CN110870576B - 保护肠道屏障的合生元及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种保护肠道屏障的合生元及其制备方法。该制备方法包括如下步骤：于水中混合桑叶低聚糖和双歧杆菌，进行发酵；所得发酵产物进行冷冻喷雾干燥；其中，所述桑叶低聚糖在所述水中的浓度为2～3％w/v，所述双歧杆菌在所述水中的浓度为3～5％w/v。该制备方法制备得到的合生元能够提高双歧杆菌存活数，进而发挥好的保护肠道屏障功效。
Description
技术领域
本发明涉及合生元技术领域，特别是涉及保护肠道屏障的合生元及其制备方法。
背景技术
肠道既是营养物质消化吸收的主要场所，也是保障机体内环境稳态的先天性屏障。一方面机体的生长需要肠道保持一定的通透性以保证营养物质能被最大限度地摄取利用，另一方面机体的健康则要求肠道保持良好的紧密性，以阻止致病菌及毒素等有害物质穿过肠道进入体内，从而发挥屏障功能。而肠道屏障功能出现异常会导致营养物质的消化吸收功能紊乱、生长缓慢、抗病能力下降、对病原微生物的易感性增强，引起各种疾病的发生。因此保护机体肠道屏障显得尤为重要。而研究表明，肠道微生物对机体肠道屏障的构建和维护方面均起重要作用，在维护肠道屏障功能的完整性上具有重要意义。
双岐杆菌作为一种重要的肠道有益微生物，对维持人体肠道屏障发挥着重要的作用。特别地，双歧杆菌是母乳喂养婴幼儿肠道内的优势菌，占母乳喂养婴儿粪便中总微生物群落总数的99％。因此，补充双岐杆菌对婴幼儿由肠道屏障受损引起腹泻、肠炎具有很好的治疗作用。
合生元又称为合生素，是指益生菌和益生元的组合制剂，或再加入维生素、微量元素等。它既可发挥益生菌的生理性细菌活性，又可选择性地快速增加这种菌的数量，使益生菌作用更显著持久。因此提供一种能够提高双歧杆菌存活数的双岐杆菌的合生元是具有十分重要的意义的。
发明内容
基于此，有必要提供一种保护肠道屏障的合生元的制备方法。该制备方法制备得到的合生元能够提高双歧杆菌存活数，进而发挥好的保护肠道屏障功效。
一种保护肠道屏障的合生元的制备方法，包括如下步骤：
于水中混合桑叶低聚糖和双歧杆菌，进行发酵；
所得发酵产物进行冷冻喷雾干燥；
其中，所述桑叶低聚糖在所述水中的浓度为2～3％w/v，所述双歧杆菌在所述水中的浓度为3～5％w/v。
在其中一个实施例中，所述桑叶低聚糖在所述水中的浓度为2.5～3％w/v，所述双歧杆菌在所述水中的浓度为4～5％w/v。
在其中一个实施例中，所述发酵的条件包括：温度为30～40℃，pH为5.5～6.5，发酵时间为48～72h。
在其中一个实施例中，所述桑叶低聚糖的制备方法包括如下步骤：
于桑叶粉中加入水进行提取，得到桑叶多糖提取液；
于所述桑叶多糖提取液中加入固定化酶进行反应，得到粗提物；
对所述粗提物进行柱层析。
在其中一个实施例中，所述固定化酶为固定于载体之上的纤维素酶和半纤维素酶。
在其中一个实施例中，所述纤维素酶和半纤维素酶的质量比为1:0.8～1.2。
在其中一个实施例中，所述载体为盐酸多巴胺修饰的二氧化硅包裹的氧化铁磁性颗粒。
在其中一个实施例中，所述反应的条件包括：温度为60～65℃，pH为4.8～5，时间为6～8h；
在其中一个实施例中，所述柱层析的方法包括：先以水为洗脱剂，采用纤维素层析柱进行第一次柱层析；再以水为洗脱剂，采用葡聚糖凝胶柱进行第二次柱层析；
其中，所述第一次柱层析过程中，洗脱剂的流速为20～30mL/min，收集 100～300min洗脱液；所述第二次柱层析过程中，洗脱剂的流速为15～20mL/min，收集100～300min洗脱液。
本发明还提供所述的制备方法制备得到的合生元。
与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：
本发明将桑叶低聚糖与双岐杆菌以一定的浓度进行发酵培养，然后进行冷冻喷雾干燥，由此制备得到的合生元中双歧杆菌存活数高，经过试验验证，具有优异的保护肠道屏障功效。
附图说明
图1为本发明实施例和对比例对小鼠结肠诱导炎症模型的小肠绒毛修复对比图；
