CN101711775B - 一种用于预防和治疗肿瘤的益生菌发酵巴西菇的发酵组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及益生菌对食用巴西菇多糖的抗肿瘤活性的影响，特别是涉及巴西菇多糖经肠道益生菌发酵，以提高和改善巴西菇多糖的抗肿瘤活性的方法。本发明进一步涉及巴西菇多糖提取物经肠道益生菌发酵后制得的发酵组合物，以及该发酵组合物在制备用于预防和治疗肿瘤的保健品或药品中的应用。

Description

一种用于预防和治疗肿瘤的益生菌发酵巴西菇的发酵组合物

技术领域

本发明涉及益生菌对巴西菇多糖的抗肿瘤活性的影响，特别是涉及巴西菇多糖经肠道益生菌发酵，以提高和改善巴西菇多糖的抗肿瘤活性的方法。本发明进一步涉及巴西菇多糖提取物经肠道益生菌发酵后制得的发酵组合物，以及该发酵组合物在制备用于预防和治疗肿瘤的保健品或药品中的应用。

技术背景

巴西菇(Agaricus blazei Murrill)又名姬松茸，是原产于巴西的珍贵而稀少的富含糖和蛋白质的药食兼用真菌。有研究证明，巴西菇具有调节免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗疲劳及保肝等作用。

巴西菇的抗肿瘤活性来自其中所含的多糖肽。Takashi Mizuno和Hagiwara等学者用热水从巴西菇子实体中提取、乙醇沉淀、离子交换和亲和层析，分离出的多糖由3种具有强抗肿瘤活性的多糖类物质，即FIO-a-α、FA-1-a-α和FA-1-a-β(Takashi Mizuno，Toshinikonagiqara，Antitumor activity and someproperties of water-soluble polysacchrides from the fruiting body ofAgaricus blazeiMurill，Agric.Biol.Chem.，1990，54(11)，2889-2996)。

有人认为，低分子量的巴西菇多糖组分具有抗肿瘤活性(Yoshiki Fujimiyaet al.，Tumor-specific cytocidal and immunopotentiating effects ofrelatively low molecular weight products derived from thebasidiomycete，Agaricus blazei Murill，Anticancer Research，1999，19：113-118)，并且从巴西菇中分离和纯化出ABM I-Ⅳ等4种组分。有人还证明，分子量为48000的道尔顿的ABM II对脾淋巴细胞增殖和K562细胞毒活性最强。例如，中国专利200610151128.3号描述了用蒸馏水浸提，乙醇沉淀和层析方法获得的低分子量(约为48000道尔顿)的巴西菇多糖，及其在制备抗肿瘤转移药物中的应用。

现有技术中的许多实验结果均提示，已知结构或未知结构的天然药物，如通过胃肠道途径摄入体内后，将会发生某些结构上的改变，从而可以更容易地被吸收并在人或动物体内发挥更大的生物学活性。因此本发明中，我们试图模拟正常人的肠道微生态环境，利用在人体内分布广泛并且作用确切的多种肠道益生菌与本发明使用的单一天然药物巴西菇提取物一起发酵，以实现肠道益生菌对巴西菇的修饰。结果令人惊奇地发现，经与肠道益生菌共同发酵处理后，巴西菇提取物显著地提高和改善了其抗肿瘤等生物学活性。

发明内容

本发明涉及益生菌对食用真菌多糖的抗肿瘤活性的影响，特别是涉及巴西菇多糖经肠道益生菌发酵，以提高和改善巴西菇多糖的抗肿瘤活性的方法。本发明进一步涉及巴西菇多糖提取物经肠道益生菌发酵后制得的发酵组合物，以及该发酵组合物在制备用于预防和治疗肿瘤的保健品或药品中的应用。

许多研究都已证实，巴西菇所含多糖的抗肿瘤活性是灵芝等15种具有抗肿瘤活性的食用菌中抗肿瘤活性最高的。巴西菇的多糖，特别是低分子量多糖(10万道尔顿以下)是其发挥抗肿瘤作用的主要活性成分。

