘菌素B的方法，包括以下步骤：

a.将多粘菌素B的发酵液固液分离，取滤液；

b.将步骤a所得的滤液用极性有机溶剂萃取，萃取液在pH1.0～2.0用水反萃；和

c.将步骤b所得的反萃液中加入反萃液体积3～8％(w/v)的无机盐，并调整至pH 9.0～10.0，从而析出沉淀，即为多粘菌素B。

本发明中步骤a为：将多粘菌素B的发酵液经固液分离，取滤液。其中所述的多粘菌素B的发酵液是任何已知的含有多粘菌素B的菌体发酵液。一般是多粘芽孢杆菌发酵液。发酵液固液分离的方法是已知的任何方法，如过滤法、离心分离法、静置沉淀法等。本发明优选过滤法。因为发酵液本身黏度较大，为了便于发酵液的大规模固液分离，优选的将发酵液经过预处理，再进行固液分离。所述的预处理优选包括调节发酵液pH至2.0～3.0，80～100℃加热25～60分钟。

本发明中步骤b为：将步骤a所得的滤液用极性有机溶剂进行萃取，然后将萃取液在pH1.0～2.0用水反萃。其中，萃取和反萃的方法都是常规方法。萃取所用的极性有机溶剂优先选自C4～C8的烷基醇和烷基醇与烷基酸所形成的C4～C8的酯。更佳的选自正丁醇、正丙醇、正戊醇、乙酸乙酯和乙酸丁酯，最优选正丁醇。极性有机溶剂在萃取时的加入量是常规的萃取体积，优选滤液体积的40～60％(体积百分比)。极性有机溶剂萃取较佳的在pH 11.0～12.5下进行。用水反萃时水的用量是常规的反萃用量，优选萃取液体积的90～110％(体积百分比)。

较佳的步骤b中极性有机溶剂萃取液在用水反萃前还经过了用水洗涤的步骤。用水洗涤的方法是常规的萃取液水洗方法，一般如加入水混合均匀后，弃水相即可。水洗对水的用量没有要求。水洗可以反复进行多次。

本发明中步骤c为：将步骤b所得的反萃液中加入反萃液体积3～8％(w/v)的无机盐，并调整至pH 9.0～10.0，从而析出沉淀，即为多粘菌素B。其中，加入无机盐是为了达到盐析的目的。所述无机盐按本领域常规，可以是盐析所用的各种无机盐类，本发明优选铵盐和钠盐，更优选铵盐。所述钠盐优先选自硫酸钠和氯化钠。所述铵盐优先选自硫酸铵和磷酸二氢铵，最优选硫酸铵。加入无机盐的量是反萃液体积3～8％(w/v)，优选5％。即相当于加入3～8克无机盐/100毫升反萃液，优选加入5克无机盐/100毫升反萃液。

本发明的从多粘菌素B的发酵液中提取多粘菌素B的方法，优选的，还包括以下步骤：d.将步骤c所得的多粘菌素B和硫酸反应成盐，然后溶析，即得多粘菌素B硫酸盐。本发明的步骤d中，多粘菌素B和硫酸反应成盐是已知技术。溶析也是已知技术。较佳的，溶析时加入有机溶剂，即得到沉淀，沉淀即为多粘菌素B硫酸盐。其中所述有机溶剂较佳的选自醇类和/或酮类，可以选自甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮，优先选自丙酮和甲醇。所述有机溶剂的用量优选为2～4倍体积。