图2为本发明实施例和对比例对小鼠结肠诱导炎症模型的粘液细胞修复对比图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的保护肠道屏障的合生元及其制备方法作进一步详细的说明。
本发明的实施例提供一种保护肠道屏障的合生元的制备方法，包括如下步骤：
于水中混合桑叶低聚糖和双歧杆菌，进行发酵；
所得发酵产物进行冷冻喷雾干燥；
其中，所述桑叶低聚糖在所述水中的浓度为2～3％w/v，所述双歧杆菌在所述水中的浓度为3～5％w/v。
作为优选地，所述桑叶低聚糖在所述水中的浓度为2.5～3％w/v，所述双歧杆菌在所述水中的浓度为4～5％w/v。合理控制所述桑叶低聚糖与双歧杆菌的发酵浓度，可以使双歧杆菌在冷冻喷雾干燥的过程中存活数进一步提升，可提高 2-3个数量级之多。
作为优选地，所述发酵的条件包括：温度为30～40℃，pH为5.5～6.5，发酵时间为48～72h。对发酵的温度、pH和时间进行合理控制，更有利于双歧杆菌对桑叶低聚糖的吸收，从而保证存活数。
在其中一个具体的实施例中，所述双歧杆菌为两歧双歧杆菌。
在其中一个具体的实施例中，所述桑叶低聚糖的制备方法包括如下步骤：
于桑叶粉中加入水进行提取，得到桑叶多糖提取液；
于所述桑叶多糖提取液中加入固定化酶进行反应，得到粗提物；
对所述粗提物进行柱层析。
通过结合固定化酶催化以及柱层析工艺，可使提取得到的桑叶低聚糖与双歧杆菌存活所需能源更加匹配，特异性地促进两歧双岐杆菌的生长，且产物便于分离，产品纯度提高，副产物减少。
在其中一个具体的实施例中，所述加入水进行提取的方法为：在75～85℃温度条件下提取3～5h。
作为优选地，所述固定化酶为固定于载体之上的纤维素酶和半纤维素酶。采用纤维素酶与半纤维素酶相配合的复合酶进行酶催化，催化获得的桑叶低聚糖中的寡糖片段更有利于双歧杆菌的吸收发酵，存活数更高。在其中一个具体的实施例中，所述纤维素酶和半纤维素酶的质量比为1:0.8～1.2。
作为优选地，所述载体为盐酸多巴胺修饰的二氧化硅包裹的氧化铁磁性颗粒。采用该载体对前述复合酶进行负载，在不影响催化效果的同时，与复合酶的连接更稳定，能够更好地实现复合酶的重复利用，在重复使用10次后，酶活保持率高达70％以上，由此可降低生产成本，且更重要的是，降低了复合酶的添加导致蛋白质的引入而影响后续低聚糖分离纯化的难度。
在其中一个具体的实施例中，所述载体的制备方法包括如下步骤：
在室温下，每1L水中加入32.4g FeCl3，15.2gFeSO4，然后加入过量的碱以形成沉淀，分离得到沉淀，并清洗、干燥，得到磁性纳米颗粒；
以20mL水计，于水中加入10.0～20.0g上述制备的磁性纳米颗粒，再加入 300mL异丙醇，超声，然后在碱性条件下，加入5～10mL正硅酸四乙酯，反应 8～12h，收集固体并清洗，制备得到二氧化硅包裹的磁性颗粒Fe3O4@SiO2；
将如上制备得到的Fe3O4@SiO2颗粒置于1L pH 8.0磷酸缓冲液中，然后加入 20～30g盐酸多巴胺，反应，得到所述载体。
在其中一个具体的实施例中，所述固定化酶的制备方法包括如下步骤：
按照每50-100g复合酶(纤维素酶和半纤维素)添加40-50g载体的用量混合复合酶和载体，于pH 7.0的磷酸缓冲液中，于室温下对酶进行12～24h固定化，制备得到所述固定化酶。
进一步地，在其中一个具体的实施例中，所述加入固定化酶进行反应的条件包括：温度为60～65℃，pH为4.8～5，时间为6～8h。
进一步地，在其中一个具体的实施例中，所述柱层析的方法包括：先以水为洗脱剂，采用纤维素层析柱进行第一次柱层析；再以水为洗脱剂，采用葡聚糖凝胶柱进行第二次柱层析。依次采用纤维素层析柱和葡聚糖凝胶柱进行柱层析，能够简单、快捷的对粗提物进行纯化，且纯化获得的桑叶低聚糖纯度高，达到95％以上。
在其中一个具体的实施例中，所述第一次柱层析过程中，洗脱剂的流速为 20～30mL/min，收集100～300min洗脱液；及/或，所述第二次柱层析过程中，洗脱剂的流速为15～20mL/min，收集100～300min洗脱液。
本发明的实施例还提供所述的制备方法制备得到的合生元。
