CN109750070A

CN109750070A - 一种功能性桑叶低聚糖及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109750070A
Application number: CN201910098976.XA
Authority: CN
Inventors: 胡腾根; 邹宇晓; 廖森泰; 黎尔纳; 沈维治; 刘凡; 王思远; 王卫飞; 李倩; 穆利霞
Original assignee: Sericulture and Agri Food Research Institute GAAS
Current assignee: Sericulture and Agri Food Research Institute GAAS
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2019-05-14
Anticipated expiration: 2039-01-31
Also published as: CN109750070B

Abstract

本发明公开了一种功能性桑叶低聚糖及其制备方法和应用，包括如下步骤：(1)以干燥的桑叶为原料，粉碎后利用石油醚脱脂，得到脱脂桑叶粉；(2)脱脂桑叶粉经水提得到桑叶多糖提取液；(3)将得到的桑叶多糖提取液中加入水解酶，经酶解反应得到低聚糖水解液；(4)在低聚糖水解液中加入乙醇，醇沉未反应的桑叶多糖，得到去多糖的桑叶低聚糖溶液；(5)在去多糖的桑叶低聚糖溶液中加入啤酒酵母发酵去单糖，最终得到功能性桑叶低聚糖。本发明利用醇沉去多糖及微生物发酵去单糖，简化了桑叶低聚糖分离纯化工艺过程，具有更好的经济性和环保性，且得到的桑叶低聚糖具有促进肠道有益菌增殖、抑制有害菌生长的生理功效。

Description

一种功能性桑叶低聚糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种功能性桑叶低聚糖及其制备方法和应用。

背景技术

功能性低聚糖由于难以被胃肠消化吸收，甜度低，热量低，基本不增加血糖和血脂，具有促进益生菌增殖、抑制有害菌、预防及辅助治疗慢性疾病、增强机体免疫机能和促进矿物质吸收等多种生理调节功能而备受关注，成为研究的重点。

低聚糖作为一种新型功能性糖源，广泛应用于食品、保健品、饮料、医药、饲料添加剂等领域。其已发展成为一个重要的生物技术产业，催生了300多亿美元的功能食品市场及100多亿美元的功能饲料市场，而且每年仍以10％-20％的速度增长，市场前景良好。但目前市场化品种较少，仅有20多种，因此开发和制备新来源低聚糖成为当前研究的热点。

桑叶为自然界中富含多种营养和生物活性成分的药食两用植物资源，具有抗炎、清热解毒、降血糖、降血脂功效，作为桑叶中重要的活性物质多糖，其降血糖、降血脂、抑菌等功能也被研究证实。但目前关于多糖的研究存在以下问题：1)由于其分子量及粘度大、导致其溶解性差、生物利用率低；2)人体内的消化酶如α-淀粉酶、葡萄糖苷酶、麦芽糖酶、异麦芽糖酶、蔗糖酶等对糖苷键的专一性很强，只能水解α-1,4构型的糖苷键，而桑叶多糖中含有大量的β构型、α-1,2、α-1,3、α-1,5的糖苷键，很难被人体吸收利用；3)多糖在体内是被降解成具有功能性的寡糖片段被吸收发挥作用。同时，体外将多糖降解得到的低聚糖，如低聚果糖、魔芋低聚糖等已被证实具有调节肠道菌群结构、降血糖、降血脂、改善胃肠道等多种功能；此外肠道菌群也已被报道与人体功能性肠病、慢性炎症、各种代谢疾病等密切相关，而目前抗生素的滥用，对人体肠道菌群破坏较大从而影响健康，同时关于桑叶低聚糖的研究及其是否具有调节肠道菌群的功效尚未见报道。因此，利用桑叶制备低聚糖不仅提供了一种新来源的低聚糖；也进一步促进低聚糖产业。

目前在多糖制备低聚糖技术方面，仍然以传统的化学法如酸水解、氧化水解为主，其缺点是对设备腐蚀性高、环境污染大、易破坏糖链上的特异性功能基团。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种反应条件温和的桑叶低聚糖制备方法，该制备方法以桑叶为原料，经酶法水解制备而成，使低聚糖结构和活性得到最大保证，不易造成环境污染。

本发明所要解决的第二个技术问题是制备一种新来源的功能性低聚糖，利用桑叶为底物，水提得到多糖后通过酶催化反应制备得到桑叶低聚糖，同时通过醇沉多糖及微生物发酵去单糖获得的桑叶低聚糖聚合度为2-10，具有促进肠道益生菌及抑制有害菌的增殖的功效。

本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：

一种功能性桑叶低聚糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)以干燥的桑叶(水分含量低于5％)为原料，粉碎后利用石油醚脱脂，得到脱脂桑叶粉；