本发明的一较佳实例为，一种发酵液中提取多粘菌素B的方法，包括以下步骤：

a.发酵液预处理：调节发酵液pH至2.0～3.0，80～100℃加热25～60分钟，得到发酵预处理液，通过固液分离得到澄清的滤液；

b.萃取：

向将步骤a所得的滤液中加入滤液体积40～60％(体积百分比)的极性有机溶剂萃取剂，充分混匀后，用碱调节pH至11.0～12.5，取萃取液，用水充分洗涤，然后加入萃取液体积90～110％(体积百分比)的水，用酸调节pH至1.0～2.0，取水相，即反萃得到含有多粘菌素B的水溶液；和

c.沉淀：

将步骤b所得萃取后的多粘菌素B溶液中加入终浓度3～8％(质量百分比)的无机盐，再调节pH至9.0～10.0，得到多粘菌素B的沉淀。

更优选的，本较佳实例还包括步骤d.成盐、溶析：将步骤c沉淀得到的多粘菌素B中加入硫酸直至反应溶解充分，然后加入2～4倍体积的有机溶剂得到沉淀即为多粘菌素B的硫酸盐。

本发明的多粘菌素B硫酸盐沉淀可以按照常规进行干燥，如减压真空干燥。干燥后获得粉末状的多粘菌素B硫酸盐，纯度85％以上，经管碟法(参考2010年版《中国药典(二部)》)测定的效价为8100IU/g以上。工艺收率在60％以上。

本发明制备的多粘菌素B或其硫酸盐能够用于制备抗生素药物，特别是抗革兰氏阴性菌的药物。特别是它能抑制由绿脓杆菌和大肠杆菌引起的各种感染，如脑膜炎、痢疾、呼吸系统感染、腹膜炎、胆管感染、尿路感染、烧伤感染、眼角膜感染及败血症等，且不易产生耐药性。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

在符合本领域常识的基础上，本发明中上述的各技术特征优选条件可以任意组合得到较佳实例。

本发明以较高的收率制备得到高纯度硫酸多粘菌素B。产品纯度为85％以上，效价为8100IU/g以上，收率为60％以上。本发明方法与专利US 2695261和专利WO 058427相比，提高了硫酸多粘菌素B的收率，与上述专利中的透析、冷冻干燥等操作相比，耗时短，成本低；与专利US 3132994和专利WO 142611的树脂纯化方法相比，提高了硫酸多粘菌素B的纯度，而且操作更为简便，对设备要求低、成本低、有机溶剂可回收利用。综上所述，本方法克服了现有技术的缺点，适合大规模的工业化生产过程。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

在本实施方式中，发酵液的获得按如下方式进行。

菌种：Bacillus polymyxa，CMCC NO：63512。

斜面培养基：牛肉膏3g；蛋白胨8g；氯化钠5g；葡萄糖5g；pH 7.0；去离子水1000mL；琼脂22g。

种子培养基：牛肉膏5g；蛋白胨8g；氯化钠3g；葡萄糖10g；pH6.8～7.0；去离子水1000mL。

发酵培养基：蛋白胨10；牛肉膏5g；葡萄糖30g；(NH₄)₂HPO₄8g；pH6.8～7.0；去离子水1000mL。

培养方法：

从斜面培养基上挑取生长良好的菌体，接入经121℃(0.1MPa)高温灭菌25分钟的种子培养基，培养18小时后接入同样经过高温灭菌的发酵培养基，接种量5％(相对于培养基的体积百分比)，培养温度28℃，培养时间48小时。

实施例1

a.发酵液预处理：

发酵结束后收集发酵液共1000mL，多粘菌素B效价为7.7IU/mL，用硫酸调节pH至2.3，加热发酵液至96℃，维持45分钟，得到发酵预处理液。

发酵液的效价的测定是用管碟法(参考2010年版《中国药典(二部)》)测定的。具体方法如下：

指示菌：Bordetella Bronchiseptica，CMCC NO：58403。

斜面培养基：牛肉膏3g；蛋白胨8g；氯化钠5g；葡萄糖5g；pH 7.0；去离子水1000mL；琼脂22g。

检定培养基：蛋白胨6g；胰消化酪素4g；酵母浸膏3g；牛肉浸膏1.5g；葡萄糖1.0g；pH6.5～6.7；水1000ml；上层琼脂15g；下层琼脂20g。

检定方法：

从斜面培养基上挑取生长良好的菌体，接入经121℃(0.1MPa)高温灭菌25分钟的检定培养基上层，接种量5％(相对于培养基的体积百分比)；每个检测平板中以等距离安置牛津杯4个，分别加入高、低剂量的标准品与待测样品各0.3ml，培养温度37℃，培养时间18小时。