以下为具体的实施例，如无特别说明，本申请所采用的原料均来源于市售。
实施例中各性能指标的测试标准或方法：
酶活的测定
待测酶液的制备：准确称取1g酶，用pH4.8醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容至 100mL容量瓶中。
1.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液：称取CMC-Na 1.50g于烧杯中，加适量pH4.8醋酸-醋酸钠缓冲液置于水浴中加热(<50℃)溶解成胶状，转入容量瓶中并用缓冲液定容至100mL，置冰箱中备用。
0.1％即1mg/mL葡萄糖标准溶液：称取无水葡萄糖0.1000g于烧杯中，加适量水溶解，转入容量瓶中并定容至100mL。
葡萄糖标准曲线的绘制：吸取1mg/mL无水葡萄糖溶液0，0.2，0.4，0.6， 0.8，1.0mL于试管中，补水至2mL，加DNS试剂3mL，混合后于沸水中煮10min，冷却后定容至15mL，于分光光度计540nm波长下测吸光度(A)。以吸光度为纵坐标，葡萄糖量为横坐标，绘制标准曲线，三次重复试验的均值用最小二乘法拟合一元线性方程y＝ax﹢b，求出吸光度与葡萄糖量的关系。
酶活的测定：取试管按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加入底物(吸取前摇匀)开始，向每支试管中加入待测酶液的时间间隔要绝对一致，于50℃水解30min。
总糖的测定方法—苯酚-硫酸法：
取2mL不同浓度的葡萄糖溶液(0-400μg/mL)，依次加入1.0mL5％苯酚溶液，5mL浓硫酸，振荡摇匀，40℃下反应15min，以蒸馏水管作空白对照，490nm 下测定吸光值，绘制标准曲线。
样品处理：2mL一定浓度的样品+1mL 5％苯酚溶液+5mL浓硫酸，振荡摇匀，40℃下反应15min，测吸光值，并计算出样品中总糖的含量。
还原糖的测定方法：
取2mL不同浓度的葡萄糖溶液(0-500μg/mL)，加入3.0mLDNS溶液，振荡摇匀，沸水浴中反应10min，冷却后定容至15mL，以蒸馏水管作空白对照，于分光光度计540nm波长下测吸光度，绘制标准曲线。
样品处理：2mL一定浓度的样品+3.0mLDNS溶液，振荡摇匀，沸水浴中反应10min，冷却后定容至15mL，测吸光值，并计算出样品中还原糖的含量。
多糖含量测定：多糖含量＝多糖提取液总糖含量-多糖提取液中还原糖含量。
低聚糖纯度分析：
将待测样品用0.22μm滤膜过滤后用于高效液相色谱分析低聚糖纯度，色谱条件为：检测器为蒸发光检测器，ELSD漂移管温度为45℃；色谱柱型号为Shodex AsahipakNH2P-504E(4.6mm×250mm，5μm)，柱温30℃；流动相为75％乙腈，流速为1mL/min，进样量为20μL，以聚合度为2-10的葡聚糖作为标准品。
活菌存活数测定：将分别盛有900μL水的8支1.5mL离心管灭菌，并按101到108的顺序进行编号；用移液枪吸取100μL培养的菌夜，注入101倍稀释的离心管中，使菌液与水充分混匀；从101倍稀释的试管中吸取100μL稀释液，注入 102倍稀释的试管中，重复第二步的混匀操作；以此类推，直到完成最后一支试管的稀释；分别取100μL菌夜滴加到固体培养基表面；用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面；在37℃下培养48h，观察菌落生长情况，并计数。
实施例1
本实施例为一种保护肠道屏障的合生元的制备方法，步骤如下：
(1)固定化酶的制备：
在室温下，1L蒸馏水中加入32.4gFeCl3，15.2gFeSO4，然后加入过量的氨水，沉淀通过离心获得并用去离子水水洗至pH为7.0为止，冷冻干燥得到磁性纳米颗粒；取15g上述制备的磁性纳米颗粒于20mL水中，加入300mL异丙醇，超声30min，然后在机械搅拌下依次加入10mL氨水，慢慢滴加5mL正硅酸四乙酯，反应8h，然后用乙醇洗涤多次，制备得到二氧化硅包裹的磁性颗粒 Fe3O4@SiO2；将制得的Fe3O4@SiO2颗粒置于1LpH8.0磷酸缓冲液中，超声10min，加入25g盐酸多巴胺，反应2h得到固定化酶载体；将100g纤维素酶和半纤维素酶(质量比1:1)二者复合酶与40g固定酶载体于1LpH7.0磷酸缓冲液中，于室温下对酶进行24h固定化，制备得到固定化纤维素酶和半纤维素酶。