本发明的一个目的是提供巴西菇提取物经益生菌发酵处理后所得到的发酵产物。本发明中，由巴西菇提取物经益生菌发酵处理后得到的发酵产物常常被简称为发酵组合物。

根据本发明，巴西菇发酵中所使用的益生菌选自双歧杆菌和乳杆菌。

根据本发明的一个优选实施方案，其中用于发酵巴西菇的所说的双歧杆菌选自两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌和婴儿双歧杆菌；其中所说的乳杆菌选自嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。

根据本发明的一个优选实施方案，其中用于发酵巴西菇的所说的双歧杆菌最好选自两歧双歧杆菌和短双歧杆菌；其中所说的乳杆菌最好选自干酪乳杆菌和德氏乳杆菌。

本发明的另一个目的是提供制备上述发酵组合物的方法，该方法包括利用超微粉碎技术，粉碎巴西菇细胞并使其细胞破壁，最大程度的获取巴西菇的有效成分。以提取的巴西菇多糖或者直接以破壁巴西菇的菌粉作为发酵底物，接种预培养的各约0.5％(体积/体积)一种或两种或两种以上双歧杆菌菌液。常规培养约2～6小时后，再次接种预培养的各约0.5％(体积/体积)的一种或两种或两种以上乳杆菌菌液，继续发酵20～22小时。当pH值降至4.0以下时，结束发酵，即得到益生菌发酵巴西菇的发酵组合物(参见实施例1和2)。

一般说来，制备益生菌发酵巴西菇的发酵组合物时，巴西菇用量为每100ml培养物中含巴西菇菌粉2-20克。

通常采用超微粉碎技术制备细胞破壁的巴西菇菌粉。以往，大多使用普通粉碎方法制备粗分散状态的粉末，这样有效成分的回收率往往较低，而且生物利用率也比较低。为了在大批量生产过程中最大限度地获取有效成分，中药制剂生产领域引入了超微粉碎技术。经过超微粉碎处理后的巴西菇粒度均匀、细密，并且细胞壁也被破碎，因而增加了菌粉的比表面积，从而更有利于药物有效成分的溶出，大大增加了药材有效成分的提取率。超微粉碎的破壁巴西菇菌粉粉碎细度在100目以上。

可在由已破壁巴西菇构成的菌粉中，加入相当于巴西菇菌粉体积约30倍的纯水，并浸泡30分钟。然后于100℃下提取大约1小时。过滤后，再向残渣中加入大约30倍的水，再次于100℃下提取1小时。过滤后，收集滤液，合并两次提取液，并减压浓缩至其中巴西菇的浓度为20％(重量/体积)，即得到所需的巴西菇多糖提取液。

为了制备用于益生菌发酵的巴西菇多糖底物，可直接利用破壁的巴西菇菌粉，用量为每100ml培养物中含巴西菇菌粉2-20克，然后再加入葡萄糖0.5％(重量/体积)、无机盐(硫酸亚铁·7H₂O 1.0mg/100ml、硫酸锌·7H₂O 4.4mg/100ml、亚硒酸钠·5H₂O  0.024mg/100ml、硫酸镁·7H₂O 70mg/100ml、硫酸锰·H₂O0.5mg/100ml、氯化钠1.0mg/100ml、磷酸二氢钾100mg/100ml、磷酸氢二钾·3H₂O 100mg/100ml)，调整pH7.0左右并115℃灭菌40分钟后，即得到继后用于益生菌发酵的巴西菇多糖底物。

可利用上述方法提取的巴西菇多糖提取液，作为益生菌发酵培养底物，调整pH7.0左右并115℃灭菌40分钟后，即得到继后用于益生菌发酵的巴西菇多糖底物。

当按上述方法制备的用于益生菌转化发酵的巴西菇多糖底物灭菌后，温度降至39℃2左右时，接种预培养的各约0.5％(体积/体积)一种或者两种双歧杆菌的菌液，常规培养约2～6小时后，再次接种预培养的各约0.5％(体积/体积)的一种或者两种乳杆菌的菌液，继续发酵20～22小时。pH值降至4.0以下时结束发酵，即得到益生菌发酵巴西菇的发酵组合物(参见实施例1和2)。