(2)脱脂桑叶粉经水提得到桑叶多糖提取液；

(3)将得到的桑叶多糖提取液中加入水解酶，经酶解反应得到低聚糖水解液；

(4)在低聚糖水解液中加入乙醇，醇沉未反应的桑叶多糖，得到去多糖的桑叶低聚糖溶液；

(5)在去多糖的桑叶低聚糖溶液中加入啤酒酵母发酵去单糖，最终得到功能性桑叶低聚糖(对最终的反应液进行喷雾干燥得到桑叶低聚糖)。

优选地，步骤(2)所述脱脂桑叶粉的添加量为1％-10％，提取温度为80-100℃，提取时间为3-5h。

优选地，步骤(3)所述水解酶为半纤维素酶，酶添加量为0.01％-0.20％，所述酶解反应的条件：温度为50-60℃，时间为8-10h，pH4.5-5.5。

优选地，步骤(3)所述桑叶多糖提取液的浓度控制为1.5％-2.5％，所述脱脂桑叶粉的添加量为3％-7％，酶添加量为0.08％-0.11％。

优选地，步骤(4)所述乙醇浓度为55％-65％，醇沉的时间为4-8h。

优选地，步骤(5)所述啤酒酵母的菌株接种量为1％-10％，发酵时间为48-96h，发酵温度20-32℃，发酵pH4.0-6.5。

优选地，步骤(5)所述桑叶低聚糖溶液的浓度控制为2％-3％；啤酒酵母的菌株接种量为1％-3％，发酵时间为60-72h，发酵温度25-30℃，发酵pH5.0-6.0。

优选地，步骤(1)所述桑叶与石油醚的料液比为1:(2～6)g/mL。

上述方法制备的功能性桑叶低聚糖可用于调节肠道菌群。

本课题组研究发现，桑叶多糖主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等组成，其中葡萄糖含量仅占10％左右，制备得到的低聚糖很难被胃肠道消化吸收利用，而直接进入结肠被肠道微生物菌群所利用，发酵产生有机酸，从而降低肠道中的pH值，促进双歧杆菌等有益菌的生长和活性，抑制有害菌的增殖，减少有毒有害物质的产生，进而调节肠道菌群。因此，桑叶是制备功能性低聚糖的理想原料。但是，由于化学法对糖链上特异性功能基团破坏较大；而酶法制备的桑叶低聚糖结构和活性得到最大保证。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明利用酶法催化制备的功能性桑叶低聚糖，最大限度的保护了桑叶低聚糖的结构和活性。

(2)本发明方法利用醇沉去多糖及微生物发酵去单糖，简化了桑叶低聚糖分离纯化工艺过程，具有更好的经济性和环保性，且得到的桑叶低聚糖具有促进肠道有益菌增殖、抑制有害菌生长的生理功效，在食品工业中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为桑叶低聚糖体外促进益生菌生长情况及代谢产酸曲线；(a)为桑叶低聚糖体外促进青春双岐杆菌生长曲线图；(b)为桑叶低聚糖体外促进青春双岐杆菌代谢产酸曲线图；(c)为桑叶低聚糖体外促进嗜酸乳杆菌生长曲线图；(d)为桑叶低聚糖体外促进嗜酸乳杆菌代谢产酸曲线图。

图2为桑叶低聚糖体外抑制大肠杆菌生长情况图。

图3桑叶低聚糖体外抑制金黄色葡萄球菌生长情况图。

具体实施方式

以下通过实施例更详细地介绍本发明的实施。在所述实施例中，所有百分比均以质量计。

各性能指标的测试标准或方法：

总糖的测定方法—苯酚-硫酸法：

取2mL不同浓度的葡萄糖溶液(0-400μg/mL)，依次加入1.0mL 5％苯酚溶液，5mL浓硫酸，振荡摇匀，40℃下反应15min，以蒸馏水管作空白对照，490nm下测定吸光值，绘制标准曲线。

样品处理：2mL一定浓度的样品+1mL 5％苯酚溶液+5mL浓硫酸，振荡摇匀，40℃下反应15min，测吸光值，并计算出样品中总糖的含量。

还原糖的测定方法：

取2mL不同浓度的葡萄糖溶液(0-500μg/mL)，加入3.0mL DNS溶液，振荡摇匀，沸水浴中反应10min，冷却后定容至15mL，以蒸馏水管作空白对照，于分光光度计540nm波长下测吸光度，绘制标准曲线。

样品处理：2mL一定浓度的样品+3.0mL DNS溶液，振荡摇匀，沸水浴中反应10min，冷却后定容至15mL，测吸光值，并计算出样品中还原糖的含量。

多糖含量测定：多糖含量＝多糖提取液总糖含量-多糖提取液中还原糖含量

低聚糖含量测定：低聚糖含量＝水解反应液中总糖含量-水解反应液中还原糖含量

低聚糖纯度分析：

将待测样品用0.22μm滤膜过滤后用于高效液相色谱分析低聚糖纯度，色谱条件为：检测器为蒸发光检测器，ELSD漂移管温度为45℃；色谱柱型号为ShodexAsahipak NH2P-504E(4.6mm×250mm，5μm)，柱温30℃；流动相为75％乙腈，流速为1mL/min，进样量为20μL，以聚合度为2-10的葡聚糖作为标准品。