(2)桑叶低聚糖的制备：
将桑叶粉加入到蒸馏水中得到5％(w/v)溶液，在80℃下提取时间为4h，过滤取上清得到桑叶多糖提取液(3％，w/v)；于所述桑叶多糖提取液中以浓度 0.15％w/v加入固定化酶，反应温度为65℃，反应时间为8h，反应pH5.0，过滤取上清得到桑叶低聚糖粗反应液(0.4％，w/v)；将上述桑叶低聚糖粗反应液中加入到DEAE-52层析柱中(70mm×1000mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为 20mL/min洗脱，收集150-300min洗脱液，浓缩得浓缩液(0.5％，w/v)；随后将浓缩液加入到葡聚糖凝胶G-25柱中(55mm×1000mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为15mL/min洗脱，收集150-300min洗脱液，浓缩得到桑叶低聚糖溶液(3％， w/v)。
(3)合生元的制备：
于上述桑叶低聚糖溶液中以5％w/v加入两歧双岐杆菌，在37℃，pH6.0下，发酵为60h，最终冷冻喷雾干燥得到富含桑叶低聚糖和两歧双岐杆菌的合生元。该产品记为实施例1。
实施例2
本实施例为一种保护肠道屏障的合生元的制备方法，步骤如下：
(1)固定化酶的制备：
在室温下，1L蒸馏水中加入32.4gFeCl3，15.2gFeSO4，然后加入过量的氨水，沉淀通过离心获得并用去离子水水洗至pH为7.0为止，冷冻干燥得到磁性纳米颗粒；取15g上述制备的磁性纳米颗粒于20mL水中，加入300mL异丙醇，超声30min，然后在机械搅拌下依次加入10mL氨水，慢慢滴加5mL正硅酸四乙酯，反应8h，然后用乙醇洗涤多次，制备得到二氧化硅包裹的磁性颗粒 Fe3O4@SiO2；将将制得Fe3O4@SiO2颗粒置于1LpH8.0磷酸缓冲液中，超声10min，加入25g盐酸多巴胺，反应2h得到固定化酶载体；将100g纤维素酶和半纤维素酶(质量比1:1)二者复合酶与40g固定酶载体于1LpH7.0磷酸缓冲液中，于室温下对酶进行24h固定化，制备得到固定化纤维素酶和半纤维素酶。
(2)桑叶低聚糖的制备：
将桑叶粉加入到蒸馏水中得到5％(w/v)溶液，在80℃下提取时间为4h，过滤取上清得到桑叶多糖提取液(3％，w/v)；于所述桑叶多糖提取液中以浓度 0.15％w/v加入固定化酶，反应温度为65℃，反应时间为8h，反应pH5.0，过滤取上清得到桑叶低聚糖粗反应液(0.4％，w/v)；将上述桑叶低聚糖粗反应液中加入到DEAE-52层析柱中(70mm×1000mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为 20mL/min洗脱，收集150-300min洗脱液，浓缩得浓缩液(0.5％，w/v)；随后将浓缩液加入到葡聚糖凝胶G-25柱中(55mm×1000mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为15mL/min洗脱，收集150-300min洗脱液，浓缩得到桑叶低聚糖溶液(2％， w/v)。
(3)合生元的制备：
于上述桑叶低聚糖溶液中以3％w/v加入两歧双岐杆菌，在37℃，pH 5.5下，发酵为48h，最终冷冻喷雾干燥得到富含桑叶低聚糖和两歧双岐杆菌的合生元。该产品记为实施例2。
实施例3
本实施例为一种保护肠道屏障的合生元的制备方法，步骤如下：
(1)固定化酶的制备：