为了证明益生菌发酵处理，巴西菇对益生菌生长的影响，我们实验观察了益生菌发酵处理巴西菇后，益生菌数目的变化。试验结果表明，经与巴西菇一同发酵后，益生菌的菌体数目不低于MRS常规培养基中生长的益生菌数量(参见实施例3)。

为了揭示益生菌发酵对巴西菇分子可能的化学修饰作用，我们的基础研究实验还证实，经益生菌发酵处理后，巴西菇底物溶液的特性粘度[η]明显降低。这一结果提示，经益生菌发酵处理后，由于巴西菇多糖分子的裂解，致使多糖分子数目显著增加，并且多糖的平均分子量减小(参见实施例4)。

发明的再一个目的是提供本发明的发酵组合物在提高机体免疫力、预防和治疗肿瘤的药物或者保健品中应用。

为检测本发明的益生菌发酵巴西菇的发酵组合物与未通过益生菌转化发酵的巴西菇多糖的抑瘤效果，两试验样品直接投用于携带实验性S₁₈₀肉瘤的动物肿瘤模型。经过益生菌发酵转化的巴西菇多糖，均对肿瘤具有明显的抑制作用，高、中、低三个剂量组对小鼠S180的抑瘤率分别为53.71％、38.2％和0.26％。而未经益生菌发酵转化的巴西菇多糖，高、中、低三个剂量组对小鼠S180的抑瘤率分别为38.90％、0.69％、-0.37％。可见，经过益生菌转化发酵后，巴西菇多糖的抑瘤作用得到明显的提高(具体见实施例5)。虽然有关机理尚不明了，但这一研究结果证明，巴西菇多糖或其他真菌多糖在肠道有益菌群的体外作用下，经过某些已知或未知的化学修饰或生物转化后，更利于人体吸收利用，发挥了更高的生物学功能(参见实施例5)。

经体外细胞学和体内动物实验证实，本发明的修饰的抗原肽可有效地促进T淋巴细胞和乳腺癌特异性CTL的增殖，激发免疫系统对瘤细胞的杀伤活性，从而达到抑制肿瘤生长的目的。特别是我们的比较实验显示，与野生型序列相比，本发明修饰的抗原肽能够更有效地促进T细胞的增殖，提高T细胞分泌IFN-γ的能力，从而提高了CTL对肿瘤细胞的杀伤活性。

虽然本发明以巴西菇为例说明巴西菇经益生菌发酵处理后，显著改善了巴西菇的生物学活性，特别是其抗肿瘤活性，但本领域技术人员可以理解到，益生菌发酵处理同样也适用于发酵处理包括金针菇、香菇、灵芝等在内的其他真菌。

具体实施方式

实施例1：益生菌发酵巴西菇多糖的发酵组合物的制备

取干燥的巴西菇，采用细胞破壁技术粉碎至孢子破壁(巴西菇菌粉粉碎细度在100目以上)。向巴西菇菌粉中加入相当于菌粉体积30倍的纯水浸泡30分钟，并于100℃提取1小时后过滤。再向滤渣中加30倍的水，100℃提取1小时，再次过滤后，合并两次提取液，并减压浓缩至含巴西菇的浓度为20％(重量/体积)，即为巴西菇多糖提取液。将巴西菇多糖提取液115℃下加热40分钟灭菌。当温度降至39℃左右时，接入预培养好的两歧双歧杆菌和短双歧杆菌液，接种量均为0.5％(体积/体积)。发酵6小时后，再接入预培养的德氏乳杆菌、干酪乳杆菌菌液各0.5％(体积/体积)。发酵培养温度为37℃左右，继续发酵20～22小时。pH值降至4.0以下时，结束发酵，即得到益生菌发酵巴西菇多糖的发酵组合物。