计算方法：

从培养箱中取出检测平板，测量其抑菌圈的直径。将测量数据代入计算公式1，所得结果乘以样品与标准品的稀释倍数比(K)，即为样品实际效价。

$\lg \frac{\mathrm{Csh}}{\mathrm{Cbh}}=\frac{(\mathrm{Xsh}+\mathrm{Xsl})-(\mathrm{Xbh}+\mathrm{Xbl})}{(\mathrm{Xsh}+\mathrm{Xbh})-(\mathrm{Xsl}+\mathrm{Xbl})}\×\mathrm{lgK}$ 公式1

注：Csh-样品溶液的效价-IU/ml；Cbh-标准溶液的效价-IU/ml；

Xsh-高剂量样品溶液所致的抑菌圈-mm；Xsl-低剂量样品溶液所致的抑菌圈-mm；

Xbh-高剂量标准溶液所致的抑菌圈-mm；Xbl-低剂量标准溶液所致的抑菌圈-mm；

K高剂量倍数与低剂量倍数的比值。

发酵预处理液通过抽滤固液分离得到澄清的滤液，取滤液用于萃取。

b.萃取：

向滤液中加入400ml的正丁醇，充分混匀后，用氢氧化钠溶液调节pH至11.0，使多粘菌素B从滤液转移到萃取剂正丁醇中。取正丁醇萃取相，用水充分洗涤，然后加入360ml水，用硫酸调节pH至2.0，取水相，即反萃得到400ml含有多粘菌素B的水溶液。

c.沉淀：

萃取后的多粘菌素B水溶液中加入萃取液体积3％(w/v)的磷酸二氢铵，再用氨水调节pH至10.0，得到约605mg多粘菌素B沉淀。

d.成盐、溶析：

沉淀得到的多粘菌素B加入0.02mol/L硫酸直至溶解充分，再加入2倍体积的甲醇得到沉淀即为多粘菌素B的硫酸盐。

沉淀抽滤，真空干燥，获得575mg粉末，即多粘菌素B硫酸盐，纯度85.3％，经管碟法(参考2010年版《中国药典(二部)》)测定的效价为8127IU/g。收率为60.7％，收率计算方法为多粘菌素B硫酸盐的效价除以发酵液的总效价。

实施例2

发酵液制备方法同实施例1。

a.发酵液预处理：

发酵结束后收集发酵液共1000mL，多粘菌素B效价为8.6IU/mL，用硫酸调节pH至2.0，加热发酵液至90℃，维持30分钟，得到发酵预处理液。

发酵预处理液通过固液分离得到澄清的滤液，取滤液用于萃取。

b.萃取：

向1000ml滤液中加入480ml的正丁醇，充分混匀后，用氢氧化钠溶液调节pH至12.0，使多粘菌素B从滤液转移到萃取剂中。取正丁醇萃取相，用水充分洗涤，然后加入等体积水，用硫酸调节pH至1.6，取水相，得到480ml含有多粘菌素B的水溶液。

c.沉淀：

萃取后的多粘菌素B溶液加入萃取液体积5％(w/v)的硫酸铵，再用氨水调节pH至9.2，得到约672mg多粘菌素B的沉淀。

d.成盐、溶析：

沉淀得到的多粘菌素B，加入0.02mol/L硫酸直至溶解充分，再加入3倍体积的丙酮得到沉淀即为多粘菌素B的硫酸盐。

沉淀抽滤，真空干燥，获得约662mg粉末，即多粘菌素B硫酸盐，纯度90.5％，经管碟法测定的效价为8622IU/g。收率为66.4％。

实施例3

所用方法和发酵液同实施例1，不同之处在于向滤液中加入正丁醇后，用氢氧化钠溶液调节pH至12.5，得到约648mg多粘菌素B的沉淀，经成盐、溶析后获得约635mg纯度86.3％粉末状的硫酸多粘菌素B，经管碟法测定的效价为8222IU/g。收率为67.8％。