实施例1

称取500g的干桑叶(水分含量低于5％)，经粉碎后用2000mL石油醚脱脂。分离回收萃取液及脱脂桑叶粉。将脱脂得到的全部桑叶粉加入到10L蒸馏水中，在90℃下提取4h，过滤取上清得到桑叶多糖提取液，将多糖提取液进行浓缩至终浓度为2％，pH调至4.9。

在1L桑叶多糖浓缩液中添加9.5g半纤维素酶，在55℃的恒温磁力搅拌器中搅拌进行酶解反应。9h后在100℃下灭酶，过滤取上清得到桑叶低聚糖粗反应液，低聚糖浓度为19.8mg/mL。在桑叶低聚糖粗反应液中加入1L无水乙醇(乙醇终浓度为50％)，醇沉6h，过滤取上清，将其浓缩至终浓度为2.5％，pH调至5.5。

取500mL上述2.5％桑叶低聚糖溶液，加入2％啤酒酵母，在28℃下发酵66h，最终得到纯度为86.3％的桑叶低聚糖溶液。该产品记为实施例1。

实施例2

称取500g的干桑叶(水分含量低于5％)，经粉碎后用2000mL石油醚脱脂。分离回收萃取液及脱脂桑叶粉。将脱脂得到的全部桑叶粉加入到7.14L蒸馏水中，在100℃下提取5h，过滤取上清得到桑叶多糖提取液，将多糖提取液进行浓缩至终浓度为2.5％，pH调至5.0。

在1L桑叶多糖浓缩液中添加11g半纤维素酶，在55℃的恒温磁力搅拌器中搅拌进行酶解反应。10h后在100℃下灭酶，过滤取上清得到桑叶低聚糖粗反应液，低聚糖得率为21.5mg/mL。在桑叶低聚糖粗反应液中加入1.86L无水乙醇(乙醇终浓度为65％)，醇沉8h，过滤取上清，将其浓缩至终浓度为3％，pH调至6.0。

取500mL上述3％桑叶低聚糖溶液，加入3％啤酒酵母，在28℃下发酵72h，最终得到纯度为93.2％的桑叶低聚糖溶液。该产品记为实施例2。

实施例3

称取500g的干桑叶(水分含量低于5％)，经粉碎后用2000mL石油醚脱脂。分离回收萃取液及脱脂桑叶粉。将脱脂得到的全部桑叶粉加入到16.7L蒸馏水中，在80℃下提取3h，过滤取上清得到桑叶多糖提取液，将多糖提取液进行浓缩至终浓度为2.0％，pH调至4.8。

在1L桑叶多糖浓缩液中添加11g半纤维素酶，在55℃的恒温磁力搅拌器中搅拌进行酶解反应。8h后在100℃下灭酶，过滤取上清得到桑叶低聚糖粗反应液，低聚糖得率为17.2mg/mL。在桑叶低聚糖粗反应液中加入1.22L无水乙醇(乙醇终浓度为55％)，醇沉8h，过滤取上清，将其浓缩至终浓度为2％，pH调至5.0。

取500mL上述2％桑叶低聚糖溶液，加入1％啤酒酵母，在28℃下发酵60h，最终得到纯度为80.5％的桑叶低聚糖溶液。该产品记为实施例3。

对比实施例1

称取500g的干桑叶(水分含量低于5％)，经粉碎后利用2000mL石油醚脱脂。分离回收萃取液及脱脂桑叶粉。将脱脂得到的全部桑叶粉加入到10L蒸馏水中，在90℃下提取4h，过滤取上清得到桑叶多糖提取液。将多糖提取液进行浓缩至终浓度为2％，pH调至5.5，加入2％啤酒酵母，在28℃下发酵66h，最终得到去单糖的未降解的桑叶多糖溶液。该产品记为对比实施例1。

对比实施例2

在1L桑叶多糖浓缩液中添加盐酸(终浓度为1mol/L)，在70℃的恒温磁力搅拌器中搅拌进行水解反应5h。过滤取上清得到桑叶低聚糖粗反应液，低聚糖得率为16.21mg/mL。在桑叶低聚糖粗反应液中加入1L无水乙醇(乙醇终浓度为50％)，醇沉6h，过滤取上清，将其浓缩至终浓度为2.5％，pH调至5.5。