在室温下，1L蒸馏水中加入32.4gFeCl3，15.2gFeSO4，然后加入过量的氨水，沉淀通过离心获得并用去离子水水洗至pH为7.0为止，冷冻干燥得到磁性纳米颗粒；取15g上述制备的磁性纳米颗粒于20mL水中，加入300mL异丙醇，超声30min，然后在机械搅拌下依次加入10mL氨水，慢慢滴加5mL正硅酸四乙酯，反应8h，然后用乙醇洗涤多次，制备得到二氧化硅包裹的磁性颗粒Fe3O4@SiO2；将将制得Fe3O4@SiO2颗粒置于1LpH8.0磷酸缓冲液中，超声10min，加入25g盐酸多巴胺，反应2h得到固定化酶载体；将100g纤维素酶和半纤维素酶(质量比1:1)二者复合酶与40g固定酶载体于1LpH7.0磷酸缓冲液中，于室温下对酶进行24h固定化，制备得到固定化纤维素酶和半纤维素酶。
(2)桑叶低聚糖的制备：
将桑叶粉加入到蒸馏水中得到5％(w/v)溶液，在80℃下提取时间为4h，过滤取上清得到桑叶多糖提取液(3％，w/v)；于所述桑叶多糖提取液中以浓度 0.15％w/v加入固定化酶，反应温度为65℃，反应时间为8h，反应pH5.0，过滤取上清得到桑叶低聚糖粗反应液(0.4％，w/v)；将上述桑叶低聚糖粗反应液中加入到DEAE-52层析柱中(70mm×1000mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为 20mL/min洗脱，收集150-300min洗脱液，浓缩得浓缩液(0.5％，w/v)；随后将浓缩液加入到葡聚糖凝胶G-25柱中(55mm×1000mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为15mL/min洗脱，收集150-300min洗脱液，浓缩得到桑叶低聚糖溶液 (2.5％，w/v)。
(3)合生元的制备：
于上述桑叶低聚糖溶液中以4％w/v加入两歧双岐杆菌，在37℃，pH 6.5下，发酵为72h，最终冷冻喷雾干燥得到富含桑叶低聚糖和两歧双岐杆菌的合生元。该产品记为实施例3。
实施例4
本实施例为一种保护肠道屏障的合生元的制备方法，步骤如下：
(1)固定化酶的制备：
在室温下，1L蒸馏水中加入32.4gFeCl3，15.2gFeSO4，然后加入过量的氨水，沉淀通过离心获得并用去离子水水洗至pH为7.0为止，冷冻干燥得到磁性纳米颗粒；取10g上述制备的磁性纳米颗粒于20mL水中，加入300mL异丙醇，超声30min，然后在机械搅拌下依次加入10mL氨水，慢慢滴加10mL正硅酸四乙酯，反应12h，然后用乙醇洗涤多次，制备得到二氧化硅包裹的磁性颗粒 Fe3O4@SiO2；将制得的Fe3O4@SiO2颗粒置于1LpH8.0磷酸缓冲液中，超声10min，加入20g盐酸多巴胺，反应2h得到固定化酶载体；将50g纤维素酶和半纤维素酶(质量比1:1)二者复合酶与50g固定酶载体于1LpH7.0磷酸缓冲液中，于室温下对酶进行12h固定化，制备得到固定化纤维素酶和半纤维素酶。
(2)桑叶低聚糖的制备：
将桑叶粉加入到蒸馏水中得到5％(w/v)溶液，在80℃下提取时间为4h，过滤取上清得到桑叶多糖提取液(2％，w/v)；于所述桑叶多糖提取液中以浓度 0.1％w/v加入固定化酶，反应温度为65℃，反应时间为8h，反应pH5.0，过滤取上清得到桑叶低聚糖粗反应液(0.8％，w/v)；将上述桑叶低聚糖粗反应液中加入到DEAE-52层析柱中(70mm×1000mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为30mL/min洗脱，收集100-250min洗脱液，浓缩得浓缩液(1％，w/v)；随后将 1.0％(w/v)浓缩液加入到葡聚糖凝胶G-25柱中(55mm×1000mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为15mL/min洗脱，收集100-250min洗脱液，浓缩得到桑叶低聚糖溶液(3％，w/v)。
(3)合生元的制备：
于上述桑叶低聚糖溶液中以5％w/v加入两歧双岐杆菌，在37℃，pH6.0下，发酵为60h，最终冷冻喷雾干燥得到富含桑叶低聚糖和两歧双岐杆菌的合生元。该产品记为实施例4。
实施例5
本实施例为一种保护肠道屏障的合生元的制备方法，步骤如下：
(1)固定化酶的制备：