实施例4

所用方法和发酵液同实施例1，不同之处在于向滤液中加入滤液体积60％(体积百分比)的正丁醇，用氢氧化钠溶液调节pH至11.0，得到约649mg多粘菌素B的沉淀，经成盐、溶析后获得约636mg纯度86.7％粉末状的硫酸多粘菌素B，经管碟法测定的效价为8260IU/g。收率为68.2％。

实施例5

所用方法和发酵液同实施例2，不同之处在于向萃取液中加入萃取液体积90％(体积百分比)的水，用硫酸调节pH至2.0，得到约651mg多粘菌素B的沉淀，经成盐、溶析后获得约638mg纯度87.0％粉末状的硫酸多粘菌素B，经管碟法测定的效价为8289IU/g。收率为61.5％。

实施例6

所用方法和发酵液同实施例2，不同之处在于向萃取液中加入萃取液体积110％(体积百分比)的水，用硫酸调节pH至1.0，获得约661mg多粘菌素B的沉淀，经成盐、溶析后获得约650mg纯度88.6％粉末状的硫酸多粘菌素B，经管碟法测定的效价为8441IU/g。收率为63.8％。

实施例7

所用方法和发酵液同实施例2，不同之处在于萃取后的多粘菌素B溶液，加入3％(w/v)的硫酸铵，再用氢氧化钠调节pH至10.0后获得约654mg多粘菌素B的沉淀，经成盐、溶析后获得约641mg纯度87.4％粉末状的硫酸多粘菌素B，经管碟法测定的效价为8327IU/g。收率为62.1％。

实施例8

所用方法和发酵液同实施例2，不同之处在于萃取后的多粘菌素B溶液，加入8％(w/v)的硫酸铵，再用氨水调节pH至9.0后获得约661mg多粘菌素B的沉淀，经成盐、溶析后获得约647mg纯度88.2％粉末状的硫酸多粘菌素B，经管碟法测定的效价为8403IU/g。收率为63.2％。

实施例9

所用方法和发酵液同实施例2，不同之处在于萃取后的多粘菌素B溶液，加入5％(w/v)的磷酸二氢铵，再用氢氧化钠调节pH至9.2后获得约652mg多粘菌素B的沉淀，经成盐、溶析后获得约638mg纯度87.0％粉末状的硫酸多粘菌素B，经管碟法测定的效价为8289IU/g。收率为61.5％。

实施例10

所用方法和发酵液同实施例2，不同之处在于沉淀得到的多粘菌素B，用硫酸充分反应溶解后，加入2倍体积的丙酮，制备得到约632mg纯度86.1％粉末状的硫酸多粘菌素B，经管碟法测定的效价为8203IU/g。收率为60.3％。

实施例11

所用方法和发酵液同实施例2，不同之处在于沉淀得到的多粘菌素B，用硫酸充分反应溶解后，加入4倍体积的丙酮，制备得到约643mg纯度87.3％粉末状的硫酸多粘菌素B，经管碟法测定的效价为8317IU/g。收率为62.2％。

实施例12

所用方法和发酵液同实施例2，不同之处在于沉淀得到的多粘菌素B，用硫酸充分反应溶解后，加入3倍体积的甲醇，制备得到约659mg纯度89.6％粉末状的硫酸多粘菌素B，经管碟法测定的效价为8536IU/g。收率为65.4％。

实施例13

所用方法和发酵液同实施例2，不同之处在于发酵液预处理时用硫酸调至pH3.0，向滤液中加入滤液体积60％(体积百分比)的正戊醇，得到644mg多粘菌素B的沉淀，经成盐、溶析后获得约631mg纯度86.2％粉末状的硫酸多粘菌素B，经管碟法测定的效价为8212IU/g。收率为60.3％。