实施例2：益生菌发酵巴西菇菌粉的发酵组合物的制备

取干燥的巴西菇，采用细胞破壁技术，粉碎，显微镜镜检，孢子已破壁。要求巴西菇粉能通过100目筛，用量为每100ml培养物中含巴西菇菌粉2克，再加入葡萄糖0.5％(重量/体积)、无机盐(硫酸亚铁·7H2O 1.0mg/100ml、硫酸锌·7H2O 4.4mg/100ml、亚硒酸钠·5H2O  0.024mg/100ml、硫酸镁·7H2O70mg/100ml、硫酸锰·H2O 0.5mg/100ml、氯化钠1.0mg/100ml、磷酸二氢钾100mg/100ml、磷酸氢二钾·3H2O 100mg/100ml)，调整pH7.0左右并115℃灭菌40分钟。当温度降至39℃左右时，接入预培养好的两歧双歧杆菌和短双歧杆菌菌液，接种量均为0.5％(体积/体积)。发酵6小时后再接入预培养的德氏乳杆菌和干酪乳杆菌菌液，接种量均为0.5％(体积/体积)。37℃继续发酵20～22小时，当pH值降至4.0以下时，结束发酵，得到益生菌发酵巴西菇菌粉的发酵组合物。

实施例3：益生菌在巴西菇多糖提取液和巴西菇菌粉底物中的发酵生长情况

在按照实施例1和2制备的培养基中，接种两歧双歧杆菌和短双歧杆菌菌液(接种量同前所述)，发酵6小时后，取样检测发酵菌菌体数目。然后再接入预培养的德氏乳杆菌和干酪乳杆菌菌液(接种量同前所述)，继续培养至48小时。其中发酵第24、32和48小时取样检测菌数。按照同样操作步骤接种MRS培养基，作为对照。检测按照《食品卫生微生物学检验双歧杆菌检验》GB/T4789.34-2003中所述的方法进行。检测结果如表1所示。

表1：益生菌在巴西菇培养基中的生长菌数

从表1可以看出，同常规的MRS培养基比较，人体益生菌双歧杆菌、乳杆菌在巴西菇多糖和巴西菇菌粉为培养基的环境中生长良好，均能够达到每毫升含菌体量1亿个(10⁸)以上。并且，发酵生长24小时后菌数达到最高，如继续培养则菌体数目逐渐降低。该实验表明，益生菌在生长过程中，可以分解代谢巴西菇多糖，获得较好的生长。继续培养，由于代谢物的累积和营养物的减少，活菌数量不断减少。

实施例4：粘度法检测巴西菇多糖益生菌发酵前后平均分子量的变化

巴西菇多糖是一种具有良好抗肿瘤活性的真菌多糖，经过益生菌发酵后，其抑瘤作用明显提高。多糖的理化性质尤其是生理活性与其分子量与分布有关。为此，本发明人利用粘度法，测定了益生菌发酵前后巴西菇多糖的相对分子量变化。根据试验，在足够稀的溶液中：当多糖、溶剂、温度等确定以后，[η](称为特性粘度)值只与高聚物的相对分子质量M有关。用半经验的麦克非线性方程来求得特性粘度值[η]：

[η]＝KM^α

式中：M----多糖相对分子质量的平均值；

K----比例常数；

α----与高聚物在溶液中的形态有关的经验。

配制5种不同浓度的样品溶液，测出各浓度的相对粘度η_r，利用硫酸-苯酚法检测巴西菇多糖的含量。发酵的巴西菇多糖样品为原浓度，发酵的巴西菇菌粉发酵液浓缩10倍，以未发酵的巴西菇多糖为对照。三个样品的检测结果如表2。η_r-1/c对浓度C作图，将直线外推，与Y轴的交点为[η]。结果如下列表2所示。