取500mL上述2.5％桑叶低聚糖溶液，加入2％啤酒酵母，在28℃下发酵66h，最终得到纯度为76.5％的桑叶低聚糖溶液。该产品记为对比实施例2。

对比实施例3

称取500g的干桑叶(水分含量低于5％)，经粉碎后用2000mL石油醚脱脂。分离回收萃取液及脱脂桑叶粉。将脱脂得到的全部桑叶粉加入到10L蒸馏水中，在90℃下提取4h，过滤取上清得到桑叶多糖提取液，将多糖提取液进行浓缩至终浓度为2％，pH调至5.5。

在1L桑叶多糖浓缩液中添加2％的H₂O₂，在50℃的恒温磁力搅拌器中搅拌进行水解反应24h。过滤取上清得到桑叶低聚糖粗反应液，低聚糖得率为13.56mg/mL。在桑叶低聚糖粗反应液中加入1L无水乙醇(乙醇终浓度为50％)，醇沉6h，过滤取上清，将其浓缩至终浓度为2.5％，pH调至5.5。

取500mL上述2.5％桑叶低聚糖溶液，加入2％啤酒酵母，在28℃下发酵66h，最终得到纯度为69.1％的桑叶低聚糖溶液。该产品记为对比实施例3。

表1实施例1-3及对比例1-3制备得到的桑叶低聚糖指标测试结果

评估桑叶低聚糖对体外肠道微生物影响实验：

通过体外培养益生菌及致病菌评价制备得到实施例1-3及对比例1-3的桑叶低聚糖促进益生菌及抑制致病菌增殖的功能。

(1)将活化好的青春双岐杆菌(Bifidobacteriaadolescentis)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)以5％的接种量接种于用20mg/mL桑叶低聚糖替代葡萄糖作为碳源的MRS液体培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养，分别于培养0、4、8、16、24和48h后，在波长600nm处测定OD值及发酵液pH，如图1。

(2)将活化好的大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，稀释至10⁸CFU/mL，取100μL菌液均匀涂布MAR固体培养基上；同时将滤纸圆片(直径6mm、15mm)经高压灭菌后分别置于浓度为2.0％实施例1-3及对比例1-3桑叶低聚糖溶液和无菌水中浸泡10min；用无菌镊子将抗菌滤纸片粘贴在MAR固体培养基上，以无菌水组为空白对照，将平板倒置在37℃恒温培养箱中孵育24h，桑叶低聚糖抑菌情况，如图2、3，并用游标卡尺或直尺量取并记录抑菌圈直径(表2)。

表2实施例1-3及对比例1-3制备得到的桑叶低聚糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑菌效果(mm)

通过体外益生实验，实施例1-3可以促进青春双岐杆菌和嗜酸乳杆菌的生长，显著高于对比例1-3(P<0.05)，特别是未降解的桑叶多糖。同时，通过测定益生菌利用桑叶多糖的产酸能力发现，青春双岐杆菌和嗜酸乳杆菌利用实施例1-3制备得到的桑叶低聚糖产酸能力显著高于对比例1-3(P<0.05)。

其次，通过体外抑菌试验观察发现，与对照组相比，实施例1-3及对比例2-3可以显著抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的增殖(P<0.05)；而且实施例1-3对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑制增殖效果显著好于对比例1-3。

Claims

1.一种功能性桑叶低聚糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以干燥的桑叶为原料，粉碎后利用石油醚脱脂，得到脱脂桑叶粉；

(2)脱脂桑叶粉经水提得到桑叶多糖提取液；

(5)在去多糖的桑叶低聚糖溶液中加入啤酒酵母发酵去单糖，最终得到功能性桑叶低聚糖。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述脱脂桑叶粉的添加量为1％-10％，提取温度为80-100℃，提取时间为3-5h。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述水解酶为半纤维素酶，酶添加量为0.01％-0.20％，所述酶解反应的条件：温度为50-60℃，时间为8-10h，pH4.5-5.5。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述桑叶多糖提取液的浓度控制为1.5％-2.5％，所述脱脂桑叶粉的添加量为3％-7％，酶添加量为0.08％-0.11％。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述乙醇浓度为55％-65％，醇沉的时间为4-8h。

6.根据权利要求1～5任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述啤酒酵母的菌株接种量为1％-10％，发酵时间为48-96h，发酵温度20-32℃，发酵pH 4.0-6.5。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述桑叶低聚糖溶液的浓度控制为2％-3％；啤酒酵母的菌株接种量为1％-3％，发酵时间为60-72h，发酵温度25-30℃，发酵pH 5.0-6.0。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述桑叶与石油醚的料液比为1:(2～6)g/mL。

9.根据权利要求1～8任意一项所述方法制备的功能性桑叶低聚糖。

10.权利要求9所述功能性桑叶低聚糖的应用，其特征在于，该桑叶低聚糖用于调节肠道菌群。