实施例14

所用方法和发酵液同实施例2，不同之处在于发酵液预处理时，加热发酵液至80℃，维持60min；向滤液中加入滤液体积48％(体积百分比)的乙酸乙酯，得到645mg多粘菌素B的沉淀，经成盐、溶析后获得约633mg纯度85.5％粉末状的硫酸多粘菌素B，经管碟法测定的效价为8145IU/g。收率为60.0％。

实施例15

所用方法和发酵液同实施例2，不同之处在于发酵液预处理时，加热发酵液至100℃，维持25min；向滤液中加入滤液体积48％(体积百分比)的乙酸丁酯，得到647mg多粘菌素B的沉淀，经成盐、溶析后获得约633mg纯度85.9％粉末状的硫酸多粘菌素B，经管碟法测定的效价为8183IU/g。收率为60.2％。

对比例1

以实施例1制备的多粘芽孢杆菌CMCC 63512发酵液为原料，重复专利US 2695261的实施例1，获得约489mg硫酸多粘菌素B，纯度为66.7％，经管碟法测定的效价为6399IU/g。收率为40.6％。

对比例2

以实施例1制备的以多粘芽孢杆菌CMCC 63512发酵液为原料，重复专利WO 058427的实施例1，获得约610mg硫酸多粘菌素B，纯度为83.2％，经管碟法测定的效价为7926IU/g。收率为62.8％。

对比例3

以实施例1制备的以多粘芽孢杆菌CMCC 63512发酵液为原料，重复专利US 3132994的实施例1，获得约415mg硫酸多粘菌素B，纯度为56.3％，经管碟法测定的效价为5360IU/g。收率为28.9％。

对比例4

以实施例1制备的以多粘芽孢杆菌CMCC 63512发酵液为原料，重复专利WO 3132994的实施例1，获得约603mg硫酸多粘菌素B，纯度为81.9％，经管碟法测定的效价为7806IU/g。收率为61.1％。

通过以上实施例和对比例可以看出，通过本发明方法制备多粘菌素B，经成盐、溶析后获得的多粘菌素B硫酸盐纯度在85％以上，经管碟法测定的效价为8100IU/g以上，收率在60％以上。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (5)

1.一种从多粘菌素B的发酵液中提取多粘菌素B的方法，包括以下步骤：

a.将多粘菌素B的发酵液固液分离，取滤液；所述的多粘菌素B的发酵液在固液分离前经过预处理，包括调节发酵液pH至2.0～3.0，80～100℃加热25～60分钟；

b.将步骤a所得的滤液在pH为11.0～12.5的条件下用极性有机溶剂萃取，萃取液在pH1.0～2.0用水反萃；和

c.将步骤b所得的反萃液中加入反萃液体积3～8％(w/v)的无机盐，并调整至pH 9.0～10.0，从而析出沉淀，即为多粘菌素B；

其中，步骤b所述的极性有机溶剂选自正丁醇、正戊醇、乙酸乙酯和乙酸丁酯。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c所述无机盐为铵盐或者钠盐。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤d：将步骤c所得的多粘菌素B和硫酸反应成盐，然后溶析，即得多粘菌素B硫酸盐。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤d溶析时加入有机溶剂，即得到沉淀。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.发酵液预处理：调节发酵液pH至2.0～3.0，80～100℃加热25～60分钟，得到发酵预处理液，通过固液分离得到澄清的滤液；

b.萃取：

向将步骤a所得的滤液中加入滤液体积40～60％(体积百分比)的极性有机溶剂萃取剂，充分混匀后，用碱调节pH至11.0～12.5，取萃取液，用水充分洗涤，然后加入萃取液体积90～110％(体积百分比)的水，用酸调节pH至1.0～2.0，取水相，即反萃得到含有多粘菌素B的水溶液；和

c.沉淀：

将步骤b所得萃取后的多粘菌素B溶液中加入反萃液体积3～8％(w/v)的无机盐，再调节pH至9.0～10.0，得到多粘菌素B的沉淀。