表2：巴西菇多糖三个样品检测结果

从表2所示的特性粘度[η]可以看出，巴西菇多糖和巴西菇菌粉经过益生菌发酵后，其数值明显减小。根据公式[η]＝KM^α，[η]值越大，多糖的相对分子量M就越大。因此可以推断，巴西菇多糖经过益生菌发酵后，分子被裂解，导致其相对分子量明显减小。

实施例5：益生菌发酵巴西菇多糖的发酵组合物与未发酵的巴西菇多糖抗肿瘤活性比较

本实施例利用肿瘤动物模型，举例描述巴西菇多糖提取物在经肠道益生菌体外发酵转化后生物学活性的改善。

取实施例1制备的巴西菇多糖提取液样品，平均分成两份。一份进行益生菌发酵，另一份不进行发酵。发酵完成后，将两份样品减压浓缩至原体积的一半。然后用硫酸苯酚法(食品科学，2004，25卷，7期，“姬松茸多糖的测定”)测定发酵和未发酵样品的多糖含量。结果可见，巴西菇多糖发酵样品中，多糖含量为35.1mg/ml，而未发酵样品的多糖含量为31.8mg/ml。

取平均体重为18-22g的70只昆明种小白鼠随机分7组，每组10只。第1组为生理盐水组(空白对照)，动物只接受生理盐水0.6ml；第2、3、4、组为巴西菇未发酵样品大、中、小剂量组，给药剂量分别为0.8g/kg、0.4g/kg和0.2g/kg；第5、6、7组为巴西菇发酵样品大、中、小剂量组，剂量分别为0.8g/kg、0.4g/kg和0.2g/kg。每天灌胃给药一次，连续给药7天。第8天，无菌条件下取荷瘤动物生长良好无溃破的实体瘤块，用剪刀剪成小碎块，按瘤块(g)：生理盐水(ml)为1∶3的比例，用玻璃匀浆器研磨成匀浆，计数每毫升浆液中的瘤细胞数。给每只小鼠腋窝下接种2×10⁶细胞悬液0.2ml，接种后继续给药10天。第11日断颈处死动物，称体重和瘤重，按下列公式计算肿瘤生长抑制率(％)。

本动物治疗实验中，抑瘤率大于30％视为被试样品对所说的肿瘤具有抗肿瘤(或肿瘤抑制)活性，而抑瘤率小于30％则视为无抗肿瘤(或肿瘤抑制)活性。

每批实验动物要求同一性别(雄)。实验结果如下列表3所示。

表3：姬松茸对小鼠S180(实体瘤)体内抑瘤作用结果

注：与阴性对照组比*P＜0.05    **P＜0.01

从本试验的结果中可以看出，巴西菇多糖经过益生菌发酵转化后，其各剂量组抑瘤作用明显高于未发酵组，推测可能巴西菇多糖经过益生菌的作用，益生菌产生的酶类将姬松茸的大分子量的多糖长链水解为小分子的、具有更强抗肿瘤活性的多糖片段，从而增加了巴西菇多糖中发挥抑瘤作用的活性成分，提高了巴西菇多糖的抑瘤作用。

Claims (2)

1.一种用于预防和治疗肿瘤的益生菌发酵巴西菇的发酵培养组合物，其特征在于该发酵培养组合物是使用巴西菇多糖提取物、或者直接利用破壁的巴西菇菌粉、按照下述方法制备的，所说的方法包括利用超微粉碎技术粉碎巴西菇至孢子破壁，然后用100℃热水提取巴西菇多糖，并以提取的巴西菇多糖为发酵底物，或者直接利用破壁的巴西菇菌粉为发酵底物，接种预培养的各0.5％(体积/体积)的两歧双歧杆菌和短双歧杆菌的双歧杆菌菌液，常规培养约2～6小时后，然后再次接种预培养的各0.5％(体积/体积)的德氏乳杆菌和干酪乳杆菌的乳杆菌菌液，37℃继续发酵20～22小时，pH值降至4.0以下时，结束发酵，即得到益生菌发酵巴西菇的发酵培养组合物。

2.根据权利要求1的发酵培养组合物在生产用于预防和治疗肿瘤的药物或者保健品中应用。