在室温下，1L蒸馏水中加入32.4gFeCl3，15.2gFeSO4，然后加入过量的氨水，沉淀通过离心获得并用去离子水水洗至pH为7.0为止，冷冻干燥得到磁性纳米颗粒；取20g上述制备的磁性纳米颗粒于20mL水中，加入300mL异丙醇，超声30min，然后在机械搅拌下依次加入10mL氨水，慢慢滴加7.5mL正硅酸四乙酯，反应10h，然后用乙醇洗涤多次，制备得到二氧化硅包裹的磁性颗粒 Fe3O4@SiO2；将制得的Fe3O4@SiO2颗粒置于1LpH8.0磷酸缓冲液中，超声10min，加入30g盐酸多巴胺，反应2h得到固定化酶载体；将75g纤维素酶和半纤维素酶(质量比1:1)二者复合酶与45g固定酶载体于1LpH7.0磷酸缓冲液中，于室温下对酶进行18h固定化，制备得到固定化纤维素酶和半纤维素酶。
(2)桑叶低聚糖的制备：
将桑叶粉加入到蒸馏水中得到5％(w/v)溶液，在80℃下提取时间为4h，过滤取上清得到桑叶多糖提取液(2.5％，w/v)；于所述桑叶多糖提取液中以浓度0.125％w/v加入固定化酶，反应温度为65℃，反应时间为8h，反应pH5.0，过滤取上清得到桑叶低聚糖粗反应液(0.6％，w/v)；将上述桑叶低聚糖粗反应液中加入到DEAE-52层析柱中(70mm×1000mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为25mL/min洗脱，收集125-275min洗脱液，浓缩得浓缩液(0.75％，w/v)；随后将浓缩液加入到葡聚糖凝胶G-25柱中(55mm×1000mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为18mL/min洗脱，收集125-275min洗脱液，浓缩得到桑叶低聚糖溶液(3％，w/v)。
(3)合生元的制备：
于上述桑叶低聚糖溶液中以5％w/v加入两歧双岐杆菌，在37℃，pH6.0下，发酵为60h，最终冷冻喷雾干燥得到富含桑叶低聚糖和两歧双岐杆菌的合生元。该产品记为实施例5。
实施例6
本实施例为一种保护肠道屏障的合生元的制备方法，步骤如下：
(1)固定化酶的制备：
在室温下，1L蒸馏水中加入32.4gFeCl3，15.2gFeSO4，然后加入过量的氨水，沉淀通过离心获得并用去离子水水洗至pH为7.0为止，冷冻干燥得到磁性纳米颗粒；取15g上述制备的磁性纳米颗粒于20mL水中，加入300mL异丙醇，超声30min，然后在机械搅拌下依次加入10mL氨水，慢慢滴加5mL正硅酸四乙酯，反应8h，然后用乙醇洗涤多次，制备得到二氧化硅包裹的磁性颗粒 Fe3O4@SiO2；将制得的Fe3O4@SiO2颗粒置于1LpH8.0磷酸缓冲液中，超声10min，加入25g盐酸多巴胺，反应2h得到固定化酶载体；将100g纤维素酶与 40g固定酶载体于1LpH7.0磷酸缓冲液中，于室温下对酶进行24h固定化，制备得到固定化纤维素酶和半纤维素酶。
(2)桑叶低聚糖的制备：
将桑叶粉加入到蒸馏水中得到5％(w/v)溶液，在80℃下提取时间为4h，过滤取上清得到桑叶多糖提取液(3％，w/v)；于所述桑叶多糖提取液中以浓度 0.15％w/v加入固定化酶，反应温度为65℃，反应时间为8h，反应pH5.0，过滤取上清得到桑叶低聚糖粗反应液(0.4％，w/v)；将上述桑叶低聚糖粗反应液中加入到DEAE-52层析柱中(70mm×1000mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为 20mL/min洗脱，收集150-300min洗脱液，浓缩得浓缩液(0.5％，w/v)；随后将浓缩液加入到葡聚糖凝胶G-25柱中(55mm×1000mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为15mL/min洗脱，收集150-300min洗脱液，浓缩得到桑叶低聚糖溶液(3％， w/v)。
(3)合生元的制备：
于上述桑叶低聚糖溶液中以5％w/v加入两歧双岐杆菌，在37℃，pH6.0下，发酵为60h，最终冷冻喷雾干燥得到富含桑叶低聚糖和两歧双岐杆菌的合生元。该产品记为实施例6。
实施例7
本实施例为一种保护肠道屏障的合生元的制备方法，步骤如下：
(1)桑叶低聚糖的制备：
将桑叶粉加入到蒸馏水中得到5％(w/v)溶液，在80℃下提取时间为4h，过滤取上清得到桑叶多糖提取液(3％，w/v)；于所述桑叶多糖提取液中以浓度 0.15％w/v加入0.15％游离酶(纤维素酶和半纤维素酶质量比1:1)，反应温度为 65℃，反应时间为8h，反应pH5.0，过滤取上清得到桑叶低聚糖粗反应液(0.4％， w/v)；将上述桑叶低聚糖粗反应液中加入到DEAE-52层析柱中 (70mm×1000mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为20mL/min洗脱，收集 150-300min洗脱液，浓缩得浓缩液(0.5％，w/v)；随后将浓缩液加入到葡聚糖凝胶G-25柱中(55mm×1000mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为15mL/min洗脱，收集150-300min洗脱液，浓缩得到桑叶低聚糖溶液(2％，w/v)。
(2)合生元的制备：
于上述桑叶低聚糖溶液中以3％w/v加入两歧双岐杆菌，在37℃，pH 5.5下，发酵为48h，最终冷冻喷雾干燥得到富含桑叶低聚糖和两歧双岐杆菌的合生元。该产品记为实施例7。
实施例8
本实施例为一种保护肠道屏障的合生元的制备方法，步骤如下：
(1)固定化酶的制备：
在室温下，1L蒸馏水中加入32.4gFeCl3，15.2gFeSO4，然后加入过量的氨水，沉淀通过离心获得并用去离子水水洗至pH为7.0为止，冷冻干燥得到磁性纳米颗粒；取15g上述制备的磁性纳米颗粒于20mL水中，加入300mL异丙醇，超声30min，然后在机械搅拌下依次加入10mL氨水，慢慢滴加5mL正硅酸四乙酯，反应8h，然后用乙醇洗涤多次，制备得到二氧化硅包裹的磁性颗粒 Fe3O4@SiO2；将制得的Fe3O4@SiO2颗粒置于1LpH8.0磷酸缓冲液中，超声10min，加入25g盐酸多巴胺，反应2h得到固定化酶载体；将100g纤维素酶和半纤维素酶(质量比1:1)二者复合酶与40g固定酶载体于1LpH7.0磷酸缓冲液中，于室温下对酶进行24h固定化，制备得到固定化纤维素酶和半纤维素酶。
(2)桑叶低聚糖的制备：
将桑叶粉加入到蒸馏水中得到5％(w/v)溶液，在80℃下提取时间为4h，过滤取上清得到桑叶多糖提取液(3％，w/v)；于所述桑叶多糖提取液中以浓度 0.15％w/v加入固定化酶，反应温度为65℃，反应时间为8h，反应pH5.0，过滤取上清得到桑叶低聚糖粗反应液(0.4％，w/v)，浓缩得粗浓缩液(3％，w/v)
(3)合生元的制备：
与上述桑叶低聚糖粗浓缩液中以5％w/v加入两歧双岐杆菌，在37℃，pH6.0 下，发酵为60h，最终冷冻喷雾干燥得到富含桑叶低聚糖和两歧双岐杆菌的合生元。该产品记为实施例1。
对比例1
本对比例为一种保护肠道屏障的产品的制备方法，步骤如下：
(1)固定化酶的制备：
在室温下，1L蒸馏水中加入32.4gFeCl3，15.2gFeSO4，然后加入过量的氨水，沉淀通过离心获得并用去离子水水洗至pH为7.0为止，冷冻干燥得到磁性纳米颗粒；取15g上述制备的磁性纳米颗粒于20mL水中，加入300mL异丙醇，超声30min，然后在机械搅拌下依次加入10mL氨水，慢慢滴加5mL正硅酸四乙酯，反应8h，然后用乙醇洗涤多次，制备得到二氧化硅包裹的磁性颗粒 Fe3O4@SiO2；将制得的Fe3O4@SiO2颗粒置于1LpH8.0磷酸缓冲液中，超声10min，加入25g盐酸多巴胺，反应2h得到固定化酶载体；将100g纤维素酶和半纤维素酶(质量比1:1)二者复合酶与40g固定酶载体于1LpH7.0磷酸缓冲液中，于室温下对酶进行24h固定化，制备得到固定化纤维素酶和半纤维素酶。
(2)桑叶低聚糖的制备：
将桑叶粉加入到蒸馏水中得到5％(w/v)溶液，在80℃下提取时间为4h，过滤取上清得到桑叶多糖提取液(3％，w/v)；于所述桑叶多糖提取液中以浓度 0.15％w/v加入固定化酶，反应温度为65℃，反应时间为8h，反应pH5.0，过滤取上清得到桑叶低聚糖粗反应液(0.4％，w/v)；将上述桑叶低聚糖粗反应液中加入到DEAE-52层析柱中(70mm×1000mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为 20mL/min洗脱，收集150-300min洗脱液，浓缩得浓缩液(0.5％，w/v)；随后将浓缩液加入到葡聚糖凝胶G-25柱中(55mm×1000mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为15mL/min洗脱，收集150-300min洗脱液，浓缩得到桑叶低聚糖溶液(3％， w/v)。该产品记为对比例1。
对比例2
本对比例为一种保护肠道屏障的产品的制备方法，步骤如下：
于3％w/v葡萄糖水溶液中以5％w/v加入两歧双岐杆菌，加在37℃，pH5.5 下，发酵为48h，离心，保留沉淀并进行冷冻喷雾干燥得到富含桑叶低聚糖和两歧双岐杆菌的合生元。该产品记为对比例2。
效果验证：
(1)对实施例1-8和对比例1-2进行测试性能指标测试，结果如下表1所示：
表1
(2)对肠道屏障的保护作用
采用10％乙酸注入小鼠结肠诱导炎症模型，模型建立后，实验组灌胃实施例1-8及对比例1-2的样品(0.9g/kg·bw)两周，正常和模型对照组灌胃等量生理盐水两周，将小鼠解剖，观察小肠绒毛及粘液细胞变化情况。结果如图1、2 所示。
由图1可知，与对比例1-2进行比较，实施例1-8均对受损的肠绒毛有较好的修复作用，其中，实施例1和3-5的修复效果更显著，实施例8相较其它实施例稍差。
由图2可以知道，与对比例1-2进行比较，实施例1-8均对受损的粘液细胞有较好的修复作用，其中，实施例1和3-5的修复效果更显著，实施例8相较其它实施例稍差。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (4)
1.一种保护肠道屏障的合生元的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
于水中混合桑叶低聚糖和双歧杆菌，进行发酵；
所得发酵产物进行冷冻喷雾干燥；
其中，所述桑叶低聚糖在所述水中的浓度为2~3%w/v，所述双歧杆菌在所述水中的浓度为3~5%w/v；
所述双歧杆菌为两歧双歧杆菌；
所述发酵的条件包括：温度为30~40℃，pH为5.5~6.5，发酵时间为48~72h；
所述桑叶低聚糖的制备方法包括如下步骤：于桑叶粉中加入水进行提取，得到桑叶多糖提取液，于所述桑叶多糖提取液中加入固定化酶进行反应，得到粗提物，对所述粗提物进行柱层析；
所述加入水进行提取的方法为：在75～85℃温度条件下提取3～5h；
所述加入固定化酶进行反应的条件包括：温度为60~65℃，pH为4.8~5，时间为6~8h；
所述柱层析的方法为：先以水为洗脱剂，采用纤维素层析柱进行第一次柱层析；再以水为洗脱剂，采用葡聚糖凝胶柱进行第二次柱层析；
其中，所述第一次柱层析过程中，洗脱剂的流速为20～30mL/min，收集100～300min洗脱液；所述第二次柱层析过程中，洗脱剂的流速为15～20mL/min，收集100～300min洗脱液；
所述固定化酶制备方法包括如下步骤：
按照每50-100g复合酶添加40-50g载体的用量混合复合酶和载体，于pH7.0的磷酸缓冲液中，于室温下对酶进行12～24h固定化，制备得到所述固定化酶；
所述复合酶为纤维素酶和半纤维素酶，其质量比为1:0.8~1.2。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述桑叶低聚糖在所述水中的浓度为2.5~3% w/v，所述双歧杆菌在所述水中的浓度为4~5% w/v。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述载体为盐酸多巴胺修饰的二氧化硅包裹的四氧化三铁磁性颗粒。
4.权利要求1-3任一项所述的制备方法制备得到的合生元。
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